Biotecnologia, Notas de estudo de Engenharia Agronômica
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Biotecnologia, Notas de estudo de Engenharia Agronômica

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Transformação de plantas via agrobacterium
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Métodos de transformação genética

Métodos de transformação genética

Módulo de Transformação Genética e Melhoramento Março 2009, Departamento de Botânica, Universidade de Coimbra

Objectivos da aula - Métodos de transformação genética

3/24/2009João Loureiro2

 Transferência genética mediada pelo Agrobacterium  O Agrabacterium tumefaciens e a doença do galho do colo  O processo de transferência e integração do T-DNA  Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium  Transformação in planta por “floral dip”  Vantagens e problemas da transformação genética mediada pelo A. tumefaciens

 Transformação genética directa  Bombardeamento de partículas (ou biolística)

 Mecanismo de funcionamento  Parâmetros a optimizar em cada espécie  Transformação in planta por pistola genética  Transformação de cloroplastos

 Transferência directa de DNA para protoplastos  Electroporação

 Metodologias de detecção da incorporação do transgene

 Factores não controláveis no processo de transformação

 O produto final

Métodos de transformação genética

3/24/2009João Loureiro3

 A transformação genética depende da introdução estável do transgene no genoma da planta.

 Existem dois tipos de métodos para atingir este objectivo:

 Transformação genética mediada por Agrobacterium

 Transformação genética directa

 Bombardeamento de partículas (ou biolística)

 Electroporação  Transferência directa de DNA para

protoplastos

Transferência genética mediada pelo Agrobacterium – O Agrobacterium tumefaciens

3/24/2009João Loureiro4

 Bactéria da rizoesfera Gram (-) com forma de bastonete que provoca a doença do galho do colo.

 A doença do galho do colo é economicamente importante em muitas plantas (particularmente videiras, roseiras e macieiras) e caracteriza-se pelo crescimento de um tecido tumoral.

 A capacidade de despoletar o galho do colo depende da capacidade do Agrobacterium de transferir genes bacterianos para o genoma vegetal.

 Os paralelismos aparentes entre o galho do colo e os tumores animais atraíram a atenção dos cientistas nas décadas de 60 e 70 para esta doença – desconheciam ainda as aplicações extraordinárias que iria ter na biotecnologia vegetal!

A doença do galho do colo

3/24/2009João Loureiro5

 O A. tumefaciens sobrevive normalmente de nutrientes libertados pelas raízes das plantas.

 Todavia, se a planta tiver uma lesão, o A. tumefaciens pode infectá-la nesse local e provocar a doença.

 O A. tumefaciens é atraído para o local da lesão por quimiotaxia, em resposta a açúcares e compostos fenólicos libertados pela células danificadas da planta.

 O DNA do plasmídeo é transferido do A. tumefaciens para a o DNA das células vegetais, provocando a doença do galho do colo.

A doença do galho do colo

3/24/2009João Loureiro6

 O sucesso da transferência do DNA depende de um plasmídeo – plasmídeo Ti (indutor de tumores).

 Parte do plasmídeo – o T-DNA (DNA de transferência) é transferido da bactéria para o a célula vegetal onde se integra no genoma.

 O T-DNA apresenta genes que codificam proteínas envolvidas na síntese de hormonas (auxinas e citoquininas) e de metabolitos novos para a planta (opinas e agropinas).

 As hormonas induzem a proliferação celular formando o galho, enquanto que as opinas (derivado de aminoácidos) e agropinas (derivados de açúcar) são a fonte de carbono e energia para o Agrobacterium.

 Estirpes diferentes de A. tumefaciens apresentam plasmídeos Ti que codificam a produção de opinas de diferentes tipos (e.g., octopina, nopalina).

 A bactéria “usurpa” a maquinaria de síntese da planta para produzir nutrientes que só ela é capaz de utilizar.

A doença do galho do colo

3/24/2009João Loureiro7

O plasmídeo Ti

3/24/2009João Loureiro8

 Plasmídeo de grandes dimensões (≈200 kb).  Características em comum dos plasmídeos das diversas estirpes de

A. tumefaciens:

 Região T-DNA (uma ou mais)

 Região vir

 Região de replicação

 Genes de catabolismo das opinas

 Região de transferência conjugativa

T-DNA

3/24/2009João Loureiro9

 Definida pelas sequências de flanco (esquerdo, LB e direito, RB) compostas por repetições de 24 pb.

 As octopinas contêm uma sequência optimizadora (“enhancer”) associada ao flanco direito, que optimiza a transferência de T-DNA.

 Todo o DNA entre os flancos é transferido para o genoma da planta hospedeira.

Nopalinas – Uma região T-DNA de ≈ 20 kb com 13 ORFs (“open reading frames”)

Octapinas – Duas regiões T-DNA (TL e TR):

 Apenas a região TL é oncogénica e apresenta 8 ORFs.

 TR contem os genes para a síntese de opinas que não a octapina (e não contém oncogenes).

 Os ORFs têm características dos genes eucariotas.

O T-DNA – genes importantes

3/24/2009João Loureiro10

 Oncogenes:  auxA (ou tms 1 ou iaaM) e auxB (ou tms2 ou iaaH) – codificam proteínas

envolvidas na produção do ácido 3-indolacético (IAA).  cyt (ou tmr ou ipt) – codifica uma enzima (isopentenil transferase) que

catalisa a passo mais importante da produção de citoquininas.

 Outros genes:  ocs – gene que codifica a síntese de opinas (octopina ou nopalina)  tml – gene envolvido na regulação do tamanho do tumor.

 Estes genes são transcritos apenas in planta e apresentam sinais típicos de expressão em eucariotas.

A região vir

3/24/2009João Loureiro11

 Os genes responsáveis pela transferência do T-DNA encontram-se numa região do plasmídeo (≈ 40kb) fora do T-DNA – a região vir

 Existem pelo menos 9 operões de genes vir (virA, B, C, D, E, F, G, H, J) que codificam proteínas com funções distintas no processo de transferência do T-DNA.

 Alguns genes vir possuem ORFs múltiplos (e.g., virB tem 11 ORFs) pelo que podem ser codificadas até 25 proteínas putativas.

 A maioria dos genes vir estão silenciados na ausência do hospedeiro, mas virA e virG são transcritos constitutivamente a um nível baixo.

 O sistema de controlo é hierárquico  os genes virA e virG regulam a expressão dos outros genes vir.

Outras regiões do plasmídeo Ti

3/24/2009João Loureiro12

Região de transferência conjugativa - controla a troca de plasmídeos entre o Agrobacterium e outras células bacterianas.

Genes de catabolismo das opinas - codificam proteínas necessárias à importação e utilização da mesma classe de opinas cuja síntese é codificada pelo T-DNA.

Região de replicação (ori) - codifica funções que permitem ao Agrobacterium manter o plasmídeo Ti durante a divisão celular bacteriana.

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro13

Ligação do Agrobacterium às células da planta  Ligação inicial através de um polissacarídeo

(produto do locus attR).  Produção de fibras de celulose (ß-1,2-glucano) pela

bactéria:  Os genes envolvidos neste ligação encontram-se no

cromossoma bacteriano (genes de virulência cromossomal, chv)

 Os genes chvA e chvB estão envolvidos na produção e secreção de ß-1,2-glucano

Reconhecimento do sinal pelo Agrobacterium  O Agrobacterium detecta compostos fenólicos ou açúcares libertados

pelas células da zona da ferida da planta. Estes compostos fazem parte dos mecanismos de defesa da planta, estando habitualmente envolvidos na síntese de fitoalexina e linhina.

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro14

Indução dos genes vir 1. VirA está associado com a

membrana bacteriana interna, num complexo com o produto do gene cromossomático chvE (transportador de glucose/galactose);

2. A ligação de uma molécula fenólica apropriada ao complexo VirA-ChvE causa a activação da cinase latente e subsequente autofosforilação de VirA;

3. A resposta de VirA é aumentada pela ligação de moléculas de açúcar à proteína ChvE;

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro15

Indução dos genes vir

4. O P-VirA activado liga-se a VirG e activa-o por fosforilação;

5. O P-VirG é um activador transcripcional para os outros loci vir.

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro16

1. Os flancos esquerdo e direito são reconhecidos pelo complexo VirD1-D2;

2. VirD2 corta uma cadeia na extremidade 5’ do T-DNA;

3. Esta actividade endonucleásica é aumentada pelos produtos do gene virC que se ligam ao optimizador;

4. A proteína VirD2 permanece ligada covalentemente à extremidade 5’ da cadeia do T-DNA durante o processo de transferência;

5. A proteína VirE2 liga-se à cadeia simples de DNA;

Produção e transferência da cadeia T-DNA

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro17

Produção e transferência da cadeia T 6. A cadeia do T-DNA é envolto por múltiplas cópias de VirE2 que também

é transferida para a célula hospedeira; Esta associação pode ocorrer logo na célula bacteriana, mas algumas experiências sugerem que a cadeia nua de T-DNA-VirD2 é transferida para o hospedeiro separada das proteínas VirE2. Só no citoplasma da células hospedeira é que o complexo é envolto pelas proteínas VirE2.

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro18

Produção e transferência da cadeia T 7. Os produtos do gene virB formam um canal membranar de secreção (que

pode incluir o T-pilus bacteriano). VirD4 também está envolvido. O mecanismo de transferência do T-DNA permanece obscuro. Sabe-se que requer energia (hidrólise de ATP) e que decorre durante 2 a 4 horas após o contacto.

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro19

1. As proteínas VirE2 protegem o T-DNA da destruição pelas nucleases do hospedeiro, facilitam a localização nuclear e conferem a conformação correcta ao complexo T-DNA-VirD2 para a sua passagem pelo complexo de poros nucleares;

2. Na célula vegetal as proteínas VirD2 e VirE2 interagem com diversas proteínas vegetais para assegurar a localização nuclear do T-DNA:

A. VirD2 apresenta um sinal de localização nuclear e interage com uma proteína vegetal (importina-α) responsável pelo reconhecimento e transporte de proteínas pelos poros nucleares.

B. VirE2 apresenta dois sinais de localização nuclear e interage com a proteína vegetal VIP1 que facilita a interacção VirE2–importina-α

Transferência do T-DNA e das proteínas Vir para a célula vegetal e localização nuclear

O processo de transferência e integração do T-DNA

3/24/2009João Loureiro20

5. Uma vez dentro do núcleo o complexo-T interage com diversas proteínas da maquinaria de transcrição;

6. As proteínas ligadas ao complexo-T são removidas num processo que envolve a proteína VirF;

7. A cadeia de T-DNA é integrado no genoma por um processo de recombinação ilegítima aparentemente em locais ao acaso (mas, mais ricas em A-T);

8. Este processo não necessita de sequência similares e é mediado por proteínas vegetais envolvidas na reparação do DNA.

Transferência do T-DNA e das proteínas Vir para a célula vegetal e localização nuclear

3/24/2009João Loureiro21

3/24/2009João Loureiro22

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium

3/24/2009João Loureiro23

 O Agrobacterium foi primeiramente usado para transferir DNA para espécies Dicotiledóneas (muitas espécies são naturalmente infectadas pela bactéria)  Fáceis de transformar com vectores “standard” e

com estirpes comuns de Agrobacterium (e.g., LBA4404).

 Subsequentemente foi desenvolvido para algumas espécies de monocotiledóneas.  Mais dificilmente transformadas (muitas vezes não

são naturalmente infectadas pela bactéria) e por isso podem necessitar de vectores modificados e estirpes super-virulentas de Agrobacterium (e.g., EHA101).

 Podem igualmente necessitar de marcadores de selecção mais fortes ou modificações ao meio de co- cultura (Apresentação oral).

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium

3/24/2009João Loureiro24

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium

3/24/2009João Loureiro25

Identificação de um explante adequado  Com capacidade de produzir plantas completas por regeneração  Com uma taxa elevada de células competentes para a transformação  Exemplos: folhas, embriões, tecido caloso, protoplastos

Construção do vector de transformação  Derivados do plasmídeo Ti, mas:

 Apenas as sequências flanco são mantidas. Os genes de virulência são habitualmente colocados num plasmídeo separado na bactéria.

 Com marcador de selecção no T-DNA selecção das plantas transformadas  Com marcador de selecção fora do T-DNA selecção das bactérias transformadas

Selecção da estirpe de Agrobacterium a usar (de acordo com a espécie a transformar)

Co-cultura com Agrobacterium

Destruição de Agrobacterium com um antibiótico adequado (que não danifique o tecido vegetal)

Selecção das células transformadas

Regeneração do tecido vegetal em plantas completas (cultura de tecidos)

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium – exemplo da planta do tabaco

3/24/2009João Loureiro26

 Selecção do explante:  Folhas de tabaco

 Co-cultura com Agrobacterium:  Corte das folhas em pedaços pequenos e co-

cultivo com Agrobacterium durante 30 minutos - LIGAÇÃO

 Remoção das folhas e colocação em meio de crescimento (e.g.,meio MS)

 Incubação com Agrobacterium durante mais 2 dias TRANSFERÊNCIA DO T-DNA

 Destruição de Agrobacterium com um antibiótico adequado  Remoção dos explantes do meio e lavagem

com solução com antibiótico (e.g., cefotaxime)

Aplicações práticas da transformação por Agrobacterium – exemplo da planta do tabaco

3/24/2009João Loureiro27

 Selecção das células transformadas:  Cultura dos explantes em meio fresco

suplementado com um agente selectivo (e.g., canamicina) que previne o crescimento das células não transformadas (semanas a meses)

 Regeneração do tecido vegetal em plantas completas:  Adição ao meio de hormonas vegetais 

auxina (e.g., NAA) e citoquininas (e.g., BAP) que induzam a regeneração por organogénese, por exemplo.

 Rácio citoquininas:auxinas elevado induz a formação de rebentos.

 Os rebentos podem ser enraizados em meio com um rácio auxinas:citoquininas elevado.

Transferência genética mediada pelo Agrobacterium

3/24/2009João Loureiro28

 Outras espécies de Agrobacterium A. rhizogenes  Menos estudado mas com uma biologia muito

semelhante à do A. tumefaciens.  Provoca a doença das raízes vilosas ou em

cabeleira.  No início foi considerada uma boa alternativa,

uma vez que originava a produção de raízes vilosas que podem ser regeneradas em plantas completas. Todavia, os sistemas baseados em A. tumefaciens são mais eficazes.

 Usada com o fim de produção de compostos bioactivos e metabolitos secundários.

 Outras bactérias em teste:  Rhizobium sp.  Sinorhizobium meliloti Mesorhizobium loti

Transformação in planta por “floral dip”

3/24/2009João Loureiro29

 Método simples (não necessita de cultura de tecidos e por isso é bastante mais rápida) em que plantas com botões florais são mergulhadas (com ou sem vácuo) numa cultura de Agrobacterium que contém um detergente (surfactante) e algum açúcar.

 O Agrobacterium invade o sistema vascular e encaminha-se até aos óvulos não fertilizados das flores.

 A planta desenvolve sementes, sendo que algumas são transgénicas.

 Apesar da eficácia da técnica ser reduzida, como são produzidas muitas sementes a taxa de transformação final é razoável.

 Desenvolvido inicialmente para Arabidopsis (mas já existem protocolos para Medicago truncatula (alfalfa) e Brassica sp.)

Vantagens da transformação genética por A. tumefaciens

3/24/2009João Loureiro30

 O Agrobacterium continua a ser o método principal de transformação genética

 As principais vantagens incluem:  Indução de menos rearranjos do

transgene

 Número menor de cópias do transgenes do que os métodos de transferência directa

 Maior proporção de transformantes estáveis

 Possibilidade de transferir segmentos de DNA de maiores dimensões

 Maior eficiência

Transferência genética mediada pelo Agrobacterium

3/24/2009João Loureiro31

 Problemas associados:  A taxa de sucesso depende das espécies  Uma transformação bem sucedida depende da possibilidade de:  Infecção celular do A. tumefaciens e incorporação do T-DNA no genoma

vegetal

 Cultivar as células transformadas para a regeneração de plantas completas

 Necessita de períodos longos de cultura de tecidos:  Tempo de cultura

 Espaço de cultura

 Indução de variação somaclonal:  Marcadores moleculares  Citometria de Fluxo

Métodos de transferência génica directa

3/24/2009João Loureiro32

 Os sistemas de transferência génica directa são mais usados em espécies recalcitrantes (onde o método do Agrobacterium não resulta)  cereais.

 Baseiam-se na transferência de quantidades elevadas de DNA após permeabilização das células vegetais.

Métodos de transferência génica directa

Comentário

Bombardeamento de partículas ou biolística

Método com muito sucesso; Risco de rearranjo génico e de um número elevado de cópias do transgene.

Electroporação Utilizado nalgumas espécies de cereais; Baixa eficiência; Necessita de optimização cuidada.

Protoplastos Usado em muitas espécies de cereais; Necessita de optimização dos métodos de isolamento de protoplastos.

Fibras de silicone Usado em algumas espécies; Necessita de suspensões de células regeneráveis.

 Em geral estes métodos resultam em taxas elevadas de rearranjo génico e a num número elevado de cópias do transgene  silenciamento génico

Método da biolística

3/24/2009João Loureiro33

 Método mais importante e eficaz de transferência génica directa.

 Baseado no “disparo” a alta velocidade de esferas (de tungsténio ou ouro) revestidas com o DNA do vector de expressão.

 O DNA é de seguida liberto nas células onde pode ser integrado no gene.

 A reparação das feridas causadas pelo disparo é rápida e, apesar de nalgumas células o DNA ser incorporado nos cromossomas (expressão estável), na maior parte das células existe apenas expressão transiente (não dependente da integração no genoma).

Método da biolística

3/24/2009João Loureiro34

 Os primeiros sistemas deste tipo foram desenvolvidos em 1987 e usavam cargas explosivas (pólvora) para disparar esferas de tungsténio.

 Todas as espécies principais de cereais foram transformadas usando este método.

 O milho contendo o gene para Bacillus thuringiensis (1º OGM comercializado) foi produzido por biolística.

 O instrumento mais usado hoje em dia é baseado em hélio (PDS-1000/He).

Mecanismo de funcionamento da biolística

3/24/2009João Loureiro35

 O tecido vegetal é colocado numa câmara de vácuo abaixo da placa de paragem do “macrocarrier”.

 Os “microcarriers” (esferas com DNA) são aderidos à membrana do “macrocarrier” e esta é inserida no sistema.

 Assim que se atinge o vácuo na parte de baixo do sistema, a pressão na câmara de hélio situada acima do disco de ruptura é aumentada.

 O disco de ruptura explode e propaga o “macrocarrier” ao longo da câmara

 O “macrocarrier” é parado no écran de paragem permitindo que os “microcarriers” sejam lançados em direcção ao material.

http://www.cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/animation.html http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/images/Genegun1.html

Parâmetros a optimizar em cada espécie

3/24/2009João Loureiro36

 O método tem que ser optimizado de forma que se atinja um equilíbrio entre o número e tamanho de esferas disparadas, o dano que provocam e a quantidade de DNA que fornecem:  Pouco DNA origina taxas reduzidas de transformação genética.  Muito DNA pode originar a números demasiado elevados do

transgene e rearranjos do transgene.

 Tipo e modo de preparação das esferas:  Novas substâncias como aminosiloxanas para revestir as esferas

com DNA em vez de cloreto de cálcio ou poliaminas (espermidina).

 Velocidade de aceleração das esferas:  Pressão a que o disco de ruptura explode;  Distância entre o écran de paragem e o material vegetal.

 Escolha do material alvo:  Explantes primários – primeiro são bombardeados e só depois é

que a embriogénese é induzida  Culturas embriogénicas em proliferação  Para proteger o tecido vegetal do dano provocado pelo

bombardeamento é comum induzir uma plasmólise limitada ou cultivar os explantes em meio com taxa elevada de osmóticos.

Transformação in planta por pistola genética

3/24/2009João Loureiro37

 A pistola genética “Helios” da BioRad  São usadas partículas de ouro revestidas

com DNA que são carregadas e disparadas directamente no tecido alvo.

 Um impulso com hélio a baixa pressão impele as partículas sobre o alvo.

Transformação de cloroplastos

3/24/2009João Loureiro38

 O método do bombardeamento tem sido usado recentemente para introduzir DNA nos cloroplastos

 A transformação de cloroplastos oferece a possibilidade de criar OGMs mais eficientes e amigos do ambiente:  Os cloroplastos são herdados da mãe por isso é prevenida a transferência génica para

espécies infestantes através do pólen;  O número elevado de cloroplastos e as cópias múltiplas de cromossomas levam a que as

células contenham muitas cópias do transgene o que resulta em taxas elevadas de expressão sem que haja silenciamento génico;

 Não há necessidade de modificar genes bacterianos pois os sistemas de transcrição e tradução dos cloroplastos são procarióticos.

Transferência directa de DNA para protoplastos

3/24/2009João Loureiro39

 Os protoplastos são células vegetais às quais a parede celular foi removida.  A remoção da parede costuma ser

efectuada através de enzimas (e.g., celulase, pectinase) em meio ligeiramente hipertónico.

 Podem ser obtidos através do:  Mesófilo foliar;  Cultura de células.

 Para algumas espécies é complicado isolar protoplastos.

 Além disso é complicado trabalhar com protoplatos, assim como regenerar plantas a partir dos protoplastos.

Transferência directa de DNA para protoplastos

3/24/2009João Loureiro40

 A transformação de protoplastos baseia-se na abertura de poros das membranas celulares através de:  Tratamento com polietilenoglicol (PEG)

na presença de catiões divalentes (e.g., Ca2+)

Electroporação.

 O PEG e o Ca2+ destabilizam a membrana plasmática do protoplasto, tornando-a permeável ao DNA.

 Uma vez dentro do protoplasto o DNA entra no núcleo e integra-se no genoma.

A electroporação

3/24/2009João Loureiro41

 A electroporação pode ser usada para transferir DNA (em plasmídeos, por exemplo) para células vegetais (e.g., culturas de tecido caloso, embriões imaturos) ou protoplastos.

 O material é incubado numa solução contendo DNA e sujeito a pulsos eléctricos de alta voltagem.

 Estes pulsos abrem os poros da membrana plasmática (por um período de tempo curto) e o DNA entra na célula onde se integra no genoma.

A electroporação

3/24/2009João Loureiro42

 A electroporação foi usada com sucesso na transformação de arroz, trigo e milho.

 No entanto o sucesso da electroporação é dependente de certos factores:  Condição do material vegetal  Condições da electroporação (e.g., voltagem aplicada)  Tratamento a que o tecido foi sujeitado.

 Mesmo em condições óptimas a quantidade de DNA integrado é baixo  vantagem no que diz respeito ao número de cópias do transgene

 A quantidade de células que efectivamente recebe DNA pode ser elevado e esta técnica é menos agressiva do que a biolística.

Metodologias de detecção da incorporação do transgene

3/24/2009João Loureiro43

 Os genes marcadores de selecção introduzidos durante a transformação permitem a selecção do tecido que foi transformado.

 No entanto, pode ter existido apenas a integração do gene do marcador e não o gene de interesse.  Solução: Análises de “Southern Blot”

Factores não controláveis no processo de transformação

3/24/2009João Loureiro44

 O modo como o DNA do transgene é integrado não é bem conhecido.

 O DNA do transgene é integrado ao acaso no genoma vegetal.

 Cada planta é derivada de um acontecimento de transformação único:  Cada planta possui DNA integrado num local diferente  Cada planta é heterozigótica para o DNA introduzido  Cada planta pode possuir inserções em números distintos

 A inserção pode ter “desmembrado” outros genes – mutação ou alteração de fenótipos

O produto final

3/24/2009João Loureiro45

 O que é preciso saber mais?  O transgene está presente?  Expressão correcta dos marcadores de selecção

 Southern Blot

 Quantas cópias do trangene estão presentes?  A expressão do transgene é a correcta?  Será que o gene inserido confere o característica desejada?  Será que existe desmembramento de algum gene vegetal

importante?  Será que o transgene provoca alterações subtis e inesperadas?

Pra quem ainda não tem material de Biotecnologia Agrícola, isso deve ajudar pra prova de terça...
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