Technologia i mikrobiologia fermentacji octowej, Notatki z Mikrobiologia

Pobierz Technologia i mikrobiologia fermentacji octowej i więcej Notatki w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity! Adres do korespondencji Jerzy Czuba, Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, ul. Rakowiecka 36, 02-532 Warszawa. biotechnologia 3 (62) 233-240 2003 PRACE PRZEGLĄDOWE Technologia i mikrobiologia fermentacji octowej Jerzy Czuba Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa Technology and microbiology of acetic acid fermentation Summary Vinegar producing is one of the oldest processes of biotechnology. It con­ sists of double fermentation, alcoholic and acetous. There are three groups of methods of acetous fermentation: surface, trickling and submerse. They are well elaborated from technological and technical points of view, but the taxon­ omy and methods for identification of the bacteria active in technical processes are still open. According to the results of molecular researches, the new genus Gluconacetobacter (characterised by requirement of the acetic acid for growing and lack of ability to oxidise acetic acid to CO2 and H2O - the main features of genus Acetobacter) was separated from acetic acid bacteria group. However, the results of few experiments showed that these phenotypic features (characteris­ tic for the genus Gluconacetobacter) could be changed in to the features charac­ teristic for genus Acetobacter by special procedure of growing. It is a question of how the differences between the same bacteria with different phenotypes would be identified by molecular methods. Key words: vinegar, technology, Acetobacter, Gluconacetobacter. 1. Wstęp Obok fermentacji alkoholowej i mlekowej jednym z najstar­ szych procesów biotechnologicznych wykorzystywanych przez człowieka jest fermentacja octowa. Pierwszy ocet był prawdopo­ dobnie niezamierzonym produktem powstałym w wyniku nie­ właściwego przebiegu procesu wytwarzania napoju alkoholowe­ go. Potwierdzeniem takiej tezy może być wytwarzanie octu. Jerzy Czuba W różnych regionach świata, z tych samych surowców co tradycyjnych napojów al­ koholowych, np. octu winnego w krajach śródziemnomorskich, octu słodowego w Wielkiej Brytanii, octu ryżowego w krajach Dalekiego Wschodu. Ocet jest produktem otrzymanym wyłącznie w procesie biologicznym poprzez następujące po sobie fermentacje alkoholową i octową z surowców pochodzenia rolniczego. Nazwą ocet nie może być znakowany roztwór syntetycznego kwasu octowego lub mieszanina octu i syntetycznego kwasu octowego (1). Istnieje wiele udokumentowanych informacji (2), że już w starożytności ocet, zdefiniowany w ten sposób, był wykorzystywany jako popularna przyprawa, środek konserwujący, napój orzeźwiający czy rozpuszczalnik. Był także szeroko stosowany w medycynie, kosmetyce i chemii. W związku z rozwojem różnych dziedzin wiedzy (nauki o żywności, medycyny, farmacji, chemii) niektóre funkcje octu przejęły inne produkty, ale nadal pełni on rolę samodzielnej przyprawy, ważnego składnika okreś­ lonych produktów spożywczych (musztard, różnych sosów, dresingów, marynat itp.) oraz konserwanta, jest nadal składnikiem niektórych wyrobów farmaceutycznych i kosmetycznych, a także ważnym elementem medycyny ludowej. Roczne zapotrzebowanie mieszkańca krajów uprzemysłowionych ocenia się w przybliżeniu na około 1 litr w przeliczeniu na ocet o kwasowości 10 g/100 ml (3). Kwasowość octu może być różna, przy czym minimalna, dopuszczona europejską normą, kwasowość wynosi 5 g/l 00 ml, a dla octu winnego 6 g/l 00 ml (1). Ocet spiry­ tusowy w porównaniu z innymi jego rodzajami charakteryzuje się na ogół wyższą kwasowością (od 10 do 18 g/100 ml). Między innymi z uwagi na wygodę stosowania wynikającą z wysokiej kwasowości, jest on najchętniej wykorzystywany w przetwór­ stwie żywności. To z kolei jest przyczyną największej jego produkcji, np. w Unii Eu­ ropejskiej ponad 60% produkcji octu stanowi właśnie ten jego rodzaj (4). 2. Technologia octownictwa Szacuje się, że ocet jako zamierzony produkt otrzymywany jest od ponad 10 000 lat (2). Do produkcji octu mogą być stosowane różne surowce pochodzenia rolniczego, zawierające węglowodany lub alkohol. Ogólne zasady otrzymywania octu z różnych surowców przedstawiono na rysunku. Bakterie kwasu octowego mogą wykorzystywać tlen rozpuszczony w fermen­ tującej cieczy. W miarę przebiegu procesu biosyntezy kwasu octowego tlen roz­ puszczony w środowisku jest zużywany, należy zatem stworzyć warunki jego stałego dopływu z fazy gazowej do ciekłej. Szybkość przenoszenia tlenu z powietrza do fermentującego środowiska, limi­ tująca najczęściej szybkość fermentacji, zależy od sposobu kontaktowania tych faz. W zależności od sposobu kontaktowania fazy ciekłej z fazą gazową metody fer­ mentacji octowej można podzielić na trzy zasadnicze grupy: powierzchniowe, ocie- kowe i wgłębne. 234 PRACE PRZEGLĄDOWE Technologia i mikrobiologia fermentacji octowej Strony prowadzi to do poprawy wskaźników technologicznych procesu, a z drugiej, stwarza realną groźbę załamania fermentacji w wyniku rozwoju specyficznych bak­ teriofagów (6). 3. Fenotypowa charakterystyka bakterii kwasu octowego w 1864 r. Ludwik Pasteur wykazał, źe fermentację octową wywołują bakterie. Do tego momentu, przez wiele tysięcy lat, człowiek wykorzystywał je nieświa­ domie. Bakterie kwasu octowego to gramujemne, elipsoidalne lub pałeczkowate komór­ ki o długości od 1 do 4 pm, występujące pojedynczo, parami lub w łańcuszkach. W zależności od gatunku mogą być ruchliwe, lub nie, z rzęskami, lub polarnie usytu­ owaną wicią. Do tej grupy bakterii do niedawna zaliczano tylko dwa rodzaje Gluco- nobacter i Acetobacter. Bakterie obu tych rodzajów utleniają etanol do kwasu octowe­ go, jednak tylko bakterie rodzaju Acetobacter mogą dalej utleniać kwas octowy do CO2 i H2O. Ta cecha oraz równoległa z nią zdolność utleniania także kwasu mleko­ wego do dwutlenku węgla i wody jest wykorzystywana do różnicowania tych dwóch rodzajów. Cecha ta w procesie produkcji wysokoprocentowego octu (końcowa kwasowość powyżej 10 g/100 ml) na ogół nie ujawnia się, gdyż utlenianie kwasu octowego, tzw. nadoksydacja, jest hamowana niskim pH oraz obecnością etanolu. Cykl fermentacji przebiega w warunkach silnie kwaśnego środowiska (pH 2-3), i kończy się przed całkowitym odfermentowaniem etanolu. Populacje bakterii występujące w proce­ sach przemysłowych na ogół stanowią nadal nie zidentyfikowane populacje drobno­ ustrojów pochodzących z poprzednich cykli produkcyjnych i zawierają nie znane ga­ tunki i szczepy bakterii kwasu octowego. Identyfikacja bakterii Acetobacter i Gluconobacter występujących w naturze nie na­ stręcza większych trudności, natomiast identyfikacja bakterii czynnych w procesie otrzymywania wysokoprocentowego octu budziła i nadal budzi wiele kontrowersji. Powodem tego są trudności występujące już na etapie ich izolacji i hodowli w wa­ runkach laboratoryjnych. Bakterie odpowiedzialne za prawidłowy przebieg procesu produkcyjnego nie rosną na powszechnie stosowanych laboratoryjnych podłożach (7-10). Prawdopodobnie w wyniku doskonalenia technologii, którego efektem było otrzy­ mywanie octu o coraz wyższej zawartości kwasu octowego oraz stosowanej zasady uruchamiania fermentacji przy użyciu tzw. octu zarodowego, pochodzącego z inne­ go fermentora, człowiek nieświadomie stworzył warunki przyspieszające naturalną ewolucję tych mikroorganizmów polegającą na przystosowaniu do wzrostu w śro­ dowisku zawierającym coraz wyższe stężenia kwasu octowego. W Japonii opracowano podłoże dwuwarstwowe (11), przydatne do izolacji i ho­ dowli bakterii kwasu octowego odpowiedzialnych za utlenianie etanolu do kwasu BIOTECHNOLOGIA 3 (62) 233-240 2003 237 Jerzy Czuba octowego W procesie produkcji wysokoprocentowego octu. Podłoże to nie w każdym przypadku dawało pozytywny efekt (12), jednak jego zastosowanie pozwoliło na wy­ izolowanie kilku nowych gatunków bakterii kwasu octowego oraz na ich charaktery­ stykę zarówno przy użyciu testów biochemicznych jak i metodami molekularnymi. 4. Genotypowe metody identyfikacji bakterii kwasu octowego Zastosowanie metod molekularnych powinno usunąć wątpliwości w zakresie klasyfikacji i identyfikacji bakterii kwasu octowego. Metody takie, od kilku już lat, są przedmiotem zainteresowania badaczy tej grupy bakterii (12-14). W badaniach tych stosowane są metody polegające na analizie genów rybosomalnego RNA, inter- gennych regionów, konstrukcji specyficznych sond DNA, analizie profilów plazmi­ dowych oraz analizie specyficznych insercyjnych sekwencji itd. (15,16). W 1992 r. z fermentorów eksploatowanych w Europie wyizolowano nowy gatunek Acetobacter europaeus - sugerowano, że jest to dominujący gatunek w przemysłowych bioreak- torach do produkcji octu (13). Niedawno opublikowano opis czterech kolejnych no­ wych gatunków wyizolowanych także z bioreaktorów produkujących wysokopro­ centowy ocet (17-19). Na podstawie analizy podobieństwa sekwencji genów 16S-rRNA Yamada (20,21) zaproponował wydzielenie nowego rodzaju - Gluconacetobacter - w ramach grupy bakterii kwasu octowego. Utworzono filogenetyczne drzewo oddające pozycje ga­ tunków w ramach rodzajów Acefobacter, Acetimonas, Gluconacetobacter i Gluconobacter (18). Rodzajem Gluconacetobacter objęto następujące gatunki bakterii: Gluconaceto­ bacter oboediens (19), Ga. hansenii, Ga. entanii (18), Ga. europaeus (13), Ga. xylinus, Ga. diazotrophicus, Ga. liquefaciens, Ga. sacchari (22). Większość tych gatunków wyizo­ lowano z wgłębnych fermentorów octowniczych, produkujących wysokoprocento­ wy ocet, pierwotnie zaliczano je do rodzaju Acetobacter. Bakterie zaliczane do ro­ dzaju Gluconacetobacter charakteryzują się fenotypem acetofllnym - do wzrostu wy­ magają obecności kwasu octowego w podłożu. 5. Stan badań nad acetoGlnymi bakteriami kwasu octowego w Polsce w Polsce do izolacji i przechowywania bakterii czynnych w procesie fermentacji octowej (o acetofllnym fenotypie), z zachowaniem ich cech przydatności technolo­ gicznej, opracowano metodę polegającą na: - zastosowaniu do izolacji i hodowli bakterii podłoża o półciekłej konsystencji, - nieprzerwanym dostępie tlenu atmosferycznego do kultury bakterii, - stężeniach kwasu octowego i etanolu zbliżonych do występujących w proce­ sie technologicznym - sumaryczne stężenie (suma stężeń kwasu octowego i etano­ lu) powyżej ]]%, 238 PRACE PRZEGLĄDOWE Technologia i mikrobiologia fermentacji octowej - zawartości w podłożu półciekłym takich składników pożywki jak w fermen­ tującej brzeczce podczas procesu technologicznego, - niedopuszczaniu do nadmiernego odfermentowania etanolu. Na takim podłożu bakterie rosną w postaci kożuszka. W celu uzyskania czystej kultury stosowano wielokrotne przeszczepianie redukcyjne. Kultury bakterii izolo­ wane i hodowane na takim podłożu wykazują trwale wysoką aktywność i odporność na wysokie stężenia kwasu octowego, a zatem przydatność technologiczną (9). Kul­ turę bakterii przechowywanych w ten sposób wykorzystywano z powodzeniem do uruchamiania fermentacji w fermentorach przemysłowych. Wyizolowane i hodowane w ten sposób szczepy bakterii, podobnie jak szczepy zaliczane do Gluconocetobacter nie rosną na podłożach nie zawierających kwasu octowego. W warunkach hodowli na podłożach o wysokiej zawartości kwasu octo­ wego (charakterystycznej dla przemysłowego procesu technologicznego) bakterie te nie ujawniają także podstawowej cechy bakterii rodzaju Acetobacter - nie utle­ niają kwasu octowego do CO2 i H2O. Mechanizm ten można jednak uruchomić po­ przez ich hodowlę na podłożach o coraz niższym, sumarycznym stężeniu oraz przez kilka pasaży hodowlanych na podłożu o zawartości etanolu \% i kwasu octowego 3% (9). Taki tryb postępowania umożliwia następnie hodowlę tych bakterii na pod­ łożach nie zawierających kwasu octowego i ich identyfikację jako rodzaj Acetobacter przy użyciu powszechnie stosowanych fenotypowych testów fizjologicznych. W ten sposób potraktowane bakterie nie wymagają już kwasu octowego do swego wzro­ stu - uzyskują fenotyp acetotolerancyjny. W tym momencie tracą również odpor­ ność na wysokie stężenia kwasu octowego, a tym samym, przydatność technolo­ giczną. Przywrócenie utraconej przydatności technologicznej, jeśli jest możliwe, jest znacznie trudniejsze niż jej pozbawienie. 6. Gluconacetohacter czy Acetobacter Rodzaj Gluconocetobacter został uwzględniony w najnowszym, wydaniu Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2000). Stanowi on jeden z dwunastu rodzajów zali­ czonych do rodziny Acetobocteriaceae. Do tej rodziny zaliczono także znane dotych­ czas rodzaje bakterii kwasu octowego; Acetobacter i Gluconobacter. Fakt częstych mutacji jest typowy dla bakterii kwasu octowego (23). Za możliwoś­ cią zmiany fenotypu charakterystycznego dla rodzaju Gluconocetobacter na charakte­ rystyczny dla Acetobacter, poza wynikami badań prowadzonych w Polsce, przema­ wiają także wyniki charakterystyki fenotypowej dwóch szczepów izolowanych z bio- reaktorów octowniczych w Słowenii. Stwierdzono ich zmienność w zakresie bez­ względnego wymagania kwasu octowego do wzrostu (14). Celowe byłoby zbadanie różnic na poziomie genotypu między kułturami o zmie­ nionym i niezmienionym fenotypie pochodzących od tych samych acetofilnych szcze­ pów pierwotnych. BIOTECHNOLOGIA 3 (62) 233-240 2003 239