Ocena wpływu wybranych czynników genetycznych na ..., Notatki z Fotografia

Pobierz Ocena wpływu wybranych czynników genetycznych na ... i więcej Notatki w PDF z Fotografia tylko na Docsity! Wydział Lekarski II Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Natalia Żuk Ocena wpływu wybranych czynników genetycznych na patomechanizm powstawania tętniaka aorty brzusznej Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotorzy: prof. dr hab. n. med. Wojciech Witkiewicz dr n. biol. Joanna Dubis Poznań 2014 2 Rozprawa doktorska jest częścią projektu „Wrovasc – Zintegrowane Centrum Medycyny Sercowo-Naczyniowej, współfinansowanego przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego, w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na lata 2007- 2013 realizowanego w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym we Wrocławiu, Ośrodku Badawczo-Rozwojowym, gdzie została w całości wykonana. 5 3.2.6. Oznaczanie aktywności TAFI w osoczu .............................................................. 42 3.2.7. Analiza statystyczna uzyskanych wyników ......................................................... 42 4. WYNIKI ............................................................................................................................. 45 4.1.Charakterystyka badanej populacji .................................................................................. 45 4.2.Wyniki oznaczeń polimorfizmów genetycznych ............................................................. 53 4.2.1. Polimorfizm 1858C/T genu PTPN22 ................................................................... 53 4.2.2. Polimorfizm -1123G/C genu PTPN22 ................................................................. 54 4.2.3. Polimorfizm 49A/G genu CTLA-4 ....................................................................... 55 4.2.4. Polimorfizm -455G/A genu FGB ......................................................................... 56 4.2.5. Polimorfizm -438G/A genu TAFI ........................................................................ 57 4.3. Średnica aorty ................................................................................................................. 60 4.4. Skrzeplina przyścienna ................................................................................................... 64 5. OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA ....................................................................... 68 6. WNIOSKI ........................................................................................................................... 89 7. STRESZCZENIE ............................................................................................................... 90 8. ABSTRACT ....................................................................................................................... 93 9. LITERATURA ................................................................................................................... 96 10. SPIS TABEL I RYCIN .................................................................................................... 111 11. ZAŁĄCZNIKI .................................................................................................................. 117 6 WYKAZ SKRÓTÓW AD średnica aorty (ang. aortic diameter) APC komórki prezentujące antygen (ang. antigen presenting cel) ASI wskaźnik wielkości aorty (ang. aortic size index) BSA powierzchnia ciała (ang. body surface area) CTLA-4 antygen 4 związany z cytotoksycznym limfocytem T (ang. cytotoxic T- lymphocyte antygen 4) ECM macierz zewnątrzkomórkowa (ang. extracellular matrix) EVAR wewnątrznaczyniowa technika zaopatrzenia tętniaka (ang. endovascular aneurysm repair) FReD domena analogiczna do fibrynogenu (ang. fibrynogen related domain) FRET fluorescencyjny rezonansowy transfer energii (ang. Förster/Fluorescent Resonanse Energy Transfer) GWAS badania asocjacyjne całego genomu (ang. genome-wide association study) H-W równowaga Hardy’ego-Weinberga ILT skrzeplina przyścienna (ang. intraluminal thrombus) ITAM motyw aktywacyjny receptora tyrozynowego (ang. immunoreceptor tyrosine- based activation motif) Lyp limfocytarna fosfataza tyrozynowa (ang. lymphoid tyrosine phosphatase) MHC układ zgodności tkankowej (ang. major histocompatibility complex) OR iloraz szans (ang. odds ratio) PCR łańcuchowa reakcja polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction) PTPN22 niereceptorowa fosfataza tyrozynowa typu 22 (ang. protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22) 7 RFLP polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism) SD odchylenie standardowe (ang. standard deviation) SNP polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism) TAB tętniak aorty brzusznej TAFI aktywowany przez trombinę inhibitor fibrynolizy (ang. thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) TK tomografia komputerowa VSMC komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych (ang. vascular smooth muscle cell) VW-SC/PC rezydentne/spoczynkowe macierzyste i progenitorowe komórki ścian naczyń krwionośnych (ang. vascular wall-resident stem cells/progenitor cells) NOMENKLATURA nazwy białek – czcionka prosta, np. CTLA-4 nazwy genów – kursywa, np. CTLA-4 oznacza gen kodujący białko CTLA-4 10 1.2. Epidemiologia Tętniaki aorty brzusznej występują od 3 do 8 razy częściej u mężczyzn niż u kobiet. Wśród pacjentek natomiast obserwuje się większą śmiertelność z powodu TAB w porównaniu z mężczyznami. Zapadalność na chorobę wzrasta wraz z wiekiem. Znane są jedynie pojedyncze doniesienia dotyczące występowania tętniaków u dzieci, w połączeniu z innymi wadami wrodzonymi. Częstość występowania TAB w Europie szacuje się na od 4% do 9% u mężczyzn i od 1% do 2% u kobiet w 65 roku życia i starszych. Wyniki najważniejszych badań epidemiologicznych, dotyczących występowania TAB, przedstawiono w Tabeli I. Pęknięcie TAB jest przyczyną śmierci od 1% do 2% mężczyzn w wieku powyżej 65 roku życia (Cornuz i wsp., 2004). Tabela I. Częstość występowania tętniaka aorty brzusznej w wybranych badaniach populacyjnych. Źródło: Zmodyfikowano na podstawie Cornuz i wsp., 2004. Populacja Liczba mężczyzn z TAB / bez TAB Częstość w % (95% CI) Liczba kobiet z TAB / bez TAB Częstość w % (95% CI) Oxford 23 / 426 5.4 (3.5 – 8.0) brak danych Gloucester 71 / 906 7.8 (6.2 – 9.8) brak danych Malmö 39 / 338 11.5 (8.3 – 15.4) brak danych Oslo 41 / 500 8.2 (5.9 – 11.0) brak danych Freemantle 31 / 654 4.7 (3.2 – 6.7) 2 / 571 0.35 (0.04 – 1.3) Birmingham 706 / 9771 7.2 (6.7 – 7.8) brak danych Rotterdam 91 / 2217 4.1 (3.3 – 5.0) 21 / 3066 0.68 (0.42 – 1.0) Genoa 65 / 741 8.8 (6.8 – 11.0) 5 / 860 0.58 (0.19 – 1.4) Chichester 178 / 2342 7.6 (6.6 – 8.7) 40 / 3052 1.3 (0.9 – 1.8) Viborg 141 / 3344 4.2 (3.6 – 4.9) brak danych USA Counties 278 / 1956 14.2 (12.7 – 15.8) 173 / 2785 6.2 (5.3 – 7.2) USA Veterans 3298 / 71373 4.6 (4.5 – 4.8) 25 / 2885 1.3 (0.8 – 1.8) Asola u 354 mężczyzn i 294 kobiet wykryto 20 TAB; częstość 3.1% (95% CI:1.9– 4.7) Edinburgh w grupie 1156 osób wykryto 34 TAB; częstość 2.9% (95% CI: 2.0 – 4.1) 11 W trakcie rekrutowania grupy kontrolnej do badań będących przedmiotem niniejszej rozprawy, przeprowadzona została ultrasonograficzna ocena średnicy aorty brzusznej w grupie 272 mężczyzn powyżej 60 roku życia. Wstępne rozpoznanie TAB postawiono u 11 spośród przebadanych osób, co stanowi 4% przebadanej populacji. Wyniki badań epidemiologicznych dowodzą, że już dziś TAB jest istotnym problemem medycznym, a biorąc pod uwagę postępujące starzenie się społeczeństw, można spodziewać się coraz większej zapadalności na tę chorobę. 1.3. Etiologia i czynniki ryzyka TAB jest chorobą wieloczynnikową, w przebiegu której nierozpoznane jak dotąd czynniki endo- i egzogenne zapoczątkowują i modulują proces patologicznego poszerzania się ściany aorty. Główne czynniki ryzyka, o udowodnionym i opisanym wpływie na powstawanie i rozwój TAB, to: płeć męska, zaawansowany wiek, rasa kaukazoidalna, palenie papierosów, nadciśnienie tętnicze, dyslipidemia, miażdżyca, przewlekła obturacyjna choroba płuc oraz dodatni wywiad rodzinny w kierunku występowania tętniaków aorty (Cornuz i wsp., 2004). Tętniak aorty może rozwinąć się w przebiegu różnych chorób, do których należą: choroby degeneracyjne (martwica torbielowata błony środkowej, tętniak rozwarstwiający aorty), zaburzenia rozwojowe (zespół Marfana, Loeysa-Dietza, Ehlersa – Danlosa typu IV), wrodzone wady budowy naczyń i choroby zakaźne takie jak salmonelloza. Publikowane są również doniesienia dokumentujące związek TAB z zakażeniami wywoływanymi przez drobnoustroje z gatunków Chlamydia pneumoniae, Treponema pallidium czy z rodzaju Staphylococcus. Występowanie TAB zaobserwowano również w przebiegu szeregu chorób autoimmunizacyjnych takich jak: toczeń rumieniowaty układowy, reumatoidalne zapalenie stawów, sarkoidoza, olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic, reaktywne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, nawracające zapalenie chrząstek, zespół Takayasu, choroba Behçeta czy zespół Cogana (Jagadesham i wsp., 2008, Witkiewicz i wsp., 2005). Stosunkowo mało wiadomo o kaskadzie czynników i procesów zapoczątkowujących rozwój chorób autoimmunizacyjnych. Grupa ta obejmuje około 80 jednostek chorobowych, przeważnie przewlekłych, niepomyślnie rokujących. Uwarunkowana genetycznie, nieprawidłowa prezentacja autoantygenów i błędna identyfikacja komórek własnych, skutkująca zmniejszeniem tolerancji immunologicznej, predysponuje do rozwoju tych 12 schorzeń (Miller i wsp., 2012). Możliwy wpływ niewłaściwej odpowiedzi układu immunologicznego na rozwój TAB opisywany jest odkąd w ścianach tętniaków zaobserwowano obecność nacieków zapalnych. Kolejne sygnały, przemawiające za hipotezą autoimmunologicznego pochodzenia TAB, to wykryte w ścianach chorobowo zmienionego naczynia ciałka Russela, podwyższone stężenie cytokin i znacznie podwyższone stężenia autoantyprzeciwciał i szeregu innych immunoglobulin w porównaniu ze zdrowymi tętnicami. Od tego czasu liczni badacze podejmują temat nieprawidłowej odpowiedzi immunologicznej towarzyszącej tętniakom i jej znaczenia w etiologii choroby (Brophy i wsp., 1991, Lindholt i Shi, 2006). Pomimo wielu badań, prowadzonych zarówno w materiale ludzkim jak i na modelu zwierzęcym, etiologia TAB jest wciąż słabo zdefiniowana. Niemniej jednak autorzy aktualnych publikacji poświęconych temu zagadnieniu zgadzają się co do połączonego wpływu czynników środowiskowych i genetycznych na powstawanie i rozwój tej choroby. 1.4. Patofizjologia Aorta jest tętnicą typu sprężystego. Poza transportem krwi wyrzucanej z lewej komory, jej głównym zadaniem jest amortyzacja i zamiana pulsacyjnego przepływu krwi, wynikającego z pracy mięśnia sercowego, w przepływ ciągły, występujący w częściach obwodowych układu tętniczego. Pełniona funkcja jest przyczyną różnic występujących w strukturze ściany tętnic wraz z oddalaniem się od serca. W budowie ściany aorty wyróżnia się trzy główne warstwy: wewnętrzną (łac. tunica intima s. communis), środkową (łac. t. media s. propria) i zewnętrzną (łac. t. cellulosa s. adventitia). Schemat budowy prawidłowej aorty przedstawiono na Rycinie 2 (Young, 2011). 15 przedstawiono na Ryc. 3. Reakcja zapalna towarzyszy prawie wszystkim tętniakom, a jej nasilenie może być tak duże, że obejmuje również struktury leżące w bezpośrednim sąsiedztwie naczynia. Taki tętniak jest wówczas określany jako zapalny (Drożdż i wsp., 2014, Rubio-Ruiz, 2014). Ryc. 3. Schemat rozwoju tętniaka aorty brzusznej i towarzyszących mu zmian w ścianie aorty. Źródło: zmodyfikowano za Hallenthal i wsp., 2009. Obrazowi klinicznemu TAB najczęściej towarzyszy obecność blaszek miażdżycowych. Do niedawna miażdżyca była rozpatrywana jako czynnik ryzyka wystąpienia i rozwoju choroby, a tętniaki nazywane bywały „miażdżycowymi”. Pomimo, iż jeszcze w 2011 roku opublikowano artykuł w którym TAB nazywany jest „szczególną formą miażdżycy”, to dotychczas nie znaleziono przekonywujących dowodów na to, że zmiany miażdżycowe są przyczyną jego powstawania (Michel i wsp., 2011). Dowiedziono natomiast różnic w patogenezie tych chorób. Od ponad dekady przeważa opinia, że są to dwie odrębne jednostki chorobowe, posiadające szereg wspólnych czynników ryzyka i często współistniejące (Carrell i wsp., 2002, Tilson, 1992, Xu i wsp., 2001). Ponieważ tętnice nerkowe przejmują znaczną ilość krwi (do 19%), jej objętościowy przepływ ulega zdecydowanemu zmniejszeniu w odcinku podnerkowym, co może tłumaczyć zmniejszenie średnicy i grubości ścian aorty występujące w tym miejscu. Powoduje to 16 osłabienie struktury, przez co odcinek brzuszny może być bardziej narażony na powstawanie tętniaków aorty. Z kolei rozwidlenie na tętnice biodrowe wspólne charakteryzuje się zmniejszeniem sumarycznych powierzchni przekrojów poprzecznych naczyń. W połączeniu z podwyższonym ciśnieniem, wywoływanym falami krwi odbitymi od rozwidlenia, tworzy to niekorzystne warunki hemodynamiczne w tym odcinku. Jednocześnie, większości TAB towarzyszy skrzeplina przyścienna, która powoduje zmianę rozkładu naprężeń biomechanicznych wywieranych na ścianę naczynia ale także zmianę charakteru przepływu krwi, co wpływa na całokształt miejscowych warunków hemodynamicznych. Fotografia zamieszczona na Rycinie 4 przedstawia skrzeplinę przyścienną usuniętą ze środkowej części TAB o maksymalnej średnicy wynoszącej 6 cm (Humphrey i Holzapfel, 2012). Ryc. 4. Przekrój poprzeczny skrzepliny przyściennej tętniaka aorty brzusznej. Źródło: fotografia własna TAB powstaje na skutek połączonego w nieznany sposób działania czynników ryzyka oraz zmian w fizjologii, zarówno związanych z naturalnym procesem starzenia jak i patologicznych, u osoby predysponowanej genetycznie. W zależności od konfiguracji tych składowych inaczej będzie przebiegała naturalna historia choroby. Tempo wzrostu i ryzyko pęknięcia TAB bywa bardzo zróżnicowane. Zdarzają się bowiem zarówno pęknięte tętniaki niewielkich rozmiarów jak i duże tętniaki bezobjawowe, nie wykazujące cech pękania pomimo znacznej średnicy lub wykrywane po zgonie pacjenta z innych przyczyn. 17 1.5. Stadium przedkliniczne i kliniczne TAB najczęściej rozwija się bezobjawowo i wykrywany jest przypadkowo w trakcie badania fizycznego lub diagnostyki obrazowej przeprowadzanej z powodu innych wskazań. Symptomami, jakie mogą się pojawić w przypadku tętniaków objawowych, są: ból w nadbrzuszu lub w okolicy lędźwiowo-krzyżowej określany najczęściej jako „gniotący”, uczucie „tętnienia” w jamie brzusznej, uczucie pełności w okolicach nadbrzusza i rzadziej wymioty spowodowane uciskiem tętniaka na dwunastnicę (Noszczyk, 2007). Leczenie zachowawcze TAB obejmuje modyfikowalne czynniki ryzyka i dotyczy głównie zaprzestania palenia papierosów, normalizacji i/lub kontroli ciśnienia tętniczego, profilu lipidowego i masy ciała oraz unikania nadmiernego wysiłku fizycznego. Ponieważ ryzyko pęknięcia tętniaka rośnie wraz ze wzrostem jego średnicy, niewielki tętniak wymaga monitorowania rozmiarów i tempa powiększania się czyli okresowego wykonywania badań obrazowych. Za graniczne rozmiary przyjęto średnicę 5.0 cm u mężczyzn i 4.5 cm u kobiet. Po ich przekroczeniu pacjent, po oszacowaniu indywidualnego ryzyka zabiegu w porównaniu z ryzykiem pęknięcia tętniaka, kwalifikowany jest do leczenia operacyjnego. Operacyjne leczenie jest także rozważane w przypadku tempa powiększania > 10 mm/rok (Moll i wsp., 2011). Otwarty zabieg naprawczy polega na wyłączeniu tętniakowato poszerzonego odcinka naczynia z krwioobiegu za pomocą protezy naczyniowej. Drugą możliwością jest endowaskularna technika zaopatrzenia tętniaka z użyciem stentgraftów (EVAR, ang. endovascular aneurysm repair). W tym celu stosowane są stentgrafty wykonane z dakronu lub politetrafluoroetylenu, w celu uszczelnienia powlekane kolagenem, charakteryzujące się układem włókien maksymalizującym trwałość zespolenia i powierzchnią ułatwiającą porastanie protezy tkanką. Wybór metody leczenia jest dobierany indywidualnie dla każdego pacjenta. Obecnie metodą z wyboru w zakresie leczenia operacyjnego TAB jest EVAR, a w przypadku kiedy pacjent nie spełnia kryteriów implantacyjnych i nie może być zakwalifikowany do leczenia wewnątrznaczyniowego, przeprowadzana jest otwarta operacja naprawcza (Szostek i wsp., 1993, Noszczyk, 2007, Filardo i wsp., 2012). Nieleczony TAB zagraża pęknięciem, które może skutkować krwotokiem prowadzącym do zgonu. Pęknięty tętniak manifestuje się silnym bólem, może wystąpić również wstrząs i utrata przytomności. Pęknięcie tętniaka związane jest ze śmiertelnością okołooperacyjną wynoszącą od 50 do 80%, podczas gdy profilaktyczna operacja naprawcza jest obarczona stosunkowo niewielkim ryzykiem okołooperacyjnych powikłań śmiertelnych (Verhoeven i wsp., 2008). 20 i wsp., 2009). Wynik ten nie miał jednak mocy statystycznej i nie udało się go odtworzyć w niezależnej próbie (Jones i wsp., 2009). Zaledwie rok później, w odpowiednio dużym GWAS, wykazano zależność pomiędzy wariantem genu DAB2IP a ryzykiem wystąpienia TAB. Gen ten znajduje się na chromosomie 3p12.3 i koduje inhibitor cyklu komórkowego. Udowodniono, że obecność wariantu rs7025486[A] w genie DAB2IP wiąże się z 20% zwiększeniem ryzyka wystąpienia TAB (OR=1.21; p=4.6 x 10 -10 ) (Gretarsdottir i wsp,. 2010). Stwierdzono również częstsze występowanie wariantu allelicznego D, powstałego przez delecję w intronie 16 genu ACE kodującego konwertazę angiotensyny. W grupie pacjentów normotensyjnych z tętniakiem odsetek homozygot DD wynosił 70% w porównaniu z 32% wśród osób z nadciśnieniem tętniczym i TAB (Pola i wsp., 2001). Z kolei wariant rs1075727[G], zlokalizowany na chromosomie 9p21, jest związany ze zwiększeniem szansy na wystąpienie TAB o OR=1.31 (p=1.2 x 10 -12 ) (Helgadottir i wsp., 2008). Podejmowano również próby znalezienia genetycznych uwarunkowań TAB poprzez analizę sprzężeń, polegającą na śledzeniu sposobu dziedziczenia markera w rodzinach z rozpoznanymi przypadkami tętniaka. Pierwsze takie badanie obejmowało 48 rodzin, u których oznaczano markery dla 3 genów kandydujących (BHMT, COL1A2 i CTSH), jednak nie odnotowano zależności z zapadalnością na TAB (van Vlijmen – van Keulen i wsp., 2003). 1.7. Badanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w TAB Jedną z dróg prowadzących do odkrycia złożonych mechanizmów predysponujących do wystąpienia choroby bądź przyczyniających się do jej rozwoju są badania molekularne. Identyfikacja genów i mutacji biorących udział w patofizjologii człowieka jest jednym z kluczowych celów współczesnej genetyki. Metody biologii molekularnej pozwalają pośrednio lub bezpośrednio badać zmienność genetyczną człowieka, za którą w głównej mierze odpowiadają polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNPs, ang. Single Nucleotide Polymorphisms). SNP to zmiana nukleotydu (mutacja) w określonej lokalizacji w genomie, występująca w populacji z częstością ponad 1%. Większość tych zmian występuje w sekwencjach niekodujących. Jeśli jednak dotyczą regionów kodujących lub regulatorowych, mogą powodować zmiany strukturalne i funkcjonalne w produkcie białkowym genu, zmiany ekspresji informacji genetycznej czy zaburzenia mechanizmów sterujących podziałem i rozwojem komórkowym (Børsting i Morling, 2013). 21 Dotychczasowe wyniki poszukiwań genów, których mutacje przyczyniają się do podwyższenia ryzyka rozwoju TAB dowodzą, że jest to choroba uwarunkowana wielogenowo. Wpływ czynników środowiskowych jest także bardzo niejednorodny tak samo jak obraz kliniczny choroby. Zróżnicowanie to skłania do poszukiwań molekularnych markerów podatności osobniczej, pozwalających na określenie indywidualnego ryzyka zachorowania. Badania SNPs mogą także przynieść inne korzyści. Ze względu na heterogenność TAB, niewykluczona jest obecność podtypów choroby, których określenie ułatwiłoby badania nad jej etiologią, a być może także wyłonienie grup ryzyka dla których zasadne byłoby stosowanie odmiennych kryteriów leczenia i kwalifikacji do profilaktycznej operacji. Przegląd wyników badań i metaanaliz opublikowanych w ostatniej dekadzie pozwala sądzić, że wyniki genotypowania będą stanowiły naturalne uzupełnienie klasycznej oceny kryteriów klinicznych. Geny PTPN22, CTLA-4, FGB oraz TAFI i ich SNPs wytypowano do badania ze względu na biologiczne funkcje, które omówiono poniżej, potencjalnie łączące je z występowaniem TAB. W świetle aktualnie dostępnego, światowego piśmiennictwa, występowanie wybranych wariantów polimorficznych genów PTPN22, CTLA-4 i TAFI nie było dotąd badane w TAB. 1.7.1. Gen PTPN22 kodujący niereceptorową fosfatazę tyrozynową typu 22 Gen PTPN22 (ang. protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22, niereceptorowa fosfataza tyrozynowa typu 22) jest położony na krótkim ramieniu chromosomu 1 w regionie p13.2. Składa się z 22 egzonów i jest ekspresjonowany na powierzchni komórek krwiotwórczych (Hendriks i Pulido, 2013). Najwyższy poziom ekspresji wykazują komórki NK, limfoblasty CD105+ i neutrofile, natomiast najniższy limfocyty T CD4+ i monocyty (Burn i wsp., 2011, Cloutier i Veillette, 1999). Koduje trzy warianty wpływające na składanie genu limfocytarnej fosfatazy tyrozynowej (ang. lymphoid tyrosine phosphatase, Lyp), spośród których najczęściej występuje izoforma Lyp1 o długości 807 aminokwasów i masie cząsteczkowej około 110 kDa. Lyp1 znajduje się w cytoplazmie limfocytów T i jest zaangażowana w stosunkowo słabo poznane szlaki sygnałowe komórki. Na jej N-końcu znajduje się domena katalityczna, natomiast w regonie C-końcowym usytuowane są cztery motywy bogate w prolinę (P1-P4). Pierwszy spośród nich wykazuje wysokie powinowactwo do domeny SH3 kinazy Csk, z którą wspólnie hamują aktywację 22 komórek T. Izoforma Lyp2 zawiera tylko jedną domenę bogatą w prolinę P1, natomiast Lyp3 nie posiada 28 aminokwasów pomiędzy P1 i P2. Rola form Lyp2 i Lyp3 nie została dotąd poznana (Begovich i wsp., 2004, Burn i wsp., 2011). Szczególnie dużo miejsca w literaturze poświęcone jest wariantowi polimorficznemu 1858C/T genu PTPN22, którego częstość występowania opisywana jest w zakresie od 15% do 19% w odmianie kaukaskiej. Zmiana cytozyny na tyminę w pozycji 1858 skutkuje zmianą argininy na tryptofan w pozycji 620 produktu białkowego. Substytucja ta uniemożliwia wiązanie się enzymu z domeną SH3 kinazy Csk, co z kolei hamuje inaktywację wewnątrzkomórkowej kinazy fosforylowej Lck, fosforylującej reszty tyrozynowe specyficznych motywów ITAM (ang. immunoreceptor tyrosine-based activation motif, motyw aktywacyjny receptora tyrozynowego) cząsteczek CD3. Efektem końcowym jest zaburzenie przekazywania sygnału do wnętrza limfocytów T, co może skutkować zwiększeniem ryzyka rozwoju odpowiedzi immunologicznej (Burn i wsp., 2011, Gregersen i wsp., 2006). Obecność allelu 1858T PTPN22 może także powodować nadmierną reakcję limfocytów B i ich kumulację. Wykazano związek tego SNP z występowaniem szeregu chorób o podłożu autoimmunologicznym takich jak cukrzyca typu 1 (Bottini i wsp., 2004, Tang i wsp., 2012), reumatoidalne zapalenie stawów (Begovich i wsp., 2004), toczeń rumieniowaty układowy (Kyogoku i wsp., 2004), choroba Gravesa-Basedowa (Velaga i wsp., 2004), miastenia (Vandiedonck i wsp., 2006), choroba Addisona (Roycroft i wsp., 2009), zapalenie tarczycy Hashimoto (Criswel i wsp., 2005), pierwotny niedobór przeciwciał, bielactwo nabyte czy twardzina układowa (Fousteri i wsp., 2013, Menard i wsp., 2011, Vang i wsp., 2007). Z kolei SNP -1123G/C zlokalizowany jest w regionie promotorowym genu PTPN22. Wykazano jego związek z występowaniem cukrzycy typu 1 (Liu i wsp., 2012), reumatoidalnego zapalenia stawów (Huang i wsp., 2012), choroby Gravesa-Basedowa (Yu i wsp., 2008), zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (Huang i wsp., 2014) oraz wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (Chen i wsp., 2013). Gen PTPN22 jest, obok genów układu zgodności tkankowej MHC (ang. major histocompatibility complex), jednym z najsilniejszych genów-kandydatów, rozpatrywanych w badaniu etiologii chorób, w których rozwój zaangażowana jest nieprawidłowa odpowiedź immunologiczna. Czyni go to również potencjalnym kandydatem do udziału w rozwoju TAB. 25 A: odłączenie peptydu aktywacyjnego z udziałem niepoznanej dotąd proteazy; B: aktywacja TAFI przez kompleks trombina/trombomodulina; C: spontaniczna zmiana konformacji, potencjalnie odwracalna. Ryc. 5. Schemat przedstawiający organizację genu TAFI i mechanizm powstawania aktywnej (TAFIa) i nieaktywnej (TAFIai) formy jego produktu białkowego. Źródło: zmodyfikowano na podstawie Bajzar, 2000. TAFIa wykazuje działanie karboksypeptydazy i w początkowym etapie fibrynolizy odszczepia reszty aminokwasowe lizyny i argininy z C-końca łańcucha α-fibryny. Powoduje to ograniczenie zdolności wiązania plazminy do fibrynogenu (Bajzar i wsp., 2004). Zaburzenia w funkcjonowaniu układu fibrynolitycznego mogą być powodowane zarówno niedoborem jak i wzrostem stężenia i aktywności TAFIa. Niedobór może zwiększać skłonność do krwawień, z kolei nadmiar powoduje tendencję prozakrzepową, wynikającą z hamowania degradacji fibryny (Chapin i Hajjar, 2014). W literaturze przedstawiane są najczęściej trzy polimorfizmy genu TAFI, mogące wpływać na stężenie TAFI we krwi (Shi i wsp., 2014). Pierwszy z nich to SNP 1040C/T, powodujący podstawienie alaniny treoniną w pozycji 147 produktu białkowego. Opisano jego związek z występowaniem choroby niedokrwiennej serca, zawału mięśnia sercowego, udaru mózgu oraz dyslipidemii (Juhan-Vague i wsp., 2002, Morange i wsp., 2003, Santos i wsp., 2014). W 2014 roku opublikowano wyniki badania asocjacji polimorfizmu 1040C/T genu TAFI z TAB przeprowadzonego wśród uczestników brytyjskiego badania 26 epidemiologicznego LEADS (ang. Leeds Aneurysm Development Study). Wykazano brak statystycznie istotnej różnicy pomiędzy rozkładem genotypów w grupie badanej i kontrolnej dla tego wariantu polimorficznego (Bridge i wsp., 2014). Drugi polimorfizm to 505G/A, skutkujący zamianą treoniny na izoleucynę w pozycji 325 białka, którego obecność powiązano ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia zakrzepicy żył głębokich (Martini i wsp., 2006). Kolejny wariant polimorficzny to -438G/A, wykazujący związek ze wzrostem śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych wśród mężczyzn (Reiner i wsp. 2005,). W szeregu badań udowodniono występowanie związku pomiędzy genetycznie uwarunkowanymi zaburzeniami procesów krzepnięcia i fibrynolizy a zapadalnością na choroby sercowo-naczyniowe. Nieprawidłowości w układzie hemostazy oraz proces zapalny odgrywają istotna rolę także w patogenezie TAB. Ponieważ TAFI bierze udział zarówno w utrzymywaniu homeostazy pomiędzy układami krzepnięcia i fibrynolizy jak również w procesach zapalnych, wzbudza zainteresowanie badaczy jako potencjalny czynnik ryzyka ChSN. 1.7.4. Gen FGB kodujący łańcuch β fibrynogenu Kolejną cząsteczką, biorącą udział w procesie krzepnięcia krwi a także w reakcji zapalnej, jest syntetyzowany w hepatocytach fibrynogen (Davalos i wsp., 2012). Strukturalnie jest to homodimer, złożony z dwóch podjednostek połączonych mostkiem disiarczkowym. Obydwie podjednostki zbudowane są z łańcuchów polipeptydowych Aα, Bβ i γ, kodowanych przez geny FGA, FGB i FGG, zlokalizowane na chromosomie 4 w pozycji q31.3 (Tousoulis i wsp., 2011). Każdy łańcuch posiada charakterystyczną C-końcową domenę FReD (ang. fibrynogen related domain, domena analogiczna do fibrynogenu), nadającą mu zdolność rozpoznawania i wiązania innych cząsteczek oraz biorącą udział w formowaniu skrzepu (Doolittle i wsp., 2012). Fibrynogen odgrywa kluczową rolę w procesie krzepnięcia krwi. W końcowej fazie kaskady krzepnięcia rozpuszczalny fibrynogen przekształca się w nierozpuszczalne włókna fibryny. Proces ten zachodzi przy udziale trombiny, która hydrolizuje wiązania pomiędzy Arg16 i Gly17 łańcucha Aα i Arg14 i Gly17 łańcucha Bβ fibrynogenu, co powoduje odszczepienie dwóch par fibrynopeptydów A (FPA) i B (FPB). Powstałe w ten sposób monomery fibryny agregują i tworzą protofibryle, a następnie włókna i pęczki włókien fibryny. Włókna fibryny łączą się ze sobą w strukturę trójwymiarowego żelu fibrynowego, który wraz z agregatami płytek krwi tworzy czop hamujący krwawienie 27 (Blombäck, 1996). Poza rolą w procesie krzepnięcia krwi fibrynogen bierze udział w reakcjach odpornościowych organizmu i jest zaliczany do białek ostrej fazy, a jego synteza wzrasta w odpowiedzi na działanie mediatorów stanu zapalnego takich jak cytokiny. Działanie prozapalne fibrynogenu związane jest z jego możliwością łączenia się za pomocą domen FReD z komórkami systemu odpornościowego na zasadzie ligand-receptor. Fibrynogen wiąże się z receptorami powierzchniowymi leukocytów. Może się też wiązać z komórkami śródbłonka naczyniowego za pośrednictwem ICAM-1 lub VE-kadheryn dla których jest ligandem, a ponieważ wykazuje znaczne powinowactwo do leukocytów, sprzyja ich adhezji na powierzchni endotelium, co związane jest ze stanem zapalnym (Davalos i wsp., 2012, Doolittle i wsp., 2012). Już w roku 1980, w publikacji prezentującej wczesne wyniki badania Northwick Park Heart Study, wykazano związek pomiędzy wysokim stężeniem fibrynogenu w osoczu a występowaniem choroby niedokrwiennej serca (Meade i wsp., 1980). Związek ten został potwierdzony w licznych późniejszych badaniach populacyjnych. Rezultaty takich programów badawczych jak PROCAM (ang. Prospective Cardiovascular Munter Study), ECAT AP (ang. European Concerted Action in Thrombosis Angina Pectoris), ARIC (ang. Atherosclerosis Risk in Communites) czy CARDIA (ang. Coronary Risk Development in Young Adults) dowodzą, że fibrynogen jest niezależnym czynnikiem powikłań sercowo- naczyniowych. Metaanaliza przeprowadzona przez zespół Fibrinogen Studies Collaboration, podsumowująca efekty 31 badań prospektywnych, w których uczestniczyło łącznie 154 211 osób, wykazała związek zwiększonego stężenia fibrynogenu z wystąpieniem choroby niedokrwiennej serca, udarem mózgu (zwłaszcza niedokrwiennym), śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych innych niż choroba niedokrwienna czy udar mózgu. Dodatkowo opisano także wpływ stężenia osoczowego fibrynogenu na śmiertelność z przyczyn innych niż sercowo-naczyniowe (głównie choroby nowotworowe) u osób w średnim wieku i starszych. Nadmiar fibrynogenu zaobserwowano także w przebiegu kolagenoz czyli autoimmunizacyjnych chorób tkanki łącznej (Danesh i wsp., 2005, Kaptoge i wsp., 2007). Wzrost stężenia fibrynogenu zależy zarówno od jego zwiększonej produkcji jak i od zwolnionej degradacji. Na podwyższenie stężenia fibrynogenu w osoczu wpływają takie czynniki jak: zaawansowany wiek, nadciśnienie tętnicze, otyłość, cukrzyca, dyslipidemia, nikotynizm czy stan zapalny. Obserwowane zmiany stężenia mogą być również przejawem zmienności genetycznej (Lim i wsp., 2003). W obrębie genu dla łańcucha β ludzkiego 30 3. MATERIAŁ I METODY 3.1. Charakterystyka uczestników badania 3.1.1. Grupa badana Do grupy badanej włączono 305 pacjentów hospitalizowanych w latach 2010 - 2014 na Oddziale Chirurgii Naczyniowej Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego we Wrocławiu, Ośrodka Badawczo-Rozwojowego, spośród których 298 chorych przyjętych było w trybie planowym celem operacyjnego leczenia tętniaka aorty brzusznej, a pozostałe 7 osób operowanych było w trybie pilnym z powodu pękniętego TAB. W grupie pacjentów tętniakowato poszerzoną aortę stwierdzano w badaniu USG i/lub angio – TK jamy brzusznej, a u wszystkich chorych ostateczne potwierdzenie diagnozy miało miejsce śródoperacyjnie. Rekrutację uczestników badania podjęto po przygotowaniu protokołu wraz z wyspecyfikowaniem istotnych elementów determinujących kwalifikacje osób do badań. Kryteria włączenia do badania:  rasa kaukaska,  pisemna świadoma zgoda pacjenta na udział w badaniu oraz izolowanie i przechowywanie DNA,  wiek powyżej 18 roku życia,  potwierdzone śródoperacyjnie rozpoznanie TAB. Kryteria wyłączenia z badania:  rasa inna niż kaukaska,  brak pisemnej świadomej zgody na udział w badaniu oraz izolowanie i przechowywanie DNA,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby genetycznej z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby autoimmunizacyjnej i przewlekłych chorób zapalnych z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby nowotworowej z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia. 31 Z grupy badanej na podstawie kryteriów wyłączenia wykluczono: 12 osób ze względu na rozpoznanie choroby nowotworowej, 7 osób w związku z występowaniem choroby autoimmunizacyjnej (reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca, choroba Crohna- Leśniewskiego), 11 osób w związku z występowaniem choroby autoimmunizacyjnej lub nowotworowej wśród krewnych I stopnia i 1 pacjenta ze względu na podejrzenie zespołu Marfana. Ostatecznie do badania włączono 274 pacjentów. Wszyscy badani zapoznali się z „Informacją dla Pacjenta” dotyczącą celu i przebiegu badania i podpisali świadomą zgodę na udział w badaniu z uwzględnieniem badań molekularnych i przechowywania materiału genetycznego (Załączniki 2 i 3). Częściej stosowanym sposobem zaopatrzenia TAB było wszczepienie wewnątrznaczyniowej protezy samorozprężalnej z dostępu przez naczynia obwodowe (69%). U wszystkich chorych wszczepienie stentgraftów powiodło się. Stosowano dwa typy stentgraftów: Excluder (W.L. Gore) i Zenith (Cook Inc.). W trakcie żadnego z zabiegów nie zaszła potrzeba tzw. konwersji chirurgicznej. W okresie okołooperacyjnym (30 dni) do powikłań pooperacyjnych doszło u 25 chorych. Stwierdzono 8 zgonów: 3 zgony spowodowane krwawieniem do przestrzeni zaotrzewnowej, 2 z powodu niewydolności oddechowej, 2 z powodu nagłego zatrzymania krążenia i 1 z powodu ogólnoustrojowej reakcji zapalnej (sepsy). Wczesne powikłania pooperacyjne niepowikłane śmiercią, jakie odnotowano w badanej grupie, to: krwotok tętniczy spowodowany nieszczelnością protezy naczyniowej, ostre niedokrwienie kończyny dolnej, zawał mięśnia sercowego oraz zakażenie rany pooperacyjnej. Przed opuszczeniem szpitala wszyscy chorzy mieli wykonane badanie USG metodą doppler-duplex, w którym nie stwierdzono nieprawidłowości. 3.1.2. Grupa kontrolna Do grupy kontrolnej włączono 250 wolontariuszy zakwalifikowanych w trakcie „białych sobót” przeprowadzonych w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym we Wrocławiu, Ośrodku Badawczo-Rozwojowym pod hasłem: „Wczesne Wykrywanie Tętniaka Aorty Brzusznej” na przełomie marca i lutego 2013 roku. Każdy ochotnik miał ultrasonograficznie potwierdzony prawidłowy przebieg aorty i zwymiarowaną średnicę naczynia. Rekrutację uczestników badania podjęto po przygotowaniu protokołu wraz z wyspecyfikowaniem istotnych elementów determinujących kwalifikacje osób do badań. 32 Kryteria włączenia do badania:  rasa kaukaska,  wiek powyżej 60 roku życia,  pisemna świadoma zgoda pacjenta na udział w badaniu oraz izolowanie i przechowywanie DNA,  prawidłowy obraz USG brzusznego odcinka aorty. Kryteria wyłączenia z badania:  rasa inna niż kaukaska,  wiek poniżej 60 roku życia,  brak pisemnej świadomej zgody na udział w badaniu oraz izolowanie i przechowywanie DNA,  rozpoznanie poszerzenia lub tętniaka aorty brzusznej w przeprowadzanym badaniu USG,  dodatni wywiad lub rozpoznanie tętniaka z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby genetycznej z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby autoimmunizacyjnej i przewlekłych chorób zapalnych z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia,  dodatni wywiad lub rozpoznanie choroby nowotworowej z uwzględnieniem krewnych I i II stopnia. Do badania zgłosiło się 288 uczestników. W trakcie badania USG wykryto 10 poszerzeń brzusznego odcinka aorty i 3 poszerzenia tętnic biodrowych wspólnych, wstępnie rozpoznano 11 TAB, zgłosił się także jeden pacjent z protezą naczyniową po leczeniu operacyjnym TAB oraz jeden pacjent z tętniakiem aorty piersiowej. W trakcie wywiadu lekarskiego wykluczono kolejnych 12 pacjentów z powodu rozpoznania choroby nowotworowej lub autoimmunizacyjnej (łuszczyca, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów). Zdecydowano się na włączenie 2 osób w wieku 58 lat i jednej osoby w 59 roku życia, które zgłosiły się na badania pomimo kryterium wyłączenia dotyczącego wieku. Wszyscy uczestnicy badania zapoznali się z „Informacją dla uczestnika badania” dotyczącą 35 DNA do złoża zachodzi dzięki obecności soli chaotropowej. Następnie złoże jest odpłukiwane z inhibitorów reakcji PCR, białek i innych zanieczyszczeń. Elucja DNA przeprowadzana jest z zastosowaniem buforu elucyjnego o niskiej zawartości soli, który powoduje zmianę warunków wiązania. Do końcowej elucji stosowano 200 µl buforu elucyjnego, a uzyskany materiał genetyczny poddawano analizie jakościowej i ilościowej i przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych badań. 3.2.3. Analiza ilości i jakości wyizolowanego DNA Analizę ilościową i jakościową wyizolowanego DNA przeprowadzono poprzez pomiar absorbcji z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop 2000 firmy ThermoScienific przy zastosowaniu fali o długości 260 i 280 nm. Zmierzone stężenie wyizolowanego DNA we wszystkich próbkach było wyższe niż 50 ng/µl, którą to wartość przyjęto za minimalną wymaganą do dalszych badań. W celu oceny jakości otrzymanego DNA, przeprowadzono pomiary absorbcji w 260 i 280 nm i obliczono stosunek A260/280. Wartości niższe niż 1.5 świadczyłyby o znacznym zanieczyszczeniu preparatu, mogącym uniemożliwić amplifikację DNA, z kolei wyniki powyżej 2.0 wskazywałyby na zanieczyszczenie RNA. Wszystkie uzyskane wartości mieściły się w zakresie 1.8 – 2.0, co oznacza bardzo dobrą czystość DNA. 3.2.4. Oznaczanie polimorfizmów typu SNP metodą dyskryminacji alleli. Analizę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) -438G/A w genie TAFI oraz 1858C/T w genie PTPN22 wykonano techniką dyskryminacji alleli (ang. allelic discrimination) z użyciem sond typu TaqMan. Metoda dyskryminacji alleli opiera się na łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR) i polega na amplifikacji określonych fragmentów DNA za pomocą zestawu starterów i sond znakowanych znacznikami fluorescencyjnymi. Do reakcji użyto komplementarnych do amplifikowanego fragmentu sond TaqMan znakowanych na końcu 5’ barwnikami FAM (karboksyfluoresceina) lub VIC ® , które odpowiednio rozpoznają allel typu dzikiego lub allel zmutowany. Działanie sond oparte jest na zjawisku fluorescencyjnego rezonansowego transferu energii (FRET, ang. Förster/Fluorescent Resonanse Energy Transfer) pomiędzy cząsteczką reporterową na końcu 5’ a wygaszającą na końcu 3’. W wyniku wzbudzenia falą świetlną o odpowiedniej długości fluorochrom reporterowy przenosi energię na fluorochrom wygaszający, który emituje falę świetlną o innej 36 długości. W sondzie natywnej fluorochrom reporterowy i wygaszający znajdują się blisko siebie i nie dochodzi do emisji fluorescencji w zakresie charakterystycznym dla FAM lub VIC. Podczas wydłużania nici dochodzi do hydrolizy sondy pod wpływem polimerazy AmpliTaq, posiadającej aktywność 5’-egzonukleazową, co powoduje oddzielenie cząsteczki reporterowej od wygaszającej i emisję fluorescencji o długości fali odpowiedniej dla FAM lub VIC. Pomiar natężenia sygnału fluorescencji umożliwia detekcję próbek homozygotycznych i heterozygotycznych. Na Rycinie 6 zilustrowano schematycznie zasadę działania sond TaqMan w reakcji dyskryminacji alleli. Ryc. 6. Schemat obrazujący zasadę działania sond typu TaqMan w reakcji dyskryminacji allelicznej (zmodyfikowano według Livak i wsp., 1995). Reakcję prowadzono z zastosowaniem aparatu StepOnePlus (Life Technologies), w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 25,0 µl, w której skład wchodziło 12,5 µl TaqMan® Universal PCR Master Mix (2x) (Life Technologies), 1,25 µl SNP Assay Mix (Life Technologies), 3 ng genomowego DNA oraz woda wolna od DNaz dodawana w ilości uzupełniającej mieszaninę do objętości 25,0 µl. Jako kontrolę negatywną użyto mieszaniny pozbawionej genomowego DNA. Reakcja przebiegała w następujących warunkach temperaturowo – czasowych: 60 °C przez 30 sekund, 95 °C przez 10 minut, następnie 50 cykli w 92 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę. Do wykrywania polimorfizmu -438G/A rs2146881 w genie TAFI użyto zestawu sond i starterów C_16136443_10 (Life Technologies), sonda znakowana barwnikiem VIC była komplementarna do allelu G, natomiast barwnik FAM wykrywał allel A. Polimorfizm 1858C/T rs2476601 w genie PTPN22 zbadano za pomocą zestawu C_16021387_20 (Life Technologies), w którym 37 barwnik VIC służył do detekcji allelu T, a barwnik FAM do allelu C. Reakcję prowadzono na 96-dołkowych płytkach MicroAMP Fast Optical (Life Technologies). Analiza wyników została przeprowadzona na podstawie wykresów punktowych uzyskanych w oprogramowaniu StepOne Software v 2.3. 3.2.5. Oznaczanie polimorfizmów typu SNP metodą PCR-RFLP Typowanie SNPs 49A/G w genie CTLA-4, -1123C/G w genie PTPN22 oraz -455G/A w genie FBG przeprowadzono z wykorzystaniem metody łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) i polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism, RFLP). Polega ona na wykrywaniu różnic pomiędzy długościami fragmentów DNA uzyskanych po trawieniu enzymem restrykcyjnym, dobranym tak aby badany polimorfizm utworzył lub wyeliminował rozpoznawaną przez niego sekwencję. W pierwszym etapie oznaczenia przeprowadzono amplifikację wybranego fragmentu genu z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze Veriti ® Thermal Cycler (Life Technologies). Sekwencje starterów zaczerpnięto z literatury, odpowiednio dla SNPs genów PTPN22, CTLA-4, i FGB z publikacji Huang i wsp. 2012, Sallacki i wsp. 2005, Thomas i wsp. 1991. Natomiast warunki dla każdej reakcji dobierano i optymalizowano eksperymentalnie. Sekwencje zastosowanych starterów, składy mieszanin reakcyjnych oraz profile czasowo-termiczne reakcji PCR przedstawiono w Tabelach III, IV i V. Tabela III. Sekwencje starterów zastosowanych podczas reakcji PCR do amplifikacji fragmentów genów PTPN22, CTLA-4 i FGB. Polimorfizm Sekwencje starterów PTPN22 -1123C/G Forward 5’-CCA TTG AGA GGT TAT GCG AGC T-3’ Reverse 5’-CGC CAC CTT GCT GAC AAC AT-3’ CTLA-4 49A/G Forward 5’-GCT CTA CTT CCT GAA GAC CT-3’ Reverse 5’-AGT CTC ACT CAC CTT TGC AG-3’ FGB -455G/A Forward 5’-AAG AAT TTG GGA ATG CAA TCT CTG CTA CCT-3’ Reverse 5’-CTC CTC ATT GTC GTT GAC ACC TTG GGA C-3’ ang. forward – starter przedni; ang. reverse – starter wsteczny 40 W drugim etapie przeprowadzania genotypowania badanych polimorfizmów, uzyskane amplikony trawiono enzymami restrykcyjnymi. Dla wariantu polimorficznego PTPN22 -1123C/G, produkt reakcji PCR o długości 175 pz trawiono enzymem SacI (Fermentas) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Otrzymano fragmenty o długościach odpowiadających poszczególnym genotypom:  GG (175pz),  CC (151pz, 24pz),  GC (175pz, 151pz, 24pz). Przykładowy wynik analizy PCR-RFLP po rozdziale w żelu agarozowym, przedstawiający warianty genetyczne genu PTPN22 przedstawiono na Rycinie 10. Ryc. 10. Wynik analizy SNP -1123C/G genu PTPN22 metodą PCR-RFLP. Trawienie produktów PCR enzymem SacI. Produkty rozdzielone na żelu agarozowym. Tor 1 – marker wielkości DNA, tor 2, 3, 4, 5 i 8 – homozygoty GG, tor 6 – heterozygota GC, tor 7 – homozygota CC. W przypadku SNP 49A/G genu CTLA-4 zastosowano restryktazę BbvI. Reakcje enzymatyczne przeprowadzono w temperaturze 65 °C przez 3 godziny. Otrzymano fragmenty o długościach odpowiadających poszczególnym genotypom:  AA (162 pz),  GA (162 pz, 74 pz)  GG (88 pz, 74 pz). Przykładowy wynik analizy PCR-RFLP po rozdziale w żelu agarozowym, przedstawiający warianty genetyczne genu CTLA-4 przedstawiono na Rycinie 11. 41 Ryc. 11. Wynik analizy SNP 49A/G genu CTLA-4 metodą PCR-RFLP. Trawienie produktów PCR enzymem restrykcyjnym BbvI. Produkty trawienia rozdzielone na żelu agarozowym. Tor 1 – marker wielkości DNA, tor 2, 4, 5, 6 i 8 – heterozygoty GA, tor 3 – homozygota GG, tor 7 – homozygota AA. Natomiast dla wariantu polimorficznego -455G/A genu FGB otrzymany produkt reakcji PCR trawiono enzymem restrykcyjnym HaeIII w 37 C przez 3 godziny. Po trawieniu otrzymano fragmenty o długościach odpowiednio dla genotypów:  AA (958 pz i 343 pz),  GG (575 pz, 383 pz i 343 pz),  GA (958 pz, 575 pz, 383 pz i 343 pz). Przykładowy wynik analizy PCR-RFLP po rozdziale w żelu agarozowym, przedstawiający warianty genetyczne genu FBN przedstawiono na Rycinie 12. Ryc. 12. Wynik analizy SNP -455G/A genu FGB metodą PCR-RFLP. Trawienie produktów PCR enzymem restrykcyjnym HaeIII. Produkty trawienia rozdzielone na żelu agarozowym. Tor 1 – marker wielkości DNA, tor 2, 3, 7, 8, 10, 11 i 12 – homozygoty GG, tory 4, 5, 6, 13 i 14 – heterozygota GA, tor 9 – homozygota AA. 42 3.2.6. Oznaczanie aktywności TAFI w osoczu Oznaczenie aktywności TAFI w osoczu przeprowadzono za pomocą komercyjnie dostępnego testu TAFI Activity Kit firmy American Diagnostica GmbH (nr kat. ADG871). Całą procedurę przeprowadzono zgodnie z instrukcją, dołączoną przez producenta. Substratem dla TAFI jest peptyd złożony z L-lizyny i L-argininy, w której α-pozycję zajmuje atom siarki. Jego degradacji przez TAFI towarzyszy powstawanie pochodnej tiolowej. Grupa tiolowa reaguje z bezbarwnym odczynnikiem Ellmana (kwas 5,5-ditiobis-(2- nitrobenzoesowy), DNTB), tworząc tionitrobenzoesową pochodną białka oraz zabarwiony na żółty kolor anion tionitrobenzoesowy (TNB) o maksimum absorbcji przy 412 nm. Absorbcja mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 405 nm jest proporcjonalna do ilości produktu zachodzącej reakcji enzymatycznej. Pomiary wykonywano w sposób ciągły przez 5 minut, przy długości fali 405 nm z wykorzystaniem czytnika płytek SPECTROstar Nano firmy BMG LABTECH. Liniową część otrzymanej krzywej kinetycznej reakcji wykorzystano do obliczenia aktywności TAFIa w badanych próbkach osocza w porównaniu z krzywą standardową przy użyciu oprogramowania MARS Data Analysis Software w wersji V3.01 R2 firmy BMG LABTECH. 3.2.7. Analiza statystyczna uzyskanych wyników Zgodność rozkładu genotypów z rozkładem oczekiwanym z równowagi Hardy’ego- Weinberga (H-W), weryfikowano testem chi-kwadrat (χ) 2 . Miarą odstępstwa częstości genotypów od równowagi Hardy’ego-Wenberga, dla locus z alellami a i b, jest współczynnik  aa aaa pp pp f    1 2 , gdzie ap to obserwowana częstość allelu a, aap to obserwowana częstość homozygot aa. Współczynnik f przyjmuje wartość zero wtedy i tylko wtedy, kiedy locus znajduje się w równowadze H-W. Wartości dodatnie współczynnika wskazują na nadmiar homozygot. Wartości ujemne sygnalizują wzrost częstości heterozygot w stosunku do tego, czego należałoby oczekiwać, gdyby locus pozostawało w równowadze H-W. W przypadku 45 4. WYNIKI 4.1. Charakterystyka badanej populacji Po uwzględnianiu kryteriów włączenia i wyłączenia ostatecznie badaniami objęto 274 pacjentów i 250 osób z grupy kontrolnej. W Tabeli VI i VII zamieszczono kolejno statystyki opisowe wieku i masy ciała chorych z TAB i osób z grupy kontrolnej. Średni wiek chorych wynosił 70.1 lat, zaś średni wiek osób bez tętniaka był równy 68.4 lata. Tabela VI. Wiek osób włączonych do grupy chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250). Grupa Min Q1 Mediana Sn Q3 Max Powyżej 65 lat N % Chorzy 43 64 71 7 76 90 188 68.6 Kontrola 58 63 67 5 73 84 145 58.0 Razem 43 63 69 7 75 90 333 63.5 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. Tabela VII. Masa ciała osób włączonych do grupy chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250), w podziale na płeć badanych. Grupa Plec Min Q1 Mediana Sn Q3 Max Chorzy Kobiety 45 64 70 10 79 100 Mężczyźni 52 70 80 12 89 140 Razem 45 70 78.5 12 88.8 140 Kontrola Kobiety 55 58.5 65 11 81.5 90 Mężczyźni 55 74 82 9 90 120 Razem 55 74 82 9 90 120 Razem 45 71 80 11 89 140 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. Parametrem najczęściej wykorzystywanym do charakteryzowania TAB, a także do monitorowania rozwoju choroby i ryzyka pęknięcia tętniaka, jest jego maksymalna średnica. W prezentowanym badaniu, w celu przeprowadzenia wnikliwej oceny zależności pomiędzy badanymi polimorfizmami genetycznymi a wystąpieniem TAB, zdecydowano się poszerzyć analizę o parametry uwzględniające osobniczą zmienność uczestników badania. W tym celu 46 obliczono wskaźnik masy ciała, BMI, (Tabela VIII) oraz powierzchnię ciała, BSA, (Tabela IX) osób badanych. Parametry te posłużyły z kolei do wyznaczenia wskaźników wielkości aorty, BMIindex i ASI, odnoszących średnicę aorty do masy i powierzchni ciała uczestników badania. Tabela VIII. Wskaźnik masy ciała (BMI) osób włączonych do grupy chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250). Grupa Min Q1 Mediana Sn Q3 Max BMI > 30 N % Chorzy 17.28 24.22 27 3.55 30.08 45.9 72 26.3 Kontrola 16.6 24.92 27.04 3.15 29.58 38.74 57 22.8 Razem 16.6 24.57 27.02 3.39 29.76 45.9 129 24.6 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. Tabela IX. Powierzchnia ciała (BSA) osób włączonych do grupy chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250), w podziale na płeć badanych. Grupa Plec Min Q1 Mediana Sn Q3 Max Chorzy Kobiety 1.44 1.665 1.77 0.12 1.845 2.11 Mężczyźni 1.58 1.83 1.92 0.14 2.04 2.73 Razem 1.44 1.79 1.9 0.15 2.027 2.73 Kontrola Kobiety 1.53 1.59 1.66 0.16 1.82 1.93 Mężczyźni 1.56 1.87 1.97 0.12 2.05 2.39 Razem 1.53 1.853 1.96 0.13 2.05 2.39 Razem 1.44 1.828 1.93 0.14 2.04 2.73 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. W Tabeli X oraz na Rycinie 13 zamieszczono porównanie średnicy aorty w grupach chorych mężczyzn i kobiet z TAB oraz z prawidłową średnicą aorty. Przeciętna średnica tętniaka w jego najszerszym miejscu wynosiła 55 mm, zarówno w grupie kobiet jak i w grupie mężczyzn, z przeciętną różnicą między dwoma dowolnie wybranymi osobami wynoszącą Sn = 7 mm. U trzech na czterech chorych średnica w najszerszym miejscu tętniaka wynosiła nie mniej niż Q1 = 50 mm, a co u czwartego była większa niż Q3 = 62 mm. Natomiast w grupie kontrolnej odnotowano różnicę wynoszącą 3.9 mm między przeciętnymi średnicami brzusznego odcinka aorty kobiet i mężczyzn, co jest wynikiem spodziewanym. 47 Tabela X. Średnica aorty [mm] osób włączonych do grupy chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250), w podziale na płeć badanych. Grupa Plec Min Q1 Mediana Sn Q3 Max Chorzy Kobiety 40 50 55 8 60 73 Mężczyźni 35 50 55 7 62 120 Razem 35 50 55 7 62 120 Kontrola Kobiety 13.5 14.9 15.5 1.8 17.1 20.4 Mężczyźni 14.2 17.9 19.4 1.9 21 28 Razem 13.5 17.6 19.4 2 20.9 28 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. Ryc. 13. Średnica aorty [mm] osób badanych, w podziale na płeć. Na wykresie lewym mediany, kwartyle pierwszy i trzeci, obserwacje minimalne i maksymalne nieodstające, oraz jako osobne punkty, obserwacje odstające w grupie chorych z TAB. Na wykresie prawym – w grupie kontrolnej. 50 Bardzo często w worku TAB obecna jest skrzeplina przyścienna. W Tabeli XIII i na Rycinie 16 zamieszczono statystyki opisowe grubości skrzepliny w grupie chorych, w podziale na kobiety i mężczyzn. Ponieważ nie u wszystkich chorych skrzeplina występowała, w tabeli zamieszczono podsumowanie grubości u tych pacjentów, u których skrzeplinę stwierdzono. Tabela XIII. Grubość skrzepliny przyściennej w grupie chorych, u których skrzeplinę stwierdzono (n=258), oraz częstość chorych bez skrzepliny (n=16), w podziale na płeć badanych. Grupa Min Q1 Mediana Sn Q3 Max Brak skrzepliny N % Kobiety 10 12 19 8 23 35 3 8.6 Mężczyźni 5 15 20 7 30 73 13 5.4 Razem 5 15 20 7 30 73 16 5.8 Q1, Q3 – pierwszy i trzeci kwartyl; Sn – miara zróżnicowania obserwacji, im wyższa tym wyższe zróżnicowanie; Min – najmniejsza obserwowana wartość; Max – największa obserwowana wartość. Przeciętna grubość skrzepliny przyściennej w grupie kobiet wyniosła 19 mm z przeciętną różnicą między dwiema kobietami wynoszącą Sn = 8 mm. Grubość skrzepliny jest zatem w tej grupie dość zróżnicowana. Podobne zróżnicowanie grubości skrzepliny zaobserwowano w grupie chorych mężczyzn, u których skrzeplina miała grubość przeciętnie 20 mm. Wobec takich różnic w grubości skrzepliny między dwoma dowolnie wybranymi mężczyznami, lub między dwiema dowolnie wybranymi kobietami, obserwowana różnica w przeciętnej grubości skrzepliny między kobietami i mężczyznami, wynosząca 1 mm, jest bez jakiegokolwiek znaczenia. U ponad 75% osób w obu grupach grubość ta była większa niż 10 mm, oraz u 25% kobiet większa niż Q3 = 23 mm, a u 25% mężczyzn większa niż Q3 = 30 mm. Na 39 kobiet w grupie chorych skrzepliny nie miały 3 kobiety, co stanowi 8.6% kobiet. Dla porównania, w grupie 239 chorych mężczyzn skrzepliny nie stwierdzono u 13, co stanowi 5.6% mężczyzn z tętniakiem. Skrzeplina przyścienna nie występuje u co dwudziestego chorego (5.8%). 51 Ryc. 16. Grubość skrzepliny przyściennej [mm] w grupie chorych, u których stwierdzono skrzeplinę. Na wykresie A – mediana, kwartyle pierwszy i trzeci, obserwacje minimalne i maksymalne nieodstające, oraz jako osobny punkt, obserwacja odstająca. Na wykresie B – histogram grubości skrzepliny. Na wykresie C – dystrybuanta empiryczna, pokazująca prawdopodobieństwo tego, że grubość skrzepliny przyjmie wartość nie większą niż zadana. W ogólnej charakterystyce uczestników badania uwzględniono również czynniki ryzyka rozwoju TAB, występowanie chorób współistniejących oraz stosowaną farmakoterapię (Tabela XVI). W Tabeli XIV zamieszczono liczebności i odsetki osób w obu badanych grupach, u których występowały wymienione choroby współistniejące i czynniki ryzyka rozwoju TAB. Bardzo silnym czynnikiem ryzyka w genezie tętniaka aorty brzusznej jest palenie tytoniu. Osoba paląca ma OR = 7.94 razy więcej szans na rozwój tętniaka niż osoba niż osoba niepaląca. Biorąc pod uwagę przedział ufności CI95%(5.23; 12.7), szansa ta prawie na pewno jest 5 – krotnie większa. 52 Tabela XIV. Porównanie występowania chorób współistniejących i czynników ryzyka w grupie chorych z tętniakiem aorty brzusznej (n=274) i kontrolnej (n=250). Grupa Chorzy Kontrola OR CI95% Choroby współistniejące i czynniki ryzyka Nie Tak % Tak Nie Tak % Tak Incydent mózgowo-naczyniowy 250 24 8.8 237 13 5.2 1.75 0.87 3.52 Cukrzyca typu 2 221 53 19.3 211 39 15.6 1.30 0.82 2.04 Nadciśnienie tętnicze 59 215 78.5 89 161 64.4 2.01 1.37 2.97 Zawał serca 204 70 25.5 222 28 11.2 2.72 1.69 4.39 Dyslipidemia 101 173 63.1 131 119 47.6 1.89 1.33 2.67 Choroby nerek 232 42 15.3 213 37 14.8 1.04 0.65 1.68 Przepuklina 232 42 15.3 180 70 28 0.47 0.30 0.72 Wczesne powikłania pooperacyjne 249 25 9.1 - - - - - - Palenie tytoniu 111 163 59.5 211 39 15.6 7.94 5.23 12.07 OR – odds ratio, iloraz szans; grupa chorych z TAB przyjęta jako grupa badana; CI95% – przedział ufności dla ilorazu szans na poziomie ufności 1–α=0.95. U każdej osoby przeanalizowano współwystępowanie głównych czynników ryzyka rozwoju TAB: płeć męską, palenie tytoniu, wiek powyżej 65 roku życia, otyłość (BMI>30), nadciśnienie tętnicze i dyslipidemię. W tym celu zliczono liczbę występujących czynników ryzyka. Liczba ta może przyjmować wartości od zera do sześciu włącznie. Rozkład liczby czynników ryzyka w obu badanych grupach zamieszczono w Tabeli XV. Tabela XV. Rozkład liczby czynników ryzyka rozwoju tętniaka aorty brzusznej (analizowane czynniki to: płeć męska, palenie tytoniu, wiek powyżej 65 roku życia, otyłość (BMI>30), nadciśnienie tętnicze i dyslipidemia), gdzie „0” oznacza brak czynników ryzyka a „6” występowanie wszystkich sześciu czynników ryzyka rozwoju tętniaka aorty brzusznej. Suma czynników 0 1 2 3 4 5 6 Razem Mediana Sn Chorzy N 1 4 25 56 112 62 14 274 Med = 4 Sn = 1 % 0.4 1.5 9.1 20.4 40.9 22.6 5.1 100% skum. % 0.4 1.9 11 31.4 72.3 94.9 100% - Kontrola N 0 25 53 85 63 22 2 250 Med = 3 Sn = 1 % 0 10 21.2 34 25.2 8.8 0.8 100% skum. % 0 10 31.2 65.2 90.4 99.2 100% - OR = 4.03; CI95%(2.89; 5.59) skum. % – procent osób skumulowany. 55 4.2.2. Polimorfizm -1123G/C genu PTPN22 W Tabeli XVIII zamieszczono wyniki analizy miejsca polimorficznego -1123G/C w genie PTPN22. Rozkład genotypów w grupie chorych odbiega od rozkładu, którego należało by oczekiwać, gdyby locus było w równowadze Hardy’ego-Weinberga. Współczynnik f = 0.13 dla tej grupy wskazuje na niedobór heterozygot. Analiza rozkładu genotypów w grupie kontrolnej nie dostarcza żadnych przesłanek do twierdzenia, że locus w tej grupie osób nie jest w równowadze Hardy’ego-Weinberga (f = 0.024). Zarówno w grupie badanej jak i kontrolnej najczęściej obserwowano genotyp CG. Tabela XVIII. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu PTPN22 -1123G/C w grupie badanej i kontrolnej. PTPN22 -1123G/C Chorzy Kontrola n % n % GG 171 62.4 147 58.8 GC 83 30.3 88 35.2 CC 20 7.3 15 6 Razem 274 100% 250 100% Zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga χ 2 lss=1 = 4.62 p = 0.0243 χ 2 lss=1 = 0.14 p = 0.7226 Miara odstępstwa rozkładu genotypów od rozkładu Hardy’ego-Weinberga f = 0.13 f = 0.024 CI95% 0.003; 0.26 CI95% -0.1; 0.15 Genotypy GG GC CC Chorzy 171 83 20 Kontrola 147 88 15 OR 1 * 0.81 1.14 CI95% - 0.56; 1.18 0.57; 2.28 χ 2 lss=1 = 1.43; p = 0.2314 Allele Chorzy Kontrola n % n % G 425 77.6 382 76.4 C 123 22.4 118 23.6 Razem 548 100% 500 100% * Genotyp GG jako grupa odniesienia. 56 4.2.3. Polimorfizm 49A/G genu CTLA-4 Porównując częstości genotypów i alleli przedstawione w Tabeli XIX można stwierdzić, że nie ma dowodów na to, by polimorfizm 49A/G w genie CTLA4 miał związek z występowaniem tętniaka aorty brzusznej (χ 2 lss=1 = 1.43; p = 0.2314). Nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic w dystrybucji genotypów pomiędzy badanymi grupami. Tabela XIX. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu CTLA-4 49 A/G w grupie badanej i kontrolnej. CTLA-4 49A/G Chorzy Kontrola n % n % AA 121 44.2 94 37.6 AG 114 41.6 117 46.8 GG 39 14.2 39 15.6 Razem 274 100% 250 100% Zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga χ 2 lss=1 = 2.03 p = 0.1821 χ 2 lss=1 = 0.067 p = 0.7881 Miara odstępstwa rozkładu genotypów od rozkładu Hardy’ego-Weinberga f = 0.086 f = 0.016 CI95% -0.03; 0.204 CI95% -0.11; 0.11 Genotypy AA AG GG Chorzy 121 114 39 Kontrola 94 117 39 OR 1 * 0.76 0.78 CI95% - 0.52; 1.1 0.46; 1.3 χ 2 lss=1 = 1.43; p = 0.2314 Allele Chorzy Kontrola n % n % A 356 65 305 61 G 192 35 195 39 Razem 548 100% 500 100% * Genotyp AA jako grupa odniesienia. 57 4.2.4. Polimorfizm -455G/A genu FGB W Tabeli XX zamieszczono wyniki analizy częstości genotypów i alleli w miejscu polimorficznym -455G/A genu FGB. Częstość homozygoty GG w grupie chorych z TAB wyniosła 55.1%, a w grupie kontrolnej 57.6%. Obserwowany rozkład częstości genotypów w grupie chorych nie odbiega od rozkładu oczekiwanego z równowagi Hardy’ego-Weinberga (p = 0.8687). W grupie kontrolnej natomiast częstości genotypów w sposób nieprzypadkowy odbiegają od częstości oczekiwanej z równowagi H-W (p = 0.0199), ponieważ współczynnik f, będący miarą odstępstwa rozkładu częstości genotypów od rozkładu H-W wynosi f = 0.147 i wskazuje na niedobór heterozygot. Częstości każdego allelu w obu grupach są niemal takie same. Tabela XX. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu FGB -455G/A w grupie badanej i kontrolnej. FGB -455G/A Chorzy Kontrola n % n % GG 151 55.1 144 57.6 GA 106 38.7 82 32.8 AA 17 6.2 24 9.6 Razem 274 100% 250 100% Zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga χ 2 lss=1 = 0.078 p = 0.8687 χ 2 lss=1 = 5.45 p = 0.0199 Miara odstępstwa rozkładu genotypów od rozkładu Hardy’ego-Weinberga f = -0.017 f = 0.147 CI95% -0.13; 0.1 CI95% 0.012; 0.28 Genotypy GG GA AA Chorzy 151 106 17 Kontrola 144 82 24 OR 1 * 1.23 0.68 CI95% - 0.85; 1.78 0.35; 1.31 χ 2 lss=1 = 0.026; p = 0.8710 Allele Chorzy Kontrola n % n % G 408 74.5 370 74 A 140 25.5 130 26 Razem 548 100% 500 100% * Genotyp GG jako grupa odniesienia. 60 Ryc. 17. Aktywność produktu genu TAFI [%], w zależności od genotypu TAFI-438G/A i grupy badanej. Na wykresie lewym mediany, kwartyle pierwszy i trzeci, obserwacje minimalne i maksymalne w grupie chorych z TAB. Na wykresie prawym – w grupie kontrolnej. W Tabeli XXIII zamieszczono podsumowanie modelu, który najlepiej opisuje zależność między poziomem aktywności TAFI a genotypem i grupą badaną. Tabela XXIII. Zależność między aktywnością TAFI a genotypem TAFI -438G/A i tętniakiem aorty brzusznej. Zmienna Zmiana w średniej aktywności TAFI CI95% p-wartość Allel G +5.78 2.56 8.99 0.0005 Kontrola +6.87 4.91 8.83 <0.0001 F3; 514 = 19.6; p < 0.0001 R 2 = 0.097 Średnia aktywność rośnie wraz ze wzrostem liczby alleli G w genomie tak, że z każdym kolejnym allelem G średnia aktywność wzrasta o 5.78 punktów procentowych (Ryc. 18). Przedział ufności dla tej różnicy pokazuje, że w rzeczywistości może to być nawet 61 9 punktów procentowych i prawie na pewno nie mniej niż 2.56 punktów procentowych. Opisana zależność dotyczy w takim samym stopniu osób z chorych z TAB jak i osób kontrolnych (p = 0.1573). Tak więc różnica w aktywności TAFI między heterozygotą GA i homozygotą AA wynosi tyle samo, co między homozygotą GG a heterozygotą GA. Nie ma dowodów, aby opisana zależność nie była liniowa (p = 0.1735). Średnia aktywność TAFI jest większa w grupie kontrolnej średnio o 6.87 punktów procentowych w porównaniu z grupą chorych z TAB i dotyczy to w takim samym stopniu każdego z trzech genotypów. Nie ma dowodów, aby różnica między chorymi i kontrolą była inna w zależności od genotypu TAFI (p = 0.1573). Ryc. 18. Średnie poziomy aktywności TAFI w zależności od genotypu TAFI -438G/A w obu badanych grupach. 4.3. Średnica aorty Średnica brzusznego odcinka aorty w grupie kontrolnej oraz największa średnica tętniaka w grupie chorych zależą od czynników antropomorficznych, tzn. od wskaźnika masy ciała, BMI, i od powierzchni ciała ludzkiego, BSA. Dlatego w analizie zależności między rozważanymi polimorfizmami genetycznymi a średnicą aorty/tętniaka aorty posłużono się 62 wskaźnikiem wielkości aorty ASI, który wyraża średnicę naczynia [cm] w stosunku do powierzchni ciała [m 2 ] oraz wskaźnikiem BMI index, który wyraża średnicę [cm] w stosunku do BMI [kg/m 2 ]. Oba wskaźniki są ze sobą wysoko dodatnio skorelowane (współczynnik korelacji liniowej między nimi wynosi r = 0.87), dlatego zostały poddane łącznej analizie jako zmienna dwuwymiarowa   2,  indexBMIASId , opisująca odpowiednio średnicę aorty w grupie kontrolnej i średnicę tętniaka aorty brzusznej w grupie chorych. Tak wyrażona średnica, d  , koreluje z kilkoma zmiennymi antropometrycznymi i klinicznymi, więc ewentualne zależności między d  a polimorfizmami genetycznymi były analizowane przy uwzględnieniu tych korelacji. Wyniki analizy d w grupie chorych zamieszczono w Tabeli XXIV. Z kolei w Tabeli XXV zamieszczono wyniki analizy związku miedzy średnicą aorty brzusznej, wyrażoną zmienną d  , a polimorfizmami genetycznymi w grupie kontrolnej. Tabela XXIV. Zależność pomiędzy średnicą tętniaka aorty, d  , a czynnikami klinicznymi i genetycznymi u chorych z TAB. W tabeli podano procentową różnicę w średnicy dla danej składowej d  , tzn. dla ASI i dla BMI index, w stosunku do grupy odniesienia. Czynniki kliniczne i antropometryczne ASI BMI index λPillai p-wartość Różnica % CI95% Różnica % CI95% Mężczyzna -8.60 -13.86 -3.02 1.20 -6.29 9.29 0.131 <0.0001 Wiek 0.37 0.13 0.61 0.43 0.14 0.71 0.037 0.0073 Palenie 4.43 -0.09 9.15 4.21 -1.14 9.86 0.017 0.1085 Nadciśnienie -4.36 -9.40 0.97 -7.67 -13.35 -1.63 0.036 0.0085 Cukrzyca typu 2 -1.40 -6.79 4.30 -7.23 -13.26 -0.78 0.055 0.0007 Choroby nerek 7.50 0.72 14.74 5.44 -2.25 13.73 0.027 0.0270 Polimorfizmy Różnica % CI95% Różnica % CI95% λPillai p-wartość FGB * -455G/A GA 3.72 -6.47 15.01 5.32 -6.21 18.28 0.008 0.717 GG 3.68 -6.42 14.88 6.30 -5.13 19.12 PTPN22 1858 C/T CT -1.46 -6.40 3.75 -1.94 -7.54 4.01 0.023 0.190 TT -10.55 -18.78 -1.48 -14.75 -24.08 -4.26 PTPN22 -1123 G/C GC 5.39 -3.17 14.70 4.83 -6.28 17.26 0.027 0.131 GG 4.24 -3.95 13.14 6.95 -3.97 19.12 CTLA-4 49 A/G GA 1.98 -2.29 6.43 4.23 -1.22 9.99 0.016 0.399 GG -1.95 -8.03 4.53 -0.87 -7.78 6.55 TAFI -438 G/A GA 9.29 -0.28 19.78 10.20 -1.99 23.90 0.010 0.629 GG 7.14 -1.85 16.94 7.52 -4.06 20.50 * Przykładowo: genotyp AA jako grupa odniesienia. 65 Ryc. 20. Zależność pomiędzy średnicą tętniaka aorty w grupie chorych oraz średnicą tętnicy prawidłowej, wyrażonych jako BMIindex [cm×m 2 /kg], a genotypem w polimorfizmie -455G/C genu FGB. Nie znaleziono dowodów na to, aby pozostałe polimorfizmy miały związek ze średnicą tętniaka aorty w grupie chorych i ze średnicą aorty prawidłowej w grupie kontrolnej. Średnica tętniaka nie ma także związku z aktywnością produktu genu TAFI, aTAFI (λPillai = 0.017; p = 0.1046), podobnie jak średnica aorty prawidłowej (λPillai = 0.014; p = 0.1941). 4.4. Skrzeplina przyścienna W Tabeli XXVI zamieszczono wyniki analizy zależności między polimorfizmami genetycznymi a grubością skrzepliny przyściennej w worku tętniaka. Z uwagi na to, że zmierzona grubość skrzepliny jest cechą quasi dyskretną, przyjmującą tylko kilkanaście różnych wartości, pacjentów podzielono na 6 rozłącznych grup. Do pierwszej grupy zaliczono n = 47 pacjentów, których grubość skrzepliny mieściła się w przedziale domkniętym [10-14] mm, do drugiego przedziału włączono n = 48 pacjentów, których grubość skrzepliny 66 mieściła się w przedziale [15-19] mm. Kolejnych pacjentów zaliczono do przedziałów: [20- 20] (n = 52), [21-29] (n = 43), [30-35] (n = 44) oraz [36-46] (n=18). Na skutek wprowadzenia tego podziału, formalnie rozpatrywano grubość skrzepliny jako zmienną  40 32, 24.5, 20, 16, 11.5,k . W nawiasie podano środki utworzonych przedziałów. Tabela XXVI. Zależność pomiędzy grubością skrzepliny przyściennej w worku tętniaka a czynnikami klinicznymi i genetycznymi. Czynniki kliniczne i antropometryczne OR CI95% χ 2 lss=2 p-wartość ASI 6.46 3.95 10.74 57.72 <0.0001 Mężczyzna 3.67 1.83 7.50 13.62 0.0002 Polimorfizmy genetyczne OR CI95% χ 2 lss=2 p-wartość FGB * -455G/A GA 1.33 0.53 3.38 0.40 0.8202 GG 1.24 0.50 3.08 PTPN22 1858 C/T CT 0.63 0.34 1.16 2.98 0.2257 TT 0.52 0.14 1.88 PTPN22 -1123 G/C GC 1.38 0.51 3.77 5.93 0.052 GG 2.29 0.89 5.99 CTLA-4 49 A/G GA 1.04 0.65 1.68 1.05 0.5915 GG 0.72 0.35 1.48 TAFI -438 G/A GA 0.41 0.11 1.45 2.07 0.3552 GG 0.41 0.12 1.40 * Przykładowo: genotyp AA jako grupa odniesienia. W tabeli podano szansę tego, że grubość skrzepliny będzie wynosiła nie mniej niż  40 32, 24.5, 20, 16, 11.5,k milimetrów, w stosunku do grupy odniesienia. Grubość skrzepliny jest związana ze średnicą tętniaka, wyrażoną jako wskaźnik ASI. Jeżeli wartość wskaźnika ASI wzrośnie o 1 cm/m 2 , to szansa tego, że grubość skrzepliny będzie nie mniejsza niż k rośnie OR = 6.46 razy dla każdego  40 32, 24.5, 20, 16, 11.5,k . Szansa tego, że osoba, której wskaźnik wielkości tętniaka aorty wynosi ASI = 2.5 będzie miała skrzeplinę o grubości nie mniejszej niż k = 16 jest OR = 6.46 razy większa niż szansa tego zdarzenia u osoby, której ASI = 1.5. Przeprowadzona analiza pozwala stwierdzić, że im większa średnica tętniaka (wyrażona jako zmienna ASI) tym grubsza skrzeplina przyścienna (χ 2 lss=2 = 57.72; p < 0.0001). Kolejną zmienną związaną z grubością skrzepliny jest płeć (χ 2 lss=2 = 13.62; p = 0.0002). Grubość skrzepliny u mężczyzny jest większa niż u kobiety o tej samej średnicy tętniaka (wyrażonej jako ASI). Przykładowo, mężczyzna, którego wskaźnik ASI = 1.5 ma 67 OR = 3.67 razy więcej szans na to, by grubość jego skrzepliny była nie mniejsza od k = 24.5 mm niż kobieta, mająca taką samą wartość wskaźnika ASI. Przedział ufności dla tego ilorazu szans wynosi CI95% (1.83; 7.50), tak więc prawie na pewno szanse mężczyzny nie są mniejsze niż OR = 1.83 krotnie, a nie wykluczone, że są nawet OR = 7.5 razy większe niż szanse kobiety o tym samym wskaźniku ASI. Zaobserwowana zależność dotyczy każdej grubości skrzepliny  40 32, 24.5, 20, 16, 11.5,k . Natomiast nie wykazano związku żadnego z wariantów polimorficznych badanych genów z grubością skrzepliny. 70 rumieniowaty indukowany lekami, a lista leków mogących wywoływać jego wystąpienie wynosi ponad 90 pozycji i stale się wydłuża. Dwa spośród wybranych do badania w ramach niniejszej pracy doktorskiej genów-kandydatów, PTPN22 i CTLA4, biorą udział w mechanizmach regulujących odpowiedź immunologiczną u ludzi. W licznych publikacjach opisano związek ich wariantów polimorficznych z wystąpieniem chorób autoimmunizacyjnych w różnych populacjach (Gregersen i wsp., 2006, Pretel i wsp., 2014, Romo-Tena i wsp., 2013). W przeprowadzonym badaniu polimorfizmu 1858C/T genu PTPN22, wśród osób z TAB stwierdzono niedobór heterozygot. Może to oznaczać, że omawiany polimorfizm ma związek z zapadalnością na tętniaka aorty brzusznej. Związek ten mógłby polegać na tym, że osoba, która jest heterozygotą CT ma o około 37% mniej szans na zachorowanie w porównaniu do homozygoty CC (OR = 0.63). Przedział ufności dla tego ilorazu, wynoszący CI95% (0.41; 0.98) wskazuje, że heterozygota może mieć nawet ponad dwukrotnie mniej szans na zachorowanie (OR = 0.41) w porównaniu z homozygotą CC. Jednak z powodu bardzo małych liczebności homozygot TT w obu grupach wnioskowanie o szansach zachorowania osób o tym genotypie jest ograniczone a uzyskane wyniki niepewne. Jeżeli istnieje zależność między polimorfizmem PTPN22 1858C/T a zachorowaniem na tętniaka aorty brzusznej, to najprawdopodobniej polega ona na tym, że heterozygoty CT mają niższą szansę na zachorowanie w porównaniu do obu homozygot, które z kolei nie różnią się od siebie. Również w przypadku polimorfizmu -1123G/C genu PTPN22 stwierdzono niedobór heterozygot w grupie osób z TAB. Ponieważ obydwa opisywane polimorfizmy dotyczą tego samego genu, prawdopodobnie znajdują się w nierównowadze gametycznej ze sobą. Stwierdzono, że szansa zachorowania na tętniaka u osoby będącej heterozygotą GC jest o około 9% niższa w porównaniu z szansą na zachorowanie homozygoty GG (OR = 0.81). Przedział ufności dla tego ilorazu pokazuje, że szansa ta może być nawet dwukrotnie niższa (OR = 0.56). Z przeprowadzonej analizy wynika, że jeśli istnieje zależność między polimorfizmem PTPN22 -1123G/C a zapadalnością na TAB, to najprawdopodobniej polega ona na tym, że heterozygoty GC mają niższą szansę na zachorowanie w porównaniu do homozygot, które z kolei nie różnią się od siebie. Nie można jednak stwierdzić istnienia takiej zależności, nie ryzykując pomyłki z prawdopodobieństwem większym niż żądane α = 0.05 (χ 2 lss=1 = 1.43; p = 0.2314). Nawet jeżeli w przypadku tego polimorfizmu opisywana zależność istnieje, to jest to i tak efekt bardzo słaby (OR = 0.81). Najprawdopodobniej jednak różnice, jakie uzyskano w rozkładach genotypów między grupą chorych i kontrolną, wynikają z tego, 71 że locus PTPN22 -1123G/C jest w niezrównoważeniu gametycznym (linkage disequiibrium, LD) z locus PTPN22 1858C/T. Obserwowane różnice mogą być także wynikiem heterozji na poziomie molekularnym, charakteryzującej się występowaniem istotnie różnego wpływu heterozygot na fenotyp w porównaniu z homozygotami. W dostępnej literaturze nie odnaleziono badań zależności pomiędzy omawianymi SNPs a występowaniem TAB. Natomiast sama dystrybucja alleli, obserwowana w badanej populacji, nie odbiega od opublikowanych przez inne zespoły wyników genotypowań. Jak wynika z piśmiennictwa, częstość występowania allelu T w miejscu polimorficznym 1858C/T genu PTPN22 wynosi w polskiej populacji około 12.6%. Wynik ten znajduje odzwierciedlenie w rezultatach badań jakie uzyskano, gdzie częstości tego allelu wyniosły 11.7% w grupie osób z TAB i 13.8% w grupie kontrolnej. Z kolei allel -1123C PTPN22 występował z częstością 23.5% w grupie 236 osób zrekrutowanych wśród pacjentów Szpitala Klinicznego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, bez klinicznych oznak i z ujemnym wywiadem w kierunku występowania chorób autoimmunizacyjnych. Podczas gdy w grupie osób z TAB i kontrolnej allel C obserwowano z częstościami 22.4% i 23.6% czyli także bardzo podobnie (Burn i wsp., 2011, Comings i MacMurray, 2000, Fichna i wsp., 2010). Analizując rozkład genotypów, jaki uzyskano dla polimorfizmu 49A/G genu CTLA-4, stwierdzono, że szansa zachorowania na tętniaka u osoby będącej heterozygotą AG jest 1.3 razy niższa w porównaniu z szansą osoby będącej homozygotą AA (OR = 0.76). Taki sam efekt zaobserwowano w przypadku homozygoty GG (OR = 0.78). Jeśli zatem istnieje zależność między zapadalnością na TAB a rozważanym polimorfizmem, to najprawdopodobniej polega ona na tym, że homozygota AA ma o około 30% więcej szans na rozwinięcie tętniaka w porównaniu do heterozygoty. Nie ma jednak wystarczających dowodów na poparcie takiego twierdzenia. Dla wyjaśnienia wątpliwości konieczne byłoby przeprowadzenie badania w grupach o liczebności zapewniającej moc statystyczną uzyskanego wyniku. Jak już wspominano, mutacje i polimorfizmy genów PTPN22 i CTLA-4 są powszechnie badane i opisywane jako predysponujące do wystąpienia chorób autoimmunizacyjnych. Z drugiej strony liczne doniesienia dotyczą potencjalnego związku TAB z genami zaangażowanymi w regulację reakcji autoimmunologicznej. Ohara i wsp. oceniali wpływ chorób autoimmunizacyjnych na wystąpienie TAB w grupie 429 pacjentów leczonych chirurgicznie. Tkanki pochodzące od chorych ze współistniejącą chorobą autoimmunizacyjną, uzyskane śródoperacyjnie, wykazywały większy stopień degradacji blaszki elastycznej wewnętrznej aorty w porównaniu z materiałem pochodzącym od grupy 72 kontrolnej bez tych schorzeń. Nie sposób jednak stwierdzić czy był to wynik wpływu samych tylko zaburzeń układu immunologicznego czy też może wieloletniego oddziaływania leków należących do grupy kortykosteroidów, stosowanych u tych pacjentów a powodujących degenerację tkanki łącznej (Ohara i wsp., 2000). Najbardziej prawdopodobny wydaje się jednak łączny skutek działania farmakoterapii i nieprawidłowego funkcjonowania układu odpornościowego, być może także wraz z innymi czynnikami ryzyka. Kolejny zespół badaczy, oceniając związek występowania TAB z chorobami autoimmunizacyjnymi, wyodrębnił spośród 520 przypadków podgrupę 31 tętniaków zapalnych. Okazało się, że u wszystkich spośród 6 pacjentów obciążonych chorobą autoimmunizacyjną rozwinął się właśnie tętniak zapalny (Haug i wsp. 2003). Wyniki uzyskane w badaniach własnych nie wskazują na zależność pomiędzy oznaczonymi polimorfizmami genów PTPN22 i CTLA-4 a wystąpieniem TAB. Sugerowałoby to, że w zapadalności na tę chorobę rolę odgrywa czynnik związany z reakcją zapalną ale nie autoimmunologiczną. Analizując uzyskane wyniki trzeba jednak uwzględnić fakt, że zastosowane kryteria włączenia i wyłączenia uczestników badania wyeliminowały osoby, u których występowały choroby autoimmunizacyjne. Dlatego jeżeli występuje zależność pomiędzy tymi chorobami, to nie została ona zaobserwowana. W zgromadzonym materiale nie zdecydowano się na przeprowadzanie takiej analizy, ponieważ liczebności osób z chorobami autoimmunizacyjnymi były zbyt małe, żeby możliwe było uzyskanie wyniku na satysfakcjonującym poziomie prawdopodobieństwa. W związku z czym uznano, że zastosowanie wspomnianych kryteriów wyłączenia z badania zarówno w grupie kontrolnej jak i badanej nie powinno wpłynąć w sposób istotny na ostateczny wynik oznaczeń. Interesujące i zasadne wydaje się jednak kontynuowanie badań w większej grupie chorych. Procesowi degradacji aorty i poszerzaniu się zwyrodniałego naczynia towarzyszy toczący się proces zapalny, szeroko opisywany w literaturze. Proces zapalny z kolei jest ściśle powiązany z procesem krzepnięcia krwi. W czasie reakcji zapalnej aktywowane są zarówno czynniki pochodzące z komórek nacieku zapalnego ale także należące do układu fibrynolizy i krzepnięcia. Ze względu na regulatorowe funkcje, pełnione zarówno w procesie krzepnięcia jak i zapalenia, przedmiotem intensywnych badań jest obecnie inhibitor fibrynolizy aktywowany trombiną (TAFI). Czynnik ten jest enzymem proteolitycznym, ograniczającym powstawanie aktywnej plazminy w procesie fibrynolizy. Substratem dla niego może być nie tylko fibryna ale także przeciwzapalne peptydy (bradykinina, anafilatoksyny C3a i C5a, osteopontyna, annexyna II, chemerin). Szczególną uwagę zespołów badawczych przykuwają 75 osocza i agregatów płytkowych. Niedobór aktywności TAFI w osoczu chorych z TAB może świadczyć o tym, że czynnik ten aktywnie uczestniczy w procesie powstawania i modulacji skrzepu w świetle nadmiernie poszerzonej aorty. Prawdopodobnie ulega on wyczerpaniu, ponieważ jest aktywnie zaangażowany w tworzenie skrzepu, który pozostając w stałym kontakcie z krążącą krwią poddawany jest ciągłej przebudowie (Bajzar, 2000, Bajzar i wsp., 2004, Kazi i wsp., 2003, Mosnier i wsp., 2003). Następnie sprawdzono czy istnieje zależność między aktywnością białka TAFI a genotypem TAFI -438G/A i tętniakiem aorty brzusznej. Stwierdzono, że aktywność TAFI rośnie wraz ze wzrostem liczby alleli G w genomie, tak samo w grupie chorych i kontrolnej. Z każdym kolejnym allelem G średnia aktywność wzrasta o 5.78 punktów procentowych (CI95% (2.56;8.99), p = 0.0005). Jednocześnie w grupie kontrolnej aktywność TAFI jest zawsze większa niż w grupie chorych, bez względu na genotyp TAFI -438G/A, średnio o 6.87 punktów procentowych (CI95% (4.91;8.83), p<0.0001). W celu głębszego przeanalizowania tych zależności sformułowano i testowano cztery hipotezy, dla których otrzymane wyniki przedstawiono w Tabeli XXVII. Znakami +, 0, – oznaczono grupy jednorodne (nieodróżnialne w danej hipotezie). Dodatkowo grupy jednorodne oznaczano kolorami. Tabela XXVII. Hipotezy różnie opisujące zależność pomiędzy aktywnością TAFI a chorobą i genotypem TAFI -438G/A. Hipoteza Chorzy Kontrola ralerting reffect size Fcontrast lss=1;512 p-wartość AA GA GG AA GA GG H1 + + + – – – 0.616 0.238 11.98 0.0006 H2 – 0 + – 0 + 0.723 0.279 12.37 0.0005 H3 – 0 + + 0 – 0.249 0.096 1.47 0.2262 H4 * – – – – + +++ 0.923 0.356 48.97 <0.00001 * Hipoteza sformułowana a posteriori. Formułując pierwszą hipotezę, H1, założono, że średnia aktywność TAFI zależy tylko od grupy badanej, tzn. różnice występują tylko między chorymi i grupą kontrolną a genotyp TAFI -438G/A nie ma znaczenia. Porównywano zatem dwie grupy: chorych {AA, GA, GG} traktowanych łącznie, oraz grupę kontrolną {AA, GA, GG} także traktowaną łącznie, bez rozróżniania genotypów. Analiza pokazała, że średnia aktywność w grupie chorych jest inna 76 niż w grupie kontrolnej (Fcontrast = 11.98; p = 0.0006). Współczynnik ralerting, określający zgodność średnich grupowych z testowaną hipotezą, przyjmuje wartość ralerting = 0.616, co świadczy o tym, że średnie grupowe w umiarkowanym stopniu wspierają omawianą hipotezę. Po uwzględnieniu dwóch dodatkowych źródeł zmienności, tj. zróżnicowania obserwacji wewnątrz grup oraz różnic między średnimi grupowymi, których nie da się wytłumaczyć testowaną hipotezą, stwierdzono, że współczynnik reffect size = 0.238. Hipotezę drugą, H2, oparto na założeniu, że wpływ na średnią aktywność TAFI ma tylko genotyp w miejscu polimorficznym TAFI -438G/A, a różnic między chorymi i grupą kontrolną nie ma. Wyodrębniono zatem 3 oddzielne grupy, oznaczone w Tabeli XXVII symbolami +, 0, –. Dla tak postawionej hipotezy uzyskano ralerting = 0.723, zatem średnie grupowe dobrze pasują do testowanej hipotezy. Po uwzględnieniu dwóch dodatkowych źródeł zmienności otrzymano reffect size = 0.279, który pokazuje, że dane eksperymentalne trochę lepiej wspierają hipotezę H2 niż omawianą wyżej H1. Na tej podstawie stwierdzono, że bez wątpienia genotyp w miejscu polimorficznym TAFI -438G/A ma związek z aktywnością produktu tego genu (Fcontrast = 12.37; p = 0.0005). Trzecia testowana hipoteza, H3, wypływa z założenia, że zarówno genotyp TAFI -438G/A jak i choroba mają związek z poziomem aktywności TAFI ale związek genotypu nie jest taki sam w grupie chorych i kontrolnej a różnice między chorymi i kontrolą zależą od genotypu. Założono tu zatem istnienie interakcji między genotypem a chorobą. Wyniki przedstawione w Tabeli XXVII pokazują, że hipoteza ta nie znajduje poparcia w danych eksperymentalnych. Współczynnik korelacji między średnimi grupowymi a ujętymi w hipotezie zależnościami jest niski i wynosi ralerting = 0.249, a po uwzględnieniu różnic między średnimi grupowymi, których omawiana hipoteza nie tłumaczy jak i różnic między obserwacjami w obrębie poszczególnych grup, współczynnik reffect size = 0.096. Wartość ta jest bardzo mała i oznacza, że hipoteza H3 nie znajduje potwierdzenia w wynikach pomiarów aktywności TAFI (Fcontrast = 1.47; p = 0.2262). Hipotezy H1, H2 i H3 zostały sformułowane a priori, gdyż są tak oczywiste, że zamiar ich testowania został powzięty zanim otrzymano wyniki pomiarów aktywności TAFI. Inaczej było w przypadku hipotezy czwartej, H4, która wywodzi się z uzyskanych wyników. Sformułowano ją na podstawie różnic między przeciętnym poziomem aktywności TAFI obserwowanych w zależności od genotypu i grupy badanej. Hipoteza ta zakłada, że średnia aktywność TAFI spada wraz ze wzrostem liczby alleli A (czyli rośnie wraz ze wzrostem 77 liczby alleli G) a także, że w grupie chorych aktywność TAFI nie zależy od genotypu -438G/A TAFI i przyjmuje średnią wartość taką, jak średnia aktywność TAFI u osób z grupy kontrolnej o genotypie AA. Innymi słowy, wszyscy chorzy mają średnią aktywność TAFI taką samą, bez względu na genotyp -438G/A i taką samą jak średnia aktywność u osób AA w grupie kontrolnej. Wyniki testowania H4, przedstawione w Tabeli XXVII, ujawniają, że jest to hipoteza najlepiej pasująca do danych eksperymentalnych. Współczynnik ralerting = 0.923 świadczy o bardzo wysokiej zgodności średnich grupowych z założeniami tej hipotezy, a po uwzględnieniu różnic między grupami, których nie da się wytłumaczyć w jej ramach oraz różnic między aktywnością w obrębie trzech wyróżnionych grup uzyskano reffect size = 0.356. Jest to wartość najwyższa spośród czterech testowanych hipotez i pokazuje, że H4 znajduje najlepsze potwierdzenie w danych eksperymentalnych (Fcontrast = 48.97; p < 0.0001). Należy jednak zastrzec, że dobre dopasowanie hipotezy do danych może wynikać nie z tego, że opisywana w H4 zależność rzeczywiście występuje ale z tego, że hipoteza ta została sformułowana a posteriori, czyli na podstawie otrzymanych danych. W H4 zakładano zarówno efekt genotypu jak i efekt choroby w związku z aktywnością produktu TAFI, podobnie jak w hipotezach H1 i H2. Jednak H4 jest od nich bardziej skomplikowana, gdyż zakłada, że efekt genotypu nie jest taki sam w grupie chorych i kontrolnej, a jeśli obie grupy różnią się aktywnością to różnice te nie są takie same w przypadku trzech genotypów TAFI -438G/A. Wobec powyższego uzasadnione wydaje się przyjęcie, że zależność między poziomem aktywności TAFI a genotypem -438G/A i chorobą lepiej opisano hipotezami H1 i H2 niż, wymagającą więcej założeń, hipotezą H4. Średnia aktywność TAFI rośnie wraz ze wzrostem liczby alleli G w genomie. Homozygoty GG mają więc wyższą średnią aktywność TAFI aniżeli homozygoty AA w obu analizowanych grupach. Jak wynika z piśmiennictwa, polimorfizm ten podobnie jak dwa pozostałe 1040C/T i 505A/A jest powiązany ze stężeniem białka TAFI we krwi. W przypadku polimorfizmu -438G/A, który jest przedmiotem badań rozprawy, wyższe stężenie antygenu TAFI obserwuje się właśnie u homozygot GG, co jest zgodne z prezentowanymi wynikami, dotyczącymi aktywności TAFI w badanych grupach. Analiza uzyskanych wyników genotypowania wariantu – 438G/A w grupie badanej i kontrolnej nie wykazała zamian w częstości występowania poszczególnych alleli, które w świetle literatury warunkują zmianę stężenia antygenu TAFI we krwi. Na tej podstawie można wnioskować, że obserwowany spadek aktywności tego czynnika nie wynika ze spadku stężenia antygenu TAFI uwarunkowanego genotypem –438G/A TAFI. Wiadomym jest, że wraz ze spadkiem stężenia 80 że do badań naukowych, a w szczególności badań dotyczących polimorfizmów genetycznych, dla których uzyskiwane wartości OR zwykle są niewielkie, jest to parametr niewystarczający. Żeby zmniejszyć efekt wpływu różnic osobniczych na przeprowadzaną analizę zależności pomiędzy badanymi polimorfizmami genetycznymi a średnicą aorty prawidłowej lub tętniakowato poszerzonej, posłużono się wskaźnikiem wielkości aorty ASI. Parametr ten wyraża średnicę naczynia [cm] w stosunku do powierzchni ciała [m 2 ]. Zastosowano także wskaźnik BMI index, który wyraża średnicę aorty [cm] w stosunku do BMI [kg/m 2 ]. Zabieg ten, wprowadzając normalizację wartości ocenianych parametrów poprzez ich indeksowanie, ma niebagatelne znaczenie dla interpretacji uzyskanych wyników (Lo i wsp., 2014). Zaobserwowano, że mężczyźni mają wskaźnik ASI niższy średnio o 8.6% w porównaniu do chorych kobiet. W badanej grupie osób płeć wykazuje więc związek ze średnicą tętniaka (λPillai = 0.131; p < 0.0001). Przedział ufności CI95%(-13.86; -3.02) jaki uzyskano dla tej różnicy pokazuje, że prawie na pewno różnica ta nie jest większa niż 13.86% i nie mniejsza niż 3.02%. Takich różnic nie wykazano w przypadku wskaźnika BMIindex, gdyż otrzymana z próby różnica wynosiła tylko 1.2%, dodatkowo przedział ufności CI95%(-6.29; 9.29) pokrywając zero nie dostarczył dowodów na to, że taka różnica istnieje. Również w grupie kontrolnej wykazano związek średnicy aorty brzusznej z płcią (λPillai = 0.068; p = 0.0002). Związek ten przejawia się w tym, że średnia uzyskana wartość BMIindex w grupie mężczyzn jest o 15.08% większa w porównaniu ze średnią wartością tego wskaźnika w grupie kobiet. Przedział ufności dla tej różnicy, wynoszący CI95%(4.47; 26.77) oznacza, że w rzeczywistości różnica ta może wynosić nawet 26% i prawie na pewno nie jest niższa niż 4.5%. Zgodnie z oczekiwaniami, potwierdzono także związek średnicy TAB z wiekiem pacjenta (λPillai = 0.037; p = 0073). Z każdym kolejnym rokiem życia średnia wartość ASI i BMIindex wzrasta o ok. 0.4%. Oznacza to, że w grupie osób starszych o 10 lat oba wskaźniki będą wyższe średnio o ok. 4.0% w porównaniu z grupą osób młodszych, przy pozostałych zmiennych klinicznych utrzymanych na tym samym poziomie. Uwzględniając wpływ czynników klinicznych na wskaźniki ASI i BMIindex, przeprowadzono analizę związku pomiędzy nimi a polimorfizmami genetycznymi oznaczanymi w pracy. W przypadku polimorfizmu 1858C/T w genie PTPN22 stwierdzono, że homozygoty TT mają średnio o 10.55% niższe wskaźniki ASI i o około 14.75% niższe wskaźniki BMIindex w porównaniu do homozygot CC. Przedziały ufności CI95% dla tych różnic nie pokrywają zera, co mogłoby świadczyć o tym, że różnice te nie są przypadkowe. 81 Należy jednak zwrócić uwagę, że jednocześnie przedziały te są bardzo szerokie, a tym samym mało precyzyjne, gdyż genotyp TT jest rzadki i posiadało go tylko 10 osób w grupie chorych. Globalna statystyka λPillai = 0.023 wskazuje, że nie można wykluczyć, iż różnice te są przypadkowe (p = 0.19). Ponadto nie ma dowodów także na związek średnicy tętniaka z drugim polimorfizmem w tym genie, tj. z genotypem w locus -1123G/C mimo, że pomiędzy oba loci występuje znaczące niezrównoważenie gametyczne (miary linkage disequilibrium, LD, D ’ = 0.83, r 2 = 0.39). Rozpatrując z kolei polimorfizm -455G/A FGB zaobserwowano, że osoby o genotypie GA mają średnio o 3.72% wyższy wskaźnik ASI niż osoby o genotypie AA, oraz średnio o 5.32% wyższy wskaźnik BMI index niż osoby o genotypie AA. Przedziały ufności CI95% dla tych różnic pokazują jednak brak dowodów na to, że różnice między genotypami w rzeczywistości występują. Podobnie osoby o genotypie GG w tym locus mają średnio o 3.68% wyższy wskaźnik ASI niż osoby o genotypie AA i o 6.3% wyższy wskaźnik BMIindex. Tak samo jednak, jak w przypadku heterozygot GA, przedziały ufności CI95% dla zaobserwowanych z próby różnic nie dostarczają dowodów na potwierdzenie tej tezy. Aby jednak dokładniej scharakteryzować związek średnicy aorty prawidłowej z genotypem w miejscu polimorficznym -455G/A genu FGB przeanalizowano jak znajomość średnicy aorty, wyrażona wskaźnikiem ASI, wpływa na ocenę prawdopodobieństwa tego, że dowolna osoba z grupy kontrolnej ma genotyp AA w miejscu -455G/A genu FGB. Jeśli nie jest znany wskaźnik ASI dla tej osoby, to można stwierdzić, że prawdopodobieństwo tego, że osoba ta jest homozygotą AA wynosi   096.0?| ASIAAP , gdyż na tyle oszacowano częstość tego genotypu w populacji kontrolnej. Przedział ufności dla tej częstości wynosi CI95%(0.062; 0.14). Wiadomo jednak, że wraz ze wzrostem liczby alleli A w tym locus oczekiwana wartość ASI także rośnie, a homozygoty AA mają ten parametr większy od pozostałych dwóch genotypów. Znając zatem wartość wskaźnika ASI dla danej osoby można określić prawdopodobieństwo tego, że jest ona homozygotą AA. Prawdopodobieństwo to będzie zależało od wartości ASI. Opisaną zależność zilustrowano na Rycinie 21, na której   096.0?| ASIAAP zaznaczono czerwoną linią. Z przebiegu niebieskiej krzywej można odczytać jakie jest prawdopodobieństwo tego, że osoba, która może być kontrolą dla chorych na tętniaka 1 , jest homozygotą AA. Przykładowo, jeśli u danej osoby wskaźnik ASI = 0.9, to 1 Celowo nie użyto sformułowania „dowolna osoba nie mająca tętniaka aorty”, gdyż grupa kontrolna w tej pracy nie jest najpewniej reprezentatywną, pod względem częstości genotypów w polimorfizmie FGB -455 G/A, grupą całej populacji generalnej osób nie posiadających tętniaka. Być może jest, ale tego nie można zakładać 82 prawdopodobieństwo tego, że osoba ta jest homozygotą AA nie wynosi P = 0.096 lecz jest o 35% mniejsze i wynosi   062.09.0| ASIAAP . Podobnie prawdopodobieństwo tego, że osoba jest AA, jeśli jej wskaźnik ASI = 1.1 wynosi   138.01.1| ASIAAP . Rozpatrując różnice pomiędzy prawdopodobieństwami AA dla ASI=0.9 i ASI=1.1, stwierdzono, że pomiędzy tymi dwoma wartościami ASI różnica wynosi 22%, a różnica pomiędzy oszacowanymi dla nich prawdopodobieństwami aż 122%. Pokazuje to, że związek między genotypem FGB -455G/A a wskaźnikiem ASI w grupie kontrolnej nie jest mały. Ryc. 21. Prawdopodobieństwo (linia niebieska) tego, że osoba z populacji kontrolnej będzie homozygotą AA w miejscu polimorficznym -455G/A genu FGB , w zależności od jej wskaźnika ASI. Linią czerwoną zaznaczono to samo prawdopodobieństwo przy nieznajomości ASI u tej osoby. W celu określenia, czy związek polimorfizmu FGB -455G/A ze średnicą aorty brzusznej jest silny czy słaby, można wyrazić go także w ilorazach szans (OR) tego, że dana osoba jest homozygotą AA jeśli jej wskaźnik ASI przyjmuje daną wartość. Pozostając przy powyższych przykładach ASI = 0.9 i ASI = 1.1, szansa tego iż osoba jest homozygotą AA jeśli jej ASI = 1.1 wzrasta OR = 1.5 razy w stosunku do szansy tego zdarzenia przy nieznajomości ASI. Podobnie, szansa tego, że osoba nie jest AA, jeśli jej ASI = 0.9 wzrasta OR = 1.6 razy w stosunku do szansy tego zdarzenia oszacowanej bez znajomości ASI. z uwagi na to, że są to osoby cierpiące na określone choroby i dobrane celowo tak, by być dobrą kontrolą dla badanych osób z tętniakiem aorty brzusznej. 85 Tabela XXIX. Łączna analiza genotypów w locus FGB -455G/A, zbierająca wyniki uzyskane w pracy Austriaków (Renner i wsp., 2002) oraz w grupach chorych z TAB i kontrolnej. FGB -455G/A AA GA GG Razem Renner i wsp.: kontrola 20 133 163 316 % 6.3 42.1 51.6 100% rezyduum -0.461 1.335 -1.073 - Renner i wsp.: chorzy 18 126 163 307 % 5.9 41 53.1 100% rezyduum -0.828 0.870 -0.430 - TAB 17 106 151 274 % 6.2 38.7 55.1 100% rezyduum -0.512 -0.111 0.369 - Razem 55 365 477 897 % 6.1 40.7 53.2 100% χ 2 lss=4 = 0.8341; p = 0.9338 Kontrola dla TAB 24 82 144 250 % 9.6 32.8 57.6 100% rezyduum 1.915 -2.262 1.241 - OR 1 * 1.94 1.45 CI95% - 1.14; 3.32 0.86; 2.42 χ 2 lss=2 = 7.2452; p = 0.0267 *Genotyp AA jako grupa odniesienia. Źródło: Wykorzystano wyniki badań własnych oraz przedstawione w pracy Renner i wsp., 2002 Analizując uzyskane wyniki stwierdzono, że grupy te różnią się od siebie nieprzypadkowo (χ 2 lss=2 = 7.2452; p = 0.0267). Zaobserwowano, że w grupie kontrolnej dla TAB jest więcej homozygot AA niż należałoby oczekiwać, gdyby grupa ta nie różniła się od trzech pozostałych grup, tzn. dwóch austriackich i grupy TAB. Dla obserwowanej liczebności homozygot AA w grupie kontrolnej dla TAB, wynoszącej n=24 uzyskano wysoką wartość standaryzowanego rezyduum (in. reszta, odstępstwo) wynoszącą 1.915, co plasuje ją w ogonie standardowej krzywej normalnej. Rezyduum jest wysokie i dodatnie, gdyż obserwowana liczebność AA jest dużo za duża w porównaniu do oczekiwanej, wynoszącej n = 17.2. Co 86 więcej, dla obserwowanej liczebności heterozygot GA w grupie kontrolnej dla TAB, wynoszącej n = 82 osoby, uzyskano rezyduum = –2.262, gdyż oczekiwana liczebność jest większa i wynosi n = 97.4 osoby. Heterozygota GA ma OR = 1.94 razy więcej szans na wystąpienie tętniaka aorty niż homozygota AA. Przedział ufności pokazuje, że może to być nawet OR = 3.32 razy więcej. Podobnie, homozygota GG ma OR = 1.45 razy więcej szans na tętniaka w porównaniu z homozygotą AA. Ostatecznie wykazano więc, że polimorfizm FGB -455G/A ma związek z TAB. Przejawia się on tym, że warto być homozygotą AA aby nie mieć TAB. Ponadto osoby kontrolne dla TAB, będące homozygotą AA, mają największą średnicę ASI. Innymi słowy im więcej allelu A, tym większa średnica ASI w grupie kontrolnej. Jak już wspomniano, wzrost aktywności prozakrzepowej może mieć znaczenie w procesie formowania się skrzepliny przyściennej, która bardzo często towarzyszy tętniakowi aorty brzusznej. Jak wynika z danych literaturowych, zmniejsza ona o około 8% ciśnienie panujące w świetle tętniaka i powoduje równomierny rozkład sił działających ścianę tętniaka, dzięki czemu zmniejsza obciążenie hemodynamiczne ściany i szybkość powiększania się średnicy tętniaka. Z drugiej jednak strony utrudnia transport składników odżywczych i tlenu, co przyczynia się do ścieńczania ściany TAB i zwiększa ryzyko jego pęknięcia (Humphrey i Holzapfel, 2012). W świetle uzyskanych wyników genotypowań, żaden z badanych polimorfizmów nie jest związany z grubością skrzepliny. Na Rycinie 22 zamieszczono krzywe ilustrujące prawdopodobieństwo zdarzenia, że grubość skrzepliny przyściennej będzie nie mniejsza niż 20 mm, w zależności od wskaźnika ASI. Szansa na to, że grubość skrzepliny pacjenta o genotypie GA, w miejscu polimorficznym -455G/A genu FGB, będzie nie mniejsza niż k = 16 mm jest OR = 1.33 razy większa niż szansa tego zdarzenia u pacjenta o genotypie AA w tym locus. Jednak przedział ufności dla tego ilorazu, wynoszący CI95% (0.53; 3.38), pokazuje, że nie można wykluczyć iż w rzeczywistości szansa heterozygoty GA jest dwukrotnie mniejsza niż szansa homozygoty AA (OR = 0.53). Nie ma więc dowodu na różnice w grubości skrzepliny między homozygotami GA i AA. Taki sam wniosek wyciągnięto z porównania homozygoty GG z homozygotą AA. Analizując uzyskane wyniki stwierdzono, że nie ma żadnych przesłanek do twierdzenia, że genotyp w miejscu polimorficznym -455G/A genu FGB ma związek z grubością skrzepliny przyściennej w tętniaku aorty brzusznej (χ 2 lss=2 = 0.40; p = 0.8202). Analogiczne wyniki uzyskano dla pozostałych badanych polimorfizmów. 87 Rycina 22. Prawdopodobieństwo, że grubość skrzepliny przyściennej będzie nie mniejsza niż 20 mm, w zależności od wskaźnika ASI, u kobiet i mężczyzn. Ograniczeniem przeprowadzonych badań może być dobór grupy badanej, rekrutowanej wyłącznie spośród pacjentów zakwalifikowanych do operacji naprawczej TAB. Obecnie nie jest jednak możliwy dobór reprezentatywnej próby populacji, z jednej strony ze względu na brak badań przesiewowych a z drugiej strony z uwagi na wysoką śmiertelność wynikającą z bezobjawowego przebiegu schorzenia. Natomiast konstruując grupę kontrolną dołożono wszelkich starań aby była jednorodna i dobrana odpowiednio do celów i założeń badania. Biorąc pod uwagę, że procesy takie jak degradacja elastyny, przebudowa kolagenu czy reakcja zapalna są charakterystyczne również dla innych lokalizacji tętniaków, to pomimo różnic w etiologii uzasadnionym wydaje się sprawdzić uzyskane wyniki także w innych lokalizacjach badanej patologii. Podsumowując, niniejsze doniesienie stanowi pierwszą obserwację dotyczącą wpływu polimorfizmu FGB -455G/A na wskaźnik średnicy aorty ASI. Potwierdza tym samym 90 7. STRESZCZENIE Tętniak aorty brzusznej jest chorobą wieloczynnikową, w przebiegu której nierozpoznane jak dotąd czynniki endo- i egzogenne zapoczątkowują i modulują proces patologicznego poszerzania się ściany aorty. Pomimo wielu badań, prowadzonych zarówno w materiale ludzkim jak i na modelu zwierzęcym, etiologia tej choroby jest wciąż słabo zdefiniowana. Niemniej jednak autorzy aktualnych publikacji poświęconych temu zagadnieniu zgadzają się co do połączonego wpływu czynników środowiskowych i genetycznych na jego powstawanie i rozwój. Dotychczas nie opracowano skutecznego systemu wczesnej diagnostyki ani terapii farmakologicznej. Pomimo ciągłego rozwoju chirurgii, także wyniki leczenia chorych z tętniakiem objawowym czy pękniętym nie są zadowalające. Geny PTPN22, CTLA4, FGB oraz TAFI i ich polimorfizmy pojedynczych nukleotydów wytypowano do badania ze względu na biologiczne funkcje, potencjalnie łączące je z występowaniem tętniaka aorty brzusznej. Gen PTPN22 koduje limfocytarną fosfatazę tyrozynową, a jego polimorfizm 1858C/T przyczynia się do zaburzenia przekazywania sygnału do wnętrza limfocytów T, co może skutkować zwiększeniem ryzyka rozwoju odpowiedzi immunologicznej. Z kolei polimorfizm 49A/G genu CTLA-4 powoduje zamianę treoniny na alaninę w cząsteczce CTLA-4. Zmiana ta zaburza apoptozę aktywowanych limfocytów i prowadzi do utraty kontroli nad nimi, co może powodować rozwój chorób o podłożu zapalnym. Cząsteczką, biorącą udział w procesie krzepnięcia krwi a także w reakcji zapalnej, jest syntetyzowany w hepatocytach fibrynogen, którego łańcuch Bβ kodowany jest przez gen FGB. Polimorfizm -455A/G genu FGB wpływa na stężenie fibrynogenu we krwi. Również aktywowany trombiną inhibitor fibrynolizy, TAFI, bierze udział zarówno w utrzymywaniu homeostazy pomiędzy układami krzepnięcia i fibrynolizy jak i w procesach zapalnych, a jego wariant polimorficzny -438G/A w badaniach populacyjnych wykazywał związek ze wzrostem śmiertelności z przyczyn sercowo- naczyniowych wśród mężczyzn. Celem pracy była ocena związku pomiędzy wybranymi odmianami polimorficznych genów PTPN22, CTLA4, TAFI i FGB a predyspozycją do wystąpienia tętniaka aorty brzusznej, a także analiza zależności między badanymi polimorfizmami a średnicą tętniaka aorty brzusznej i brzusznego odcinka prawidłowej aorty oraz analiza zależności między genotypem w locus TAFI -438 G/A a aktywnością produktu białkowego tego genu. 91 Do badań włączono 305 pacjentów hospitalizowanych w latach 2010 - 2014 na Oddziale Chirurgii Naczyniowej Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego we Wrocławiu, Ośrodka Badawczo-Rozwojowego, natomiast do grupy kontrolnej włączono 250 wolontariuszy zakwalifikowanych w trakcie „białych sobót” przeprowadzonych w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym we Wrocławiu, Ośrodku Badawczo- Rozwojowym pod hasłem: „Wczesne Wykrywanie Tętniaka Aorty Brzusznej” na przełomie marca i lutego 2013 roku. Każdy ochotnik miał ultrasonograficznie potwierdzony prawidłowy przebieg aorty i zwymiarowaną średnicę naczynia. Materiałem do badań była krew obwodowa, pobierana z żyły odłokciowej do probówek z antykoagulantem. Analizę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu -438G/A w genie TAFI oraz 1858C/T w genie PTPN22 wykonano techniką dyskryminacji alleli z użyciem sond typu TaqMan. Typowanie SNPs 49A/G w genie CTLA-4, -1123C/G w genie PTPN22 oraz -455G/A w genie FBG przeprowadzono z wykorzystaniem metody PCR-RFLP. Oznaczenie aktywności TAFI w osoczu przeprowadzono za pomocą komercyjnie dostępnego testu TAFI Activity Kit firmy American Diagnostica GmbH. Zgodność rozkładu genotypów z rozkładem oczekiwanym z równowagi Hardy’ego-Weinberga, weryfikowano testem chi-kwadrat χ 2 . Ilorazem szans i przedziałem ufności (CI95%) dla niego na poziomie 1-α=0.95 określano siłę związku genotypu z chorobą. Dla loci PTPN22 1858C/T i PTPN22 -1123C/G obliczono niezrównoważenie sprzężeń (ang. linkage disequilibrium, LD). Modelem liniowym analizowano aktywność produktu genu TAFI, aTAFI. Porównanie częstości genotypów w grupie chorych i kontrolnej nie daje podstaw do twierdzenia, że polimorfizmy CTLA-4 49A/G, PTPN22 1858C/T i PTPN22 -1123C/G mają związek z występowaniem tętniaka aorty brzusznej. Natomiast rozpatrując polimorfizm -455G/A FGB zaobserwowano, że osoby o genotypie GA mają średnio o 3.72% wyższy wskaźnik ASI niż osoby o genotypie AA, oraz średnio o 5.32% wyższy wskaźnik BMI index niż osoby o genotypie AA. Przeprowadzona analiza pozwoliła na wysnucie następujących wniosków: heterozygota GA ma 1.94 razy więcej szans na wystąpienie tętniaka aorty brzusznej niż homozygota AA, a przedział ufności pokazuje, że może to być nawet OR =3.32 razy więcej. Podobnie, homozygota GG ma 1.45 razy więcej szans na tętniaka w porównaniu z homozygotą AA. Polimorfizm FGB -455G/A ma związek z TAB. Ponadto osoby kontrolne dla TAB, będące homozygotą AA, mają największą średnicę ASI. Im więcej allelu A, tym większa średnica ASI w grupie kontrolnej. Z kolei w przypadku polimorfizmu -438G/A TAFI, wyższe stężenie antygenu TAFI obserwuje się u homozygot GG, co jest 92 zgodne z prezentowanymi wynikami, dotyczącymi aktywności TAFI w badanych grupach. Przy czym spadek aktywności TAFI w grupie badanej nie zależy od badanego genotypu -438G/A. Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykazała, że średnia aktywność TAFI rośnie wraz ze wzrostem liczby alleli G w genomie. Homozygoty GG mają wyższą średnią aktywność TAFI aniżeli homozygoty AA w obu analizowanych grupach. Jak wynika z piśmiennictwa, polimorfizm ten jest powiązany ze stężeniem białka TAFI we krwi. Wiadomym jest, że wraz ze spadkiem stężenia danego czynnika we krwi należy się spodziewać spadku jego aktywności. Obecność antygenu nie jest jednak równoznaczna z obecnością białka aktywnego we krwi. W krwioobiegu TAFI może występować jako nieaktywny zymogen uaktywniany proteolitycznie trombiną miejscowo, w czasie nasilenia się procesów koagulacyjnych. Zatem nie można wykluczyć, że wraz ze spadkiem aktywności TAFI spada jego stężenie. Pewnym jest, że obok czynników środowiskowych również czynniki genetyczne odgrywają rolę w patogenezie tętniaka aorty brzusznej. Wyniki badań epidemiologicznych nie pozostawiają co do tego wątpliwości. Z uwagi na złożoność obserwowanych fenotypów tętniaka, wpływ genów na zapadalność na TAB pochodzi najprawdopodobniej zarówno z sumowania się wpływów alleli lub loci jak i z interakcji pomiędzy nimi (wpływ addytywny i nieaddytywny). Predyspozycja do rozwoju tej choroby jest także wynikiem interakcji genotypu z czynnikami środowiskowymi. Nawet jeżeli w przyszłości okaże się, że na tą chorobę wpływają głównie ewolucyjnie młode, rzadkie geny, to stale dokonujący się postęp technologiczny i metodologiczny w epidemiologii molekularnej pozwala sądzić, że możliwa będzie ich identyfikacja. Jej wynikiem z kolei może być nie tylko poznanie patomechanizmu choroby i wyjaśnienie przyczyn klinicznej różnorodności obserwowanych fenotypów TAB ale także usprawnienie wczesnej diagnostyki i zmniejszenie przedwczesnej umieralności. Stworzy także szansę na opracowanie strategii terapii zindywidualizowanej i wdrożenie poradnictwa genetycznego dla rodzin obciążonych ryzykiem zachorowania. 95 polymorphism, a higher concentration of the TAFI antigen is observed in the GG homozygotes, which is consistent with the presented results concerning the TAFI activity in the test groups. A decrease in the TAFI activity in the test group does not depend on the tested -438G/A genotype. The statistical analysis of the obtained results showed that the average TAFI activity increases with the number of the G alleles in the genome. The GG homozygotes have a higher than average TAFI activity as compared to the AA homozygotes in both analysed groups. As the literature clearly shows, this polymorphism is associated with TAFI protein concentration in the blood. It is known that with the decrease in the concentration of the particular agent in the blood, a decrease in its activity can be expected. The presence of the antigen is not synonymous with the presence of the active protein in the blood. In the blood stream, TAFI may occur as an inactive zymogen proteolytically activated by thrombin locally with an increase in coagulation processes. Therefore, it cannot be ruled out that with the decrease in the TAFI activity, its concentration decreases. It is certain that in addition to environmental factors, genetic factors also affect the pathogenesis of the abdominal aortic aneurysm. Epidemiological studies leave no doubt about it. Due to the complexity of the observed phenotypes of the aneurysm, the impact of the genes on the incidence of TAB probably comes from the sum of influences of alleles or loci and from the interaction between them (an additive and non-additive impact). Predisposition to the development of this disease is also the result of the genotype interaction with environmental factors. Even if it is shown in the future that this condition affects mainly evolutionarily young and rare genes, the constantly advancing technology and methodology in molecular epidemiology suggest that it will be possible to identify them. In turn, not only can the pathogenesis of the disease and explanation of the clinical causes for the observed TAB phenotype diversity be known as a result thereof, but also the early diagnosis and reduction of premature mortality can improve. It will also create an opportunity to develop individualized treatment strategies and implement genetic counselling for high risk families. 96 9. LITERATURA Anderson J.J., Wendy L., Jeffrey I. W., Genetics of Coagulation: What the Cardiologist Needs to Know. Canadian Journal of Cardiology 2013; 29(1): 75–88. Bajzar L., Jain N., Wang P., Walker J.B., Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor: not just an inhibitor of fibrinolysis. Crit Care Med 2004; 32(5): 320-324. Bajzar L., Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor and an Antifibrinolytic Pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20(12): 2511-2518. Baxter B.T., McGee G.S., Shively V.P., Drummond I.A., Dixit S.N. i wsp., Elastin content, cross-links, and mRNA in normal and aneurysmal human aorta. J Vasc Surg 1992; 16: 192– 200. Begovich A.B., Carlton V.E., Honigberg L.A., Schrodi S.J., Chokkalingam A.P. i wsp., A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis. Am. J. Hum. Genet 2004; 75(2): 330–337. Bilińska M., Frydecka I., Noga L., Dobosz T., Zołedziewska M. i wsp., Progression of multiple sclerosis is associated with exon 1 CTLA-4 gene polymorphism. Acta Neurol Scand. 2004; 110(1): 67-71. Biros E., Cooper M., Palmer L.J., Walker P.J., Norman P.E. i wsp., Association of an allele on chromosome 9 and abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis 2010; 212(2): 539–542. Biros E., Norman P.E., Jones G.T., van Rij A.M., Yu G. i wsp., Meta-analysis of the association between single nucleotide polymorphisms in TGF-β receptor genes and abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis 2011; 219(1): 218–223. Blombäck B., Fibrinogen and fibrin--proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res 1996; 83(1): 1-75. 97 Borkett-Jones H.J., Stewart G., Chilvers A.S., Abdominal aortic aneurysms in identical twins. J R Soc Med 1988; 81(8): 471-472. Børsting C., Morling N., Single-Nucleotide Polymorphisms. Encyclopedia of Forensic Sciences, Elsevier 2013, 233-238. Bottini N., Musumeci L., Alonso A., Rahmouni S., Nika K. i wsp., A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is associated with type I diabetes. Nat Genet 2004; 36: 337– 338. Botvinick E.H., Perini R., Bural G., Chen W., Chryssikos T. i wsp., The Aging of the Heart and Blood Vessels: A Consideration of Anatomy and Physiology in the Era of Computed Tomography, Magnetic Resonance Imaging, and Positron Emission Tomographic Imaging Methods With Special Consideration of Atherogenesis. Semin Nucl Med 2007; 37(2): 120– 143. Bown M.J., Braund P.S., Thompson J., London N.J., Samani N.J. i wsp., Association between the coronary artery disease risk locus on chromosome 9p21.3 and abdominal aortic aneurysm. Circ Cardiovasc Genet 2008; 1(1): 39–42. Bridge K.I., Macrae F., Bailey M.A., Johnson A., Philippou H. i wsp., The alpha-2- antiplasmin Arg407Lys polymorphism is associated with Abdominal Aortic Aneurysm. Thromb Res 2014; 134(3): 723–728. Brophy C.M., Reilly J.M., Smith G.J., Tilson M.D., The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 1991; 5(3): 229-233. Burn GL., Svensson L., Sanchez-Blanco C., Saini M., Cope A.P., Why is PTPN22 a good candidate susceptibility gene for autoimmune disease. FEBS Lett 2011; 585(23): 3689–3698. Carrell T.W., Burnand K.G., Wells G.M., Clements J.M., Smith A., Stromelysin-1 (matrix metalloproteinase-3) and tissue inhibitor of metalloproteinase-3 are overexpressed in the wall of abdominal aortic aneurysms. Circulation 2002; 105: 477–482.