Pobierz Zakład Medycyny Laboratoryjnej Katedra Mikrobiologii ... i więcej Notatki w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity!
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
PROTOKOŁY DO ĆWICZEŃ
ĆWICZENIE 1.
POMIAR ILOŚCI DROBNOUSTROJÓW
Metody bezpośredniego liczenia drobnoustrojów
A. Liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór BÜRKERA i THOMA Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem to najczęściej szklane płytki z wyciętym wgłę- bieniem, podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Po naniesieniu rozcieńcze- nia do komory dokonuje się liczenia komórek widocznych w obrazie mikroskopowym, a następnie przelicza się ich liczbę na 1 cm³ badanego materiału. Najczęściej stosuje się komory BÜRKERA i THOMA
Liczbę komórek (L) przelicza się według wzorów:
Komora Thoma: L = 4 x 10^6 an a - średnia liczba komórek w małym kwadracie n - rozcieńczenie badanej próby
Komora Bürkera: L = 2,5 x 10^5 an a - średnia liczba komórek w małym kwadracie n - rozcieńczenie badanej próbki
B. Mikroskopia fluorescencyjna (DEFT) Wykonanie oznaczenia obejmuje filtrowanie odpowiednio przygotowanej próby a następnie barwie- nie osiadłych na filtrze drobnoustrojów fluorescencyjnym barwnikiem (oranżem akrydyny) i policze- nie liczby bakterii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. W metodzie tej komórki żywe barwią się na kolor ZIELONY, natomiast martwe na kolor POMARAŃCZOWY.
Metody hodowlane stosowane do oznaczania liczby drobnoustrojów
A. Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL) Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą płytkową Metoda oznaczania liczby drobnoustrojów na podłożu stałym zakłada, że liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek w badanej próbie. Wynik podaje się w jednostkach tworzących kolonie - jtk (ang. CFU - colony forming units) w 1g lub 1 cm³ produktu.
a. posiewy wgłębne
Na płytki Petriego nanosi się po 1 cm³ wybranych kolejnych rozcieńczeń w dwóch powtórzeniach, a następnie wylewa się określone podłoże ogrzane do temp. 42-44°C w łaźni wodnej. W przypadku badania w kierunku bakterii mezofilnych płytki inkubuje się w 30°C przez 72 godziny lub w tempera- turach optymalnych dla wybranych grup drobnoustrojów. Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolej- nych rozcieńczeń, na których wyrosło od 30 do 300 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm³ lub 1 g próbki oblicza się wg wzoru:
L = C × d / (N1+ 0,1N2)
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
C - suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia N1 - liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia N2 - liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia d - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńczeniu
Do odczytu wyników, można wybrać jedno rozcieńczenie, zliczyć kolonie na płytkach z równoległych powtórzeń, wyliczyć średnią liczbę kolonii w rozcieńczeniu i przeliczyć na 1 cm³ lub 1 g próby, mno- żąc przez odwrotność rozcieńczenia.
b. posiewy powierzchniowe
Na płytki Petriego z zestalonym podłożem nanosi się po 0,1 cm³ wybranych, kolejnych rozcieńczeń próby w dwóch powtórzeniach. Materiał rozprowadza się jałową głaszczką na powierzchni całego podłoża, aż do wyschnięcia. Przy oznaczaniu liczby bakterii mezofilnych płytki inkubuje się w temp. 30°C przez 72 h, przy oznaczaniu innych grup drobnoustrojów należy stworzyć optymalne warunki temperaturowe i czasowe potrzebne do wzrostu drobnoustrojów. Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolejnych rozcieńczeń, na których wyrosło od 15 do 150 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm³ lub 1g próbki oblicza się wg wzoru:
L = C × d × a / (N1+0.1N2)
C - suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia N1 - liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia N2 - liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia d - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńczeniu a - współczynnik posianej ilości materiału przy posiewie 0,1 cm³, a=
SCHEMAT WYKONANIA ROZCIEŃCZEŃ I POSIEWÓW METODĄ WGŁĘBNĄ
I POWIERZCHNIOWĄ
Produkt badany ↓ 10 ml lub 10 mg produktu badanego + 90 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10¹) ↓ 1 ml rozcieńczenia 10¹ + 9 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10²) ↓ 1 ml rozcieńczenia 10² + 9 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10³) ↓ ↓ Posiew wgłębny (po 1 ml rozcieńczeń) Posiew powierzchniowy (po 0,1 ml rozcieńczeń)
B. Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą sączenia przez filtry membranowe Dla prób o niewielkiej liczbie drobnoustrojów można zastosować metodę polegającą na przesączeniu badanej próbki (np. określona objętość) przez sączek membranowy, a następnie położeniu sączka na podłożu stałym i po okresie inkubacji policzeniu kolonii wyrosłych na powierzchni sączka.
C. Określenie ilości bakterii na podstawie zmętnienia zawiesiny według skali McFarlanda Oryginalne standardy zawierają określone ilości chlorku baru i kwasu siarkowego razem. Mieszanie tych dwóch związków powoduje zmętnienie roztworu wskutek powstawania osadu siarczanu baru.
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
ĆWICZENIE 2.
OKREŚLENIE CECH METABOLICZNYCH DROBNOUSTROJÓW
A. Określenie zdolności proteolitycznych Posiew szczepów na bulion z żelatyną w celu wykrycia drobnoustrojów rozkładających żelatynę.
B. Określenie zdolności do rozkładu cukrów Posiew na podłoże Hugh-Leifsona - zdolność rozkładu glukozy Posiew na podłoże Kliglera - określenie zdolności do rozkładu glukozy, laktozy i produkcji H 2 S.
C. Określenie innych cech metabolicznych drobnoustrojów Posiew na wodę peptonową - określenie zdolności do reakcji Voges-Proskauera służącą do różnico- wania bakterii ze względu na zdolność do wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny).
Posiew na podłoże z mocznikiem wg Christensena - zdolność do rozkładu mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku.
Posiew na podłoże Simmonsa - zdolność do wykorzystywania cytrynianu jako źródła węgla.
Podłoże Hugh-Leifsona - pozwala określić właściwości sacharolityczne (wykrywanie tlenowego lub beztlenowego rozkładu cukrów) (Skład: 1% glukozy oraz błękit bromotymolowy) ⇒ Dwie probówki - po posiewie jedną pokrywa się szczelnie parafiną ⇒ Efekty: zmiana barwy z zielonej na żółtą w obu probówkach - fermentacja zmiana barwy tylko w probówce niepokrytej parafiną - utlenianie
Podłoże Kliglera - podłoże do szybkiej identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae (w oparciu o zdolność do rozkładu glukozy, laktozy, i redukcji tiosiarczanu do H 2 S) żółty skos i żółty słupek oznacza fermentację laktozy i glukozy, niezmieniona barwa podłoża oznacza brak fermentacji obu cukrów, czerwony skos i żółty słupek oznacza fermentację glukozy i brak fermentacji laktozy, zaczernienie podłoża oznacza wytwarzanie siarkowodoru, powstawanie gazu wewnątrz podłoża (niekiedy jego rozerwanie) wskazuje na wytwarzanie gazu.
Test Vogesa-Proskauera - należy do serii testów IMViC. Nazwa serii pochodzi od słów „Indole, Met- hyl Red, Voges-Proskauer i Citrate” (indol, czerwień metylowa, Voges-Proskauer i cytrynian). Są one stosowane głównie do rozróżniania bakterii z grupy coli, ale można ich także używać wobec innych organizmów należących do rodziny Enterobacteriaceae. Test Vogesa-Proskauera swoiście wykrywa obecność acetylometylokarbinolu (acetoiny). Związek ten jest wytwarzany przez określone mikroor- ganizmy podczas wzrostu na buforowanym bulionie peptonowo-glukozowym. Po dodaniu odczyn- ników Vogesa-Proskauera A i B do probówki zawierającej bulion MR-VP zawarty w niej acetylomety- lokarbinol zostanie utleniony do diacetylometylokarbinolu. Ten ostatni związek reaguje z kreatyną (z bulionu), tworząc związek o czerwonym zabarwieniu. Obecność tego związku jest wykrywana wizu- alnie i oznacza dodatni wynik testu.
Podłoże z mocznikiem Christensena - (barwa wyjściowa podłoża jest jasnożółta) służy do różnico- wania drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wykazujących zdolność hydrolizy mocznika. Pod- łoże zawiera mocznik jako jedyne źródło azotu i indykator – czerwień fenolową. Amoniak uwalniany podczas wzrostu bakterii silnie alkalizuje pożywkę, powodując zmianę jej barwy na fioletową.
Podłoże Simmonsa - jest podłożem hodowlanym służącym do odróżniania bakterii Gram-ujemnych na podstawie wykorzystania cytrynianu. Drobnoustroje mogące wykorzystywać dwuwodorofosforan
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
amonu i cytrynian sodu jako jedyne źródła odpowiednio azotu i węgla rosną na tym podłożu i wywo- łują reakcję zasadową, czego dowodzi zmiana koloru wskaźnika błękitu bromotymolowego z zielone- go (obojętne) na niebieskie (zasadowe).
Kontynuacja ćwiczenia 1 Odczyt wykonanych posiewów oraz interpretacja wyników.
Ćwiczenie 2 - karta zaliczeniowa
Test Escherichia coli Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae
Określenie zdolności proteo- litycznych szczepów
Określenie zdolności do rozkładu cukrów
Określenie zdolności do wytwarzania acetoiny
Określenie zdolności do rozkładu mocznika
Określenie zdolności wy- twarzania cytrynianu
Imię i nazwisko: Zaliczenie:
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
C. Określenie zdolności wyizolowanych szczepów Bacillus do produkcji enzymów proteolitycz- nych Powierzchnię płytki przesianej redukcyjnie z podłożem żelatynowym Fraziera zalać nasyconym roz- tworem siarczanu amonowego lub odczynnikiem Fraziera, zamknąć płytkę i pozostawić na 5 minut. Nadmiar płynu ostrożnie odpipetować. Obecność kolonii wokół których powstały strefy przejaśnienia świadczy o hydrolizie białka. Wzrost bakterii w probówce z 1% wodą peptonową w postaci zmętnienia, kożucha czy osadu świad- czy o aktywności proteolitycznej. Po dodaniu kilku kropel odczynnika Nesslera pojawienie się poma- rańczowej zabarwienia wskazuje na aktywność amonifikacyjną wyizolowanych szczepów.
D. Barwienie szczepu Bacillus sp. metodą Grama, wykrywanie przetrwalników oraz ich umiejsco- wienie w komórce.
Ćwiczenie 3 - karta zaliczeniowa
Rodzaj testu Szczep badany
Barwienie metodą GRAMA (obecność przetrwalników i ich umiejscowienie w komórce)
Zdolność do produkcji enzy- mów amylolitycznych
Zdolność do produkcji enzy- mów lipolitycznych
Zdolność do produkcji enzy- mów proteolitycznych (podłoże stałe)
Zdolność do produkcji enzy- mów proteolitycznych (podłoże płynne)
Imię i nazwisko: Zaliczenie:
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
ĆWICZENIE 4.
MIKROFLORA WYBRANYCH PRODUKTÓW ŻYWNOŚCIOWYCH
Mikroflora wybranych produktów żywnościowych wykonanie posiewów wybranych produktów spożywczych: kefir, ser pleśniowy, sok owocowy, mięso drobiowe, mleko odtłuszczone w proszku określenie bakterii kwaszących typu mlekowego oznaczanie liczby bakterii z grupy coli metodą płytkową wykrywanie obecności bakterii Campylobacter spp. oznaczanie liczby drożdży i pleśni metodą płytkową oznaczanie liczby drobnoustrojów tlenowych, mezofilnych metodą płytkową oznaczanie liczby gronkowców koagulazo-dodatnich oznaczanie liczby Bacillus cereus metodą płytkową
Kontynuacja ćwiczenia 3 Odczyt wykonanych poprzedniego dnia posiewów oraz wykonanie testów diagnostycznych służą- cych identyfikacji drobnoustrojów.
Określenie liczby bakterii kwaszących typu mlekowego wg. Normy PN-90-A-75052/07: Materiał badany: kefir, mleko odtłuszczone w proszku
Procedura:
Roztwór fizjologiczny z peptonem (10 g + 90 ml rozcieńczenia) ↓ Zmodyfikowane podłoże Blickfeldta - posiew metodą zalewową, inkubacja - 30° (24 h) ↓ Testy potwierdzające ↓ ↓ Test katalazy barwienie metodą Grama
Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli metodą płytkową wg normy PN-ISO 4832: Materiał badany: kefir, sok owocowy, mięso drobiowe, mleko odtłuszczone w proszku
Procedura:
Roztwór fizjologiczny z peptonem (10 g/ml + 90 ml rozcieńczenia) - zawiesina wyjściowa ↓ Agar z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i laktozą (VRBL) - posiew metodą zalewo- wą 2 etapową:
- 1 ml próbki produktu płynnego lub 1 ml zawiesiny wyjściowej przenieść na 2 płytki, zalać 15 ml pożywki VRBL o temp. 45°C. Po zestaleniu płytki zalać 4 ml pożywki VRBL o temp. 45°C (inkubacja odwróconych płytek - 37°C - 24 h)
- płytka kontrolna z pożywką (w przypadku mleka i produktów mlecznych) - inkubacja - 30°C - 24 h ↓ W przypadku obecności nietypowych kolonii pobrać 5 kolonii i posiać do probówek z bulionem z zielenią brylantową i żółcią (+ rurki Durhama) - inkubacja 37°C - 24 h
Wynik: Podłoże VRBL - ciemno-purpurowo-czerwone kolonie otoczone czerwoną strefą wytrącanej żółci (wynik+) Bulion z zielenią brylantową i żółcią + rurki Durhama - wynik + = gaz +
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
Oznaczanie liczby gronkowców koagulazo-dodatnich wg normy PN- EN ISO 6888:1:2001+A 1: Materiał badany: mleko odtłuszczone w proszku, ser pleśniowy, kefir
Procedura:
Roztwór fizjologiczny z peptonem ↓ Podłoże agar Baird-Parkera- posiew metodą powierzchniową po 0,1 ml zawiesiny na 2 płytki lub 1 ml zawiesiny na jedną dużą płytkę agarową ↓ Inkubacja 37°C - 24 h - 48h ↓ Z każdej płytki przenieść 5 kolonii typowych lub 5 kolonii nietypowych do bulionu mózgowo- sercowego - inkubacja 37°C- 24h ↓ Test koagulazy, Staphkit
Oznaczanie liczby Bacillus cereus metodą płytkową wg normy PN-EN ISO 7932: Materiał badany: sok owocowy, mleko w proszku, kefir, ser pleśniowy
Procedura:
Roztwór fizjologiczny z peptonem ↓ Podłoże agarowe MYP - rozprowadzić po 0,1 ml zawiesiny wyjściowej na 2 płytki z pożywką ↓ Inkubacja 30°C - 18-24 h ↓ 5 podejrzanych kolonii przesiewamy na agar z dodatkiem krwi baraniej ↓ Preparat barwiony metodą Grama
Wynik: Podłoże MYP - duże, różowe kolonie (zdolność do fermentacji mannitolu)otoczone strefą zmętnienia (wytwarzanie lecytynazy) Podłoże agar z dodatkiem krwi baraniej - zdolność do wytwarzania hemolizy
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
Ćwiczenie 4 - karta zaliczeniowa
Test Obserwacje i wnioski
Określenie liczby bakterii kwaszących
Określenie liczby bakterii z grupy coli
Wykrywanie obecności bakte- rii Campylobacter spp.
Określenie liczby drożdży i pleśni
Określenie liczby bakterii mezofilnych
Określenie liczby gronkow- ców koagulazo-dodatnich
Określenie liczby bakterii Bacillus cereus
Imię i nazwisko: Zaliczenie:
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
Wykonać wymaz z wewnętrznej strony dłoni, a następnie wymazówkę umieścić w kolbie z solą fi- zjologiczną i wytrząsać 5 minut. Pobrać po 1 cm³ popłuczyn i metodą umieścić na sterylnej płytce Petriego. Płytkę zalać upłynnionym agarem odżywczym i inkubować w temp. 30°C przez 72 go- dziny. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i przeliczyć na 40 cm³ płynu.
wykrywanie obecności gronkowców koagulazo-dodatnich Wykonać wymaz z wewnętrznej strony dłoni, a następnie wymazówkę umieścić w kolbie z solą fi- zjologiczną i wytrząsać 5 minut. Pobrać po 1 cm³ popłuczyn i posiać metodą powierzchniową na płytkę z podłożem Chapmana. Inkubować 37°C przez 24 h. Po inkubacji określić obecności żółtych kolonii, a następnie wykonać test koagulazy.
Wymagania:
Liczba bakterii tlenowych mezofilnych
Obecność gronkowców koagulazo-dodatnich Stopień czystości rąk <100 Nb. Ręce czyste 100 - 1000 Nb. Ręce dostatecznie czyste
1000 Nb. Ręce brudne
Analiza czystości opakowań określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych Do badanego naczynia np. butelki wlać 20 cm³ NaCl z dodatkiem 0,05 % tiosiarczanu sodu, który jest inaktywatorem pozostałości detergentów i środków dezynfekujących. Naczynie zamknąć kor- kiem a następnie ustawić w pozycji poziomej obracając ją płukać 20-krotnie całą jej powierzchnię. Po 1 cm³ popłuczyn przenieś na sterylną płytkę Petriego, po czym zalać upłynnionym agarem od- żywczym. Inkubować w temp.30°C przez 72 h. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i przeliczyć na 20 cm³ płynu płuczącego.
wykrywanie obecności pałeczek grupy coli Do badanego naczynia np. butelki wlać 20 cm³ NaCl z dodatkiem 0,05 % tiosiarczanu sodu, który jest inaktywatorem pozostałości detergentów i środków dezynfekujących. Naczynie zamknąć kor- kiem a następnie ustawić w pozycji poziomej obracając ją płukać 20-krotnie całą jej powierzchnię. Po 1 cm³ popłuczyn przenieść na podłoże MacConkey’a. Inkubować w temp. 30 °C przez 48 h.
Kontynuacja ćwiczenia 4 Odczyt wykonanych poprzedniego dnia posiewów oraz wykonanie testów diagnostycznych służą- cych identyfikacji drobnoustrojów.
Pojemność opakowania
Liczba bakterii tlenowych
Obecność pałeczek grupy coli
Stopień czystości 1 litr <1000 Nb. Dobry 1 litr <1500 Nb. Dostateczny 0,5 litra >500 Nb. Dobry 0,5 litra <750 Nb. Dostateczny 0,25 litra <200 Nb. Dobry 0,25 litra <500 Nb. dostateczny
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
Ćwiczenie 6 - karta zaliczeniowa
Test Obserwacje i wnioski
Określenie liczby bak- terii tlenowych rosną- cych w temp. 22 °C
Określenie liczby bak- terii tlenowych rosną- cych w temp.37°C
Określenie pałeczek grupy coli metodą filtrów membrano- wych
Określenie liczby pa- ciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus
Ocena czystości powie- trza metodą sedymen- tacyjna
Ocena czystości po- wierzchni z zastoso- waniem płytek kontak- towych (Count-tact)
Określenie liczby bak- terii tlenowych mezo- filnych na rękach
Wykrywanie obecności gronkowców koagula- zo-dodatnich na rękach
Określenie liczby bak- terii tlenowych mezo- filnych na opakowaniu
Wykrywanie obecności pałeczek grupy coli na opakowaniu
Imię i nazwisko: Zaliczenie:
Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej
Kontynuacja ćwiczenia 6 Odczyt wykonanych poprzedniego dnia posiewów.
Ćwiczenie 7 - karta zaliczeniowa
Ćwiczenie Obserwacje Wnioski
Immobilizacja laktazy
Pomiar glukozy za pomocą glukometru
Imię i nazwisko: Zaliczenie:
