Wyznaczanie współczynnika logP i Kd jako podstawowych ..., Publikacje z Chemia

Pobierz Wyznaczanie współczynnika logP i Kd jako podstawowych ... i więcej Publikacje w PDF z Chemia tylko na Docsity!

Z a k ł a d A n a l i z y Ś r o d o w i s k a , W y d z i a ł C h e m i i , U n i w e r s y t e t G d a ń s k i

Wyznaczanie współczynnika logP i Kd jako podstawowych

parametrów fizykochemicznych służących do oceny losu

środowiskowego substancji chemicznych

PRACOWNIA DYPLOMOWA

III ROK AGROCHEMII

Ćwiczenie

1. Współczynnik podziału n - oktanol-woda Potencjał rozprzestrzeniania się związku chemicznego w środowisku oraz jego aktywność biologiczna wiąże się w sposób bezpośredni z jego cechami fizykochemicznymi (tj. właściwości elektronowe, steryczne, potencjał tworzenia wiązań wodorowych i inne). Jednak najbardziej użytecznym parametrem w przewidywaniu rozprzestrzeniania się potencjalnego zanieczyszczenia w środowisku, a także prognozowania jego aktywności toksycznej jest lipofilowość - parametr będący wypadkową kilku takich cech. Lipofilowość charakteryzuje powinowactwo związku chemicznego do fazy lipidowej i wodnej, a jej miarą jest stosunek równowagowych stężeń rozpuszczonej substancji w układzie dwufazowym, składającym się z dwóch niemieszających się rozpuszczalników. Zgodnie z prawem Nernsta, w warunkach równowagi termodynamicznej, w stałej temperaturze i przy stałym ciśnieniu, stosunek stężeń (a dokładniej aktywności) rozpuszczonej substancji w obu takich rozpuszczalnikach jest wielkością stałą, zwaną współczynnikiem podziału. Należy zaznaczyć, iż wartość współczynnika podziału nie zależy od aktywności substancji rozpuszczonej, jest natomiast cechą charakterystyczną dla danego układu dwóch rozpuszczalników i jednej substancji rozpuszczonej, zależną od temperatury i ciśnienia. Praktyczne znaczenie lipofilowości polega na możliwości przewidywania, w jakim stopniu dany związek będzie miał tendencję do gromadzenia się w tkankach organizmów żywych. Im bardziej substancja jest lipofilowa, tym większa jest tendencja do jej gromadzenia w organizmie ( bioakumulacji) i przenoszenia się wzdłuż łańcuchów pokarmowych (biomagnifikacji ). Przyjęto, że rozpuszczalnikami najlepiej odwzorowującymi układ faz polarnych i niepolarnych w ustroju biologicznym oraz środowisku naturalnym są n - oktanol i woda. Rozpuszczalniki te po zmieszaniu tworzą dwie rozseparowane fazy, przy czym ze względu na wzajemną częściową rozpuszczalność jest to układ zawierający oktanol nasycony wodą (2, mol/L) oraz wodę nasyconą oktanolem (4,5 x10-^3 mol/L). Współczynnik podziału P jest wyrażany ilorazem dwóch stężeń substancji rozpuszczonej:

!"#$ !"

gdzie: Cokt (mol/L) stężenie molowe substancji w oktanolu a Cw (mol/L) stężenie molowe substancji w wodzie. Współczynnik taki mierzy się w 25oC, przy stężeniu substancji badanej nie wyższym niż 0,01 mol/L. W takim układzie, jeżeli większa ilość cząsteczek badanego związku chemicznego znajdzie się w fazie oktanolowej, to mamy do czynienia ze związkiem

log P = log cokt − log cw (2)

Dla tak obliczonego współczynnika podziału przyjmuje się, iż związki których log P jest mniejsze od jedności, mogą być charakteryzowane jako hydrofilowe, a więc takie, które nie ulegają bioakumulacji. Związki dla których 1 < log P < 3, charakteryzują się średnią lipofilowością i mogą ulegać częściowej bioakumulacji. Natomiast związki, których log P > 3, charakteryzują się wysoką lipofilowością i wysokim potencjałem bioakumulacji. Jest to typowa wartość współczynnika podziału dla większości tzw. trwałych zanieczyszczeń organicznych (chlorowane węglowodory, PCB, WWA, polichlorowane dibenzodioksyny i furany). Przykładowo, wartość log P dla metanolu wynosi - 0,82; dla kwasu mrówkowego - 0,41; zaś dla 2,2',4,4',5-pentachlorobifenylu 6,41. Tak jak przedstawiono wcześniej, oddziaływania międzycząsteczkowe zachodzące pomiędzy substancją rozpuszczoną a n - oktanolem i wodą zależą od jej budowy chemicznej i wielkości ale też od obecności ugrupowań kwaśnych bądź zasadowych. Mając do czynienia z kwasami bądź zasadami organicznymi, kolejnym bardzo ważnym czynnikiem wpływającym na podział staje się również wartość pH układu, która determinuje stopień zjonizowania substancji rozpuszczonej. W przypadku kwasów i zasad podziałowi pomiędzy fazy ulegają nie tylko związki neutralne, ale również formy zjonizowane oraz formy zasocjowane tych związków. Dodatkowo, występowanie związku w formie zjonizowanej może stać się poważnym ograniczeniem technicznym w wyznaczeniu współczynnika podziału. Jeżeli związek taki w swojej strukturze zawierał by także obszerny fragment hydrofobowy (np. kilku- lub kilkunastowęglowy łańcuch alkilowy), to swoją budową przypominałby substancję powierzchniowo czynną. Na Rysunku 2 przedstawiono przykład podziału kwasu octowego pomiędzy oktanol i wodę z uwzględnieniem wszystkich możliwych form występowania. Rysunek 2. Formy występowania kwasu octowego w układzie n - oktanol – woda. W fazie wodnej kwas występować będzie zarówno w formie zjonizowanej jak i obojętnej. Im większy będzie udział formy zjonizowanej, tym większa ilość cząsteczek kwasu

znajdzie się w tej właśnie fazie. Oczywiście, jeżeli pH układu uległoby obniżeniu, to przeważałaby forma obojętna, a poniżej wartości 4,8 (wartość pKa dla kwasu octowego) byłaby formą dominującą. W miarę protonowania grupy karboksylowej część cząsteczek kwasu przechodzić będzie do fazy oktanolowej. Oprócz formy obojętnej w fazie n - oktanolu utworzyć się mogą także dimery kwasu octowego powstałe w wyniku asocjacji. Asocjacja ma miejsce w niepolarnych rozpuszczalnikach i określą ją stałą równowagi reakcji asocjacji. Polega ona na tworzeniu cząstek zawierających dwie lub więcej cząsteczek związanych wiązaniami wodorowymi. Strukturę dimeru kwasu octowego przedstawiono na Rysunku 3. Rysunek 3. Asocjat dwóch cząsteczek kwasu octowego. Jeżeli kwas asocjuje w fazie oktanolowej, to jego współczynnik podziału pomiędzy fazę oktanolową i wodną przyjmuje następującą postać: 𝑃 = !!"#$ !"

gdzie n to liczba asocjujących cząsteczek. Zlogarytmowana postać tego równania to: 𝑙𝑜𝑔𝑃 = ! !

Po przekształceniu uzyskujemy równanie liniowe, gdzie log P jest punktem przecięcia prostej z osią y przy x = 0, a 1/ n jest współczynnikiem kierunkowym prostej: 𝑙𝑜𝑔𝐶𝑤 = ! ! log 𝐶𝑜𝑘𝑡 − 𝑙𝑜𝑔𝑃 (5) Równanie to pozwala na podstawie wykresu wyznaczyć współczynnik podziału P oraz liczbę cząsteczek n tworzących asocjaty w fazie oktanolowej. Do obliczenia log P należy analitycznie określić aktywność substancji rozpuszczonej w obydwóch fazach, co w przypadku roztworów rozcieńczonych sprowadza się do wyznaczenia stężenia. W tym celu stosuje się szereg metod np. miareczkowanie, oznaczanie kolorymetrycznie, chromatografię cieczową lub gazową. UWAGA! Studenci pracować będą w dwóch grupach, a każda grupa wykonana oba ćwiczenia (1.1 oraz 2.2).

cw – stężenie kwasu octowego w roztworach wodnych po wytrząsaniu c okt – Stężenie kwasu octowego w n - oktanolu

5. Narysować graficzną zależność: logcw = f(logc okt ). Na podstawie wykresu, z nachylenia prostej odczytać wartość 1/ n. Obliczyć n (czyli liczbę cząsteczek kwasu asocjujących w n- oktanolu). Obliczyć wartość współczynnika podziału.
6. Obliczyć współczynnik ekstrakcji D, jako stosunek stężenia kwasu octowego w n - oktanolu do stężenia kwasu octowego w warstwie wodnej dla poszczególnych roztworów.
7. Obliczyć ile procent kwasu octowego wyekstrahowało się do n - oktanolu (c okt /cp). 1.3. SZKŁO I ODCZYNNIKI

• pipeta jednomiarowa 25 cm^3 – 1 szt.
• pipeta wielomiarowa 25 cm^3 – 1 szt.
• pipeta 1 cm^3 – 2 szt.
• pipeta 2 cm^3 – 1 szt.
• cylinder miarowy 25 cm^3 – 1 szt.
• kolba stożkowa z korkiem 100 cm^3 – 4 szt.
• kolba stożkowa z korkiem 50 cm^3 – 4 szt.
• rozdzielacz 100 cm^3 – 4 szt.
• zlewka 250 cm^3 – 2 szt.
• zlewka 100 cm^3 – 1 szt.
• lejek mały – 1 szt.
• biureta 25 cm^3 – 1 szt.
• pompka do pipet
• mianowany NaOH 0,1 M 500 cm^3
• n - oktanol 100 cm^3
• kwas octowy 2M 200 cm^3
• fenoloftaleina (0,1 % w 70 % EtOH)
• tryskawka z wodą destylowaną
• rękawice ochronne
• ręcznik papierowy 1.4. LITERATURA
• Kłoczko E., Metody eksperymentalne w chemii , PWN, Warszawa 1978
• Pigoń K., Chemia fizyczna , Tom I, PWN, Warszawa 2005
• Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna. Chemiczne metody analizy ilościowej , PWN, Warszawa 1997

2. Wyznaczanie równowagowego współczynnika adsorpcji Kd substancji chemicznej do gleb 2.1.Podstawy teoretyczne procesów sorpcji Proces, w wyniku którego związki chemiczne zostają związane z fazą stałą, nosi ogólną nazwę sorpcji. Z a dsorpcją mamy do czynienia gdy pochłanianie substancji występuje na powierzchni, podczas gdy absorpcja ma miejsce, gdy substancja pochłaniana jest w całej objętości fazy stałej. Te procesy mogą dotyczyć zarówno substancji lotnych jak i cząsteczek rozpuszczonych w środowisku ciekłym, które ulegają asocjacji z drobinami fazy stałej. Cząsteczki i atomy mogą przyłączać się do powierzchni na dwa sposoby. W procesie adsorpcji fizycznej pomiędzy adsorbatem i adsorbentem istnieją oddziaływania van der Waalsa (np. siły dyspersyjne lub oddziaływania dipolowe). W procesie adsorpcji chemicznej (chemisorpcji) cząsteczki (lub atomy) łączą się z powierzchnią, tworząc wiązania chemiczne (najczęściej kowalencyjne), dążąc przy tym do największej liczby koordynacyjnej na powierzchni. Należy wziąć pod uwagę fakt, że te same związki mogą zachowywać się w zróżnicowany sposób, gdy: (a) są w fazie gazowej lub (b) otoczone są cząsteczkami wody i innymi jonami lub (c) są zaadsorbowane na powierzchni fazy stałej lub (d) są inkorporowane do struktury matrycy stałej ( Rysunek 4 ). Dlatego też zjawisko sorpcji może w znaczący sposób wpływać na szybkość rozprzestrzeniania się, losy oraz oddziaływanie związków chemicznych w środowisku.Transport ksenobiotyków w środowisku wodnym różni się znacząco od rozprzestrzeniania się tych samych związków w stałych materiałach porowatych (gleba, osady, warstwy wodonośne i in.). Co więcej, transport danego związku w tych matrycach, jest silnie uzależniony od możliwości wiązania się z różnymi komponentami fazy stałej. Dodatkowo, tylko rozpuszczone cząsteczki mają możliwość oddziaływań z powierzchniami międzyfazowymi, co może prowadzić do ich przenikania do innych komponentów środowiska (np. atmosfera). Również biodostępność danego związku, a tym samym możliwość jego biotransformacji i jego właściwości toksykologiczne, są silnie zależne od intensywności sorpcji. Silne związanie z matrycą porowatą w dużym stopniu może ograniczać dostępność danej substancji dla organizmów żywych, a tym samym możliwość jej biodegradacji. Oprócz degradacji przez organizmy żywe, ksenobiotyki poprzez związanie z matrycą porowatą często są chronione przed wpływem światła, co powoduje, że nie ulegają procesom np. fotodegradacji czy degradacji termicznej. Co więcej, kiedy związki chemiczne znajdują się w strukturze matrycy, możliwe jest, iż nigdy nie wejdą w reakcję z czynnikami

minerałów ilastych, a także od grup karboksylowych i fenolowych w materii organicznej, które przyciągają kationy. Oddziaływania kulombowskie należą do bardzo silnych wiązań (300-1500 kJ/mol), a tym samym wiązanie kationów do ujemnie naładowanej powierzchni może być bardzo trwałe i często nieodwracalne. Generalnie uznaje się, iż te dwa typy oddziaływań (z formą jonową i niezjonizowaną) są prawdziwe w przypadku większości związków organicznych oraz dla większości naturalnych powierzchni. Oczywiście, inne typy oddziaływań (np. między grupą karbonylową sorbentu a grupą aminową w sorbacie) także mogą występować w trakcie wiązania cząsteczek na powierzchni. Powoduje to, że procesy sorpcji składają się z szeregu mechanizmów, które działają w tym samym czasie i z różną intensywnością. Intensywność ta zależy od właściwości związku chemicznego jaki i rodzaju sorbatu. Aby określić, w jakim stopniu związek chemiczny łączy się z fazą stałą w stanie równowagi, w danym układzie, należy znać stosunek całkowitej ilości związku na sorbencie do ilości pozostałej w roztworze. Stosunek ten nazwany jest równowagowym współczynnikiem podziału (sorpcji), Kd , ciało stałe – roztwór wodny (wyrażony w jednostkach np.: l x kg-^1 sorbentu): 𝐾𝑑 = !" !"

gdzie: Cs to całkowita ilość zaadsorbowanej substancji chemicznej na jednostkę sorbentu (np. mol kg-^1 ), Cw to ilość związku pozostająca w roztworze wodnym w stanie równowagi (np. mol l-^1 ). Wartość równowagowego współczynnika sorpcji pozwala nam na przewidzenie podziału związku chemicznego do różnych gleb, o różnych parametrach fizykochemicznych (np. zawartość węgla organicznego, zawartość frakcji ilastych, struktura gleby czy pH). Mówiąc o równowagowym podziale substancji chemicznej między ciecz a ciało stałe, należy zastanowić się w jaki sposób całkowita pojemność sorbatu, Cs , wpływa na stężenie związku chemicznego w roztworze, Cw. Powiązanie między tymi dwoma wartościami często zwane jest izotermą sorpcji. Termin izoterma wskazuje, że ta zależność pojawia się tylko w warunkach stałej temperatury. Eksperymentalnie dowiedziono, że izotermy sorpcji mogą przyjmować bardzo różny kształt, w zależności od oddziaływań między sorbatem a sorbentem ( Rysunek 5 ). W najprostszym przypadku (2.a) zależność stężenia sorbatu od sorbentu jest taka sama w całym zakresie stężeń. Jest to tak zwana izoterma liniowa. Odnosi się do sytuacji kiedy dominującym

oddziaływaniem jest podział do homogenicznej fazy stałej i/ lub kiedy, nie następuje całkowite wysycenie centrów adsorpcji (np. w niskich stężeniach). Rysunek 5. Różne typy izoterm. Drugi typ izotermy (2.b i c) występuje, gdy w coraz wyższych stężeniach sorbatu, jest coraz mniej dostępnych miejsc oddziaływań. Dzieje się tak albo na skutek całkowitego wysycenia centrów aktywnych, albo gdy pozostałe centra nie są wystarczająco uprzywilejowane. W granicznych przypadkach (2.c), powyżej pewnej wartości Cs , wszystkie miejsca aktywne zostają wysycone i nie jest już możliwa dalsza sorpcja. Izotermy typu 2.b i c są charakterystyczne za równo dla adsorpcji na powierzchniach organicznych (np.: węgiel aktywny) jak i mineralnych (minerały ilaste). Oczywiście, w przypadku gleb lub osadów może występować na raz więcej niż jeden rodzaj aktywnej powierzchni. Dlatego też, ogólna izoterma sorpcji odzwierciedla "nałożenie się" poszczególnych mechanizmów i przybierać zróżnicowane kształty. Najczęstszą próbą opisu matematycznego danych eksperymentalnych jest posłużenie się empiryczną zależnością, zwaną izotermą Freundlicha : Cs = KF . Cw 1/n (7)

2.2.WYKONANIE ĆWICZENIA

Ćwiczenie przeprowadzone zostanie dla modelowego związku – naftalenu, zaliczanego do grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), stanowiących liczbą grupę związków zaliczanych do podstawowych zanieczyszczeń środowiska. Najistotniejszym ze zdrowotnego punktu widzenia skutkiem oddziaływania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych na organizm człowieka jest zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Liczne badania dostarczyły dostatecznej ilości danych, aby zakwalifikować niektóre WWA, jak np. benzo(a)piren, dibenzo(a,h)antracen, benzo(a)antracen, benzo(b)fluoranten czy dibenzo(a,e)piren, do substancji rakotwórczych. WWA do środowiska glebowego dostają się różnymi dragami. Są wymywane z powierzchni dróg, gdzie znajdują się duże ilości tych związków pochodzące ze spalin samochodowych, ze ścierania opon gumowych i z samego asfaltu bogatego w różne węglowodory naftenowe w tym WWA. Dodatkowo WWA przedostają się do gleb ze ścieków przemysłowych, miejsc składowania odpadów odlewniczych i materiałów stosowanych w budownictwie.

1. Odważyć po 1 gramie gleby do 6 probówek.
2. Przygotować 5 stężeń naftalenu o objętości 12 ml. Roztwór wyjściowy WWA o stężeniu 500 mg/dm^3 należy rozcieńczyć w 50% (v/v) metanolu według następującego schematu: Próbka Naftalen 1 2 x 2 3 x 3 5 x 4 10 x 5 20 x
3. Następnie dodać po 5 ml przygotowanych roztworów, do probówek z uprzednio naważoną glebą. Do szóstej probówki z glebą dodać taką samą objętość 50% roztworu metanolu (ślepa próba). Probówki układamy na wytrząsarce i nastawiamy na 60 min na 180 rpm. W czasie wytrząsania wykonujemy krzywą kalibracyjną dla naftalenu zgodnie z punktem 6.
4. Zdejmujemy próbki z wytrząsarki i wkładamy je do wirówki na 10 minut na 4000 obrotów.

Po odwirowaniu próbki przefiltrowujemy przez sączki uprzednio zwilżone 50% metanolem

5. Po przefiltrowaniu przystępujemy do analizy WWA za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), włączając w to ślepą próbę.
6. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej: ● W trakcie wytrząsania roztworów WWA z glebą wykonujemy krzywą kalibracyjną dla zadanych stężeń naftalenu. Pomiary wykonujemy za pomocą techniki HPLC-UV. ● oktadecylowa faza stacjonarna – C ● detektor UV, długość fali – 254 nm ● faza ruchoma - metanol:woda (90:10, w/w) ● prędkość przepływu – podana przez prowadzącego ● nastrzyk - 20 μl ● Wykonać po jednym nastrzyku dla każdego stężenia WWA 2.3.OPRACOWANIE WYNIKÓW
7. Z uzyskanych wartości należy wykreślić krzywą kalibracyjną jako funkcję pola powierzchni od stężenia WWA oraz podać równanie prostej.
8. Z krzywej kalibracyjnej odczytujemy wartości stężeń naftalenu w badanych próbkach w mg/ml. Dane wpisujemy do tabeli (pozycja D): A B C D E F G H Cint [mg/ml] Pole pow. Cinit Pole pow. CW CW [ mg/ml ] Masa początkowa [mg] Masa w roztworze CS – masa zaadsorbowana na glebie [mg/g] Kd
9. Obliczamy masę początkową (pozycja E), uwzględniając ilość ml branych do eksperymentu, oraz masę w roztworze w stanie równowagi ( CW – pozycja F). Z różnicy E- F, obliczamy masę zaadsorbowaną na jednostkę gleby, w naszym przypadku na 1 gram (pozycja G). Następnie należy wykonać wykres masy zaadsorbowanej od stężenia w roztworze. Z równania prostej odczytujemy współczynnik Kd , jako Cs= Kd CW.