Espectroscopia de Absorção Molecular, Notas de estudo de Bioquímica e Instrumentação

Baixe Espectroscopia de Absorção Molecular e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica e Instrumentação, somente na Docsity! Espectroscopia de Absorção Molecular MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISE PÁGINA 1 Índice  Introdução ................................................................................... 2 o Espectro Eletromagnético .......................................................................... 2 o Espetroscopia ............................................................................................ 2 o Espetroscopia de absorção Vs. Espetroscopia de emissão ........................ 3 o Espetroscopia de absorção molecular Vs. Espetroscopia de absorção atómica ....................................................................................................... 3  Espetroscopia de Absorção ......................................................... 3 o Fundamento geral ..................................................................................... 3 o Transmitância ...........................................................................................4 o Espécies com capacidade de absorção e transição eletrónica ................. 4 o Lei de Beer-Lambert (conceito, fórmulas e desvios) ............................... 5  Importância do estudo da variação da concentração com a absorção  Instrumentação e procedimentos experimentais ..................... 8 o Espetroscópios .......................................................................................... 8 o Espetrofotómetros .................................................................................... 8 o Fontes de radiação, seletores de comprimento de onda, reservatório de amostras, sistema de deteção e sistema de controle ............................... 9 o Espetrogramas .......................................................................................... 10 o Limitações dos instrumentos ................................................................... 11 o Exemplos de alguns dos instrumentos mais utilizados ........................... 11  Aplicações da espetroscopia de absorção molecular em análises ........................................................................................ 12 o Análises qualitativas e quantitativas ....................................................... 12  Conclusão .................................................................................... 12  Bibliografia .................................................................................. 13 PÁGINA 4 Transmitância A transmitância é a fração da luz incidente com um determinado comprimento de onda e que atravessa uma amostra de matéria. Está relacionada diretamente com a absorbância, pois quando a luz atravessa a amostra, parte da energia é absorvida pelas moléculas. Espécies com capacidade de absorção Estas espécies contêm eletrões específicos (π, σ e n), pelo que a absorção de comprimentos de onda da radiação UV e visível é restrita a um número de grupos funcionais (cromóforos) que contêm eletrões de valência com energias de excitação relativamente baixas. Os eletrões associados à absorção de uma molécula são:  Os que participam diretamente na associação entre 2 ou mais átomos  Os eletrões desemparelhados, que sem encontram em torno de determinados átomos (oxigénio, enxofre, nitrogénio…) Transição As transições eletrónicas moleculares ocorrem quando eletrões excitados, ao absorver energia, transitam para um nível de energia mais alto em relação ao nível de energia onde se encontravam, ou quando se retira esse estímulo, eles transitam para um nível de energia abaixo do seu original emitindo energia. A mudança de energia associada a esta transição fornece informações sobre a estrutura de uma molécula e determina muitas propriedades moleculares, como por exemplo a cor, um benefício que pode ser utilizado na Espetroscopia. A maioria das aplicações espectroscópicas para compostos orgânicos são baseados, sobretudo, em transições de eletrões específicos (n ou π para o estado π*), pelo facto de a energia necessária para este processo propiciar picos capazes de absorver uma região do espectro conveniente ao método utilizado. PÁGINA 5 Características associadas à Transição Auxocromismo: Um auxócromo é um grupo funcional que, por si só, não absorve na região UV, mas ao conjugar-se com outras moléculas, permite deslocar os picos do cromóforo para comprimentos de onda maiores, bem como aumentar a intensidade. Os deslocamentos dos comprimentos de onda são classificados como: Batocrómicos: deslocamento para zona do vermelho Hipsocrómicos: deslocamento para zona do azul Quanto a intensidade de absorção:  Efeito hipercrómico: aumento da intensidade de absorção  Efeito hipocrómico: diminuição da intensidade de absorção Lei de Lambert-Beer Conceitos As leis de Lambert-Beer são o fundamento da espectroscopia, servindo como um guia no processo, em que a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada solução depende da concentração do soluto e da espessura da solução.  Lambert (1870) observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromático, atravessava um meio transparente homogéneo, cada camada deste meio absorvia igual fração de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão, enunciou a seguinte lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ". PÁGINA 6  Beer (1852) observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra. A partir desta conclusão, enunciou a seguinte lei: Fórmulas Transmitância (T): A razão da potência radiante do feixe transmitido (P) pela potência radiante do feixe incidente (P0). T = P/P0 Absorbância (A): ao contrário da transmitância, ou seja, é antilog da transmitância. A = - log10T = P/P0 Absorbância (A): Para radiações monocromáticas, a absorbância (A) é diretamente proporcional ao comprimento do percurso ótico (b) através do meio e à concentração (c) das espécies absorventes. A constante de proporcionalidade é chamada de absortividade (a). A = abc Absortividade molar (ε): é a capacidade que um mol de substância tem de atenuar a luz incidida num dado comprimento de onda, ou por outras palavras, o quão fortemente uma substância absorve radiação de uma determinada frequência. A = εbc A absorbância aumenta conforme aumenta qualquer um dos três: ε, b ou c - εb é a inclinação de A x C e, portanto, responsável pela sensibilidade do método. Desvios da Lei Lambert-Beer Desvio Real São desvios realmente associados à lei, que limitam a sua aplicação a determinados sistemas possíveis de sofrerem tais distorções. Causas do desvio real:  Variação do índice de refração com a concentração " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente ". PÁGINA 9  Para selecionar diferentes comprimentos de onda é necessária a existência de filtros (absorção ou interferência) e de monocromadores. Os filtros de absorção são mais baratos que os de interferência, mas apenas selecionam alguns comprimentos de onda; são normalmente utilizados para seleção de bandas na região do visível e os tipos mais comuns deste filtro consistem em vidro colorido. Já os filtros de interferência selecionam o comprimento de onda pretendido através de reflexões e interferências destrutivas e construtivas; estes filtros utilizam a interferência ótica para fornecer bandas estreitas de radiação. Os monocromadores são constituídos por uma fenda de entrada, um elemento de dispersão de radiação e por uma fenda de saída. Os elementos de dispersão podem ser prismas ou redes de difração.  As amostras podem ser colocadas em diferentes tipos de reservatórios ou cuvettes. Na região do visível é aconselhado o uso de cuvettes de vidro e de plástico enquanto é aconselhado o uso de cuvettes de quartzo ou sílica fundida na região do ultravioleta.  Quanto aos sistemas de deteção estes são compostos por mecanismos denominados transdutores. Os transdutores convertem a luz para o domínio elétrico. Os sistemas de deteção podem ser fototubos, tubos fotomultiplicadores ou fotodiodos. Nestes, o tubo fotomultiplicador é o mais sensível uma vez que consegue detetar níveis muito baixos de luminosidade. Já um arranjo linear de fotodiodos permite detetar simultaneamente vários comprimentos de onda  Por último, o sistema de controle, aquisição e processamento de dados pode ser simplesmente o monitor de um computador, ou no caso de espetrofotómetros mais avançados diretamente no monitor do aparelho. Espetrofotómetros mono-feixe VS duplo-feixe Os espetrofotómetros variam na sua complexidade e desempenho. Existem modelos simples e mais sofisticados e equipados com softwares especiais de acordo com a necessidade industrial. Os espetrofotómetros podem ser de dois tipos: mono-feixe e duplo-feixe.  No espetrofotómetro de feixe +único, a radiação vinda de um filtro ou monocromador passa por uma célula de referência ou célula de amostra.  No caso dos espetrofotómetros de feixe duplo estes podem ser espaciais ou temporais. Nos espaciais, a radiação vinda do filtro/monocromador é dividida em dois feixes que passam simultaneamente pela célula de PÁGINA 10 referência e de amostra antes de atingir dois detetores separados. Já nos espetrofotómetros de feixe duplo temporal, o feixe é alternadamente enviado através das células de referência e da amostra antes de atingir um único fotodetetor Modo de utilização:  Mono-feixe: Ajusta-se a transmitância a 0 % (zero) e fecha-se o obturador entre a fonte de radiação e o detetor. Coloca-se o solvente (branco) no percurso óptico, abre-se o obturador e varia- se a intensidade da radiação até que o sinal seja de 100% de transmitância. Após se observar este valor substitui-se o recipiente com solvente pelo recipiente com a amostra e o percentual de transmitância da mesma é lido no indiciador de sinal.  Duplo-feixe: dois feixes de radiação são formados no espaço. Um feixe passa pela solução de referência (branco) até ao transdutor e o segundo feixe, ao mesmo tempo, passa pela amostra até ao segundo transdutor. O ajuste neste tipo de espetrofotómetros é realizado a 0% com a interrupção da radiação nos dois feixes e a 100% com o solvente (branco) colocado no percurso ótico dos dois feixes. Espetrogramas Por definição são gráficos que analisam dinamicamente a densidade espetral de energia. Os valores do espetrograma são indicados no plano tempo vs. frequência e podem ser traçados através de um gráfico de superfície. A forma usual para apresentação do espetrograma é planar: diferentes cores identificam diferentes intensidades da densidade espetral de energia, as intensidades variam do violeta ao vermelho do espetro de luz visível. Os espetrogramas são dados através do espetrómetro/espetrofotómetro. A quantidade de fotões absorvidos de um feixe de luz, após este ter atravessado a solução da amostra, é que dá resultado aos gráficos. PÁGINA 11 Limitações dos instrumentos A radiação eletromagnética usada nos espectrómetros e espectrofotómetros é policromática, pois provém da seleção por filtros ou monocromador da radiação emitida por uma lâmpada de espectro contínuo. Estes selecionam uma banda de radiação mais ou menos estreita em energias, deixando ainda passar luz parasita com energia muito diferente da radiação selecionada. Importância da monocromaticidade O uso de radiação policromática provoca desvios à lei de Beer, pois o coeficiente de absorção molar depende do comprimento de onda da radiação. De modo a diminuir a influência da policromaticidade na determinação de absorbâncias, estas devem, sempre que possível, ser efetuadas na região da banda de absorção onde as variações com o comprimento de onda sejam mínimas. Este problema é importante quando se usam fotómetros (espectrofotómetros) baratos, que não permitem a seleção de uma banda estreita de comprimentos de onda. Por outro lado, a monocromaticidade do feixe de luz, determinada pelas fendas de entrada e saída do monocromador, limita também a resolução do espectro de absorção. Para resolver uma banda de absorção é necessário que a largura de banda do monocromador seja inferior a 10% da largura da banda de absorção. Esta condição pode ser impraticável, pois a diminuição da largura das fendas do monocromador reduz a intensidade do feixe, o que provoca a diminuição da razão sinal/ruído. Instrumentos mais utilizados Espetrofotómetros  Spectronic  Glomax  Jasco V630  Nicolet Evolution  Shimadzu UV  Gehaka 380G UV-VIS