analise microbiologia da maçã, Notas de estudo de Engenharia de Alimentos
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-DBIO

ENGENHARIA DE ALIMENTOS

RELATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

FEIRA DE SANTANA-BA 2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-DBIO ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: BIO 432-MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS DOCENTE: MILTON ABREU ROQUE

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA MAÇÃ (Malus domestica)

FEIRA DE SANTANA-BA 2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-DBIO ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: BIO 432-MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS DOCENTE: MILTON ABREU ROQUE

FEIRA DE SANTANA-BA 2008

ÍNDICE

Objetivos gerais Introdução Aula Prática 01: Preparação e esterilização dos materiais utilizados no laboratório. Aula Prática 02: Preparo da amostra para exame microbiológico. Aula Prática 03: Contagem e isolamento de colônias. Aula Prática 04: Isolamento de colônias em tubo. Aula Prática 05: Coloração de Gram. Aula Prática 06: Identificação de colônias. Aula Prática 07: Identificação de colônias. Aula Prática 08: Identificação de colônias. Resultados e Discussão Conclusão Referências Bibliográficas

OBJETIVOS GERAIS:

• Analisar microbiologicamente as maçãs (Malus domestica); • Aprender as técnicas utilizadas em um laboratório de microbiologia.

INTRODUÇÃO

A segurança num laboratório de microbiologia envolve utilização de procedimentos específicos, associados às métodos necessários para manipular

culturas microbianas. Por um lado, devido às reduzidas dimensões das células, que para nós são imperceptíveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares puras, as quais podem conter um número elevadíssimo de células microbianas, o laboratório deverá estar organizado de forma a garantir a boa execução dos trabalhos. Em qualquer laboratório, os procedimentos a seguir devem incluir o cumprimento de regras de funcionamento, de medidas de segurança obrigatórias e o manuseamento correto e cuidadoso do material, dos reagentes químicos e do equipamento laboratorial. Seguir às regras contribui para a prevenção de acidentes e para impedir a existência de fontes de contágio ou de perigo no local de trabalho. Para impedir a contaminação das culturas microbianas deve acontecer à desinfecção e esterilização dos objetos necessários e do ambiente. A desinfecção de um determinado objeto ou ambiente consiste na destruição, inibição ou remoção de agentes microbianos causadores de doenças ou de outros problemas, como por exemplo, a degradação de alimentos, que podem ser utilizados agentes físicos ou agentes químicos. Os agentes físicos mais utilizados na esterilização e desinfecção de ambientes ou objetos são: o calor úmido, o calor seco, a filtração e as radiações. A esterilização por calor úmido pode ser conseguida através da fervura, autoclavagem ou pasteurização. O calor úmido conduz à destruição rápida de organismos por coagulação das proteínas constituintes das suas células. O aparelho mais utilizado na esterilização de materiais e meios de cultura é a autoclave. Geralmente as autoclaves de laboratório funcionam sob a pressão de 1atm e à temperatura de 121ºC. A duração do tempo de esterilização está relacionada não só com a temperatura, como também com a relação superfície/ volume da massa do material a esterilizar, ou seja, com o tempo de penetração do calor. Para a mesma temperatura, os tempos de tratamento térmico são tanto maiores quanto maior for o volume do material a esterilizar. De uma forma geral, os materiais ficam esterilizados em 20-40 minutos. O material a esterilizar deve ser devidamente preparado. Assim, os frascos a esterilizar devem ser tapados com rolhas de algodão. Apresentam-se tampas com rosca, estas devem ser pouco apertadas para que haja saída de ar quente e entrada de vapor, de modo a evitar o seu rompimento na autoclave. A esterilização pelo calor seco pode ser alcançada pelos seguintes métodos: flamejação, incineração ou estufa de ar quente. As estufas de ar quente atingem temperaturas da ordem de 160-180°C, que provocam a oxidação e a desnaturação das proteínas destruindo quer às células vegetativas quer aos esporos. Contudo deve ter-se em atenção que o uso de temperaturas muito elevadas e um tempo de exposição muito prolongado podem interferir na estabilidade de alguns materiais, de que o aço é exemplo, ou mesmo causar a sua deterioração, como é o caso de materiais como a borracha e os tecidos. Como o poder de penetração do calor seco é baixo, este método só deve ser utilizado quando o contacto com o vapor é inadequado, nomeadamente com materiais de vidro, outros materiais sólidos termoestáveis ou alguns componentes do laboratório. Os microrganismos são o grupo de organismos mais amplamente distribuídos na Terra. Eles estão em sua pele e cabelo, no tártaro de seu dente, ao longo de seu intestino e também nas superfícies do seu corpo. Observam-se sinais do trabalho microbiano na produção de alimentos, de drogas e de outros derivados industriais. Além disso, as bactérias e os fungos degradam resíduos, tais como plantas mortas, óleos de derramamentos, despejos de esgoto e

resto de alimentos até alimentos inteiros, como a maça, nosso objeto de estudo. Fruta das regiões temperadas, a maçã, além de saborosa, tem considerável valor nutritivo. Contém vitaminas B1, B2, niacina e sais minerais como fósforo e ferro. É rica em quercetina, substância que ajuda a evitar a formação dos coágulos sanguíneos capazes de provocar derrames. Seu período de safra vai de janeiro a abril. Daí até setembro só existem as importadas. Para melhor aproveitamento das suas vitaminas, o ideal é consumí-la ao natural com casca, pois é junto dela que estão a maior parte das suas vitaminas e os sais minerais; por outro lado, encontramos organismos microbianos, que podem causar problemas a nossa saúde. É possível conhecermos os microrganismos presentes em diferentes habitats simulando, no laboratório, as condições em que se desenvolvem naturalmente. As suas necessidades nutricionais são asseguradas pela utilização de meios de cultura e o crescimento microbiano é facilitado pelas condições ambientais que lhes são proporcionadas pela temperatura e quantidade de oxigênio. Os meios de cultura (preparações sólidas, líquidas ou semi-sólidas que contêm todos os nutrientes necessários para o crescimento de microrganismos) são utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras. Os meios de cultura devem ter na sua composição os nutrientes indispensáveis ao crescimento do organismo em questão, sob forma assimilável e em concentração não inibitória do crescimento. Além disso, após a sua preparação, cada meio de cultura deve ser submetido à esterilização, por forma a eliminar qualquer organismo vivo contaminante. Por outro lado, para manter uma cultura pura, é necessário que o meio de cultura que se pretende utilizar seja mantido desprovido de qualquer organismo vivo contaminante. Para a prevenção de contaminações durante a manipulação de culturas puras recorre-se a técnicas de assepsia. De um ponto de vista geral, os meios de cultura podem ser classificados tendo em conta a sua composição química, o seu estado físico e os objetivos funcionais a que se destinam. Quanto à composição química, podem ser: Meios sintéticos (os componentes são quimicamente definidos) e Meios complexos (quando se adicionam ao meio substâncias complexas, como por exemplo, extrato de carne, peptona, sangue, etc). Em relação ao estado físico, podem ser líquidos, também denominados de caldos, ou sólidos (caldo contendo 1,5% a 2% de Ágar). Em relação ao objetivo de utilização, podem ser: meios seletivos que são elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse impedindo o crescimento das outras bactérias; meios diferenciais são utilizados para a fácil identificação da colônia da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa de meio de cultura. Os microrganismos de colônia pura apresentam reações características quando cultivados em tubos ou placas contendo meio diferencial. A especificidade dos meios de cultura é muito importante, nomeadamente no isolamento e identificação de certos microrganismos (por exemplo, no isolamento de microrganismos do solo) ou em testes de sensibilidade a antibióticos ou na análise microbiológica de águas, de alimentos, etc. Para o crescimento de microrganismos no laboratório há uma grande variedade de meios de cultura. Quando desejado é adicionado ao meio da bactéria em meio sólido um agente solidificante como o ágar. O ágar é um

polissacarídeo complexo obtido a partir de algas marinhas que já vem sendo bastante utilizado no espessamento de alimentos como geléias e sorvetes. Um meio contendo ágar é normalmente utilizado em tubos de ensaio ou em placas de Petri. Em um tubo de ensaio o meio de cultura poderá ser utilizado de duas maneiras. O tubo poderá ser colocado na posição inclinada, em determinado ângulo, favorecendo a formação de uma região grande para o crescimento durante a solidificação, esta forma é denominada ágar inclinado. A solidificação do meio poderá ocorrer com o tubo na posição vertical (ágar em coluna) permitindo um crescimento na profundidade do meio de cultura. As placas de Petri, denominadas em função de seu inventor, são placas rasas contendo uma tampa que recobre até o fundo das placas evitando a contaminação. Quando contêm o meio de cultura são denominadas culturas sólidas em placa de Petri. O método de contagem em placa é a técnica mais utilizada na determinação do tamanho de uma população bacteriana. A grande vantagem deste método é que as células viáveis são qualificadas. A desvantagem pode ser considerada o tempo, em geral 24 horas, para o aparecimento das colônias visíveis em placa. Na realização deste método é essencial que somente um número limitado de colônias cresça em cada placa. Quando muitas colônias estão presentes ocorrerá uma saturação impedindo o crescimento de algumas colônias, conduzindo assim, a uma contagem errônea do número de células. Normalmente, somente são analisadas para contagem, as placas contendo entre 25 e 250 colônias. Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o número de células presentes num determinado material ou superfície, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez, determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA) ou através da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na água, em alimentos como leite, carnes, vegetais, superfícies, ar ou até mesmo em culturas puras.

Contagem microscópica direta – esse método requer o uso de câmaras de contagem especiais como a de Petroff-Hauser, na qual uma alíquota de uma suspensão da cultura ou de qualquer amostra é contada e o número de células é determinado matematicamente. O método é rápido, mas não permite discriminar células vivas de células mortas. Também não é sensível o suficiente para determinação de populações inferiores a 1 milhão de células.

Contagem eletrônica – quantifica rapidamente o número de células numa suspensão, através da passagem do fluido por um orifício minúsculo contendo um fluxo de elétrons. Como as células não são condutoras, elas aumentam a resistência elétrica do fluido condutor e a resistência é registrada eletronicamente, quantificando o número de células que passam através do orifício. Esse método tem o inconveniente de detectar células mortas e também quantifica materiais inertes porventura presentes na amostra.

Análise espectrofotométrica – a turbidez de uma cultura está relacionada com a concentração de células. Quanto mais turva a cultura, maior é a concentração celular. O método turbidimétrico mede a quantidade de luz transmitida no espectrofotômetro a 600F 06 8m. Quanto menor for a quantidade de luz transmitida maior é a concentração celular daquela suspensão.

Quando amostras de determinado material são semeadas na superfície de meios de culturas sólidos, várias colônias desenvolver-se-ão originando cópias exatas uma das outras quando do mesmo organismo. Teoricamente, a origem de uma colônia visível poderá ocorrer a partir de um único esporo, de uma célula vegetativa ou de um grupo de microrganismos em grumos ou cadeias. Normalmente as colônias microbianas apresentam características morfológicas diferentes permitindo distinguir os microrganismos. Para isto, a distribuição uniforme das bactérias é essencial para permitir a visualização das colônias individualizadas na placa. O estudo dos microrganismos está muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e manter microrganismos viáveis no laboratório, sob a forma de culturas puras. Para a obtenção de culturas puras o método mais comumente utilizado é o método da semeadura por esgotamento. A metodologia de semeadura pode ser realizada com sucesso para o isolamento de organismos presentes em grandes números relativos à população microbiana. Quando, no entanto, o microrganismo de interesse estiver presente em baixos números será necessária a utilização de meios de enriquecimento, para aumentar sua população, antes do isolamento em placa. Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é necessário manter as culturas vivas por um período de tempo com o objetivo de estudá-las. As culturas bacterianas podem ser mantidas refrigeradas para estocagem preservação de bactérias por longos períodos de tempo, o congelamento em baixas temperaturas e a liofilização. No processo de congelamento em baixas temperaturas as culturas puras são colocadas em um líquido de suspensão e congeladas rapidamente nas temperaturas de -50 a -95ºC. Estas culturas permanecem viáveis por vários anos e podem ser descongeladas e utilizadas quando necessário. Durante a liofilização a suspensão microbiana é rapidamente congelada nas temperaturas entre -54 a 72ºC e imediatamente ocorre a remoção da água através da utilização de alto vácuo (sublimação). A final deste processo as ampolas são seladas pela utilização de chama de alta temperatura. O resíduo parecendo um pó, contendo os microrganismos viáveis, pode ser estocado durante vários anos. Estes organismos podem ser recuperados pela adição ao resíduo do meio líquido nutriente adequado. Alguns dos mais usados métodos de conservação: transferência periódica para meios novos; sob camada de óleo mineral; liofilização; congelamento. Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnóstico. A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em

1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram- positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação

A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. A morfologia das bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. Em relação às formas, a maioria das bactérias estudadas seguem um padrão menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira geral, as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos gerais: cocos, bacilos e espiralados. Os cocos correspondem a células arredondadas, podem se dividir sem um plano de orientação definido, o que leva a um grande número de arranjos diferentes. Assim temos os cocos isolados, diplococos (Neisseria, pneumococos), tetracocos, sarcinas (cubos contendo 8 células), estreptococos (cocos em cadeia) e estafilococos (cocos formando massas irregulares).

Figura 1: Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos.

Figura 2: Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos formando cadeias, um arranjo denominado estreptococos.

Para se poder distinguir os diferentes microrganismos presentes em amostras, são usados meios de cultura seletivos que promovem o crescimento de determinados microrganismos, inibindo o de outros, e que são inoculados sob as condições de temperatura e disponibilidade de oxigênio mais vantajosas para os microrganismos com diversas características específicas. A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado

microrganismo possui um sistema enzimático específico, promovendo transformação bioquímica específica, as provas bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização.

Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais necessárias ao seu desenvolvimento.

As principais e mais utilizadas provas bioquímicas são:

1. Produção de catalase - Esta enzima atua sobre a água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em oxigênio e água. A prova é feita colocando uma gota de solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 3-5% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, colocar uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado. A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou efervescência devido à liberação do oxigênio. A catalase é produzida por muitos microrganismos e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que são catalase positivos deStreptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.

2. Utilização do citrato como única fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da célula, não conseguindo portanto crescer no meio contendo como única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na prova negativa o meio não se altera pois não há crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

3. Ágar TSI – Triplo Açúcar Ferro: Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0%lactose, 1,0%sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo). A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície

F 0 2 0inclinada. Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro

do mesmo tubo. A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é

F 0 2 0relativamente anaeróbia. Esse meio é utilizado para diferenciar bacilos

Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás. O meio apresenta uma cor original vermelho laranja, levemente opalescente, sendo a cor púrpura indicador de alcalinidade e a cor amarela indicadores de acidez. A coloração púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativas), F 0 2 0amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares).

4. Ágar EMB (Eosine Methylene Blue) ou Meio de Levine: É um meio seletivo, pois é parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo devido ao azul de metileno, e, por conseguinte o crescimento dos Gram negativo é mais abundante. É um meio diferencial, pois a presença de lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactérias fermentadoras das não fermentadoras da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose levam à baixa de pH, de modo que as colônias aparecem com aspecto verde metalizado. Os que não fermentam a lactose produzem colônias incolores, mas devido à sua transparência aparecem com a cor do meio, ou seja, púrpura. Este meio permite identificar os Gram negativo patogênicos através da caracterização visual, porque eles raramente fermentam a lactose.

5. Descarboxilação da Lisina: A descarboxilação é a remoção de um grupo carboxilo de uma molécula orgânica. As bactérias que crescem num meio líquido descarboxilam aminoácidos mais activamente quando as condições são anaeróbias e ligeiramente ácidas. A descarboxilação de aminoácidos, como a lisina, resulta na produção de uma amina e de dióxido de carbono.

As bactérias que produzem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina e usar as aminas como percursoras para a síntese de outras moléculas. Adicionalmente, quando certas bactérias fazem fermentação são produzidos produtos ácidos que tornam o meio ácido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases são activadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos ácidos dos aminoácidos produzem aminas que aumentam o pH do meio que fica mais adequado.

A descarboxilação da lisina pode ser detectada semeando a bactéria num meio de cultura contendo esse aminoácido, glicose e um indicador de pH (púrpura de bromocresol). Antes da incubação deve ser colocado óleo mineral no caldo para impedir o oxigénio de atingir as bactérias e inibir a reacção. Os ácidos produzidos pelas bactérias a partir da fermentação da glicose vão inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudança de cor do indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido activa então a enzima que causa descarboxilação da lisina a aminas e a subsequente neutralização do meio que muda de amarelo para púrpura outra vez.

6. Ágar Mac Conkey:

O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. A concentração de sais de

bile é relativamente baixa em comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS. Esse meio isola bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verifica a fermentação ou não da lactose. O meio apresenta cor original rosa avermelhado. Colônias cor de rosa indicam bactérias fermentadoras de lactose, e colônias incolores indicam bactérias não fermentadoras de lactose.

7. Reação de Oxidase: O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria. Ajuda caracterizar espécies de Neisseria, distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp. Este teste pode ser feito a partir de tiras para a reação da oxidase. O teste é positivo quando há o desenvolvimento da cor roxa. Por outro lado, ele é negativo quando não há alteração da cor.

AULA PRÁTICA 01: PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DOS MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO.

DATA DE REALIZAÇÃO: 26/05/2008

OBJETIVO:

• Preparar e esterilizar os materiais utilizados no laboratório.

MATERIAIS UTILIZADOS

• Algodão; • Béquer; • Erlenmeyer; • Estufa; • Gaze; • Fita para autoclave; • Papel Kraft; • Pipetas; • Tesoura; • Tubos de ensaio; • Placa de Petri.

Figura 3: Erlenmeyer. Figura 4: Papel Kraft. Figura 5: Béquer. Figura 6: Fita adesiva para autoclave. Figura 7: Placa de Petri. Figura 8: Autoclave.

PROCEDIMENTO

Com a tesoura, cortou-se o papel Kraft de forma adequada para revestir a vidraria em questão. Para a pipeta, utilizou-se o papel Kraft cortado de acordo com a figura 9.

Figura 9: Corte para a pipeta.

O embalamento da pipeta iniciou-se pelo posicionamento transversal da mesma sobre o papel, seguindo o enrolamento desta a partir da extremidade superior até a inferior. Para a diferenciação das extremidades, enrolou-se a sobra do papel na extremidade inferior e dobrou-se a da extremidade superior lacrando com um pedaço de fita para autoclave. Para as placas de Petri utilizou-se o papel Kraft cortado de acordo com a figura 10.

Figura 10: Corte para as placas de Petri.

Embalou-se no máximo três placas de Petri empilhadas como se fosse um embrulho e lacrou-se com a fita para autoclave.

Para a esterilização do Erlenmeyer e do tubo de ensaio necessita-se de um tampão. Este é obtido pelo enrolamento do algodão na gaze dobrando uma das pontas. Em seguida, colocou-o na abertura do material a ser esterilizado. As pipetas e as placas de Petri já envolvidos em papel devem ser esterilizados na autoclave. Já os tubos de ensaio e os Erlenmeyers são esterilizados na estufa, ficando 2 horas a 180ºC.

AULA PRÁTICA 02: PREPARO DA AMOSTRA PARA EXAME MICROBIOLÓGICO.

DATA DE REALIZAÇÃO: 02/06/2008

OBJETIVOS: • Preparar a amostra para o exame microbiológico, utilizando meio de

cultura, com a finalidade de cultivar e manter os organismos microbianos presentes na maçã para ser analisado.

MATERIAIS UTILIZADOS:

• Alça de inoculação; • Alça de semeadura de vidro; • Béquer; • Bico de Bunsen; • “Contonete” estéril; • Estufa incubadora; • Placa de Petri com ágar nutriente estéril; • Solução de água salina; • Três maçãs compradas na Feira da Estação Nova – Feira de

Santana (Caseb).

PROCEDIMENTO Durante as inoculações, a abertura das placas de Petri, bem como o manuseio do material, em geral, deve ser realizado sempre próximo à chama

do bico de Bunsen. Além disso, deve-se evitar, tossir, espirrar ou até falar próximo à bancada de trabalho. Assim, escolheu-se a maçã para ser analisada. Pegou-se três maçãs sem estarem lavadas, derramou-se sobre o pendúculo uma solução de água salina que foi recolhida em um béquer. Logo após, passou-se um “contonete” em volta do pendúculo, pegou-se uma placa de Petri passou-se as laterais da placa na chama, a fim de eliminar qualquer contaminação potencial. Esterilizou-se a alça de inoculação, flambando-a na chama do bico de Bunsen. Com a alça retirou- se uma pequena quantidade do inóculo e, em seguida, espalhou-se no meio sólido e estéril. O mesmo procedimento foi realizado com as duas maçãs restantes. Para a água de lavagem recolhida no béquer, utilizou-se a técnica de semeadura em superfície, onde colocou-se um pouco da água de lavagem na superfície do ágar e espalhou-se com o auxílio de uma alça de semeadura de vidro (alça de Drigalky). Identificou-se cada amostra. Incubou-se, a 37ºC, as inoculações realizadas.

Figura 11: Bico de Bunsen. Figura 12: Maçãs.

Figura 13: Alças de inoculação. Figura 14: Estufa incubadora.

AULA PRÁTICA 03: CONTAGEM E ISOLAMENTO DE COLÔNIAS.

DATA DE REALIZAÇÃO: 09/06/2008

OBJETIVOS:

• Contagem das colônias formadas; • Aplicar o método do isolamento em placa para a obtenção de uma

cultura pura.

MATERIAS UTILIZADOS:

• Alça de inoculação; • Bico de Bunsen; • Estufa incubadora; • Microscópio; • Placas de Petri com ágar nutriente estéril; • Placas de Petri com ágar nutriente e colônias em desenvolvimento;

PROCEDIMENTO

Passada uma semana, após ter feito a semeadura constatou-se nas placas diversos tipos de colônias. Dividiu-se com auxilio de um marcador as placas de Petri em quatro partes iguais para facilitar a contagem dos microrganismos e colocou-se a placa com as bactérias no microscópio e fez-se a contagem das bactérias presentes na placa. Em seguida, escolheu-se dois tipos de colônias, uma colônia branca e outra colônia amarela que foram submetidas a uma segunda semeadura em duas novas placas de Petri para obtenção da colônia pura desejada. Uma alça de inoculação estéril foi utilizada para mergulhar na cultura mista da amostra (maça) contendo mais de um tipo de microrganismo, e posteriormente semeada na placa de meio nutriente sólido. Após a primeira estria, flambou-se novamente a alça, girou-se a placa cerca de 30º e puxou-se nova estria. Repetiu-se esse passo por mais duas vezes (Figura 15). Sempre esfriando a alça no meio de cultura. Repetiu-se o procedimento para a outra colônia da amostra (maçã). Identificou-se as placas com as colônias puras e incubou-as, a 37ºC na estufa.

Figura 15: Técnica de isolamento de cultura pura por esgotamento. AULA PRÁTICA 04: ISOLAMENTO DE COLÔNIAS EM TUBO.

DATA DE REALIZAÇÃO: 30/06/2008

OBJETIVOS:

• Isolar as culturas em tubos de cultura para conservá-las viáveis para o estudo.

MATERIAIS UTILIZADOS:

• Alça de inoculação; • Bico de Bunsen;

• Estufa incubadora; • Placas de Petri inoculadas com as colônias puras; • Tubos de cultura;

PROCEDIMENTO

Pegou-se a placa de Petri inoculada com a colônia amarela, passou-se levemente a alça estéril sobre a colônia. Em seguida, pegou-se o tubo, retirou- se a tampa com o dedo mínimo da mão que estava segurando a alça e flambou-se a boca do tubo. Encostou-se a alça na parte mais baixa do plano inclinado e subiu-se fazendo estrias na superfície do ágar. Após isso, flambou- se novamente a alça e a boca do tubo e colocou-se a tampa. Repetiu-se o procedimento para a colônia branca. Identificou-as e incubou-as a 37º Incubou- as a 37ºC na estufa.

Figura 16: Retirada da tampa do tubo. Figura 17: Estrias no tubo.

AULA PRÁTICA 05: COLORAÇÃO DE GRAM.

DATA DE REALIZAÇÃO: 07/07/2008

OBJETIVOS:

• Demonstrar a importância da Coloração de Gram; • Identificar se as bactérias em estudo são Gram-positivas ou Gram-

negativas; • Identificar a morfologia das bactérias em estudo.

MATERIAIS UTILIZADOS:

• Água corrente; • Água destilada; • Alça de inoculação; • Álcool 95%; • Bico de Bunsen; • Cristal violeta; • Microscópio; • Lâmina; • Lugol; • Papel filtro;

• Pinça de madeira; • Placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido; • Safrinina;

PROCEDIMENTO

No processo de coloração de Gram, inicialmente, preparou-se o esfregaço para a coloração de cultivo em meio sólido, adicionando-se uma gota de água destilada na lâmina, flambou-se a alça corretamente, em seguida, a esfriou no meio de cultura (local sem colônias). Na amostra foi coletada a colônia amarela (1) a qual foi transferida para a lâmina que continha água destilada, sendo bem espalhada com movimentos suaves para evitar a quebra do agrupamento das bactérias com objetivo de obter um esfregaço fino. Deixou-se em repouso em uma temperatura ambiente para secar. Após o esfregaço ficar completamente seco, com auxilio da pinça de madeira, fixou-o na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardou-se até o resfriamento da lâmina. O próximo passo foi à técnica de coloração, na qual utilizou-se soluções tais como: cristal violeta, lugol, álcool 95%, água corrente e safrinina. Na realização dessa etapa, com auxilio da pinça de madeira, foi colocado o cristal violeta sobre a lâmina com esfregaço e esperado tempo de um minuto para sua fixação, logo após lavou-se rapidamente em água corrente para retirar a solução. Adicionou lugol de forma a cobrir todo esfregaço, depois de um minuto, colocou-se novamente em baixo da água corrente para lavar o lugol. Adicionou-se o álcool 95% passado um minuto lavou-se com água corrente. Realizou-se o mesmo procedimento com a safrinina. Feito isso, retirou-se com o papel filtro o excesso de água da lâmina e a pôs para secar na temperatura ambiente. Repetiu-se as mesmas etapas com a colônia branca (2). Com tudo isto, o material encontra-se preparada para ser estudado. Utilizando-se o microscópio, identificou-se as bactérias Gram-positiva e Gram-negativa, analisou-se a morfologia e seu arranjo.

AULA PRÁTICA 06: IDENTIFICAÇÃO DE COLÔNIAS.

DATA DE REALIZAÇÃO: 28/07/2008

OBJETIVOS:

• Identificar as bactérias em estudo através das reações metabólicas;

MATERIAIS UTILIZADOS

• Alça de inoculação; • Estante para tubos; • Lamparina a álcool; • Placa de Petri contendo ágar Mac Conkey; • Placa de Petri com meio EMB; • Tubo com ágar citrato; • Tubo com ágar nutriente; • Tubo com lisina; • Tubo com meio Klienger; • Tubos com cultura de microrganismo em meio sólido. .

PROCEDIMENTO

Com auxílio da alça de inoculação e mediante flambagem da mesma na lamparina, coletou-se as bactérias da colônia 1 (amarela) e da colônia 2

(branca), e transferiu-se para diferentes meios de culturas. Alguns meios de culturas estavam em tubos de ensaio e outros na placa de Petri. Os meios citrato, lisina, Klieger e ágar nutriente estavam presentes em tubos de ensaio, e os meios Mac Conkey e EMB estavam na placa de Petri. Inoculou-se as colônias a serem analisadas nos meios, segundo as técnicas já utilizadas em outras aulas anteriores. Incubou-as a 37ºC na estufa.

AULA PRÁTICA 07: IDENTIFICAÇÃO DE COLÔNIAS.

DATA DE REALIZAÇÃO: 18/08/2008

OBJETIVO:

• Analisar o desenvolvimento das colônias nos meios inoculados; • Fazer o teste da catalase; • Inocular as colônias no ágar TSI.

MATERIAIS UTILIZADOS

• Alça de inoculação; • Água oxigenada (H2O2); • Bico de Bunsen; • Lâmina; • Tubo com ágar TSI – Triplo Açúcar Ferro; • Tubos de cultura preparados na aula anterior.

PROCEDIMENTO

Fez-se a análise dos tubos com diferentes meios de cultura, utilizando alguns critérios de avaliação, tais como: coloração do meio, presença e forma das bactérias na superfície do meio, etc. Realizou-se a inoculação das colônias 1 e 2 em tubos com meio ágar TSI da mesma forma que em procedimentos anteriores.

Além disso, fez-se, também, o teste da catalase, no qual, coletou-se com o auxílio da alça de inoculação, bactérias da colônia amarela (1) e colônia branca (2) e transferiu-se para uma lâmina. Em seguida, adicionou-se algumas gotas de água oxigenada (H2O2) e verificou-se a presença ou a ausência de bolhas.

AULA PRÁTICA 08: IDENTIFICAÇÃO DE COLÔNIAS.

DATA DE REALIZAÇÃO: 25/08/2008

OBJETIVO: • Realizar o teste da oxidase; • Identificar a partir de todos os testes realizados as bactérias em estudo.

MATERIAIS UTILIZADOS

• “Contonete”; • Estante com os tubos com todos os meio testados; • Fita para teste da oxidase.

PROCEDIMENTO

Com um “contonete” recolheu-se uma amostra da colônia 1 do seu tubo de ágar nutriente. Em seguida, depositou-a na fita te teste da oxidase. Realizou-se o mesmo procedimento com uma amostra da colônia 2. Esperou-se um tempo para a reação e observou-se o que ocorreu. Além disso, fez-se uma tabela com todos os testes realizados para facilitar a identificação das bactérias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com a realização das técnicas, obtiveram-se duas colônias distintas, as quais foram caracterizadas por diferentes colorações. Uma colônia que apresentou uma cor branca, chamada de colônia 1, e outra colônia de cor amarela, chamada de colônia 2. Na seleção das placas que permitiam uma maior visualização dos microrganismos presentes, e conseqüentemente, possibilitando uma maior precisão na contagem destes, foram descartadas as placas identificadas como maçã 1, maçã 3, maçã 4 e água de lavagem, sendo o elevado número de microrganismos desenvolvidos nestas três placas o critério utilizado para o descarte. Portanto, avaliamos e fizemos o método da contagem direta ao microscópio das colônias da maçã 2.

A partir do experimento de Coloração de Gram, identificou-se e diferenciou- se as bactérias Gram-positiva da Gram–negativa. Isso, porque as bactérias apresentam a estrutura da parede celular diferentes. O mecanismo utilizado no laboratório baseia-se em diferenciar as bactérias através da estrutura de parede celular das mesmas, pois cada uma reage de forma diferente com os vários reagentes utilizados. Com a adição de cristal violeta, o corante primário, cora ambas as células de púrpura por ser captado pelas paredes celulares. Quando o lugol é aplicado, forma grandes cristais com corante e se combina peptideoglicana das paredes celulares.

De acordo, com a literatura, as bactérias Gram-positivas possuem mais peptideoglicana que as Gram-negativas, sendo por essa razão que mais cristais de corantes são depositados nas paredes celulares das bactérias Gram-positiva. A aplicação de álcool dissolve os lipídeos na membrana externa da parede celular Gram-negativa o que permite a remoção dos cristais de corantes, mas os cristais de corante permanecem nas paredes celulares das bactérias Gram-positivas. Como as bactérias Gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a safranina é adicionada e as células adquirem a cor rosa. Enquanto que, as bactérias Gram-positivas permanecem com a coloração roxa após a adicionar a safranina, porque as paredes celulares são espessas.

Assim, o resultado obtido na primeira lâmina identificada como colônia 1 foi analisada pelo microscópio que se observou uma cor rosa identificando com

uma bactéria Gram-negativa. Enquanto na segunda colônia apresentou uma cor roxa que podemos identificá-la com uma bactéria Gram-positiva. Além dessa característica pode observar a forma das bactérias em estudo; ambas apresentaram-se em forma de cocos que têm forma esférica. A partir daí, verificamos o tipo de bactéria desenvolvida nos diferentes meios.

Características Colônia 1 Colônia 2 Forma Cocos Cocos Coloração de Gram - + Catalase + - Oxidase - - Klienger - - EMB + + Citrato - - Lisina + - TSI - - Mac Conkey - -

Com os resultados listados na tabela acima, percebeu-se que as bactérias desenvolvidas nas colônias 1 e 2 apresentam forma de cocos, sendo a bactéria da colônia 1, Gram-positiva, e a da colônia 2, Gram-negativa. No teste da catalase, verificou-se que na bactéria da colônia 1, houve produção de bolhas quando adicionou-se água oxigenada, sendo, portanto, positiva. Já na bactéria da colônia 2, houve ausência de produção de bolhas, sendo esta, negativa. No meio de cultura Klieger, verificou-se que em ambas as colônias não houve produção de H2S, e foram negativas para a glicose e lactose. No meio EMB apresentou cor azul, indicando que ambas as colônias foram positivas. No citrato verificou-se que não houve mudança na coloração do meio, ou seja, o tubo continuou com a cor verde característica desse meio de cultura, sendo, portanto, ambas as colônias negativas, visto que, se apresentassem uma cor azul seriam positivas. No meio TSI ambas as colônias foram negativas, sendo, portanto, não fermentadoras de sacarose e de glicose. No meio Mac Conkey, as duas colônias foram negativas, indicando que não são fermentadoras de lactose. E no meio ágar nutriente, verificamos o crescimento de bactérias das duas colônias, visto que, esse meio é indicador de crescimento das bactérias.

Figura 18: Teste da Catalase.

Com todos esses testes, não foi possível a identificação da bactéria da colônia 1. Além disso, para a colônia 2, foi possível apenas a identificação do gênero da bactéria da mesma que é: ................................

CONCLUSÃO

Dado o exposto, os microrganismos são um grupo de organismos muito importantes para a Terra. Portanto, torna-se importante o estudo sobre os mesmos a fim de conhecer seu metabolismo e sua relação com o ser humano. Além disso, é de suma importância o desenvolvimento de técnicas capazes de identificar os microrganismos com os quais os seres humanos têm contato constantemente, por exemplo, na ingestão de alimentos. Assim, apesar de não ter-se identificado devidamente as bactérias, devido à falta de testes mais específicos, esse trabalho ampliou o conhecimento sobre as técnicas utilizadas em uma análise microbiológica e familiarizou com a rotina de um laboratório de microbiologia.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FRANCO, Bernadette Dora Gombossy de Mello; LADGRAF, Mariza. Microbiologia dos alimentos. Sao Paulo: Atheneu, 2002. 181p JAY, James M. (James Monroe). Microbiologia de alimentos. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 711 p.

TORTORA, Gerard J,1940; FUNKE, Berbell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 6. ed Porto Alegre: Artmed, 2003.

http://www.microbiologia.ufba.br/aulas/Contagem%20em%20placas%20pourplate.rtf. Acesso em: 27/08/2008 às 19:34.

Isolamento de microrganismos. Disponível em: http://www.microbiologia.ufba.br/aulas/ provas%20bioquimicas.doc. Acesso em: 20/08/2008 às 21:21.

http://www.microbiologia.vet.br. Acesso em: 07/09/2008 às 20:45.

http://icb.usp.br/~bmm/ 2.%20BMM%200121_%20Apostila%20de%20Praticas%20MOD%20I.doc. Acesso em: 07/09/2008 às 21:34.

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