Apostila farmacognosia pr, Manual de Farmacognosia. Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
andrews_marques
andrews_marques28 de julho de 2015

Apostila farmacognosia pr, Manual de Farmacognosia. Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)

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UNIVERSIDADE DO RIO GRANDE DO NORTE (UFRN)

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA

FARMACOGNOSIA FAR 0046

2010/2

ROTEIRO PARA AS

AULAS PRÁTICAS

AUTORES: Profa. Dra. SILVANA MARIA ZUCOLOTTO LANGASSNER

Doutoranda MARA RÚBIA WINTER DE VARGAS

NATAL 2010

NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO

- Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é potencialmente perigoso.

Portanto, tenha o máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento, evitando

conversas e brincadeiras que dispersem a concentração.

- As substâncias químicas, principalmente os solventes, são geralmente, voláteis, corrosivos

explosivos. Desta forma, o uso de chama deve ser evitado, quando utilizado, deve-se cercar de

todas precauções.

- Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente: toda substância desconhecida é

potencialmente perigosa até que se prove o contrário!

- A toxidade das substâncias químicas varia enormemente e nem todas, mesmo as mais

comuns, tiveram seus aspectos toxicológicos suficientemente estudados.

As normas aqui descritas devam se estender a todos os ambientes onde se manipulem

substâncias químicas, portanto essas práticas gerais devem ser sempre obedecidas:

1. Não trabalhe sozinho no laboratório. Um companheiro, ao menos, sempre será uma

ajuda ou testemunha em caso de acidente.

2. Use o guarda-pó ou avental para proteger-se. Uso obrigatório!

3. Use sapato fechado (nunca sapatos abertos!).

4. Não fume no laboratório.

5. Evite brincar no laboratório.

6. Se algum ácido ou outro produto químico for derramado, lave local com bastante água.

7. Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou frasco

correto.

8. Não jogue material sólido, solvente orgânico, soluções ácidas e básicas na pia. Após

utilização, os materiais devem ser descartados em recipientes próprios para esse fim.

9. Observe a limpeza dos materiais antes de utilizá-los.

10. Não gaste reagentes e soluções inutilmente, utilize somente o necessário para o

experimento.

11. Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança; use béquer, vidro de relógio

ou papel toalha.

12. Se houver precipitado ou duas fases em solução a ser utilizada, agite cuidadosamente

de modo a homogeneizá-la.

13. Não ingira ou beba qualquer alimento no laboratório.

14. Não recoloque nos frascos soluções restantes, podem contaminar o conteúdo do

recipiente.

15. Quando utilizar soluções e reagentes, certifique-se que o rótulo esteja voltado para

cima, evitando que se estrague.

16. Só use água destilada nos experimentos.

17. Não trabalhe com material danificado, principalmente o de vidro.

18. Não deixe vidro quente em lugar que possam pegá-lo de forma inadequada.

19. Não prove ou engula drogas ou reagentes do laboratório.

20. Não trabalhe com substâncias inflamáveis próximos a chamas.

21. Não aqueça tubos de ensaio com a boca virada para si ou para outra pessoa. Habitue-se

a aquecer o tubo de ensaio de forma intermitente.

22. Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta, use banho-maria.

23. Feche direito os frascos das soluções e regentes, principalmente os que forem voláteis e

inflamáveis.

24. Evite jogar líquidos inflamáveis na pia, se o fizer abra bastante a torneira.

25. Lave bem as mãos ao deixar o laboratório

26. NUNCA pipete com a boca soluções ou líquidos puros;

27. NUNCA adicione água a uma solução de ácido ou base concentrada para diluí-los.

Sempre adicione essas soluções concentradas à água.

28. Substâncias como vapores tóxicos tais como: bromo, cloro, ácido clorídrico e nítrico

concentrados, solução concentrada de amônia entre outras devem ser manipuladas na

capela.

29. Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar ordenadamente, com

consciência da seqüência a ser realizada. Leia atentamente o roteiro da aula prática

certificando-se de que todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis.

Anote os resultados obtidos relacionado-os à teoria da prática.

30. Consulte o professor quando tiver dúvidas e avise-o de qualquer acidente que ocorra

por menor que pareça.

EXERCÍCIOS

REGULAMENTAÇÃO DE MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS

Objetivos: Compreender alguns dos principais conceitos descritos na Legislação de

Fitoterápicos e conceitos importantes para o desenvolvimento das aulas de Farmacognosia.

Defina os termos abaixo por meio de pesquisa bibliográfica:

1) Remédio

2) Medicamento

3) Medicamento

Fitototerápico

4) Derivado de droga

vegetal

5) Medicamento

Acabado

6) Matéria-prima

Vegetal

7) Droga Vegetal

8) Farmacógeno

9) Marcadores

10) Planta Medicinal

11) Princípio ativo

12) Fitoterapia

13) Fármaco

14) Adjuvantes

15) Extrato

16) Extrato líquido

17) Extrato Fluido

18) Extrato Mole

19) Extrato Seco

20) Tintura

21) Forma Farmacêutica

22) Infusão

23) Decocção

24) Maceração

25) Características

Organolépticas

26) Nomenclatura popular

27) Nomenclatura

botânica

EXERCÍCIOS

ANÁLISE FARMACOPÉICA

1- A droga vegetal utilizada para a produção de um medicamento fitoterápico X, a base

das folhas de Peumus boldus, espécie conhecida popularmente como boldo, foi

submetido a uma análise de controle de qualidade, para verificar se o produto está de

acordo com as exigências da legislação brasileira. Foram realizados ensaios de

identificação, de pureza e de quantificação, de acordo com a Farmacopéia Brasileira IV

(1996). Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 1.

A) Descreva o nome científico completo da espécie e da Família a que pertence.

B) Qual o farmacógeno da espécie vegetal?

C) Qual a principal indicação farmacológica para um produto fitoterápico a base de

boldo?

D) Quais metabólitos secundários são considerados os marcadores químicos do boldo?

E) Por meio de comparação dos valores obtidos com os valores preconizados na

monografia do boldo da F. BRAS IV, 1996 (figura 1), a droga vegetal de boldo está de

acordo com as especificações da legislação brasileira? A droga vegetal estaria aprovada

ou reprovada?

Tabela 1: Ensaios de pureza, identificação e doseamento para a droga vegetal de boldo.

Ensaios Resultados obtidos F. BRAS IV,

1996

Cinzas totais 14%

Cinzas insolúveis em ácido 7,0%

Determinação de água 3,5%

Materiais estranhos 4,0%

Teor de boldina 0,25%

Reação de identificação (vanilina

a 1% em HCl SR)

Desenvolvimento de coloração

vermelha.

Cromatografia em Camada

Delgada (CCD)

Manchas de coloração azul

fluorescente (UV 365 nm), com

Rf 0,5,semelhante ao padrão de

boldina. Após revelação com

Reagente de Dragendorff, a

boldina apresentou coloração

castanha a luz visível.

Figura 1: Monografia do boldo da F. BRAS IV, 1996.

EXERCÍCIOS

MÉTODOS GERAIS DE EXTRAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS

1- Pode-se utilizar etanol para extrair uma substância que se encontra dissolvida em

água? Justifique sua resposta:

2- Se uma solução aquosa for tratada com os solventes abaixo (em um funil de

separação), descreva em cada caso qual será a fase superior e a fase inferior- densidade

da água=1 g/cm 3 :

a) éter etílico (0,789 g/cm 3 ) b) clorofórmio (1,48 g/cm

3 )

c) acetona (0,79 g/cm 3 ) d) n-hexano (0,6548 g/cm

3 )

e) benzeno (0,8765 g/cm 3 ) f) diclorometano (1,3266 g/cm

3 )

g) acetato de etila (0,897 g/cm 3 )

3- Qual o princípio básico do processo de extração líquido-líquido?

4- Por que a água é geralmente usada como um dos solventes na extração líquido-

líquido?

5- Como funciona um extrator do tipo Soxhlet?

6- Cite um método de extração exaustiva a frio e a quente. Justifique a resposta.

TRABALHO

ANÁLISE DA PROPAGANDA (PEÇA PUBLICITÁRIA) DE UM

MEDICAMENTO FITOTERÁPICO

Objetivo: Analisar criticamente as informações contidas na propaganda de um

medicamento fitoterápico de acordo com a atual legislação que dispõe sobre

medicamento fitoterápicos (RDC N o 14) e sobre a propaganda de medicamentos (RDC

N o 96 e 102) (em anexo).

Este trabalho deverá ser feito em grupo (o mesmo de realização das aulas

práticas).

Bibliografia que deverá ser consultada:

 Resolução RDC nº 14 (31/03/10)- Registro de Medicamentos Fitoterápicos

 Resolução RDC nº 96 (17/12/08)- Propaganda, publicidade, informação e outras

práticas cujo objetivo seja a divulgação ou promoção comercial de medicamentos.

 Resolução RDC nº 102 (30/11/00) - Propaganda de Medicamentos

Bibliografia adicional:

RESENDE, M. A.; SCHENKEL, E. P.; SIMÕES, C. M.O. Análise da Qualidade de

Propagandas de Medicamentos Fitoterápicos disponibilizadas em Santa Catarina

(Brasil). Acta Farmaceutica Bonaerense, v. 25 (4), p. 583-589, 2006.

CARVALHO, A. C. B.; FERNANDES, M. G.; SANTOS, E. J. V.; MELO, A. F. M.;

MEDEIROS, I. A.; DINIZ, M. F. F. M. Avaliação Legal da Propaganda e Publicidade

de Medicamentos Fitoterápicos Anunciados na Paraíba (Brasil). Acta Farmaceutica

Bonaerense, v. 23 (4), p. 583-589, 2006.

AULA PRÁTICA 1

CROMATOGRAFIA

O termo CROMATOGRAFIA foi atribuído pelo botânico russo Mikhael S.

Os termos e expressões cromatografia, cromatograma e método cromatográfico, são

atribuídos ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, que em 1906, os utilizou em dois

trabalhos descrevendo suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas,

nas quais usou colunas de vidro recheadas com vários sólidos e arrastou os diferentes

componentes com éter de petróleo.

A palavra cromatografia tem origem grega chrom (cor) e graphe (escrever), embora o

processo não dependa da cor, exceto para facilitar a identificação dos componentes

separados.

DEFINIÇÃO

Cromatografia é um método físico-químico utilizado para analisar, identificar ou

separar os componentes de uma mistura. A cromatografia é definida como a separação

de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das quais é

estacionária e a outra móvel. Os componentes da mistura são distribuídos pelas duas

fases de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, o que

resulta em migrações diferenciais desses componentes.

CaCO

3

Éter de petróleo

Existem várias tipos de técnicas cromatográficas, desde as mais simples como

Cromatografia e Papel (CP), Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia de

Coluna (CC) até as técnicas mais sofisticadas, como a Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE) e Cromatografia Gasosa (CG). De modo geral, dentre os métodos

modernos de análises, as técnicas cromatográficas, ocupam um lugar de destaque na química

e bioquímica, na pesquisa e na indústria, devido a sua facilidade em efetuar a separação,

identificação e quantificação de compostos presentes em uma amostra, mesmo tratando-se de

misturas muito complexas.

A característica comum entre as diferentes técnicas cromatográficas é o fato de os

componentes da amostra serem distribuídos entre duas fases, durante a separação dos

componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas

fases, que estão em contato. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra se move

através dela. Durante a passagem da fase móvel pela fase estacionária, os componentes da

mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é

retido de acordo com a seletividade pela fase estacionária, resultando em migrações

diferenciais destes componentes.

A fase que permanece fixa é denominada fase estácionária (FE) e a fase que se move

sobre a FE, carregando os solutos é denominada fase móvel (FM).

Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes

de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente

retido sobre uma superfície plana.

A CCD tem várias aplicações importantes em química orgânica, tais como:

estabelecer se dois compostos são idênticos, verificar a pureza de um composto

(complexidade e muitas vezes a natureza), determinar o número de componentes em uma

mistura, determinar o solvente apropriado para separação em uma coluna cromatográfica,

monitorar a separação de uma mistura em uma coluna cromatográfica ou acompanhar o

progresso de uma reação química.

A CCD é um método extremamente prático e apresenta como vantagens: rapidez,

reprodutibilidade, versatilidade, baixo custo e sensibilidade, já que para a realização de uma

análise é necessário uma quantidade reduzida de amostra.

Existem comercialmente cromatoplacas pré-recobertas por alumina ou gel de sílica

(FE polar) para CCD, muitas vezes com material fluorescente impregnado. Na ausência de

cromatoplacas comerciais, pode-se preparar facilmente as placas de vidro. A fase sólida é

espalhada em camada fina sobre uma placa de vidro ou folha de alumínio. Para fixar o

adsorvente à superfície da lâmina usa-se sulfato de cálcio (gesso) ou um polímero orgânico.

Uma pequena quantidade de uma amostra orgânica é colocada em um ponto numa das

extremidades da placa, sendo adsorvida pela fase sólida.

Fundamento da técnica: O processo de separação por CCD está fundamentado,

principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto, usando-se FE tratadas, pode ocorrer

também por partição ou troca iônica, o que permite o seu emprego tanto na separação de

substâncias hidrofóbicas como hidrofílicas.

DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA DE CCD

Para a escolha da fase móvel de desenvolvimento de uma CCD pode-se utilizar um

único solvente ou uma mistura de dois ou mais solventes. Durante a seleção do solvente

alguns aspectos devem ser considerados: seletividade do solvente em relação a amostra,

facilidade de manuseio, custo, toxicidade e facilidade de eliminação (volatilidade do

solvente).

Uma vez escolhido o eluente (fase móvel) adequado, as amostras são aplicadas nas

cromatoplacas na forma de soluções, em solventes bastante voláteis por meio de um tubo

capilar. O tubo capilar é introduzido na solução da amostra e em seguida toca-se a ponta do

capilar na cromatoplaca, cerca de 1 cm da base inferior, conforme demonstrado na Figura 1,

permitindo que a amostra seja adsorvida pela fase estacionária. Alguns cuidados devem ser

tomados para evitar que a camada de adsorvente não seja alterada ou que o halo de difusão da

amostra seja maior que 2 mm. Um mesmo ponto de aplicação poderá sofrer várias aplicações,

se necessário uma maior concentração da amostra. Após cada aplicação deve-se esperar a

evaporação do solvente. Mais de uma amostra pode ser aplicada em uma mesma placa

mantendo-se uma distância entre as aplicações para evitar contato entre os pontos de cada

amostra. Em seguida, a placa é introduzida cuidadosamente em uma cuba fechada (cuba

cromatográfica), contendo o eluente escolhido, com a extremidade que contém a amostra para

baixo. O nível do solvente deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação das amostras. Durante

a análise o sistema deverá permanecer fechado para que a atmosfera esteja saturada pelo

vapor do solvente. Facilita-se a saturação colocando-se um pedaço de papel de filtro na

parede interna da câmara. A cromatoplaca deverá ser retirada da cuba somente quando a

frente do solvente atingir um limite pré-determinado na parte superior da placa (cerca de 1

cm). Após o desenvolvimento a cromatoplaca deve ser seca e revelada. Esta última etapa

consiste em tornar visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. A visualização

pode ser feita através de métodos físicos ou químicos. Muitos compostos, que contêm grupos

cromóforos (duplas ligações conjugadas) podem ser visualizados por meio de luz ultravioleta

(UV), por se tornarem fluorescentes quando excitados por essas radiações, podendo-se

observar manchas negras nos pontos onde a fluorescência é obstada. Estas manchas (e

quaisquer outras detectadas pelos métodos alternativos mencionados abaixo) devem ser

marcadas por um pequeno círculo. Para a revelação, a cromatoplaca pode ser borrifada com

reagentes universais como vanilina e anisaldeído ou exposta aos vapores de iodo, em

recipiente fechado, ou ainda, ser utilizado, um reagente específico para determinada classe de

metabólitos secundários, conforme tabela 1.

O valor do Rf é constante para uma dada substância, e corresponde a uma propriedade

física daquele composto. O valor de Rf pode, então, ser utilizado para identificar um

composto desconhecido, mas como muitas substâncias podem apresentar o mesmo valor de

Rf, assim como, podem ter o mesmo ponto de fusão, métodos adicionais devem ser utilizados

para confirmar a identidade do composto.

Para calcular o valor de Rf mede-se a distância que a substância se deslocou a partir

do ponto de aplicação (∆x) (Figura 1), considerando-se para efeito de medida o centro de

gravidade da mancha, e divide-se pela distância percorrida pela frente do solvente a partir do

ponto original de aplicação da amostra (∆y) (Figura 1). Na figura 1 está demonstrado como

deve ser efetuado o cálculo do Rf para cada componente de uma mistura.

Rf= distância percorrida pela amostra distância percorrida pelo

solvente

Figura 1: Esquema representativo de uma Cromatografia em Camada Delgada (CCD).

Cromatografia em Coluna

A cromatografia em coluna (CC) é uma técnica usada para a separação de muitos

compostos orgânicos. Essa técnica fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das

moléculas envolvidas. O investigador deverá dispor de tubos de vidro (coluna

cromatográfica), na qual o adsorvente (FE) deverá ser compactado, em geral, gel de sílica,

alumina e poliamida. O adsorvente será empacotado com um solvente orgânico ou uma

mistura de solventes, escolhidos como eluente (FM). Uma solução contendo a mistura que se

deseja purificar é aplicada na superfície superior da fase estacionária, e após inicia-se a

eluição, com fluxo determinado e a coleta das frações com volume predeterminados, as quais

muito provavelmente conterão os componentes da mistura separados.

A velocidade na qual um composto é eluído (migrado) da coluna depende de sua

polaridade, da polaridade da fase estacionária e da polaridade do solvente utilizado como

eluente. Se o composto interage mais fortemente com a FE do que pela FM (exemplo,

composto de coloração verde em destaque, Figura 2), ele migrará mais lentamente da coluna.

Caso contrário, se o composto tiver maior afinidade pela FM (composto de coloração

vermelha em destaque, Figura 2) ele migrará mais rapidamente da coluna, gastando menos

tempo e solvente. O êxito de uma coluna dependerá então da escolha de um adsorvente e

solvente adequados para a sua realização. Em alguns casos é possível visualizar a separação

dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na

coluna. Entretanto, na maioria das vezes, torna-se necessário o acompanhamento da separação

dos componentes pela técnica de CCD.

Figura 2: Esquema representativo de uma CC.

Objetivo da aula prática de Cromatografia: Verificar a autenticidade do extrato por

meio de comparação da amostra com a solução padrão (substância ativa ou marcador

especificados na farmacopéia), de acordo com os valores de Rf, coloração e

comportamento das manchas frente aos reveladores.

Preparação da amostra= Pesar 2 g da droga vegetal (inflorescências de Calendula

officinalis-calêndula) em um béquer e adicionar 50 mL de álcool 70%. Colocar o béquer

sob aquecimento em uma chapa aquecedora. Após iniciar a fervura, deixar por 5

minutos e filtrar.

Solução padrão= Solução de rutina em metanol.

Solução de ácido clorogênico em metanol.

Sistema cromatográfico

Adsorvente (Fase Estacionária)= gel de sílica 60 F254

Fase móvel= Acetato de etila: ácido fórmico: água (8:1:1, v/v/v)

Detecção: Reagente Natural A 0,5% (solução metanólica de difenilboriloxietilamina)

Passos para o desenvolvimento da cromatografia:

- Preparar o eluente (fase móvel) indicado para a amostra.

- Colocar o eluente na cuba de vidro.

- Preparar a placa fazendo uma linha cerca de 1 cm do início do ponto de migração e

marque o fronte do solvente.

- Aplicar a amostra e os padrões utilizando capilares, empregando o método de

aplicação em barra.

- Colocar a placa na cuba de vidro e deixar o eluente migrar até o fronte.

- Retirar a placa da cuba, deixar secar na capela ou com o auxílio do secador.

- Revelação: Aplicar o reativo de detecção adequado, secar com o auxílio do secador e

observar o cromatograma na câmara escura sob luz UV 360 nm.

- Interpretar o cromatograma, desenhando o mesmo e calculando os valores de Rf.

Responder o questionário abaixo:

1- Qual o método de extração empregado? Constitui um método de extração exaustiva?

Justifique sua resposta.

2- Qual o fundamento da técnica de cromatografia em camada delgada?

3- Descreva os resultados (coloração das manchas e Rf). Os resultados observados estão

de acordo com Farmacopéia Brasileira 4ª edição, 2002 (3º fascículo), que contém a

monografia da calêndula?

4- Explique porque um dos compostos apresentou menor valor de Rf?

5- Durante um experimento, foi realizado uma análise com uma amostra X, na qual a

fase móvel percorreu uma distância de 5 cm. Em outra análise com a mesma amostra X,

não foi possível esperar a amostra migrar até o final, sendo que a fase móvel percorreu

uma distância de 4 cm. Os compostos presentes na amostra X apresentarão Rf diferentes

em cada das análises. Justifique sua resposta.

6- Por que os padrões foram solubilizados em metanol?

7- O cromatograma abaixo representa o resultado da análise de uma amostra, na qual

foram separados três compostos. Sabendo-se que a fase estacionária era gel de sílica

(polar) e a fase móvel um mistura de acetato de etila: ácido fórmico: água (8:1:1/v/v/v),

relacione cada mancha com as estruturas abaixo. Justifique sua escolha.

Acessar farmacopéia no site da ANVISA:

www.anvisa.gov.br

 Medicamentos/Farmacopéia Brasileira/Farmacopéias Virtuais

AULA PRÁTICA 2

PESQUISA DE FENÓIS, FLAVONÓIDES E

ANTRAQUINONAS

Objetivo: Verificar a presença ou ausência de fenóis, flavonóides e antraquinonas nas

matérias-primas vegetais analisadas.

Preparação do extrato:

Pesquisa de fenóis e flavonóides:

Extrato hidroalcoólico a 10% das inflorescências de Matricaria recutita

(CAMOMILA).

 Pesar 5 g da droga vegetal em um béquer e adicionar etanol a 70% até 50 mL.

 Aquecer o extrato em chapa aquecedora.

 Quando atingir a fervura, deixar o extrato sob aquecimento por 10 min.

 Deixar esfriar (cuidado! Não coloque o béquer quente sob a bancada, pois o

béquer pode quebrar. Utilize papel toalha) e filtrar em funil de vidro com o

auxílio de algodão.

1. Reação com cloreto férrico (FeCl3) –reação geral para detecção de FENÓIS

Transferir 2 mL do extrato bruto para um tubo de ensaio. Adicionar 2 gotas de solução

etanólica de cloreto férrico a 2,5%. Verificar se há desenvolvimento de coloração.

Reação positiva: Desenvolvimento de coloração verde-escuro, violeta e azul (figura

1). Se necessário, diluir com água para melhor visualização da coloração desenvolvida.

Fundamento do método: Fenóis são compostos instáveis, assim, todos os fenóis são

facilmente oxidáveis. As hidroxilas fenólicas são redutoras e, portanto, se oxidam com

facilidade, resultando em substâncias coradas. A cor destes produtos de oxidação se

deve ao seu elevado grau de conjugação. Oxidantes, como o cloreto férrico (FeCl3),

favorecem a reação. O teste com cloreto férrico, portanto, serve para a caracterização de

polifenóis em geral. O desenvolvimento de coloração azul ou verde azulada pode

indicar a presença de flavonóides ou taninos, que deverá ser confirmada por outros

testes. A classe específica a que pertencem os polifenóis assim detectados deve ser

melhor caracterizada por reações particulares de cada grupo. Resultado positivo: A

positividade é evidenciada pelo desenvolvimento de coloração azul ou verde-

esverdeada.

2. Reação de cianidina ou Shinoda-reação para detecção de FLAVONÓIDES

Transferir 2 mL do extrato filtrado para uma cápsula de porcelana e aquecer até secura

em banho-maria (50 ºC), cuidando para que não haja carbonização do resíduo. Deixar

esfriar. Adicionar ao resíduo da cápsula 0,2 mL de clorofórmio para eliminação da

clorofila, ainda no banho-maria. Desprezar esse resíduo. Redissolver o resíduo restante

na cápsula com 1mL de etanol 70% e transferi-lo para um tubo de ensaio. Verter

CUIDADOSAMENTE, pelas paredes do tubo de ensaio grande, cerca de 1 mL de HCl

concentrado e adicionar pequena quantidade de magnésio em pó (cerca de 200 mg)

(CUIDADO!Poderá ocorrer projeções, reação exotérmica). Observar o

desenvolvimento de coloração (tabela 1).

Reação positiva: Desenvolvimento de coloração vermelha (figura 2).

A B

Figura 1: Resultado da reação de diferentes extratos com cloreto férrico. A: Reação negativa. B: Reação positiva.

Figura 2: Resultado positivo para a reação de Cianidina ou Shinoda.

Tabela 1: Positividade da reação de Cianidina ou de Shinoda.

REAÇÃO POSITIVA

(DESENVOLVIMENTO DE COLORAÇÃO)

REAÇÃO NEGATIVA (NÃO

DESENVOLVEM COLORAÇÃO)

- Flavona - amarelo a vermelho

- Flavonol - vermelho a vermelho-sangue

- Dihidroflavonol - vermelho a vermelho-sangue

- Flavanona - vermelho a violeta

- Deriv. antociânicos – vermelho para rosa

- Chalconas

- Auronas

- Dihidrochalconas

- Isoflavonas

- Isoflavononas

Pesquisa de antraquinonas:

Cascas do caule de Rhamnus purshianus (CÁSCARA-SAGRADA)

1.Reação de Bornträger direta – Reação para detecção de ANTRAQUINONAS

LIVRES

 Pesar 2 g da droga vegetal seca em pó e colocar em um tubo de ensaio;

 Adicionar 4 mL de Hidróxido de amônio diluído (10%) ou o suficiente para que o

pó seja coberto;

 Agitar por 2 minutos e filtrar com algodão para outro tubo de ensaio;

 Adicionar ao filtrado 1 mL da solução de NaOH a 10%.

Reação positiva: desenvolvimento de coloração rósea (figura 3).

2.Reação de Bornträeger indireta (com hidrólise)- Reação para detecção de

ANTRAQUINONAS NA FORMA GLICOSILADA

 Pesar em torno de 2,0 g da droga vegetal em pó em um béquer;

 Adicionar 20 ml de etanol a 25% e ferver (chapa aquecedora) durante 2 minutos;

 Filtrar com auxílio de algodão;

Figura 3: Resultado positivo para a reação direta para detecção de antraquinonas.

 Transferir o filtrado para um funil de separação e sobre o filtrado a quente, adicionar

30 ml de ácido sulfúrico a 5 %, agitar e esfriar;

 Adicionar 20 ml de hexano e agitar vagarosamente (para evitar a formação de

emulsão), por inversão;

 Decantar e transferir em torno de 5 ml da camada hexânica para tubo de ensaio.

 Adicionar 2 a 3 ml de hidróxido de amônio diluído.

 Observar a coloração da camada amoniacal.

Reação positiva: camada amoniacal de coloração rosa.

Responda o questionário abaixo:

1-O que significa análise fitoquímica preliminar?

2-Qual o método de extração empregado para a reação para detecção de flavonóides?

3- Qual o fundamento da reação de cianidina ou Shinoda?

4- Qual o fundamento da reação com cloreto férrico para detecção de fenóis?

5- Qual o fundamento da reação de Borntraeger?

6- Qual a diferença entre a reação de Borntraeger direta e indireta?

Figura 4: Reação de Borntraeger indireta. Esquerda=reação negativa. Direita=reação

positiva (camada inferior de coloração rosa)

AULA PRÁTICA 3

PESQUISA DE CUMARINAS, TANINOS E SAPONINAS

Objetivo: Verificar a presença ou ausência de cumarinas, taninos e saponinas nas

matérias-primas vegetais analisadas.

Pesquisa de cumarinas

1.Teste de fluorescência- reação para detecção de CUMARINAS

Pesar 1 g da droga vegetal (folhas de Mikania glomerata- GUACO) em um béquer.

Adicional 10 mL de etanol a 30%. Ferver em chapa aquecedora por 2 min. Deixar

esfriar e filtrar em um funil de decantação com o auxílio de algodão para um tubo de

ensaio. Pingar ao extrato obtido cerca de 5 gotas de solução alcoólica de KOH 10%.

Observar na luz UV.

Resultado positivo: Desenvolvimento de fluorescência verde-azulada (figura 1).

Fundamento do método: As cumarinas são heterosídeos que apresentam diversas

propriedades, dentre elas a do dicumarol que é anticoagulante, a dos furano-derivados

com ação sobre a vitiligo, dentre outras. As cumarinas puras não são fluorescentes, mas

em meio alcalino, formam o ácido cis-o-hidroxicinâmico que sob a ação da radiação

ultravioleta origina o isômero trans, que é fluorescente (figura 2) (sob a ação da

radiação ultravioleta possuem em geral fluorescência azul e alguns derivados já à luz

natural; em meio alcalino torna-se verde ou desaparece).

Figura 1: Teste de fluorescência para detecção de cumarinas.

Pesquisa de taninos

Preparação do extrato: Decoctos das folhas de Psidiun guajava (GOIABEIRA) e das

folhas de Eugenia uniflora L (PITANGUEIRA).

Pesar 5 g da droga vegetal pulverizada em um béquer e adicionar 100 mL de água

destilada. Colocar em chapa aquecedora e deixar 15 min sob extração após atingir a

fervura. Deixar esfriar e filtrar em funil de vidro com auxílio de algodão.

1.Reação de precipitação em gelatina- reação para detecção de TANINOS

Transferir 2 mL do extrato bruto para um tubo de ensaio e adicionar uma solução

aquosa de gelatina a 2,5% gota a gota. Cuidado: excesso de reagente poderá solubilizar

o precipitado.

Reação positiva: formação de precipitado (figura 3)

Fundamento do método: São substâncias polifenólicas de alto peso molecular e

apresentam como característica a propriedade de precipitar proteínas. Os taninos podem

ser caracterizados por reações de coloração ou de precipitação. A reação de precipitação

com gelatina a 2,5% em água é uma reação clássica para determinação de taninos. A

complexação formada em presença de proteínas pode gerar:

O O

COOH

OH OH

COOH

KOH/sol. alcoólica

ácido cis-o-hidróxicinâmico

luz UV

ácido o-cumárico (fluorescência verde)

cumarina

Figura 2: Reação em meio alcalino para detecção de cumarinas.

Figura 3: Reação de gelatina para detecção de taninos totais. Esquerda=reação

negativa. Direita= reação positiva.

Complexos reversíveis: ocorrem via pontes de hidrogênio entre as hidroxilas fenólicas

dos taninos e os grupamentos amida das proteínas e interações hidrofóbicas atuam como

uma força de atração inicial na complexação, que forma uma rede polifuncional de

ligações de hidrogênio, entre os núcleos aromáticos dos taninos e as cadeias alifáticas

ou aromáticas dos aminoácidos. Os complexos reversíveis podem ser solúveis ou

insolúveis, dependendo da proporção tanino/proteína, do pH e da força iônica do meio.

A adição de pequenas quantidades de proteína a uma solução de tanino produz um

precipitado que é dissolvido com a adição de mais proteína. O máximo de precipitação

ocorre quando existe uma proporção ótima entre tanino e proteína, que é, no entanto,

dependente da quantidade de sítios ligantes como grupos galoila e hidroxilas fenólicas,

presentes nos taninos.

Complexos irreversíveis: ocorrem em condições oxidativas, via ligações covalentes, na

qual os fenóis são transformados em quinonas que reagem com grupos nucleofílicos na

proteína.

2. Reação de Stiasny-SEPARAÇÃO DOS TANINOS HIDROLISÁVEIS E

CONDENSADOS

Adicionar 50 mL do extrato e 15 mL do reativo de Stiasny* em um béquer.

*O reativo de Stiasny é preparado no momento do uso da seguinte forma (ATENÇÃO:

O REATIVO DEVERÁ SER PREPARADO NA CAPELA): 10 mL de formol e

sobre este verter pelas paredes do frasco 5 mL de HCl concentrado. Misturar com

bastão de vidro. A mistura extrato + Reativo de Stiasny deve ser aquecida em manta

aquecedora (na capela) por 30 min.

Reação positiva: Os taninos condensados originam um precipitado vermelho

(flobafenos) (figura 4).

Figura 4: Reação de Stiasny. Reação de

taninos para condensados.

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