Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas ..., Esquemas de Materiais

Baixe Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas ... e outras Esquemas em PDF para Materiais, somente na Docsity! Juliana Rodrigues de Souza Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas nanopartículas para aplicação em Engenharia de Tecidos São Paulo 2017 Juliana Rodrigues de Souza Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas nanopartículas para aplicação em Engenharia de Tecidos Dissertação apresentada à Escola Politécnica da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências. São Paulo 2017 Dedico este projeto, ao Wagner de Souza Pereira, que, como um samba de raiz, me traz alegria, calor e vibração, e no meu dia a dia é o tempero necessário para o meu viver, me tornando mais forte em cada abraço seu envolvido com todo amor. Agradeço primeiramente a Deus, esta força maior que a tudo rege, por me dar discernimento de fazer as escolhas certas, por me proporcionar alegria de enxergar beleza nas pequenas coisas e de me transmitir força para seguir em frente. Agradeço ao meu melhor amigo, meu pai Raul, que é a luz da minha vida e que sempre tem uma palavra terna e de estímulo nos momentos mais difíceis. Agradeço à minha mãe, Maria Cristina, por sempre ter sido uma referência de luta, de superação e de determinação pelo que acreditamos ser a nossa felicidade. Agradeço aos meus irmãos lvan e Rodrigo pelo exemplo de coragem e determinação, pela inspiração diária que representam pra mim de seriedade diante dos obstáculos da vida, me fazendo acreditar na realização de meus sonhos, e enfrentar desafios que me pareciam intransponíveis. Agradeço ao meu querido Wagner de Souza Pereira pelo seu amor que me fortalece, pelo seu olhar terno nos dias difíceis, pelos seus abraços fortes quando achei que não iria conseguir e por me proporcionar paz em nossa casa, toda sua dedicação e compreensão foram fundamentais para minha concentração no desenvolvimento deste projeto. Agradeço ao meu orientador, o professor Dr. Reinaldo Giudici pela oportunidade, por acreditar em meu potencial e por me orientar em todos os momentos desde o início deste trabalho. Agradeço à Capes pela bolsa de estudos, que em muito contribuiu para que este estudo se concretizasse. Agradeço aos colegas e amigos da USP que me incentivaram e que me auxiliaram nas dúvidas durante o estudo: Erica, Esmar, Altanajara, Maria Giuliana, Thiago, Vinicius, Tnamara, Katia, Camila e Aninha. Agradeço aos amigos que muito me motivaram, em especial minha querida irmãzinha de alma Elizangela, sempre com suas palavras de carinho e incentivo. Agradeço aos professores doutores que foram importantíssimos nos esclarecimentos de muitas dúvidas no decorrer deste estudo, são eles: Alberto Ramos, Mauro Cesar Terence, Antônio Brant, Martha Simões, Dr. David, Carmen e Martin Schmal. Agradeço a todos os técnicos do laboratório de engenharia de materiais, da Universidade Presbiteriana Mackenzie, pelas dúvidas esclarecidas e por me fazer me sentir em casa como uma eterna mackenzista. “A vida é uma peça de teatro que não permite ensaios. Por isso, cante, chore, dance, ria e viva intensamente, antes que a cortina se feche e a peça termine sem aplausos.” Charles Chaplin ABSTRACT Itis estimated that in Brazil about one million burn victims occur per year, and even with the dynamics of innovations in the health area, the repair of this type of tissue injury, remains a great challenge. Burns tend to contract systemic infections, which can lead to death if the patient is not adequately treated. In this way, extreme care is required in the steps involved in this complex tissue repair. Faced with difficulties in the replacement or regeneration of injured organs or tissues, an interdisciplinary field called tissue engineering has emerged, focusing on the study for the development of three-dimensional supports, consisting of synthetic or natural materials, where the patient's own cells are cultured, subsequently reinserted by repairing tissues or replacing whole organs. Chitosan is one of the most widely used biopolymers nowadays in the field of tissue engineering, due to its capacity to act in a significant way in the three phases that involve the healing of burns, namely: inflammatory phase, proliferative phase and repair phase, and for its high bacteriostatic and fungiostatic action. In view of the existing properties of chitosan, the objective of this research was to intensify them by increasing its degree of deacetylation and modifying it to a gauge scale, thus increasing its surface area. For this, chitosan was submitted to a highly alkaline medium with temperature variation and reaction time variation, using the complete factorial statistical tool 2. After obtaining the deacetylated samples, it was verified by spectroscopy in the infrared region, that the highest values of deacetylation degree occurred after using the maximum levels in all factors involved in the reaction. In order to analyze the kinetics of the reaction and to confirm the information obtained from factorial 2º, a new 22 factorial design was made, fixing the time of six hours of reaction, during which eleven aliquots were taken for analysis of their degree of desacetylation (GD). The pattern of results of the experiments allowed the application of a mathematical model that represented the reality of what occurred during the reaction, being this the model of the shrinking core model. Subsequently, the chitosan with a high degree of deacetylation was subjected to the ultrasound method and the analysis of particle diameter, zeta potential and polydispersion index allowed to verify that chitosan after being submitted to ultrasound at the appropriate pH achieved particles in nanometer scale. Keywords: chitosan, tissue engineering, burns and nanoparticles. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Estrutura da quitina... Figura 2 - Comparaçao entre as estruturas da celulose e da quitina Figura 3 - Estruturas polimórficas da quitina...............eseeerreeeeeeerereeeerreeeeerererenra 28 Figura 4 - Reação de desacetilação da quitina. ............... eternas 29 Figura 5 - Estrutura da quitosana.................. tr receererereneeeenerereneerenereneneerenena 31 Figura 6 - Comparaçao entre ácido hialurônico e quitosana..............eeererere 33 Figura 7 - Tecido epitelial................... rr rereeeeeererereeeenerereneerenereneneerenano 40 Figura 8 - Fibroblasto. ............................. Figura 9 — Profundidade das queimaduras... Figura 10 - Etapas da Engenharia de Tecidos. Figura 11 - Estratégia experimental. ...............rreeeeererereerereeeeeeerereeeerrerecerererena 51 Figura 12 — Desacetilação da quitosana. .................... ii iiisssssesesenereeasa 52 Figura 13 - Reação de desacetilação no balão volumétrico e equipamentos. .......... 54 Figura 14 - Medidor de pH de bancada................... ii iissssesenenereeaa 58 Figura 15 - Equipamento ultrassônico de ponteira. .................... siri 59 Figura 16 - Espectrômetro da marca Shimadzu, modelo IR Prestige - 21. Figura 17 - Laminas de silício antes e depois do recobrimento de ouro.. Figura 18 - Equipamento para análise de MEV. Figura 19 - Equipamento Zetasizer, modelo ZEN3600 da Malvern Instruments. ......64 Figura 20 - Cubeta para potencial Zeta e para diâmetro hidrodinâmico................... 65 Figura 21 - Espectro de FTIR referente ao experimento 8 da duplicata.................... 67 Figura 22 - Espectros sobrepostos dos oito primeiros experimentos do fatorial 23...68 Figura 23 - Espectros deslocados dos oito primeiros experimentos do fatorial 2º....69 Figura 24 - Espectros sobrepostos da duplicata genuína do fatorial 23. . Figura 25 - Espectros deslocados da duplicata genuína do fatorial 2º. Figura 26 - Espectros sobrepostos da triplicata genuína fatorial 2º Figura 27 — Espectros deslocados da triplicata genuína do fatorial 23...................... 71 Figura 28 - Representação gráfica da triplicata do fatorial 23.................. 73 Figura 29 - Cubo referente aos graus de desacetilação obtidos no fatorial 2º.......... 73 Figura 30 - Gráfico de probabilidade normal de análise de resíduos. ............... 74 Figura 31 - Gráfico que demonstra ausencia de outliers...................i ii 75 Figura 32 - Análise da variância de resíduos. ................ si iiieereeeeseeeeereeeteno 75 Figura 33 - Diagrama de pareto Fatorial 2º... 76 «77 «77 Figura 36 - Gráfico de contorno do Concentração de NaOH com o tempo do fatorial Figura 34 - Efeitos principais fatorial 2º Figura 35 - Interações entre os fatores do fatorial 2º Di iiterercateaeraraeaaaaaraneaaaaaararacaaaaa race caaaaa aa caaaaaaaanaceaaaasananaaaaasarasnaaaarananeoa 78 Figura 37 - Gráfico de contorno da temperatura com a Concentração de NaOH do fatorial 23... trreeeeteaetereceatarararaeaaaaararceaaaaarareceaaaaarneaaaaaaanas 79 Figura 38 - Gráfico de contorno do tempo de reação com a temperatura do fatorial 2º. etanaraaaarananaaaa arena aaa aaa rena aaa aa Rea aaa aaa ARA aaa aaa aaa RAR Rana Rana Rea a aaa aa aaa a acena nana aeee aaa aa cia anaaaanaaaanaa aa 79 Figura 39 - Superfície de resposta (tempo x temperatura x GD) Fatorial completo 23. ..80 Figura 40 - Superfície de resposta (concentração de NaOH x temperatura x GD) Fatorial completo 2º............... nl rreeeeeaeeaeeeaeeeaeeaaeeeaaeeaaeeeaaerantaa 81 Figura 41 - Superfície de resposta (tempo x Concentração de NaOH x GD) Fatorial completo 2º. .......... ii iririreeereeereeeeeeeeaaeeaaeeeraeaaare aeee rare aare rare aaraaanananea 81 Figura 42 - Espectro de referência experimento 4 após 360 minutos de reação. ......82 Figura 43 - Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 1 do fatorial 22. experimento 1... recceerererereeeenerenereeeenerenererenereneeecenereneeenenenenennes 85 Figura 46 - Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 2 do fatorial 22. Figura 47 — Espectros deslocados das 11 alíquotas do experimento 2 do fatorial 2287 Figura 48 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação das 11 alíquotas do ..87 Figura 49 — Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 3 do fatorial 22. experimento 2. Figura 50 - Espectros deslocados das 11 alíquotas do experimento 3 do fatorial 22.88 Figura 51 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação das 11 alíquotas do experimento 3... rereeerererereerenererereeeenenenerecenerenereereneneneeeeneneneneanes 89 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Planejamento Fatorial 23.................. Tabela 2 - Níveis dos fatores do planejamento fatorial 2º. Tabela 3 - Planejamento Fatorial 22.................... Tabela 4 - Níveis dos fatores do planejamento fatorial 22................. 56 Tabela 5 - Resultados dos graus de desacetilação obtidos no fatorial 2º................. 72 Tabela 6 - Resultados do planejamento experimental 22 com tres repetiçoes no ponto central... si ietettteeeeeaaeareeeaaeeneeeaaearereaaeaneeeaacaneeeaacaneeeaaaaneeaacaneaaaaanenaanana 84 Tabela 7 - Resultados das 11 alíquotas do fatorial 22... 95 Tabela 8 - Valores dos parâmetros A e K ajustados individualmente para cada ensaio. Tabela 9 - Resultados da medição de temperatura pH 4,1. Tabela 10 - Resultados da medição de temperatura pH 4,4..................... 117 Tabela 11 - Resultados da medição de temperatura pH 4,7... 118 Tabela 12 - Resultados das nanopartículas em pH 4,1............ eee 120 Tabela 13 - Resultados das nanopartículas em pH 4,4... 121 Tabela 14 - Resultados das nanopartículas em pH 4,7... 121 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... rea creereeeereea ease cmeaaeeaerseaeameara 17 1.1 GENERALIDADES... iii 17 1.2 MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA... ssa 20 1.3 OBJETIVO... inertes enaee rear enteeenatrs 20 1.4 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO................. iss 21 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............... rr emeeeeeeeeeseesearemearaaa 23 21 POLÍMEROS... rerreeeeeertreeeeeeaeeererreeenaes 23 2.1.1 | Polímeros naturais e sintéticos . 2.1.2 Biopolímeros... 2.1.3 | Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis. 2.1.4 — Copolímeros.............. is rcererteeeeererereererereeecererereerrererecerererrerererecenenenena 2.2 BIOMATERIAIS............... ss rreeeeerereererrereeeeererererererecerereerererereeereneneanaranes 25 2.3 POLISSACARIDEOS ................ us irereerreeeeeeererereerererecereerererereneeereeneanerenes 26 2.4 QUITOSANA.. 2.4.1 | Origem, fontes e processos de obtenção 24.2 Propriedades da quitosana e características de sua estrutura ................. 30 2.4.3 Nanopartículas de quitosana ..............teeeereeererereeeeererereerererecererereno 35 2.5 NANOTECNOLOGIA................. reter 35 2.6 SISTEMA TEGUMENTAR.................. reatar 39 2.6.1 Fibroblastos ................. ss isereeaeeeeeeaaeeeeeeaaceneeeaaeanereraraneeeaananeeeaananta 41 2.7 QUEIMADURAS.................. eretas 42 2.71 Processo de cicatrização da pele .................. recesso 44 2.8 ENGENHARIA DE TECIDOS.................. 45 2.9 CINÉTICA DAS REAÇÕES................. isentas 47 2.10 MODELAGEM MATEMATICA... 2.10.1 Modelo do núcleo não reagido.. 2.11 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS COM VÁRIOS FATORES............... 49 3 MATERIAIS E MÉTODOS... 3.1 DESACETILAÇÃO DA QUITOSANA .............. rise 52 3.2 OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA POR ULTRASSOM.57 3.3 CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA E DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA............ ir rreretaeerreaararnaetaraararararanaarrrarantananaa 59 3.3.1 Análise de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) 60 3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 3.3.3 Potencial Zeta, índice de polidispersão e diâmetro hidrodinâmico 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................... remar 66 4.1 RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERENTE AO FATORIAL 23................... 66 4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERENTE AO FATORIAL 22.................. 82 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES DA MODELAGEM MATEMÁTICA DO NÚCLEO NÃO REAGIDO (SHRINKING CORE MODEL) PARA REAÇÃO DE DESACETILAÇÃO................ ii itiisiieetneeaseeeereeeaeeeeaeaeaerataeeeaeratnetaneis 100 4.4 RESULTADOS E DISCUSSÕES SOBRE AS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA OBTIDAS APÓS O TRATAMENTO DE ULTRASSOM..................... 115 5 CONCLUSÕES... reeereereereeeeeerreeeaereerreersrersarrrersaass 129 REFERÊNCIAS............... nr rereereeeeeeeeereeeeeereerseerseerearseerse eee rsrerseesaaseersaass 131 19 tecidos que sofreram queimaduras; são elas: a fase inflamatória, a fase proliferativa e a fase reparadora ou fase de remodelação *1º. Na fase inflamatória, ocorre a formação de uma barreira formada por plaquetas que se aglomeram, esta rede que se forma, tem fundamental importância contra agentes infecciosos e é ainda nesta fase que se inicia o processo para restauração da matriz extracélular. A quitosana, auxilia nesta etapa devido a sua capacidade de ativar macrófagos, que são células que surgem logo após o surgimento de uma rede de fibrina, estas células agem na defesa do organismo contra infecções 1911. Na fase proliferativa, ocorre a movimentação de células importantes como os queratinócitos e os fibroblastos, que agem na formação do tecido de granulação, os fibroblastos tem papel fundamental na formação de uma nova matriz extracélular. A quitosana é capaz de auxiliar nesta etapa, pois em contato com o meio fisiológico, sendo um glicosaminoglicano, ela se quebra em monômeros que são biossintetizados, dando origem ao ácido hialurônico (substância que é necessária em grande quantidade nesta etapa de formação da matriz extracélular) 1011, Na fase de remodelação do tecido ocorre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal. A quitosana age nesta fase final de reparação por ativar as células envolvidas na reparadora do tecido como, os leucócitos, macrófagos e fibroblastos, facilitando assim, a granulação e organização das células durante o processo de epitelização 10:11. A quitosana, além da ação mencionada anteriormente nas etapas de cicatrização de lesões, quanto maior a quantidade de grupos amino protonados em sua estrutura, com o aumento do seu grau de desacetilação, mais intensa é sua atividade antimicrobiana, pois seus grupos amino protonados são capazes de se ligar aos grupos aniônicos das paredes célulares de micro-organismos, inibindo o crescimento destes 3:14. Na área médica, muito se tem estudado materiais em escala manométrica. Esta escala está associada a um conjunto de conceitos, conhecimentos e ferramentas de um campo de estudo chamado de nanotecnologia, em que se utilizam estruturas no tamanho entre 1 a 100 nanômetros (nm), definido como 10º metro. Neste estudo, buscam-se métodos na produção de nanopartículas, aumentando sua área superficial, e que mesmo procurando manter a estabilidade da molécula e manutenção de sua ação biológica 1419. 20 Para intensificar a capacidade de auxiliar na reparação das queimaduras de pele, aumentar a interação em meio biológico, e agir contra possíveis infecções, a quitosana pode ter seu grau de desacetilação alterado para valores iguais ou maiores que 90%, e pode ser modificada para forma de nanopartículas, aumentando-se portanto sua área superficial. 1.2 MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA O foco principal deste estudo foi obter quitosana na escala nanométrica com alto grau de desacetilação, para que, desta forma, suas propriedades já existentes, fossem intensificadas, como sua ação bacteriostática e fungistática e sua capacidade de agir de forma significativa nas fases de reparação da pele. A obtenção de nanopartículas de quitosana com alto grau de desacetilação, poderá ser utilizada em trabalhos futuros, sendo inseridas em uma rede tridimensional. Esta rede, poderá ser feita de nanofibras de materiais sintéticos ou naturais com características biodegrádeis e biorreabsorvíveis, formando um tecido artificial que poderá ser aplicado em queimaduras graves, podendo evitar processos inflamatórios que poderiam gerar cicatrizes hipertróficas. Até o presente momento, dentro dos estudos e das pesquisas feitas, não foi publicado ainda, nenhum trabalho utilizando nanopartículas de quitosana inseridas em uma rede tridimensional, para aplicação como um tecido artificial em queimaduras graves. 1.3 OBJETIVO O objetivo principal deste estudo foi intensificar as propriedades já existentes da quitosana para sua futura aplicação em engenharia de tecidos, tendo como objetivos específicos: . submeter a quitosana a reação de desacetilação para retirar os grupos acetil da estrutura; . identificar os graus de desacetilação obtidos após as reações; . analisar os fatores principais e suas interações durante a reação e analisar a cinética da reação de desacetilação; 21 . submeter a quitosana com o maior grau de desacetilação obtido ao método de ultrassom; . analisar se foi atingida a escala nanométrica da quitosana estudada. 1.4 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO Este trabalho está dividido em 6 capítulos, em que o primeiro é uma introdução do tema proposto, explicando inicialmente as estatísticas atuais no Brasil em relação às queimaduras, a importância dos cuidados para as etapas de reparação para evitar a ocorrência de cicatrizações patológicas no paciente queimado, ou até mesmo levar o paciente a óbito, devido a um quadro crítico de infecções. Ainda na introdução, foram mencionados, os principais materiais utilizados na área de engenharia, dando ênfase ao material quitosana devido suas propriedades relevantes para a aplicação estudada. Por fim, é mencionado o aumento dos grupos amino protonados pela desacetilação da quitosana, e a modificação para uma escala nanométrica, permitindo acentuar suas propriedades já existentes. O segundo capítulo se refere à revisão bibliográfica relacionada ao tema proposto, dando ênfase aos principais tópicos como: polímeros, biomateriais, polissacarídeos, quitosana, nanotecnologia, sistema tegumentar, queimaduras, engenharia de tecidos, cinética das reações, modelagem matemática e planejamento de experimentos com vários fatores. Alguns tópicos foram subdivididos em subtópicos, para melhor compreensão do assunto abordado. Ainda que, o tópico principal foi o biomaterial quitosana. O terceiro capítulo está relacionado à metodologia do trabalho cujo título é materiais e métodos, em que são mencionados os materiais utilizados como: a quitosana, o hidróxido de sódio, o ácido acético e o acetato de sódio; os procedimentos para as reações de desacetilação, e para a obtenção das nanopartículas de quitosana e a caracterização daquelas, o detalhamento das análises do grau de desacetilação feitas através da obtenção de espectros (FTIR), também está dentro deste capítulo, assim como o uso da ferramenta estatística para analisar de forma mais aprofundada as interações e efeitos dos fatores envolvidos na reação. O quarto capítulo se refere aos resultados e às discussões feitas em relação aos graus de desacetilação obtidos, e a viabilidade da análise da cinética mediante as 24 vital importância nos avanços da ciência devido a facilidade de obtenção e por serem biocompatíveis e biodegradáveis. Os polímeros sintéticos são os polímeros produzidos em laboratório, muitos deles são sintetizados para imitar polímeros naturais. Os polímeros sintéticos mais utilizados hoje na área médica, são os poliésteres biorreabsorvíveis como: o copolímero PLGA poli (ácido lático-co-ácido glicólico), que permite grande versatilidade em sua estrutura e que são capazes de serem totalmente metabolizados pelo corpo 18:19. 2.1.2 Biopolímeros Os biopolímeros são polímeros produzidos a partir de matérias primas de fontes renováveis, como: celulose e a quitina. As fontes renováveis geralmente possuem um ciclo de vida menor, ainda assim são muito explorados em diversas áreas, pois geralmente possuem propriedades como biodegrabilidade e biocompatibilidade. Alguns desses materiais, possuem algumas limitações em suas propriedades. Por esta razão estudos são feitos modificando-os em sua forma ou em sua estrutura química, ou então, são misturados com polímeros sintéticos para adquirir as propriedades necessárias para determinadas aplicações!920.21, Desta forma, esses biopolímero são utilizados na forma de blendas, compósitos, nanopartículas ou microesferas. Por exemplo, a quitosana originária da quitina, por não possuir boas propriedades mecânicas, geralmente é utilizada na forma de blenda, que é uma técnica que se baseia na mistura com outro polímero, melhorando suas propriedades e aumentando seu número de aplicações; ou como nanopartículas ou microesperas intensificando suas propriedades já existentes e aumento sua interação em meio biológico. 19:20:21, 2.1.3 Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis Polímeros biodegradáveis são materiais que possuem a capacidade de sofrer degradação por atividade biológica, em especial, por ação enzimática de microrganismos. A biodegradabilidade dos polímeros é uma propriedade explorada na modulação da liberação de fármacos, e na área médica como suturas cirúrgicas ou tecidos artificiais, uma vez que é altamente desejável que um material introduzido no organismo sofra degradação depois de cumprida sua função, sem a necessidade 25 de intervenções para sua retirada. Os produtos de degradação formados, podem ser metabolizados dando origem a dióxido de carbono e água, ou são eliminados na urina. Polímeros biocompatíveis se assemelham em relação às propriedades dos polímeros biodegradáveis, pois estes materiais são capazes de ser absorvidos em um determinado tempo em meio biológico, e quando aplicados na área médica, sem causar toxicidade ao paciente 21:22:28, 2.1.4 Copolímeros A polimerização simultânea de dois ou mais monômeros constitui o processo chamado de copolimerização, enquanto que a polimerização de apenas um monômero constitui uma homopolimerização. Por exemplo, ácido láctico e ácido glicólico podem ser polimerizados indivualmente dando origem ao poli (ácido láctico) e ao poli (ácido glicólico), mas quando combinados em um único meio reacional se ligam de forma aleatória em uma só cadeia formando o copolímero poli (ácido lático- co-ácido glicólico) 2324, Existe uma grande quantidade de estruturas que podem ser formadas por meio de copolimerização, variando-se as combinações de monômeros e as proporções entre eles. A composição do copolímero resultante de um dado meio reacional, em copolimerização via radicais livres, pode ser calculada a partir da composição da carga inicial e da reatividade relativa dos monômeros (razão de reatividade) 224. Assim como mencionado anteriormente pelo exemplo do copolímero poli (ácido lático-co-ácido glicólico), outro exemplo é a quitosana, que é formada por dois monômeros, N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, em proporções que podem variar ao longo da cadeia de acordo com a aplicação desejada, permitindo, portanto, uma grande variedade de aplicações 22:23. 2.2 BIOMATERIAIS Por definição, biomaterial é uma substância, ou uma mistura de substâncias, podendo ser sintético ou natural, que pode ser utilizado em meio biologico. Sua utilização na área médica tem a função de agir por um determinado tempo tratando, reparando ou substituindo um orgão ou função do corpo. A escolha de um biomaterial envolve fatores como biocompatibilidade, biodegrabilidade, propriedades mecânicas 26 específicas, tempo de degradação controlado, devendo ser atóxico e ter capacidade de se decompor nos fluidos corpóreos sem desencadear processos inflamatórios 242º, 2.3 POLISSACARÍDEOS Os mais polissacarídeos são as macromoléculas abundantes da biosfera, formados pela união de muitos monossacarídeos através de ligações glicosídicas. Geralmente são um dos principais elementos estruturais de plantas e encontrados nos exoesqueletos de animais. As ligações glicosídicas ocorrem devido à ligação covalente entre a hidroxila de um carbono ligado ao oxigênio central com a hidroxila de qualquer carbono de outro monossacarídeo, produzindo água. As moléculas se unem produzindo a ligação glicosídica (-0-) como demonstrado na Figura 1 na estrutura da quitina. A maioria dos carboidratos encontrados na natureza ocorre como polissacarídeo e são polímeros de alto peso molecular, constituídos praticamente de carbono, oxigênio e hidrogênio, podendo ter também nitrogênio em sua estrutura. Alguns exemplos de polissacarídeos encontrados na natureza são: a celulose, a quitina, amido, proteínas entre outros 2. Figura 1 - Estrutura da quitina. Fonte: Guilbot et al., 1985. 2.4 QUITOSANA A quitosana é um copolímero linear de origem natural que possui em sua estrutura unidades N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, em proporções que 29 a da a-quitina. Dessa maneira, as quitinas podem apresentar cristalinidades diferentes, e as aplicações podem variar de acordo com a ação desejada 27:28. O polímero quitina é um material semicristalino, de baixa toxicidade, biocompatível e biodegradável. A quitina mais comercializada atualmente é a originária da carapaça de crustáceos, em que para sua extração, são feitas etapas de desmineralização, desproteinação e despigmentação, etapas essas são feitas devido ao fato de as cascas de crustáceos possuírem 15 a 20% de quitina, 25 a 40% de proteínas e de 40 a 55% de carbonato de cálcio 232º. Após a extração, a quitina poderá dar origem à quitosana. Quando submetida ao processo de desacetilação, a quitina é adicionada em meio altamente alcalino aquoso no qual a concentração desta solução, o tempo e a temperatura de reação, variam de acordo com as propriedades que a quitosana deve adquirir para uma determinada aplicação. Os principais fatores que devem ser analisados para obtenção da quitosana a partir da quitina são: concentração da solução alcalina, temperatura de reação, tempo de reação, tamanho das particulas da quitina, atmosfera da reação e existência de impurezas 28:29.30, As condições utilizadas durante a reação de desacetilação heterogênea, da quitina influenciam na massa molar do polímero quitosana, e no seu grau de desacetilação (porcentagem de grupos amino livres existentes na estrutura após a retirada dos grupos acetil). Quando esse grau de desacetilação está acima de 50%, o polímero torna-se solúvel em soluções aquosas de ácidos fracos e passa a ser chamado de quitosana. A reação de desacetilação da quitina, pode ser vista na Figura 4 3081, Figura 4 - Reação de desacetilação da quitina. aros di “ « ua a LL NÉOCI R Noca , Desacetilação cer RE Fonte: Anitha et al., 2014. 30 A massa molar média, o grau de desacetilação e a distribuição das unidades monoméricas da cadeia, afetam a solubilidade da quitosana. Assim, quanto maior a quantidade de grupos amino protonados em sua estrtura, maior será a repulsão eletrostática entre as cadeias, e desta forma maior será sua solubilidade. Os polimorfos (a-quitina, B-quitina e y-quitina), que dão origem a quitosana, devido os diferentes arranjos solidos, possuem diferentes solubilidades e diferentes capacidades de intumescimento 30.31, Devido à estrutura de a B-quitina ser um material menos densamente empacotado, permite-se uma maior acessibilidade aos sítios reativos quando comparados à da a-quitina, em que a acessibilidade das espécies ativas do hidróxido de sódio aos grupos acetamidas (sítios reativos onde estão os grupos acetil), é muito menor, dificultando o aumento do grau de desacetilaçao durante a reação. A cristalidade da quitina interfere na acessibilidade aos sítios reativos, onde ocorre cristalinos para a parte do centro dos domínios cristalinos, vai aumentando a dificuldade para o acesso interferindo nos graus de desacetilação obtidos *031. Os processos para o aumento do grau de desacetilação da quitina geralmente são feitos em soluções aquosas altamente alcalinas (utilizando hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio com água destilada), por longos períodos e com temperaturas elevadas, e em muitos casos, gerando despolimerização durante a reação. Para minimizar este efeito, pode-se utilizar uma atmosfera inerte durante a reação, sendo que muitas técnicas vêm sendo aprimoradas para que a despolimerização durante a reação possa ser evitada “0:31. 2.4.2 Propriedades da quitosana e características de sua estrutura A quitosana nos últimos trinta anos vem sendo utilizada tradicionalmente nos países orientais para o tratamento de reparação de tecidos. No Japão, já existem materiais comercialmente utilizados, com base principal em sua formulação, a quitosana, sendo empregado para uso no tratamento de lesões teciduais. A sua estrutura lhe permite aplicação no auxílio da cura em diversas enfermidades na área médica, devido a suas propriedades, tais como, biocompatibilidade, biodegradabilidade, capacidade bioadesiva, alta permeabilidade, ação na recuperação de lesões, ação na homeostasia, eficácia na redução do nível do 31 colesterol sanguíneo, estímula efeitos no sistema imunológico, ação analgésica, baixa toxicidade, além de ser bacteriostática e fungistática 323334, Diante de propriedades da quitosana, este biomaterial vem sendo largamente utilizado na área médica e, em muitos casos em escala nanométrica, na forma de nanocascas para liberação de fámacos, encapsulando outros materiais, em suturas cirurgicas, para reconstrução óssea, na regeneração de tecidos nervosos, como pele artificial entre outros. A grande variedade de aplicações da quitosana, se dá especialmente pela quantidade de grupos amino protonados em sua estrutura e pelas suas unidades monoméricas que a caracterizam como um glicosaminoglicano *3:3438, A estrutura polissacarídea da quitosana é composta pelas unidades monoméricas 2-amino-2-desoxi-D-glicose e tipo B-(1—4)-2-acetamida- 2-desoxi-D- glicose ligadas pelas ligações glicosídicas do tipo B-(1—4),- como pode ser verificado na Figura 5. Este polímero natural possui uma estrutura semicristalina, sendo insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos mas, podendo alterar sua solubilidade de acordo com a quantidade de grupos amino em sua estrutura 343, Figura 5 - Estrutura da quitosana. 0H Ei 0H 4 NH NH; 2 Ho 0 HO 40 Q 0 + 9 b HO o Ho NH NH, 0H ou H Fonte: Campana et al., 2007. 2.4.2.1 Ação antimicrobiana A quitosana é um biomaterial que possui ação bacteriostática e fungistática. Estudos têm mostrado que a carga superficial da quitosana, tem grande importância em sua atividade antimicrobiana. As cargas se tornam positivas, quando em contato com fluidos fisiológicos, contribuindo para que estes grupos amino protonados da 34 bloquear terminações nervosas, reduzindo a dor, esta ação tópica, é decorrente da captura de hidrogênios ácidos liberados no local da inflamação pela ionização do grupo amínico “2:43:44, O processo de cicatrização da pele em feridas, e também em queimaduras, se divide em três fases principais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase reparadora ou de remodelação. A restauração da pele, necessita de um processo dinâmico o qual envolve processos célulares, moleculares, fisiológicos e biológicos. Os biopolímeros mais utilizados hoje na reparação ou regeneração de tecidos são: os alginatos, a quitosana, o ácido hialurônico, o colágeno e a elastina, onde estes três últimos são sintetizados pelos fibroblastos “23:44 A fase inflamatória, ocorre logo após a lesão, nesta fase as plaquetas formam uma rede de fibrina, agindo como uma rede de proteção contra micoorganismos indesejáveis, e nesta fase ocorre também o surgimento de células importantes para remoção de tecidos desvitalizados, as principais células envolvidas nesta etapa são: macrófagos, neutrófilos e linfócitos. Os macrófagos são células importantes para proteção contra agentes infecciosos, e de acordo com estudos anteriores a quitosana é capaz de ativar os macrófagos. Muitas vezes as infecções, comuns em pacientes que sofrem queimaduras, tendem a ocorrer e agravar o quadro do paciente “2: 4344, Na fase proliferativa, ocorre a formação do tecido de granulação, ela é dividida em três subfases: reepitalização, fibroplasia e angiogenese. A subfase envolvendo a reepitalização, em que ocorre a movimentação dos queratinócitos. A subfase onde ocorre a fibroplasia iniciando a proliferação dos fibroblastos que sintetizam colágeno e elastina. E a subfase que ocorre paralela a fibroplasia chamada de angiogenese, onde novos vasos darão suporte a formação da nova matriz extracélular. Nesta etapa ocorre a contração da ferida. A quitosana possui a capacidade de agir nesta etapa, pois em contato em meio biológico ela se quebra em monômeros que são biossintetizados formando glicosaminoglicanos importantes na formação da nova matriz extracélular “3, A fase de remodelação do tecido, ocorre substituição de tipos de colágenos gerados pelos fibroblastos, formando as fibras reticulares necessárias para uma recuperação tecidual que se assemelhe o mais próximo de um tecido normal não danificado. De acordo com estudos anteriores, a quitosana também auxilia da fase final de reparação, pois intensifica a ação das células já mencionadas nas etapas 35 anteriores como: os leucócitos, os macrófagos e os fibroblastos, auxiliando de forma significativa na ação destas células durante a reparação das lesões. 8:47. 2.4.3 Nanopartículas de quitosana A preparação de nanoesferas, é uma estratégia para incrementar a capacidade de adsorção da quitosana, em que a adsorção é a capacidade de adesão de moléculas de um fluido a uma superfície sólida, uma vez que nesta escala, possuem uma área superficial cerca de 1000 vezes maior do que a quitosana em flocos. Além disso, as nanoesferas apresentam cinéticas de adsorção mais rápidas e maior facilidade de manuseio e operação *8:*º. Muitas pesquisas na área médica, foram feitas trabalhando com quitosana na forma de nanopartículas pois, além de aumentar sua ação antimicrobiana, de intensificar sua capacidade de auxiliar a cicatrização de lesões, a grande quantidade de cargas positivas em sua superfície favorece sua capacidade de se ligar a íons metálicos, entre os quais o zinco, que é de extrema importância na restauração de tecidos “50,51, Como mencionado anteriormente no parágrafo logo acima, o alto teor de grupos amino protonados (cargas positivas) na quitosana intensifica sua capacidade de se ligar a íons metálicos. No entanto esta capacidade de se ligar a íons metálicos, esta intimamente relacionada ao pH do meio. Essas ligações podem ser favorecidas com o aumento do pH, onde ocorre à neutralização dos grupos amino protonados favorecendo ligações com metais como: urânio, cobre chumbo ou zinco. Lembrando que o zinco é um elemento com intensa ação antimicrobiana e auxilia no processo de reparação de feridas e queimaduras º253, 2.5 NANOTECNOLOGIA A nanotecnologia, é um campo da ciência que envolve a obtenção de estruturas em escala molecular e a manipulação de materiais em uma escala atômica, podendo ser definida como o estudo e uso de estruturas com tamanho entre 1 e 100 nanômetros, sendo que, um nanômetro é definido como 10º m. As pesquisas envolvendo escalas “nano” envolve conhecimentos, conceitos e ferramentas da biotecnologia, engenharias, química, medicina, ciência dos materiais e biologia. Este 36 estudo permite um aprofundamento do estudo da matéria em toda sua complexidade 54,55,56. Os materiais em proporção de nanopartículas devem possuir estabilidade da molécula, manutenção de sua atividade biológica, solubilidade desejável de acordo com sua aplicação, mantendo sua composição química, e podendo alterar propriedades mecânicas, óticas e eletrônicas ou acentuar propriedades já existentes. O físico americano Richard Feynman foi quem sugeriu a manipulação dos átomos para construção de produtos com propriedades únicas dando início à nanotecnologia 54,55,56. Entre os principais motivos para o rápido desenvolvimento na utilização de nanomateriais e grande número de estudos neste campo nos dias atuais, é devido a diversidade de aplicações que podem ser feitas nesta escala, tendo a grande vantagem de não alterar a composição química do material que foi modificado para uma escala nanométrica. Em muitas situações, os materiais na forma de nanopartículas ficam com suas propriedades intensificadas como o caso da quitosana, um biomaterial que quando utilizado na forma de nanopartículas, possui sua propriedade bacteriostática mais efetiva 857,58, Desta forma, a nanotecnologia vem sendo explorada e aplicada nas mais diversas áreas da ciência, uma vez que surgem novas possibilidades de aplicações. Em aplicações médicas e farmacêuticas, a faixa utilizada é geralmente de 5 — 1000 nm. Lembrando que uma partícula é considerada nanométrica quando apresenta um tamanho inferior a 100 nm. Desta forma na área médica as partículas muitas vezes são utilizadas na forma de microesferas º8.57,58, Os materiais, quando manipulados em escala manométrica, podem ter algumas de suas características inicias alteradas, estas mudanças ocorrem devido os métodos empregados para modificação em uma escala nanométrica, podendo ocorrer efeitos como: fricção, combustão, alterações eletrostáticas, movimentos brownianos pelo uso de ultrassom, entre outros. Os materiais quando trabalhados em escala nanométrica tem sua área superfícial muito maior e possivelmente melhorando sua interação com outras moléculas 857,58, A mudança das propriedades de materiais em escala nanométrica ocorre muitas vezes pela fração de átomos de superfície. Na superfície de nanopartículas existe um número menor de átomos vizinhos coordenados, por consequência, esses átomos vizinhos tem um número menor de coordenação sendo menos estáveis 39 associada ao metal zinco, pois este metal é bacteriostático e essencial no processo de reparação da pele, pois estabiliza a membrana célular e age nas etapas de cicatrização como nas fases proliferativa e de remodelação 8384, Geralmente as nanopartículas de quitosana obtidas, independentemente do método adotado, apresentam variação dos tamanhos obtidos apresentando uma distribuição heterogênea, e o índice de polidispersão pode variar muito de acordo com o método adotado. Os métodos mais utilizados para a determinação da distribuição de tamanho das nanopartículas consistem em microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão, ou pelo equipamento Zetasizerr, que permite verificar a carga do material, seu diâmetro hidrodinâmico e seu índice de polidispersão 64,65 2.6 SISTEMA TEGUMENTAR Os tecidos do corpo humano, são divididos em tecidos epiteliais, conjuntivos, musculares e nervosos. O tecido epitelial não possui vascularização e sua nutrição é feita por difusão por meio dos vasos sanguíneos do tecido conjuntivo, onde a membrana basal seleciona o que deve ser transportado para o epitélio. O tecido conjuntivo é formado em especial por células mesenquimais e uma matriz extracélular rica, isto é abundante 8887. O tecido conjuntivo é ricamente vascularizado e é responsável pela homeostase do corpo, possui os fibroblastos que são células encarregadas de produzir a matriz extracélular. Esta matriz é o meio no qual as células do tecido conjuntivo estão dispostas e lhes proporciona nutrição e substrato para sua organização 6.67,68, Este tecido possui também outras células de extrema importância como os macrófagos, os mastócitos e os plasmócitos. Além das células a sua matriz extracélular, é constituída por um fluido aquoso formado de glicosaminoglicanos, proteoglicanos e glicoproteínas, além das fibras colágenas, das fibras reticulares e das fibras elásticas (fibrilina e elastina) 8889,70. O tecido epitelial do nosso corpo tem um papel de extrema importância na termorregulação e nos protege contra atrito, perda de água, invasão de micro- organismos e a incidência dos raios ultravioleta 88970. As camadas de nossa pele 40 são classificadas de acordo com a forma das células, a localização, a distribuição e a quantidade como mostrado na Figura 7. Figura 7 - Tecido epitelial. Poro c E | clandiila: i orpúsculo sebácea sudoriparo de Meissner Camada córnea Epiderme | (queratinizada) Terminação nervosa livre Derme-| | ; ” e /y )/— glândula y », * — sudoripara Músculo eretor do pêlo Tecido subcutâneo (adiposo) Fonte: Junqueira e Cameiro, 2007 A epiderme, que é o tecido epitelial estratificado pavimentoso é queratinizado e possui uma espessua entre 1 a 2mm na maior parte do corpo, diferenciando-se somente em relação as palmas das mãos e as plantas dos pés tendo espessura com cerca de 5 mm. Ela possui quatro camadas principais: o estrato basal, o estrato espinhoso, o extrato granuloso e o extrato córneo. Nestas camada, são encontradas as células tronco, os queratinócitos, os melanócitos, as células de Merkel, células eosinófilas, as células de Langerhans entre outras, cada uma desempenhando um papel de extrema importância na estrutura da epiderme 8970. A derme, que também é chamada de tecido conjuntivo, tem como função principal de unir outros tecidos; é subdividida em tecido conjuntivo frouxo e tecido conjuntivo denso. Ela é altamente vascularizada possuindo em sua estrutura os vasos sanguíneos e linfáticos , os nervos e as terminações de neurônios sensoriais. O tecido conjuntivo, como mencionado anteriormente, é formado por células alongadas do mesênquima embrionário e pela matriz extracélular. As células mais importantes do 41 tecido conjuntivo, formadas pelo mesênquima embrionário são: os fibroblastos, os macrófagos, os mastócitos e os plasmócitos 7271. Os fibroblastos são células que estão em crescimento ativo e são responsáveis pela sintetização da matriz extracélular (meio onde as células estão dispostas proporcionando condições para suas atuação e organização). Eles também sintetizam as proteínas como o colágeno e elastina, os glicosaminoglicanos e glicoproteínas multiadesivas. Os macrófagos protegem o tecido de agentes infecciosos. Os mastócitos agem na proteção de reações alérgicas. Os plasmócitos são importantes nos processos imunológicos produzindo os anticorpos 7º”. 2.6.1 Fibroblastos As células mesenquimais são capazes de se tranformar em fibroblastos. Estes têm a função de síntese de componentes fibrilares como o colágeno e a elastina, e não fibrilares como as glicoproteínas e os glicosaminoglicanos (ácido hialurônico) da matriz extracélular do tecido conjuntivo. Os fibroblastos possuem retículo endoplasmático rugoso e o complexo de Golgi bem desenvolvidos, pois sintetizam os componentes da matriz extracélular: as fibras colágenas, as fibras reticulares, as fibras elásticas e a substância fundamental para remodelação tecidual 72. Quando localizados na derme reticular, apresentam-se em tramas paralelas à superfície e possuem formas estreladas mantendo íntima relação com as células vizinhas, conferindo-lhes resistência as forças mecânicas que atuam sobre a pele, enquanto quando em menor atividade, ficam com aspecto de filamento e recebe o nome de fibrócito. Durante o processo de recuperação de lesões, os fibroblastos migram para as áreas afetadas auxiliando na produção de matriz célular e cicatrização da lesão, em algumas situações os fibroblastos podem sofrer uma desregulação na atividade de síntese de matriz extracélular e aumentar a produção principalmente de colágeno, acarretando na deformação dos órgãos afetados, a este processo dá-se o nome de fibrose. Na Figura 8 esta representada a estrutura do fibroblasto e suas organelas, e a representação do fibroblasto ativo e inativo (fibrócito) 7º. 44 Ao atingir tecidos subcutâneos, dentre eles músculos, e até osso, essa lesão é mais grave, e considerada queimadura de terceiro grau. Do ponto de vista médico tem aspecto esbranquiçado e tende a perda significativa de elasticidade, onde o tempo de tratamento, varia muito para cada paciente, essa queimadura tem aspecto esbranquiçado e necessita de enxertia 87º. As reparações das queimaduras graves implicam não somente em cirurgias de enxertia de pele precoces, mas também em controlar e orientar a regeneração ou restauração cicatricial, que tende a ocorrer de forma anárquica e com potencial de sequelas e infecções. 2.7.1 Processo de cicatrização da pele O processo de cicatrização da pele, após uma queimadura que afeta sua integridade além da derme, se divide em três fases principais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase reparadora ou de remodelação. A restauração da pele necessita da interação de células estromais e circulatórias, fragmentos de célula, matriz célular, alterações físico-químicas e ação de micro-organismos sendo portanto um processo dinâmico envolvendo processos célulares, moleculares, fisiológicos e biológicos?8!. A fase inflamatória, tem início logo após a lesão podendo durar até cinco dias, ocorrendo a agregação das plaquetas, e formação da rede de fibrina, formando um coagulo sobre a lesão, formando um trombo rico em plaquetas infiltrado rapidamente pela fibrina. Ao mesmo tempo ocorre a migração de linfócitos, neutrófilos e os macrófagos sobre a rede da fibrina com o objetivo de remover tecidos desvitalizados. Esta etapa é de fundamental importância para o processo de cura, envolvendo sinais inflamatórios como dor, aumento do fluxo sanguíneo e edema 8182, A fase proliferativa pode durar até três semanas, é responsável pela formação do tecido de granulação, divide-se em três fases: reepitelização, fibroplasia e angiogênese. Na reepitelização ocorre a migração de queratinócitos das bordas e anexos remanescentes, na fibroplasia ocorre à proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, elastina e outras proteínas; na angiogenese ocorre ao mesmo tempo em que a fibroplasia, nesta fase a vascularização é refeita possibilitando o fluxo de nutrientes, desenvolvendo o tecido de granulação e novos vasos capilares que dará suporte à formação de uma nova matriz extracélular 82:83. A fase de remodelação, também chamada de fase de maturação, se inicia na terceira semana e pode durar até dois anos. Nela ocorre a substituição do tipo de 45 colágeno tipo 3 para o tipo 2. O colágeno tipo 2 aparece na cartilagem, e o colágeno tipo 3 constitui as fibras reticulares de muitos órgãos como: fígado, útero, coração, pulmões, músculos, entre outros 28384. 2.8 ENGENHARIA DE TECIDOS A engenharia de tecidos é um campo interdisciplinar que envolve conhecimentos na área da engenharia, ciência dos materiais e das ciências da saúde, tendo como objetivo criar, reparar, ou substituir tecidos e orgãos lesionados. Com isso, é fundamental o uso de três ferramentas básicas: biomateriais, células e fatores de crescimento *. As células são responsáveis pela secreção da matriz para formação de um novo tecido, enquanto que o biomaterial tem função de fornecer suporte e ambiente adequado para as células. Já as moléculas biologicamente ativas podem ser adicionadas ao conjunto a fim de auxiliar e estimular as células na reparação tecidual 85, O biomaterial utilizado deve ser submetido ao processo de eletrofiação para formar fibras que possam mimetizar fisicamente, a matriz tridimensional, proporcionando um ambiente favorável ao desenvolvimento célular. As células que serão semeadas, nesta matriz tridimensional, devem ocupar uniformemente toda a unidade para proporcionar a completa formação do tecido *5:88.87, O campo interdisciplinar da engenharia de tecidos envolve a reparação ou regeneração de órgãos ou tecidos vivos, pelo recrutamento dos tecidos do próprio paciente. As células extraídas do paciente, são cultivadas sobre suportes tridimensionais feitos de materiais sintéticos ou naturais, para sua completa adesão e proliferação, para que com segurança, sejam reeinseridas no paciente. As etapas que envolvem a engenharia de tecido são sequencialmente: extrair as células do paciente, criar um meio fisiológico para seu crescimento, inseri-las na rede tridimensional, verificar sua proliferação e adesão e para por fim fazer testes em animais com maior similaridade com o tecido humano. Esta sequencia de etapas esta ilustrada na Figura 10 88.89, 46 Figura 10 - Etapas da Engenharia de Tecidos. Tecido Doador Suporte Polimérico Cultura de Células in vitro Células Implante Estudo in vitro Fonte: Barbanti etal., 2005. Os polímeros biorreabsorvíveis, são muito utilizados no campo da engenharia de tecidos nos dias de hoje, pois possuem características como biocompatibilidade e bioabsorção quando aplicados em sistemas biológicos. Estes materiais biodegradáveis, podem se dissolve em fluidos corpóreos e geralmente eles são degradados por hidrólise 29.90, Os materiais poliméricos para aplicações biomédicas são capazes de substituir e permitir o crescimento e regeneração dos tecidos do corpo, de modo permanente, sem efeitos tóxicos. Em aplicações específicas, estes materiais são desenvolvidos para manter um equilíbrio entre as propriedades biomecânicas dos tecidos substituídos e os efeitos bioquímicos e biológicos da interação entre o material e o tecido reparado 9:90 49 kt=1-3(1-X5+2(1-X5) Equação (2) controle pelo transporte de massa externo, de acordo com a Equação 3: kt =X Equação (3) O modelo matemático representativo que envolve as três equações seguem de acordo com, X; sendo a fração reagida do sólido, k a constante cinética e t o tempo de reação. É importante ressaltar, como mencionado nos tópicos de cinética das reações e modelagem matemática, muitos fatores podem influenciar na determinação de quais reações são as controladoras (reações mais lentas). No caso das reações heterogêneas, os possíveis determinantes para a fase controladora, dentre eles estão: a temperatura, a pressão, a porosidade do material, a estrutura do material, os diferentes arranjos no estado sólido, a área exposta, a formação de camada de material reagido que dificulta acesso aos sítios reativos pelas espécies ativas, entre outros fatores 105.108,107, 2.11 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS COM VÁRIOS FATORES Um planejamento fatorial é uma ferramenta estatística de extrema importância para engenheiros e cientistas que pretendam melhorar o desempenho de um processo ou compreender, de forma rápida e eficiente, novos processos e o desenvolvimento de novos produtos. Quando queremos analisar vários fatores envolvidos em um processo, o planejamento fatorial permite analisar todas as combinações possíveis dos níveis e fatores envolvidos. Esta técnica permite, direcionar a pesquisa, indicar o tamanho da amostra a ser selecionada, fazer múltiplas comparações e, desta forma, analisar o experimento em relação as interações dos fatores, otimizando o tempo para analise de resposta de experimentos. O tipo mais simples de planejamento fatorial é planejamento com dois níveis, que permite analisar diversos fatores representados pela letra k, sendo portanto o fatorial de dois níveis representado por 2%. Este modelo é especialmente útil na etapa exploratória de uma pesquisa, permitindo estudar fatores qualitativos ou quantitativos 108-109, 50 3 MATERIAIS E MÉTODOS Neste capítulo, consta a metodologia para obtenção de nanopartículas de quitosana com alto grau de desacetilação para intensificar as propriedades já existentes neste biopolímero, possibilitando seu uso futuro no auxílio das etapas de cicatrização de queimaduras graves (de segundo grau profundas ou de terceiro grau). O estudo, durante a reação da desacetilação da quitosana, permitiu uma análise da cinética da reação verificando de acordo com os graus de desacetilação obtidos ao longo do tempo a modelagem matemática mais próxima da resposta real do experimento. A quitosana, obtida pela Sigma-Aldrich com alta massa molar (310000 - 375000 Da), originária da carapaça de crustáceos e com grau de pureza de 99%, de acordo com as informações fornecidas pela empresa Sigma-Aldrichê E, tendo portanto, uma estrutura de cadeias antiparalelas conforme o material a-quitina, seu grau de desacetilação (GD) de acordo com os dados de sua ficha técnica, era de 75%, e esta na forma de flocos com coloração amarelo claro. Para obtenção do aumento do grau de desacetilação, a quitosana foi submetida a reação em meio altamente alcalino com hidróxido de sódio com 98% de pureza na forma de pélets, fornecido também pela empresa Sigma-AldrichO. As reações de desacetilação da quitosana, foram feitas com o auxílio da ferramenta estatística experimental completo de dois níveis 2%, em que foram verificados os efeitos e as interações dos três fatores: concentração de NaOH, o tempo e temperatura. As análises para verificação dos graus de desacetilação obtidos foram feitos através de seus espectros obtidos por análise de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), Após a obtenção da quitosana com maior grau de desacetilação, um novo experimental completo 22 com três repetições no ponto central foi feito retirando 11 alíquotas no decorrer de seis horas de reação, variando a temperatura e a concentração de NaOH, para verificar o aumento do grau de desacetilação com o tempo, permitindo assim uma análise da cinética da reação heterogênea de desacetilação. Para a definição da modelagem matemática, foi necessário um estudo dos fatores envolvidos durante a reação heterôgenea da desacetilação da quitosana como: concentração de reagentes, porosidade do material, cristalinidade do material, 51 acessibilidade aos sítios reativos, fenômeno difusivo, tranferência de massa e a reação na interface entre o líquido que circunda o material. O modelo cinético definido foi adaptado para que se aproximasse do comportamento real para uma reação envolvendo a solução de hidróxido de sódio e as partículas porosas da quitosana. Após a verificação dos graus de desacetilação obtidos, as amostras com maior grau de desacetilação foram modificadas da forma de flocos finos para nanopartículas, pelo método de ultrassom. A quitosana para ser submetida ao ultrassom em diferentes tempos, foi colocada em solução tampão com acetato de sódio e acido acético glacial, ambos fornecidos pela empresa Sigma-Aldrichô e submetidas a diferentes tempos. A caracterização das nanopartículas de quitosana, foram feitas utilizando as análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), para verificar o diâmetro das particulas e a ocorrencia de agregação, pelo equipamento Zetasizer que permitiu verificar o potencial zeta (a carga das nanopartículas), o índice de polidipersão (uniformidade dos tamanhos das moléculas) e o diâmetro hidrodinâmico (tamanho médio das partículas), para três pHs diferentes. A estratégia experimental resumida para obtenção das nanopartículas de quitosana altamente desacetiladas, para uso futuro em queimaduras graves, que possam futuramente auxiliar de forma significativa nas etapas de cicatrização e evitar possíveis infecçoes. Seguem na Figura 10 as etapas principais envolvidas durante a etapa experimental: Figura 11 - Estratégia experimental. Desacetilação da quitosana em meio altamente alcalino, com variação da temperatura e tempo de reação. Análises dos resultados da triplicata do fatorial 23, em relação ao GD mediante os espectros obtidos por FTIR Caracterização das nanopartículas obtidas por MEV e pelo Acic itIa Análise para verificar a cinética da reação de desacetilação [e] quitosana, pelo fatorial 28, Modificação das partículas de quitosana desacetilada, para nanopartículas pelo método de ultrassom. 54 Figura 13 - Reação de desacetilação no balão volumétrico e equipamentos. Fluxo de entrada de Nitrogênio F; Condensador Termômetro Suspensão de quitosana em solução de NaOH aquosa Fluido térmico Chapa aquecedora Fonte: Autoria própria. Após o tempo determinado, de acordo com cada experimento feito do fatorial 23, a solução foi imediatamente filtrada a vácuo para interromper a reação. A quitosana, de cada experimento que ficou retida no filtro, foi lavada com água destilada até atingir pH neutro. Os filtros de todos os 24 experimentos, com a quitosana retida foram colocados em placa de Petri e submetidos à estufa por 48 h na temperatura de 40ºC 117,118,119, As amostras de quitosana obtidas foram, separadamente, trituradas utilizando- se um pistilo e um almofariz. O grau de desacetilação foi calculado após obtenção dos espectros, por espectroscopia na região do infravermelho, a partir das absorbância das bandas no infravermelho, nas frequências de 1655 cm! e da amida | do grupo acetil, e 3450 cm”! do grupo hidroxila, calculadas após correção da linha de base e a normalização dos espectros obtidos, usando a Equação 5 proposta por Domszy e Roberts 118,119,120 GD % = 100 - [(Atess/As4s0) * 75.2] Equação (5) 55 Para verificação dos graus de desacetilação obtidos, cerca de 1,5 mg de cada amostra de quitosana obtida após a reação de desacetilação foi dispersada em KBr devidamente seco e limpo. As amostras forma maceradas e posteriormente prensadas até adquirir a forma de uma pastilha para, então, serem submetidas à análise no espectômetro da marca SHIMADZU, modelo IRPRESTIGE-21, operado com média de 32 varreduras e resolução de 2 cm"! na região de 4000 — 700 cm”! 118,119,120 Após os resultados do planejamento experimental 23, foi feito um planejamento experimental 22 com três repetições no ponto central, de acordo com a Tabela 3, para verificar o aumento do grau de desacetilação no decorrer do tempo de seis horas. Nestes ensaios, foram retiradas 11 alíquotas para verificar a cinética da reação de desacetilação da quitosana, e posteriormente inserir uma modelagem matemática adequada que mais se assemelhasse ao comportamento dos experimentos 108:109,110, A modelagem matemática é uma representação por meio de equações, que possam se aproximar ao máximo do comportamento real do fenômeno estudado. No caso da reação heterogênea de quitosana, em que muitos fatores estão influenciando nos resultados obtidos, e é necessário um conhecimento mais detalhado a respeito da estrutura do material e como se comporta durante esta reação. Para isso, foi feito um estudo da estrutura da quitosana baseando-se no que já existe na literatura, sobre a cinética de desacetilação para a adEquação da modelagem utilizada. Tabela 3 - Planejamento fatorial 22. Experimentos Temperatura (*C) Conan ) de 1 - - 2 + - 3 - + 4 + + 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Desta forma, utilizou-se quitosana com alta massa molar e com grau de desacetilação inicial de 75%, onde as reações de desacetilação foram feitas com Juliana Rodrigues de Souza Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas nanopartículas para aplicação em Engenharia de Tecidos São Paulo 2017 Juliana Rodrigues de Souza Estudo da desacetilação da quitosana e obtenção de suas nanopartículas para aplicação em Engenharia de Tecidos Dissertação apresentada à Escola Politécnica da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências. São Paulo 2017 Dedico este projeto, ao Wagner de Souza Pereira, que, como um samba de raiz, me traz alegria, calor e vibração, e no meu dia a dia é o tempero necessário para o meu viver, me tornando mais forte em cada abraço seu envolvido com todo amor. Agradeço primeiramente a Deus, esta força maior que a tudo rege, por me dar discernimento de fazer as escolhas certas, por me proporcionar alegria de enxergar beleza nas pequenas coisas e de me transmitir força para seguir em frente. Agradeço ao meu melhor amigo, meu pai Raul, que é a luz da minha vida e que sempre tem uma palavra terna e de estímulo nos momentos mais difíceis. Agradeço à minha mãe, Maria Cristina, por sempre ter sido uma referência de luta, de superação e de determinação pelo que acreditamos ser a nossa felicidade. Agradeço aos meus irmãos lvan e Rodrigo pelo exemplo de coragem e determinação, pela inspiração diária que representam pra mim de seriedade diante dos obstáculos da vida, me fazendo acreditar na realização de meus sonhos, e enfrentar desafios que me pareciam intransponíveis. Agradeço ao meu querido Wagner de Souza Pereira pelo seu amor que me fortalece, pelo seu olhar terno nos dias difíceis, pelos seus abraços fortes quando achei que não iria conseguir e por me proporcionar paz em nossa casa, toda sua dedicação e compreensão foram fundamentais para minha concentração no desenvolvimento deste projeto. Agradeço ao meu orientador, o professor Dr. Reinaldo Giudici pela oportunidade, por acreditar em meu potencial e por me orientar em todos os momentos desde o início deste trabalho. Agradeço à Capes pela bolsa de estudos, que em muito contribuiu para que este estudo se concretizasse. Agradeço aos colegas e amigos da USP que me incentivaram e que me auxiliaram nas dúvidas durante o estudo: Erica, Esmar, Altanajara, Maria Giuliana, Thiago, Vinicius, Tnamara, Katia, Camila e Aninha. Agradeço aos amigos que muito me motivaram, em especial minha querida irmãzinha de alma Elizangela, sempre com suas palavras de carinho e incentivo. Agradeço aos professores doutores que foram importantíssimos nos esclarecimentos de muitas dúvidas no decorrer deste estudo, são eles: Alberto Ramos, Mauro Cesar Terence, Antônio Brant, Martha Simões, Dr. David, Carmen e Martin Schmal. Agradeço a todos os técnicos do laboratório de engenharia de materiais, da Universidade Presbiteriana Mackenzie, pelas dúvidas esclarecidas e por me fazer me sentir em casa como uma eterna mackenzista. “A vida é uma peça de teatro que não permite ensaios. Por isso, cante, chore, dance, ria e viva intensamente, antes que a cortina se feche e a peça termine sem aplausos.” Charles Chaplin ABSTRACT Itis estimated that in Brazil about one million burn victims occur per year, and even with the dynamics of innovations in the health area, the repair of this type of tissue injury, remains a great challenge. Burns tend to contract systemic infections, which can lead to death if the patient is not adequately treated. In this way, extreme care is required in the steps involved in this complex tissue repair. Faced with difficulties in the replacement or regeneration of injured organs or tissues, an interdisciplinary field called tissue engineering has emerged, focusing on the study for the development of three-dimensional supports, consisting of synthetic or natural materials, where the patient's own cells are cultured, subsequently reinserted by repairing tissues or replacing whole organs. Chitosan is one of the most widely used biopolymers nowadays in the field of tissue engineering, due to its capacity to act in a significant way in the three phases that involve the healing of burns, namely: inflammatory phase, proliferative phase and repair phase, and for its high bacteriostatic and fungiostatic action. In view of the existing properties of chitosan, the objective of this research was to intensify them by increasing its degree of deacetylation and modifying it to a gauge scale, thus increasing its surface area. For this, chitosan was submitted to a highly alkaline medium with temperature variation and reaction time variation, using the complete factorial statistical tool 2. After obtaining the deacetylated samples, it was verified by spectroscopy in the infrared region, that the highest values of deacetylation degree occurred after using the maximum levels in all factors involved in the reaction. In order to analyze the kinetics of the reaction and to confirm the information obtained from factorial 2º, a new 22 factorial design was made, fixing the time of six hours of reaction, during which eleven aliquots were taken for analysis of their degree of desacetylation (GD). The pattern of results of the experiments allowed the application of a mathematical model that represented the reality of what occurred during the reaction, being this the model of the shrinking core model. Subsequently, the chitosan with a high degree of deacetylation was subjected to the ultrasound method and the analysis of particle diameter, zeta potential and polydispersion index allowed to verify that chitosan after being submitted to ultrasound at the appropriate pH achieved particles in nanometer scale. Keywords: chitosan, tissue engineering, burns and nanoparticles. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Estrutura da quitina... Figura 2 - Comparaçao entre as estruturas da celulose e da quitina Figura 3 - Estruturas polimórficas da quitina...............eseeerreeeeeeerereeeerreeeeerererenra 28 Figura 4 - Reação de desacetilação da quitina. ............... eternas 29 Figura 5 - Estrutura da quitosana.................. tr receererereneeeenerereneerenereneneerenena 31 Figura 6 - Comparaçao entre ácido hialurônico e quitosana..............eeererere 33 Figura 7 - Tecido epitelial................... rr rereeeeeererereeeenerereneerenereneneerenano 40 Figura 8 - Fibroblasto. ............................. Figura 9 — Profundidade das queimaduras... Figura 10 - Etapas da Engenharia de Tecidos. Figura 11 - Estratégia experimental. ...............rreeeeererereerereeeeeeerereeeerrerecerererena 51 Figura 12 — Desacetilação da quitosana. .................... ii iiisssssesesenereeasa 52 Figura 13 - Reação de desacetilação no balão volumétrico e equipamentos. .......... 54 Figura 14 - Medidor de pH de bancada................... ii iissssesenenereeaa 58 Figura 15 - Equipamento ultrassônico de ponteira. .................... siri 59 Figura 16 - Espectrômetro da marca Shimadzu, modelo IR Prestige - 21. Figura 17 - Laminas de silício antes e depois do recobrimento de ouro.. Figura 18 - Equipamento para análise de MEV. Figura 19 - Equipamento Zetasizer, modelo ZEN3600 da Malvern Instruments. ......64 Figura 20 - Cubeta para potencial Zeta e para diâmetro hidrodinâmico................... 65 Figura 21 - Espectro de FTIR referente ao experimento 8 da duplicata.................... 67 Figura 22 - Espectros sobrepostos dos oito primeiros experimentos do fatorial 23...68 Figura 23 - Espectros deslocados dos oito primeiros experimentos do fatorial 2º....69 Figura 24 - Espectros sobrepostos da duplicata genuína do fatorial 23. . Figura 25 - Espectros deslocados da duplicata genuína do fatorial 2º. Figura 26 - Espectros sobrepostos da triplicata genuína fatorial 2º Figura 27 — Espectros deslocados da triplicata genuína do fatorial 23...................... 71 Figura 28 - Representação gráfica da triplicata do fatorial 23.................. 73 Figura 29 - Cubo referente aos graus de desacetilação obtidos no fatorial 2º.......... 73 Figura 30 - Gráfico de probabilidade normal de análise de resíduos. ............... 74 Figura 31 - Gráfico que demonstra ausencia de outliers...................i ii 75 Figura 32 - Análise da variância de resíduos. ................ si iiieereeeeseeeeereeeteno 75 Figura 33 - Diagrama de pareto Fatorial 2º... 76 «77 «77 Figura 36 - Gráfico de contorno do Concentração de NaOH com o tempo do fatorial Figura 34 - Efeitos principais fatorial 2º Figura 35 - Interações entre os fatores do fatorial 2º Di iiterercateaeraraeaaaaaraneaaaaaararacaaaaa race caaaaa aa caaaaaaaanaceaaaasananaaaaasarasnaaaarananeoa 78 Figura 37 - Gráfico de contorno da temperatura com a Concentração de NaOH do fatorial 23... trreeeeteaetereceatarararaeaaaaararceaaaaarareceaaaaarneaaaaaaanas 79 Figura 38 - Gráfico de contorno do tempo de reação com a temperatura do fatorial 2º. etanaraaaarananaaaa arena aaa aaa rena aaa aa Rea aaa aaa ARA aaa aaa aaa RAR Rana Rana Rea a aaa aa aaa a acena nana aeee aaa aa cia anaaaanaaaanaa aa 79 Figura 39 - Superfície de resposta (tempo x temperatura x GD) Fatorial completo 23. ..80 Figura 40 - Superfície de resposta (concentração de NaOH x temperatura x GD) Fatorial completo 2º............... nl rreeeeeaeeaeeeaeeeaeeaaeeeaaeeaaeeeaaerantaa 81 Figura 41 - Superfície de resposta (tempo x Concentração de NaOH x GD) Fatorial completo 2º. .......... ii iririreeereeereeeeeeeeaaeeaaeeeraeaaare aeee rare aare rare aaraaanananea 81 Figura 42 - Espectro de referência experimento 4 após 360 minutos de reação. ......82 Figura 43 - Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 1 do fatorial 22. experimento 1... recceerererereeeenerenereeeenerenererenereneeecenereneeenenenenennes 85 Figura 46 - Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 2 do fatorial 22. Figura 47 — Espectros deslocados das 11 alíquotas do experimento 2 do fatorial 2287 Figura 48 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação das 11 alíquotas do ..87 Figura 49 — Espectros sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 3 do fatorial 22. experimento 2. Figura 50 - Espectros deslocados das 11 alíquotas do experimento 3 do fatorial 22.88 Figura 51 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação das 11 alíquotas do experimento 3... rereeerererereerenererereeeenenenerecenerenereereneneneeeeneneneneanes 89 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Planejamento Fatorial 23.................. Tabela 2 - Níveis dos fatores do planejamento fatorial 2º. Tabela 3 - Planejamento Fatorial 22.................... Tabela 4 - Níveis dos fatores do planejamento fatorial 22................. 56 Tabela 5 - Resultados dos graus de desacetilação obtidos no fatorial 2º................. 72 Tabela 6 - Resultados do planejamento experimental 22 com tres repetiçoes no ponto central... si ietettteeeeeaaeareeeaaeeneeeaaearereaaeaneeeaacaneeeaacaneeeaaaaneeaacaneaaaaanenaanana 84 Tabela 7 - Resultados das 11 alíquotas do fatorial 22... 95 Tabela 8 - Valores dos parâmetros A e K ajustados individualmente para cada ensaio. Tabela 9 - Resultados da medição de temperatura pH 4,1. Tabela 10 - Resultados da medição de temperatura pH 4,4..................... 117 Tabela 11 - Resultados da medição de temperatura pH 4,7... 118 Tabela 12 - Resultados das nanopartículas em pH 4,1............ eee 120 Tabela 13 - Resultados das nanopartículas em pH 4,4... 121 Tabela 14 - Resultados das nanopartículas em pH 4,7... 121 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... rea creereeeereea ease cmeaaeeaerseaeameara 17 1.1 GENERALIDADES... iii 17 1.2 MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA... ssa 20 1.3 OBJETIVO... inertes enaee rear enteeenatrs 20 1.4 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO................. iss 21 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............... rr emeeeeeeeeeseesearemearaaa 23 21 POLÍMEROS... rerreeeeeertreeeeeeaeeererreeenaes 23 2.1.1 | Polímeros naturais e sintéticos . 2.1.2 Biopolímeros... 2.1.3 | Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis. 2.1.4 — Copolímeros.............. is rcererteeeeererereererereeecererereerrererecerererrerererecenenenena 2.2 BIOMATERIAIS............... ss rreeeeerereererrereeeeererererererecerereerererereeereneneanaranes 25 2.3 POLISSACARIDEOS ................ us irereerreeeeeeererereerererecereerererereneeereeneanerenes 26 2.4 QUITOSANA.. 2.4.1 | Origem, fontes e processos de obtenção 24.2 Propriedades da quitosana e características de sua estrutura ................. 30 2.4.3 Nanopartículas de quitosana ..............teeeereeererereeeeererereerererecererereno 35 2.5 NANOTECNOLOGIA................. reter 35 2.6 SISTEMA TEGUMENTAR.................. reatar 39 2.6.1 Fibroblastos ................. ss isereeaeeeeeeaaeeeeeeaaceneeeaaeanereraraneeeaananeeeaananta 41 2.7 QUEIMADURAS.................. eretas 42 2.71 Processo de cicatrização da pele .................. recesso 44 2.8 ENGENHARIA DE TECIDOS.................. 45 2.9 CINÉTICA DAS REAÇÕES................. isentas 47 2.10 MODELAGEM MATEMATICA... 2.10.1 Modelo do núcleo não reagido.. 2.11 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS COM VÁRIOS FATORES............... 49 3 MATERIAIS E MÉTODOS... 3.1 DESACETILAÇÃO DA QUITOSANA .............. rise 52 3.2 OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA POR ULTRASSOM.57 3.3 CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA E DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA............ ir rreretaeerreaararnaetaraararararanaarrrarantananaa 59 3.3.1 Análise de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) 60 3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 3.3.3 Potencial Zeta, índice de polidispersão e diâmetro hidrodinâmico 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................... remar 66 4.1 RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERENTE AO FATORIAL 23................... 66 4.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO REFERENTE AO FATORIAL 22.................. 82 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES DA MODELAGEM MATEMÁTICA DO NÚCLEO NÃO REAGIDO (SHRINKING CORE MODEL) PARA REAÇÃO DE DESACETILAÇÃO................ ii itiisiieetneeaseeeereeeaeeeeaeaeaerataeeeaeratnetaneis 100 4.4 RESULTADOS E DISCUSSÕES SOBRE AS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA OBTIDAS APÓS O TRATAMENTO DE ULTRASSOM..................... 115 5 CONCLUSÕES... reeereereereeeeeerreeeaereerreersrersarrrersaass 129 REFERÊNCIAS............... nr rereereeeeeeeeereeeeeereerseerseerearseerse eee rsrerseesaaseersaass 131 19 tecidos que sofreram queimaduras; são elas: a fase inflamatória, a fase proliferativa e a fase reparadora ou fase de remodelação *1º. Na fase inflamatória, ocorre a formação de uma barreira formada por plaquetas que se aglomeram, esta rede que se forma, tem fundamental importância contra agentes infecciosos e é ainda nesta fase que se inicia o processo para restauração da matriz extracélular. A quitosana, auxilia nesta etapa devido a sua capacidade de ativar macrófagos, que são células que surgem logo após o surgimento de uma rede de fibrina, estas células agem na defesa do organismo contra infecções 1911. Na fase proliferativa, ocorre a movimentação de células importantes como os queratinócitos e os fibroblastos, que agem na formação do tecido de granulação, os fibroblastos tem papel fundamental na formação de uma nova matriz extracélular. A quitosana é capaz de auxiliar nesta etapa, pois em contato com o meio fisiológico, sendo um glicosaminoglicano, ela se quebra em monômeros que são biossintetizados, dando origem ao ácido hialurônico (substância que é necessária em grande quantidade nesta etapa de formação da matriz extracélular) 1011, Na fase de remodelação do tecido ocorre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal. A quitosana age nesta fase final de reparação por ativar as células envolvidas na reparadora do tecido como, os leucócitos, macrófagos e fibroblastos, facilitando assim, a granulação e organização das células durante o processo de epitelização 10:11. A quitosana, além da ação mencionada anteriormente nas etapas de cicatrização de lesões, quanto maior a quantidade de grupos amino protonados em sua estrutura, com o aumento do seu grau de desacetilação, mais intensa é sua atividade antimicrobiana, pois seus grupos amino protonados são capazes de se ligar aos grupos aniônicos das paredes célulares de micro-organismos, inibindo o crescimento destes 3:14. Na área médica, muito se tem estudado materiais em escala manométrica. Esta escala está associada a um conjunto de conceitos, conhecimentos e ferramentas de um campo de estudo chamado de nanotecnologia, em que se utilizam estruturas no tamanho entre 1 a 100 nanômetros (nm), definido como 10º metro. Neste estudo, buscam-se métodos na produção de nanopartículas, aumentando sua área superficial, e que mesmo procurando manter a estabilidade da molécula e manutenção de sua ação biológica 1419. 20 Para intensificar a capacidade de auxiliar na reparação das queimaduras de pele, aumentar a interação em meio biológico, e agir contra possíveis infecções, a quitosana pode ter seu grau de desacetilação alterado para valores iguais ou maiores que 90%, e pode ser modificada para forma de nanopartículas, aumentando-se portanto sua área superficial. 1.2 MOTIVAÇÃO E JUSTIFICATIVA O foco principal deste estudo foi obter quitosana na escala nanométrica com alto grau de desacetilação, para que, desta forma, suas propriedades já existentes, fossem intensificadas, como sua ação bacteriostática e fungistática e sua capacidade de agir de forma significativa nas fases de reparação da pele. A obtenção de nanopartículas de quitosana com alto grau de desacetilação, poderá ser utilizada em trabalhos futuros, sendo inseridas em uma rede tridimensional. Esta rede, poderá ser feita de nanofibras de materiais sintéticos ou naturais com características biodegrádeis e biorreabsorvíveis, formando um tecido artificial que poderá ser aplicado em queimaduras graves, podendo evitar processos inflamatórios que poderiam gerar cicatrizes hipertróficas. Até o presente momento, dentro dos estudos e das pesquisas feitas, não foi publicado ainda, nenhum trabalho utilizando nanopartículas de quitosana inseridas em uma rede tridimensional, para aplicação como um tecido artificial em queimaduras graves. 1.3 OBJETIVO O objetivo principal deste estudo foi intensificar as propriedades já existentes da quitosana para sua futura aplicação em engenharia de tecidos, tendo como objetivos específicos: . submeter a quitosana a reação de desacetilação para retirar os grupos acetil da estrutura; . identificar os graus de desacetilação obtidos após as reações; . analisar os fatores principais e suas interações durante a reação e analisar a cinética da reação de desacetilação; 21 . submeter a quitosana com o maior grau de desacetilação obtido ao método de ultrassom; . analisar se foi atingida a escala nanométrica da quitosana estudada. 1.4 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO Este trabalho está dividido em 6 capítulos, em que o primeiro é uma introdução do tema proposto, explicando inicialmente as estatísticas atuais no Brasil em relação às queimaduras, a importância dos cuidados para as etapas de reparação para evitar a ocorrência de cicatrizações patológicas no paciente queimado, ou até mesmo levar o paciente a óbito, devido a um quadro crítico de infecções. Ainda na introdução, foram mencionados, os principais materiais utilizados na área de engenharia, dando ênfase ao material quitosana devido suas propriedades relevantes para a aplicação estudada. Por fim, é mencionado o aumento dos grupos amino protonados pela desacetilação da quitosana, e a modificação para uma escala nanométrica, permitindo acentuar suas propriedades já existentes. O segundo capítulo se refere à revisão bibliográfica relacionada ao tema proposto, dando ênfase aos principais tópicos como: polímeros, biomateriais, polissacarídeos, quitosana, nanotecnologia, sistema tegumentar, queimaduras, engenharia de tecidos, cinética das reações, modelagem matemática e planejamento de experimentos com vários fatores. Alguns tópicos foram subdivididos em subtópicos, para melhor compreensão do assunto abordado. Ainda que, o tópico principal foi o biomaterial quitosana. O terceiro capítulo está relacionado à metodologia do trabalho cujo título é materiais e métodos, em que são mencionados os materiais utilizados como: a quitosana, o hidróxido de sódio, o ácido acético e o acetato de sódio; os procedimentos para as reações de desacetilação, e para a obtenção das nanopartículas de quitosana e a caracterização daquelas, o detalhamento das análises do grau de desacetilação feitas através da obtenção de espectros (FTIR), também está dentro deste capítulo, assim como o uso da ferramenta estatística para analisar de forma mais aprofundada as interações e efeitos dos fatores envolvidos na reação. O quarto capítulo se refere aos resultados e às discussões feitas em relação aos graus de desacetilação obtidos, e a viabilidade da análise da cinética mediante as 24 vital importância nos avanços da ciência devido a facilidade de obtenção e por serem biocompatíveis e biodegradáveis. Os polímeros sintéticos são os polímeros produzidos em laboratório, muitos deles são sintetizados para imitar polímeros naturais. Os polímeros sintéticos mais utilizados hoje na área médica, são os poliésteres biorreabsorvíveis como: o copolímero PLGA poli (ácido lático-co-ácido glicólico), que permite grande versatilidade em sua estrutura e que são capazes de serem totalmente metabolizados pelo corpo 18:19. 2.1.2 Biopolímeros Os biopolímeros são polímeros produzidos a partir de matérias primas de fontes renováveis, como: celulose e a quitina. As fontes renováveis geralmente possuem um ciclo de vida menor, ainda assim são muito explorados em diversas áreas, pois geralmente possuem propriedades como biodegrabilidade e biocompatibilidade. Alguns desses materiais, possuem algumas limitações em suas propriedades. Por esta razão estudos são feitos modificando-os em sua forma ou em sua estrutura química, ou então, são misturados com polímeros sintéticos para adquirir as propriedades necessárias para determinadas aplicações!920.21, Desta forma, esses biopolímero são utilizados na forma de blendas, compósitos, nanopartículas ou microesferas. Por exemplo, a quitosana originária da quitina, por não possuir boas propriedades mecânicas, geralmente é utilizada na forma de blenda, que é uma técnica que se baseia na mistura com outro polímero, melhorando suas propriedades e aumentando seu número de aplicações; ou como nanopartículas ou microesperas intensificando suas propriedades já existentes e aumento sua interação em meio biológico. 19:20:21, 2.1.3 Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis Polímeros biodegradáveis são materiais que possuem a capacidade de sofrer degradação por atividade biológica, em especial, por ação enzimática de microrganismos. A biodegradabilidade dos polímeros é uma propriedade explorada na modulação da liberação de fármacos, e na área médica como suturas cirúrgicas ou tecidos artificiais, uma vez que é altamente desejável que um material introduzido no organismo sofra degradação depois de cumprida sua função, sem a necessidade 25 de intervenções para sua retirada. Os produtos de degradação formados, podem ser metabolizados dando origem a dióxido de carbono e água, ou são eliminados na urina. Polímeros biocompatíveis se assemelham em relação às propriedades dos polímeros biodegradáveis, pois estes materiais são capazes de ser absorvidos em um determinado tempo em meio biológico, e quando aplicados na área médica, sem causar toxicidade ao paciente 21:22:28, 2.1.4 Copolímeros A polimerização simultânea de dois ou mais monômeros constitui o processo chamado de copolimerização, enquanto que a polimerização de apenas um monômero constitui uma homopolimerização. Por exemplo, ácido láctico e ácido glicólico podem ser polimerizados indivualmente dando origem ao poli (ácido láctico) e ao poli (ácido glicólico), mas quando combinados em um único meio reacional se ligam de forma aleatória em uma só cadeia formando o copolímero poli (ácido lático- co-ácido glicólico) 2324, Existe uma grande quantidade de estruturas que podem ser formadas por meio de copolimerização, variando-se as combinações de monômeros e as proporções entre eles. A composição do copolímero resultante de um dado meio reacional, em copolimerização via radicais livres, pode ser calculada a partir da composição da carga inicial e da reatividade relativa dos monômeros (razão de reatividade) 224. Assim como mencionado anteriormente pelo exemplo do copolímero poli (ácido lático-co-ácido glicólico), outro exemplo é a quitosana, que é formada por dois monômeros, N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, em proporções que podem variar ao longo da cadeia de acordo com a aplicação desejada, permitindo, portanto, uma grande variedade de aplicações 22:23. 2.2 BIOMATERIAIS Por definição, biomaterial é uma substância, ou uma mistura de substâncias, podendo ser sintético ou natural, que pode ser utilizado em meio biologico. Sua utilização na área médica tem a função de agir por um determinado tempo tratando, reparando ou substituindo um orgão ou função do corpo. A escolha de um biomaterial envolve fatores como biocompatibilidade, biodegrabilidade, propriedades mecânicas 26 específicas, tempo de degradação controlado, devendo ser atóxico e ter capacidade de se decompor nos fluidos corpóreos sem desencadear processos inflamatórios 242º, 2.3 POLISSACARÍDEOS Os mais polissacarídeos são as macromoléculas abundantes da biosfera, formados pela união de muitos monossacarídeos através de ligações glicosídicas. Geralmente são um dos principais elementos estruturais de plantas e encontrados nos exoesqueletos de animais. As ligações glicosídicas ocorrem devido à ligação covalente entre a hidroxila de um carbono ligado ao oxigênio central com a hidroxila de qualquer carbono de outro monossacarídeo, produzindo água. As moléculas se unem produzindo a ligação glicosídica (-0-) como demonstrado na Figura 1 na estrutura da quitina. A maioria dos carboidratos encontrados na natureza ocorre como polissacarídeo e são polímeros de alto peso molecular, constituídos praticamente de carbono, oxigênio e hidrogênio, podendo ter também nitrogênio em sua estrutura. Alguns exemplos de polissacarídeos encontrados na natureza são: a celulose, a quitina, amido, proteínas entre outros 2. Figura 1 - Estrutura da quitina. Fonte: Guilbot et al., 1985. 2.4 QUITOSANA A quitosana é um copolímero linear de origem natural que possui em sua estrutura unidades N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina, em proporções que 29 a da a-quitina. Dessa maneira, as quitinas podem apresentar cristalinidades diferentes, e as aplicações podem variar de acordo com a ação desejada 27:28. O polímero quitina é um material semicristalino, de baixa toxicidade, biocompatível e biodegradável. A quitina mais comercializada atualmente é a originária da carapaça de crustáceos, em que para sua extração, são feitas etapas de desmineralização, desproteinação e despigmentação, etapas essas são feitas devido ao fato de as cascas de crustáceos possuírem 15 a 20% de quitina, 25 a 40% de proteínas e de 40 a 55% de carbonato de cálcio 232º. Após a extração, a quitina poderá dar origem à quitosana. Quando submetida ao processo de desacetilação, a quitina é adicionada em meio altamente alcalino aquoso no qual a concentração desta solução, o tempo e a temperatura de reação, variam de acordo com as propriedades que a quitosana deve adquirir para uma determinada aplicação. Os principais fatores que devem ser analisados para obtenção da quitosana a partir da quitina são: concentração da solução alcalina, temperatura de reação, tempo de reação, tamanho das particulas da quitina, atmosfera da reação e existência de impurezas 28:29.30, As condições utilizadas durante a reação de desacetilação heterogênea, da quitina influenciam na massa molar do polímero quitosana, e no seu grau de desacetilação (porcentagem de grupos amino livres existentes na estrutura após a retirada dos grupos acetil). Quando esse grau de desacetilação está acima de 50%, o polímero torna-se solúvel em soluções aquosas de ácidos fracos e passa a ser chamado de quitosana. A reação de desacetilação da quitina, pode ser vista na Figura 4 3081, Figura 4 - Reação de desacetilação da quitina. aros di “ « ua a LL NÉOCI R Noca , Desacetilação cer RE Fonte: Anitha et al., 2014. 30 A massa molar média, o grau de desacetilação e a distribuição das unidades monoméricas da cadeia, afetam a solubilidade da quitosana. Assim, quanto maior a quantidade de grupos amino protonados em sua estrtura, maior será a repulsão eletrostática entre as cadeias, e desta forma maior será sua solubilidade. Os polimorfos (a-quitina, B-quitina e y-quitina), que dão origem a quitosana, devido os diferentes arranjos solidos, possuem diferentes solubilidades e diferentes capacidades de intumescimento 30.31, Devido à estrutura de a B-quitina ser um material menos densamente empacotado, permite-se uma maior acessibilidade aos sítios reativos quando comparados à da a-quitina, em que a acessibilidade das espécies ativas do hidróxido de sódio aos grupos acetamidas (sítios reativos onde estão os grupos acetil), é muito menor, dificultando o aumento do grau de desacetilaçao durante a reação. A cristalidade da quitina interfere na acessibilidade aos sítios reativos, onde ocorre cristalinos para a parte do centro dos domínios cristalinos, vai aumentando a dificuldade para o acesso interferindo nos graus de desacetilação obtidos *031. Os processos para o aumento do grau de desacetilação da quitina geralmente são feitos em soluções aquosas altamente alcalinas (utilizando hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio com água destilada), por longos períodos e com temperaturas elevadas, e em muitos casos, gerando despolimerização durante a reação. Para minimizar este efeito, pode-se utilizar uma atmosfera inerte durante a reação, sendo que muitas técnicas vêm sendo aprimoradas para que a despolimerização durante a reação possa ser evitada “0:31. 2.4.2 Propriedades da quitosana e características de sua estrutura A quitosana nos últimos trinta anos vem sendo utilizada tradicionalmente nos países orientais para o tratamento de reparação de tecidos. No Japão, já existem materiais comercialmente utilizados, com base principal em sua formulação, a quitosana, sendo empregado para uso no tratamento de lesões teciduais. A sua estrutura lhe permite aplicação no auxílio da cura em diversas enfermidades na área médica, devido a suas propriedades, tais como, biocompatibilidade, biodegradabilidade, capacidade bioadesiva, alta permeabilidade, ação na recuperação de lesões, ação na homeostasia, eficácia na redução do nível do 31 colesterol sanguíneo, estímula efeitos no sistema imunológico, ação analgésica, baixa toxicidade, além de ser bacteriostática e fungistática 323334, Diante de propriedades da quitosana, este biomaterial vem sendo largamente utilizado na área médica e, em muitos casos em escala nanométrica, na forma de nanocascas para liberação de fámacos, encapsulando outros materiais, em suturas cirurgicas, para reconstrução óssea, na regeneração de tecidos nervosos, como pele artificial entre outros. A grande variedade de aplicações da quitosana, se dá especialmente pela quantidade de grupos amino protonados em sua estrutura e pelas suas unidades monoméricas que a caracterizam como um glicosaminoglicano *3:3438, A estrutura polissacarídea da quitosana é composta pelas unidades monoméricas 2-amino-2-desoxi-D-glicose e tipo B-(1—4)-2-acetamida- 2-desoxi-D- glicose ligadas pelas ligações glicosídicas do tipo B-(1—4),- como pode ser verificado na Figura 5. Este polímero natural possui uma estrutura semicristalina, sendo insolúvel em meio aquoso e na maioria dos solventes orgânicos mas, podendo alterar sua solubilidade de acordo com a quantidade de grupos amino em sua estrutura 343, Figura 5 - Estrutura da quitosana. 0H Ei 0H 4 NH NH; 2 Ho 0 HO 40 Q 0 + 9 b HO o Ho NH NH, 0H ou H Fonte: Campana et al., 2007. 2.4.2.1 Ação antimicrobiana A quitosana é um biomaterial que possui ação bacteriostática e fungistática. Estudos têm mostrado que a carga superficial da quitosana, tem grande importância em sua atividade antimicrobiana. As cargas se tornam positivas, quando em contato com fluidos fisiológicos, contribuindo para que estes grupos amino protonados da 34 bloquear terminações nervosas, reduzindo a dor, esta ação tópica, é decorrente da captura de hidrogênios ácidos liberados no local da inflamação pela ionização do grupo amínico “2:43:44, O processo de cicatrização da pele em feridas, e também em queimaduras, se divide em três fases principais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase reparadora ou de remodelação. A restauração da pele, necessita de um processo dinâmico o qual envolve processos célulares, moleculares, fisiológicos e biológicos. Os biopolímeros mais utilizados hoje na reparação ou regeneração de tecidos são: os alginatos, a quitosana, o ácido hialurônico, o colágeno e a elastina, onde estes três últimos são sintetizados pelos fibroblastos “23:44 A fase inflamatória, ocorre logo após a lesão, nesta fase as plaquetas formam uma rede de fibrina, agindo como uma rede de proteção contra micoorganismos indesejáveis, e nesta fase ocorre também o surgimento de células importantes para remoção de tecidos desvitalizados, as principais células envolvidas nesta etapa são: macrófagos, neutrófilos e linfócitos. Os macrófagos são células importantes para proteção contra agentes infecciosos, e de acordo com estudos anteriores a quitosana é capaz de ativar os macrófagos. Muitas vezes as infecções, comuns em pacientes que sofrem queimaduras, tendem a ocorrer e agravar o quadro do paciente “2: 4344, Na fase proliferativa, ocorre a formação do tecido de granulação, ela é dividida em três subfases: reepitalização, fibroplasia e angiogenese. A subfase envolvendo a reepitalização, em que ocorre a movimentação dos queratinócitos. A subfase onde ocorre a fibroplasia iniciando a proliferação dos fibroblastos que sintetizam colágeno e elastina. E a subfase que ocorre paralela a fibroplasia chamada de angiogenese, onde novos vasos darão suporte a formação da nova matriz extracélular. Nesta etapa ocorre a contração da ferida. A quitosana possui a capacidade de agir nesta etapa, pois em contato em meio biológico ela se quebra em monômeros que são biossintetizados formando glicosaminoglicanos importantes na formação da nova matriz extracélular “3, A fase de remodelação do tecido, ocorre substituição de tipos de colágenos gerados pelos fibroblastos, formando as fibras reticulares necessárias para uma recuperação tecidual que se assemelhe o mais próximo de um tecido normal não danificado. De acordo com estudos anteriores, a quitosana também auxilia da fase final de reparação, pois intensifica a ação das células já mencionadas nas etapas 35 anteriores como: os leucócitos, os macrófagos e os fibroblastos, auxiliando de forma significativa na ação destas células durante a reparação das lesões. 8:47. 2.4.3 Nanopartículas de quitosana A preparação de nanoesferas, é uma estratégia para incrementar a capacidade de adsorção da quitosana, em que a adsorção é a capacidade de adesão de moléculas de um fluido a uma superfície sólida, uma vez que nesta escala, possuem uma área superficial cerca de 1000 vezes maior do que a quitosana em flocos. Além disso, as nanoesferas apresentam cinéticas de adsorção mais rápidas e maior facilidade de manuseio e operação *8:*º. Muitas pesquisas na área médica, foram feitas trabalhando com quitosana na forma de nanopartículas pois, além de aumentar sua ação antimicrobiana, de intensificar sua capacidade de auxiliar a cicatrização de lesões, a grande quantidade de cargas positivas em sua superfície favorece sua capacidade de se ligar a íons metálicos, entre os quais o zinco, que é de extrema importância na restauração de tecidos “50,51, Como mencionado anteriormente no parágrafo logo acima, o alto teor de grupos amino protonados (cargas positivas) na quitosana intensifica sua capacidade de se ligar a íons metálicos. No entanto esta capacidade de se ligar a íons metálicos, esta intimamente relacionada ao pH do meio. Essas ligações podem ser favorecidas com o aumento do pH, onde ocorre à neutralização dos grupos amino protonados favorecendo ligações com metais como: urânio, cobre chumbo ou zinco. Lembrando que o zinco é um elemento com intensa ação antimicrobiana e auxilia no processo de reparação de feridas e queimaduras º253, 2.5 NANOTECNOLOGIA A nanotecnologia, é um campo da ciência que envolve a obtenção de estruturas em escala molecular e a manipulação de materiais em uma escala atômica, podendo ser definida como o estudo e uso de estruturas com tamanho entre 1 e 100 nanômetros, sendo que, um nanômetro é definido como 10º m. As pesquisas envolvendo escalas “nano” envolve conhecimentos, conceitos e ferramentas da biotecnologia, engenharias, química, medicina, ciência dos materiais e biologia. Este 36 estudo permite um aprofundamento do estudo da matéria em toda sua complexidade 54,55,56. Os materiais em proporção de nanopartículas devem possuir estabilidade da molécula, manutenção de sua atividade biológica, solubilidade desejável de acordo com sua aplicação, mantendo sua composição química, e podendo alterar propriedades mecânicas, óticas e eletrônicas ou acentuar propriedades já existentes. O físico americano Richard Feynman foi quem sugeriu a manipulação dos átomos para construção de produtos com propriedades únicas dando início à nanotecnologia 54,55,56. Entre os principais motivos para o rápido desenvolvimento na utilização de nanomateriais e grande número de estudos neste campo nos dias atuais, é devido a diversidade de aplicações que podem ser feitas nesta escala, tendo a grande vantagem de não alterar a composição química do material que foi modificado para uma escala nanométrica. Em muitas situações, os materiais na forma de nanopartículas ficam com suas propriedades intensificadas como o caso da quitosana, um biomaterial que quando utilizado na forma de nanopartículas, possui sua propriedade bacteriostática mais efetiva 857,58, Desta forma, a nanotecnologia vem sendo explorada e aplicada nas mais diversas áreas da ciência, uma vez que surgem novas possibilidades de aplicações. Em aplicações médicas e farmacêuticas, a faixa utilizada é geralmente de 5 — 1000 nm. Lembrando que uma partícula é considerada nanométrica quando apresenta um tamanho inferior a 100 nm. Desta forma na área médica as partículas muitas vezes são utilizadas na forma de microesferas º8.57,58, Os materiais, quando manipulados em escala manométrica, podem ter algumas de suas características inicias alteradas, estas mudanças ocorrem devido os métodos empregados para modificação em uma escala nanométrica, podendo ocorrer efeitos como: fricção, combustão, alterações eletrostáticas, movimentos brownianos pelo uso de ultrassom, entre outros. Os materiais quando trabalhados em escala nanométrica tem sua área superfícial muito maior e possivelmente melhorando sua interação com outras moléculas 857,58, A mudança das propriedades de materiais em escala nanométrica ocorre muitas vezes pela fração de átomos de superfície. Na superfície de nanopartículas existe um número menor de átomos vizinhos coordenados, por consequência, esses átomos vizinhos tem um número menor de coordenação sendo menos estáveis 39 associada ao metal zinco, pois este metal é bacteriostático e essencial no processo de reparação da pele, pois estabiliza a membrana célular e age nas etapas de cicatrização como nas fases proliferativa e de remodelação 8384, Geralmente as nanopartículas de quitosana obtidas, independentemente do método adotado, apresentam variação dos tamanhos obtidos apresentando uma distribuição heterogênea, e o índice de polidispersão pode variar muito de acordo com o método adotado. Os métodos mais utilizados para a determinação da distribuição de tamanho das nanopartículas consistem em microscopia eletrônica de varredura, microscopia eletrônica de transmissão, ou pelo equipamento Zetasizerr, que permite verificar a carga do material, seu diâmetro hidrodinâmico e seu índice de polidispersão 64,65 2.6 SISTEMA TEGUMENTAR Os tecidos do corpo humano, são divididos em tecidos epiteliais, conjuntivos, musculares e nervosos. O tecido epitelial não possui vascularização e sua nutrição é feita por difusão por meio dos vasos sanguíneos do tecido conjuntivo, onde a membrana basal seleciona o que deve ser transportado para o epitélio. O tecido conjuntivo é formado em especial por células mesenquimais e uma matriz extracélular rica, isto é abundante 8887. O tecido conjuntivo é ricamente vascularizado e é responsável pela homeostase do corpo, possui os fibroblastos que são células encarregadas de produzir a matriz extracélular. Esta matriz é o meio no qual as células do tecido conjuntivo estão dispostas e lhes proporciona nutrição e substrato para sua organização 6.67,68, Este tecido possui também outras células de extrema importância como os macrófagos, os mastócitos e os plasmócitos. Além das células a sua matriz extracélular, é constituída por um fluido aquoso formado de glicosaminoglicanos, proteoglicanos e glicoproteínas, além das fibras colágenas, das fibras reticulares e das fibras elásticas (fibrilina e elastina) 8889,70. O tecido epitelial do nosso corpo tem um papel de extrema importância na termorregulação e nos protege contra atrito, perda de água, invasão de micro- organismos e a incidência dos raios ultravioleta 88970. As camadas de nossa pele 40 são classificadas de acordo com a forma das células, a localização, a distribuição e a quantidade como mostrado na Figura 7. Figura 7 - Tecido epitelial. Poro c E | clandiila: i orpúsculo sebácea sudoriparo de Meissner Camada córnea Epiderme | (queratinizada) Terminação nervosa livre Derme-| | ; ” e /y )/— glândula y », * — sudoripara Músculo eretor do pêlo Tecido subcutâneo (adiposo) Fonte: Junqueira e Cameiro, 2007 A epiderme, que é o tecido epitelial estratificado pavimentoso é queratinizado e possui uma espessua entre 1 a 2mm na maior parte do corpo, diferenciando-se somente em relação as palmas das mãos e as plantas dos pés tendo espessura com cerca de 5 mm. Ela possui quatro camadas principais: o estrato basal, o estrato espinhoso, o extrato granuloso e o extrato córneo. Nestas camada, são encontradas as células tronco, os queratinócitos, os melanócitos, as células de Merkel, células eosinófilas, as células de Langerhans entre outras, cada uma desempenhando um papel de extrema importância na estrutura da epiderme 8970. A derme, que também é chamada de tecido conjuntivo, tem como função principal de unir outros tecidos; é subdividida em tecido conjuntivo frouxo e tecido conjuntivo denso. Ela é altamente vascularizada possuindo em sua estrutura os vasos sanguíneos e linfáticos , os nervos e as terminações de neurônios sensoriais. O tecido conjuntivo, como mencionado anteriormente, é formado por células alongadas do mesênquima embrionário e pela matriz extracélular. As células mais importantes do 41 tecido conjuntivo, formadas pelo mesênquima embrionário são: os fibroblastos, os macrófagos, os mastócitos e os plasmócitos 7271. Os fibroblastos são células que estão em crescimento ativo e são responsáveis pela sintetização da matriz extracélular (meio onde as células estão dispostas proporcionando condições para suas atuação e organização). Eles também sintetizam as proteínas como o colágeno e elastina, os glicosaminoglicanos e glicoproteínas multiadesivas. Os macrófagos protegem o tecido de agentes infecciosos. Os mastócitos agem na proteção de reações alérgicas. Os plasmócitos são importantes nos processos imunológicos produzindo os anticorpos 7º”. 2.6.1 Fibroblastos As células mesenquimais são capazes de se tranformar em fibroblastos. Estes têm a função de síntese de componentes fibrilares como o colágeno e a elastina, e não fibrilares como as glicoproteínas e os glicosaminoglicanos (ácido hialurônico) da matriz extracélular do tecido conjuntivo. Os fibroblastos possuem retículo endoplasmático rugoso e o complexo de Golgi bem desenvolvidos, pois sintetizam os componentes da matriz extracélular: as fibras colágenas, as fibras reticulares, as fibras elásticas e a substância fundamental para remodelação tecidual 72. Quando localizados na derme reticular, apresentam-se em tramas paralelas à superfície e possuem formas estreladas mantendo íntima relação com as células vizinhas, conferindo-lhes resistência as forças mecânicas que atuam sobre a pele, enquanto quando em menor atividade, ficam com aspecto de filamento e recebe o nome de fibrócito. Durante o processo de recuperação de lesões, os fibroblastos migram para as áreas afetadas auxiliando na produção de matriz célular e cicatrização da lesão, em algumas situações os fibroblastos podem sofrer uma desregulação na atividade de síntese de matriz extracélular e aumentar a produção principalmente de colágeno, acarretando na deformação dos órgãos afetados, a este processo dá-se o nome de fibrose. Na Figura 8 esta representada a estrutura do fibroblasto e suas organelas, e a representação do fibroblasto ativo e inativo (fibrócito) 7º. 44 Ao atingir tecidos subcutâneos, dentre eles músculos, e até osso, essa lesão é mais grave, e considerada queimadura de terceiro grau. Do ponto de vista médico tem aspecto esbranquiçado e tende a perda significativa de elasticidade, onde o tempo de tratamento, varia muito para cada paciente, essa queimadura tem aspecto esbranquiçado e necessita de enxertia 87º. As reparações das queimaduras graves implicam não somente em cirurgias de enxertia de pele precoces, mas também em controlar e orientar a regeneração ou restauração cicatricial, que tende a ocorrer de forma anárquica e com potencial de sequelas e infecções. 2.7.1 Processo de cicatrização da pele O processo de cicatrização da pele, após uma queimadura que afeta sua integridade além da derme, se divide em três fases principais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase reparadora ou de remodelação. A restauração da pele necessita da interação de células estromais e circulatórias, fragmentos de célula, matriz célular, alterações físico-químicas e ação de micro-organismos sendo portanto um processo dinâmico envolvendo processos célulares, moleculares, fisiológicos e biológicos?8!. A fase inflamatória, tem início logo após a lesão podendo durar até cinco dias, ocorrendo a agregação das plaquetas, e formação da rede de fibrina, formando um coagulo sobre a lesão, formando um trombo rico em plaquetas infiltrado rapidamente pela fibrina. Ao mesmo tempo ocorre a migração de linfócitos, neutrófilos e os macrófagos sobre a rede da fibrina com o objetivo de remover tecidos desvitalizados. Esta etapa é de fundamental importância para o processo de cura, envolvendo sinais inflamatórios como dor, aumento do fluxo sanguíneo e edema 8182, A fase proliferativa pode durar até três semanas, é responsável pela formação do tecido de granulação, divide-se em três fases: reepitelização, fibroplasia e angiogênese. Na reepitelização ocorre a migração de queratinócitos das bordas e anexos remanescentes, na fibroplasia ocorre à proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, elastina e outras proteínas; na angiogenese ocorre ao mesmo tempo em que a fibroplasia, nesta fase a vascularização é refeita possibilitando o fluxo de nutrientes, desenvolvendo o tecido de granulação e novos vasos capilares que dará suporte à formação de uma nova matriz extracélular 82:83. A fase de remodelação, também chamada de fase de maturação, se inicia na terceira semana e pode durar até dois anos. Nela ocorre a substituição do tipo de 45 colágeno tipo 3 para o tipo 2. O colágeno tipo 2 aparece na cartilagem, e o colágeno tipo 3 constitui as fibras reticulares de muitos órgãos como: fígado, útero, coração, pulmões, músculos, entre outros 28384. 2.8 ENGENHARIA DE TECIDOS A engenharia de tecidos é um campo interdisciplinar que envolve conhecimentos na área da engenharia, ciência dos materiais e das ciências da saúde, tendo como objetivo criar, reparar, ou substituir tecidos e orgãos lesionados. Com isso, é fundamental o uso de três ferramentas básicas: biomateriais, células e fatores de crescimento *. As células são responsáveis pela secreção da matriz para formação de um novo tecido, enquanto que o biomaterial tem função de fornecer suporte e ambiente adequado para as células. Já as moléculas biologicamente ativas podem ser adicionadas ao conjunto a fim de auxiliar e estimular as células na reparação tecidual 85, O biomaterial utilizado deve ser submetido ao processo de eletrofiação para formar fibras que possam mimetizar fisicamente, a matriz tridimensional, proporcionando um ambiente favorável ao desenvolvimento célular. As células que serão semeadas, nesta matriz tridimensional, devem ocupar uniformemente toda a unidade para proporcionar a completa formação do tecido *5:88.87, O campo interdisciplinar da engenharia de tecidos envolve a reparação ou regeneração de órgãos ou tecidos vivos, pelo recrutamento dos tecidos do próprio paciente. As células extraídas do paciente, são cultivadas sobre suportes tridimensionais feitos de materiais sintéticos ou naturais, para sua completa adesão e proliferação, para que com segurança, sejam reeinseridas no paciente. As etapas que envolvem a engenharia de tecido são sequencialmente: extrair as células do paciente, criar um meio fisiológico para seu crescimento, inseri-las na rede tridimensional, verificar sua proliferação e adesão e para por fim fazer testes em animais com maior similaridade com o tecido humano. Esta sequencia de etapas esta ilustrada na Figura 10 88.89, 46 Figura 10 - Etapas da Engenharia de Tecidos. Tecido Doador Suporte Polimérico Cultura de Células in vitro Células Implante Estudo in vitro Fonte: Barbanti etal., 2005. Os polímeros biorreabsorvíveis, são muito utilizados no campo da engenharia de tecidos nos dias de hoje, pois possuem características como biocompatibilidade e bioabsorção quando aplicados em sistemas biológicos. Estes materiais biodegradáveis, podem se dissolve em fluidos corpóreos e geralmente eles são degradados por hidrólise 29.90, Os materiais poliméricos para aplicações biomédicas são capazes de substituir e permitir o crescimento e regeneração dos tecidos do corpo, de modo permanente, sem efeitos tóxicos. Em aplicações específicas, estes materiais são desenvolvidos para manter um equilíbrio entre as propriedades biomecânicas dos tecidos substituídos e os efeitos bioquímicos e biológicos da interação entre o material e o tecido reparado 9:90 49 kt=1-3(1-X5+2(1-X5) Equação (2) controle pelo transporte de massa externo, de acordo com a Equação 3: kt =X Equação (3) O modelo matemático representativo que envolve as três equações seguem de acordo com, X; sendo a fração reagida do sólido, k a constante cinética e t o tempo de reação. É importante ressaltar, como mencionado nos tópicos de cinética das reações e modelagem matemática, muitos fatores podem influenciar na determinação de quais reações são as controladoras (reações mais lentas). No caso das reações heterogêneas, os possíveis determinantes para a fase controladora, dentre eles estão: a temperatura, a pressão, a porosidade do material, a estrutura do material, os diferentes arranjos no estado sólido, a área exposta, a formação de camada de material reagido que dificulta acesso aos sítios reativos pelas espécies ativas, entre outros fatores 105.108,107, 2.11 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS COM VÁRIOS FATORES Um planejamento fatorial é uma ferramenta estatística de extrema importância para engenheiros e cientistas que pretendam melhorar o desempenho de um processo ou compreender, de forma rápida e eficiente, novos processos e o desenvolvimento de novos produtos. Quando queremos analisar vários fatores envolvidos em um processo, o planejamento fatorial permite analisar todas as combinações possíveis dos níveis e fatores envolvidos. Esta técnica permite, direcionar a pesquisa, indicar o tamanho da amostra a ser selecionada, fazer múltiplas comparações e, desta forma, analisar o experimento em relação as interações dos fatores, otimizando o tempo para analise de resposta de experimentos. O tipo mais simples de planejamento fatorial é planejamento com dois níveis, que permite analisar diversos fatores representados pela letra k, sendo portanto o fatorial de dois níveis representado por 2%. Este modelo é especialmente útil na etapa exploratória de uma pesquisa, permitindo estudar fatores qualitativos ou quantitativos 108-109, 50 3 MATERIAIS E MÉTODOS Neste capítulo, consta a metodologia para obtenção de nanopartículas de quitosana com alto grau de desacetilação para intensificar as propriedades já existentes neste biopolímero, possibilitando seu uso futuro no auxílio das etapas de cicatrização de queimaduras graves (de segundo grau profundas ou de terceiro grau). O estudo, durante a reação da desacetilação da quitosana, permitiu uma análise da cinética da reação verificando de acordo com os graus de desacetilação obtidos ao longo do tempo a modelagem matemática mais próxima da resposta real do experimento. A quitosana, obtida pela Sigma-Aldrich com alta massa molar (310000 - 375000 Da), originária da carapaça de crustáceos e com grau de pureza de 99%, de acordo com as informações fornecidas pela empresa Sigma-Aldrichê E, tendo portanto, uma estrutura de cadeias antiparalelas conforme o material a-quitina, seu grau de desacetilação (GD) de acordo com os dados de sua ficha técnica, era de 75%, e esta na forma de flocos com coloração amarelo claro. Para obtenção do aumento do grau de desacetilação, a quitosana foi submetida a reação em meio altamente alcalino com hidróxido de sódio com 98% de pureza na forma de pélets, fornecido também pela empresa Sigma-AldrichO. As reações de desacetilação da quitosana, foram feitas com o auxílio da ferramenta estatística experimental completo de dois níveis 2%, em que foram verificados os efeitos e as interações dos três fatores: concentração de NaOH, o tempo e temperatura. As análises para verificação dos graus de desacetilação obtidos foram feitos através de seus espectros obtidos por análise de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), Após a obtenção da quitosana com maior grau de desacetilação, um novo experimental completo 22 com três repetições no ponto central foi feito retirando 11 alíquotas no decorrer de seis horas de reação, variando a temperatura e a concentração de NaOH, para verificar o aumento do grau de desacetilação com o tempo, permitindo assim uma análise da cinética da reação heterogênea de desacetilação. Para a definição da modelagem matemática, foi necessário um estudo dos fatores envolvidos durante a reação heterôgenea da desacetilação da quitosana como: concentração de reagentes, porosidade do material, cristalinidade do material, 51 acessibilidade aos sítios reativos, fenômeno difusivo, tranferência de massa e a reação na interface entre o líquido que circunda o material. O modelo cinético definido foi adaptado para que se aproximasse do comportamento real para uma reação envolvendo a solução de hidróxido de sódio e as partículas porosas da quitosana. Após a verificação dos graus de desacetilação obtidos, as amostras com maior grau de desacetilação foram modificadas da forma de flocos finos para nanopartículas, pelo método de ultrassom. A quitosana para ser submetida ao ultrassom em diferentes tempos, foi colocada em solução tampão com acetato de sódio e acido acético glacial, ambos fornecidos pela empresa Sigma-Aldrichô e submetidas a diferentes tempos. A caracterização das nanopartículas de quitosana, foram feitas utilizando as análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), para verificar o diâmetro das particulas e a ocorrencia de agregação, pelo equipamento Zetasizer que permitiu verificar o potencial zeta (a carga das nanopartículas), o índice de polidipersão (uniformidade dos tamanhos das moléculas) e o diâmetro hidrodinâmico (tamanho médio das partículas), para três pHs diferentes. A estratégia experimental resumida para obtenção das nanopartículas de quitosana altamente desacetiladas, para uso futuro em queimaduras graves, que possam futuramente auxiliar de forma significativa nas etapas de cicatrização e evitar possíveis infecçoes. Seguem na Figura 10 as etapas principais envolvidas durante a etapa experimental: Figura 11 - Estratégia experimental. Desacetilação da quitosana em meio altamente alcalino, com variação da temperatura e tempo de reação. Análises dos resultados da triplicata do fatorial 23, em relação ao GD mediante os espectros obtidos por FTIR Caracterização das nanopartículas obtidas por MEV e pelo Acic itIa Análise para verificar a cinética da reação de desacetilação [e] quitosana, pelo fatorial 28, Modificação das partículas de quitosana desacetilada, para nanopartículas pelo método de ultrassom. 54 Figura 13 - Reação de desacetilação no balão volumétrico e equipamentos. Fluxo de entrada de Nitrogênio F; Condensador Termômetro Suspensão de quitosana em solução de NaOH aquosa Fluido térmico Chapa aquecedora Fonte: Autoria própria. Após o tempo determinado, de acordo com cada experimento feito do fatorial 23, a solução foi imediatamente filtrada a vácuo para interromper a reação. A quitosana, de cada experimento que ficou retida no filtro, foi lavada com água destilada até atingir pH neutro. Os filtros de todos os 24 experimentos, com a quitosana retida foram colocados em placa de Petri e submetidos à estufa por 48 h na temperatura de 40ºC 117,118,119, As amostras de quitosana obtidas foram, separadamente, trituradas utilizando- se um pistilo e um almofariz. O grau de desacetilação foi calculado após obtenção dos espectros, por espectroscopia na região do infravermelho, a partir das absorbância das bandas no infravermelho, nas frequências de 1655 cm! e da amida | do grupo acetil, e 3450 cm”! do grupo hidroxila, calculadas após correção da linha de base e a normalização dos espectros obtidos, usando a Equação 5 proposta por Domszy e Roberts 118,119,120 GD % = 100 - [(Atess/As4s0) * 75.2] Equação (5) 55 Para verificação dos graus de desacetilação obtidos, cerca de 1,5 mg de cada amostra de quitosana obtida após a reação de desacetilação foi dispersada em KBr devidamente seco e limpo. As amostras forma maceradas e posteriormente prensadas até adquirir a forma de uma pastilha para, então, serem submetidas à análise no espectômetro da marca SHIMADZU, modelo IRPRESTIGE-21, operado com média de 32 varreduras e resolução de 2 cm"! na região de 4000 — 700 cm”! 118,119,120 Após os resultados do planejamento experimental 23, foi feito um planejamento experimental 22 com três repetições no ponto central, de acordo com a Tabela 3, para verificar o aumento do grau de desacetilação no decorrer do tempo de seis horas. Nestes ensaios, foram retiradas 11 alíquotas para verificar a cinética da reação de desacetilação da quitosana, e posteriormente inserir uma modelagem matemática adequada que mais se assemelhasse ao comportamento dos experimentos 108:109,110, A modelagem matemática é uma representação por meio de equações, que possam se aproximar ao máximo do comportamento real do fenômeno estudado. No caso da reação heterogênea de quitosana, em que muitos fatores estão influenciando nos resultados obtidos, e é necessário um conhecimento mais detalhado a respeito da estrutura do material e como se comporta durante esta reação. Para isso, foi feito um estudo da estrutura da quitosana baseando-se no que já existe na literatura, sobre a cinética de desacetilação para a adEquação da modelagem utilizada. Tabela 3 - Planejamento fatorial 22. Experimentos Temperatura (*C) Conan ) de 1 - - 2 + - 3 - + 4 + + 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Desta forma, utilizou-se quitosana com alta massa molar e com grau de desacetilação inicial de 75%, onde as reações de desacetilação foram feitas com 56 soluções de NaOH, preparadas com água destilada e mantidas em repouso por 24 horas antes do uso, para sua total dissolução. Os experimentos foram planejados no tempo de seis horas com variações dos dois fatores envolvidos: concentração de NaOH e temperatura, com os níveis de acordo com a Tabela 4 118,119,120 Tabela 4 - Níveis dos fatores do planejamento fatorial 22 Níveis Fatores - 0 + Temperatura (*C) 80 95 10 Concentração de NaOH (%) 20 40 50 Para cada experimento do experimental 22, foi preparada uma solução com 350 mL de hidróxido de sódio (m/v), pré-aquecido, em balão volumétrico de fundo redondo de 500 mL onde uma alíquota de 10 mL foi retirada e adicionada ao béquer com que continha 7.0 g de quitosana. Em seguida, a mistura foi devolvida ao balão volumétrico, dando inicio a reação 118,119,120, O balão volumétrico de fundo redondo, onde ocorreu a reação de desacetilação da quitosana, foi previamente equipado com um termômetro, um condensador de refluxo, entrada de nitrogênio, envolto por fluido térmico dentro de um béquer sob chapa aquecedora e utilizando agitador magnético dentro da solução de NaOH e quitosana. O uso do béquer com fluido térmico sob a chapa aquecedora, permitiram que as soluções atingissem as temperaturas desejadas em cada reação como foi planejado no fatorial 2º 118,119,120, Durante a reação, onze alíquotas de 20 mL foram retiradas após os tempos de: 2 minutos, 4 minutos, 8 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos e 300 minutos. E por fim, quando atingiu os 360 minutos, o material restante retido no balão volumétrico foi imediatamente filtrado. Todas as alíquotas retiradas antes do tempo de 360 minutos, foram imediatamente filtradas a vácuo para interromper a reação 118:119,120,121, As quitosanas retidas nos filtros, foram lavadas com água destilada até atingir pH neutro. Os 11 filtros com as amostras com a quitosana retida foram colocados separadamente em placas de Petri e levados à estufa por 48 h na temperatura de 59 Figura 15 - Equipamento ultrassônico de ponteira. Ponteira utilizada imersa na Béquer de 10 mL solução. com solução tampão com quitosana Fonte: Autoria própria. 3.3 CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA E DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA As amostras de quitosana após a desacetilação foram submetidas à análise por espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), para verificar os graus de desacetilação obtidos, através da análise quantitativa e qualitativa dos espectros. Logo após a verificação do maior grau obtido, a amostra foi submetida ao ultrassom e em seguida, foram verificadas as dimensões das nanopartículas obtidas e a estabilidade das mesmas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), e pelo seu potencial zeta, diâmetro hidrodinâmico e índice de polidispersão utilizando o equipamento Zetasizer Nano. 60 3.3.1 Análise de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) A análise de espectroscopia na região do infravermelho é um método que permite analisar qualitativamente e quantitativamente a estrutura de materiais, pela interação da radiação eletromagnetica que incide sob os atomos e moléculas em constante movimentação. A condição necessária para que ocorra absorção desta radiação é que haja variação do momento de dipolo elétrico da molécula, como consequência de seu movimento vibracional ou rotacional. 128129 O campo elétrico alternante da radiação incidente, interage com a molécula em movimento, originando os espectros. De outra forma, pode-se dizer que o espectro de absorção no infravermelho tem origem quando a radiação eletromagnética incidente tem um componente com frequência correspondente a uma transição entre dois níveis vibracionais 130.131, A vibração dos átomos no interior de uma molécula, apresenta energia coerente com a região do espectro eletromagnético correspondente ao infravermelho (100 a 10000 cm"!). Os átomos em uma molécula nunca estão parados, onde as vibrações moleculares podem ser classificadas de acordo com suas vibrações em :deformação axial ou estiramento e deformação angular, onde as deformações angulares podem ser simétricas ou assimétricas 131132, A espectroscopia no infravermelho é considerada uma das técnicas analíticas mais importantes para análise de biopolímeros. Esta técnica, nos permite identificar compostos orgânicos e inorgânicos. Os espectros das amostras foram obtidos em um espectrômetro da marca SHIMADZU, modelo IR Prestige-21 representado na Figura 16. As amostras de quitosana foram preparadas de acordo com o item 3.1 de desacetilação da quitosana, em que menciona que as amostras foram separadamente misturadas com uma quantidade de 1,5 mg de KBr seco e limpo, cada mistura foi macerada e prensada para adquirir a forma de uma pastilha. O espectro foi registrado no espectômetro com a média de 32 scans com resolução de 2 cm! na região de 4000 — 400 cm"! 133,134,135, 61 Figura 16 - Espectrômetro da marca Shimadzu, modelo IR Prestige - 21. Fonte: Autoria própria. 3.3.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) O método de microscopia eletrônica de varredura (MEV) é utilizado para observar a morfologia interna de materiais nanoestruturados, em que é possível verificar o tamanho das partículas obtidas e sobretudo verificar se partículas estão agregadas. A imagem obtida é formada pela incidência de um feixe de elétrons promovendo a emissão de elétrons secundários, representando o mapeamento e a contagem de elétrons secundários e retroespalhados emitidos pelo material 138.137,138, O MEV é um aparelho que pode fornecer de forma rápida, o diâmetro dos materiais nanoestruturados estudados e identificar os elementos químicos que compõem o material em estudo. Este equipamento, garante uma imagem de alta resolução para materiais com valores de até 1 nanômetro de diâmetro, suas imagens permitem grande profundidade de foco com aparência tridimensional !37.138,139, Para analisar as nanopartículas de quitosana pelo método de microscopia eletrônica de varredura, o filamento de tungstênio foi operado em uma faixa de tensão de operação de 20 kV, a soluções tampão com as nanopartículas de quitosana foram separadamente gotejadas em lâminas de silicio logo após serem submetidas ao tempo determinado de ultrassom, e colocadas sobre placa de Petri para sua completa secagem em uma estufa a vácuo, temperatura de 40ºC, durante 24 horas como representada na Figura 17 na imagem A e B. Pouco tempo antes de ser analisada, as amostras foram recobertas com uma fina camada de ouro possibilitando a análise de suas estruturas 199140,141. 64 degradação de partículas. Índices de polidispersão podem variar de O a 1, e os índices acima 0,3 são de soluções com partículas com grande variedade de tamanhos e abaixo deste valor soluções monodispersas 148147, Esta técnica de espalhamento de luz é amplamente utilizada para a avaliação das dimensões de nanopartículas ou micropartículas em suspensão, dependendo dos valores dos característicos índices de polidispersão, podem ser caracterizados pelas formas nano esféricas ou nanocápsulas, sendo sua medição baseada que quando uma partícula é iluminada por uma fonte de luz, como um LASER (light amplification by stimulated emission of radiation). Essa partícula irá espalhar luz em todas as direções possibilitando analisar-se o movimento da partícula, movimento este que é a causa das flutuações da intensidade 48.149. Para a análise do diâmetro hidrodinâmico (que indica o tamanho médio das partículas), índice de polidispersão das nanopartículas e o potencial zeta, foram realizados utilizando o equipamento de espalhamento de luz dinâmico Nano- Zetasizerr — ZS, modelo ZEN3600 - Malvern Instruments mostrado na Figura 19. O equipamento opera com espalhamento de luz de 90º, na temperatura de 25ºC, utilizando a própria solução tampão como dispersante feita com água Milli-Q com viscosidade de 0,8872 cP e índice de refração de 1,33. 148149, Figura 19 - Equipamento Zetasizer, modelo ZEN3600 da Malvern Instruments. Fonte: Autoria própria. 65 Para a caracterização das nanopartículas quanto ao tamanho hidrôdinâmico e polidispersão (PDI), e potencial zeta de cada amostra foi transferida uma alíquota de 25,0 uL para uma cubeta de poliestireno com 1,0 cm de caminho óptico. Cada análise foi realizada em triplicata, sendo que cada análise representa a média de 12 leituras em cada ponto, e os dados foram tratados com o software Zetasizer 7.11. Segue as cubetas para análise de potencial zeta e para análise de diâmetro hidrodinâmico na Figura 20 separadas em A e B 1ºº. Figura 20 - Cubeta para potencial zeta na imagem A e cubeta para diâmetro hidrodinâmico na imagem B. Fonte: Autoria própria. É importante mencionar que as cubetas com a solução devem estar isentas de bolhas de ar, pois podem interferir nos resultados, e deverm estar secas ao redor em especial a de potencial zeta, pois pode interferir na precisão dos resultados. Após confirmadas a isenção de bolhas foram feitas as análise no equipamento Zetasizer. 66 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES Neste capítulo, constam os resultados dos graus de desacetilação obtidos no planejamento fatorial 2º e no planejamento fatorial 22. Em que, com os resultados do fatorial 22 foi possível verificar um padrão de comportamento em todas as reações de acordo com os graus de desacetilação obtidos e podendo portanto analisar a cinética da reação. Os resultados dos graus de desacetilação foram verificados no decorrer de seis horas nos sete experimentos permitindo verificar boa repetibilidade na triplicata do ponto central e portanto confiabilidade nos resultados. O modelo que mais se aproximou do comportamento real da evolução do grau de desacetilação com o tempo, para a reação de desacetilação, foi o modelo do núcleo não reagido. Em paralelo ao estudo da cinética da reação da desacetilação da quitosana, foram analisados os resultados das amostras de quitosana após serem submetidas ao método de ultrassom bem como a verificação do tamanho na escala nanométrica logo após os tempos de sonicação. Em todos os 31 experimentos (planejamento fatorial 22 com três repetições no ponto central e o fatorial 2%), as amostras de quitosana, foram inseridas no espectômetro da marca SHIMADZU, para gerar seus espectros analisa-los quantitativamente e qualitativamente. Todos os espectros foram corrigidos para mesma linha de base e os excessos de ruídos foram trabalhados para melhor visualização dos picos. 4.1 RESULTADOS E DISCUSSÕES REFERENTE AO FATORIAL 2º Os resultados dos graus de desacetilação são inferidos dos espectros obtidos nos 24 experimentos. Seguem a seguir os comentários referentes aos graus de desacetilação obtidos e a análise estatística utilizando o software MINITAB17. Antes das Figuras dos espectros obtidos, segue o espectro referente ao experimento oito, em que foram utilizados, os valores máximos de temperatura, concentração de hidróxido de sódio e tempo de reação, como representativo para demonstrar os grupos químicos associados característicos da quitosana mostrados na Figura 21. Lembrando que as bandas de referência da amida |, e do grupo hidroxila também foram verificados no espectro e demarcados em círculos verdes. Figura 23 - Espectros FTIR deslocados dos oito primeiros experimentos do fatorial 2º 69 g 5 075 s e 05 «my L 2 0.25 O «4 0 Experimento 1 xperim - Experimento 3 - Experimento 4 Experimento 5 Experimento 6 - Experimento 7 — Experimento 8 2000 1500 Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. Na duplicata e na triplicata genuína (seguindo todas as sequencias do experimento do fatorial 2%), foi possível verificar as bandas de referência representadas também pelas setas azuis, sendo a banda que não se altera com o aumento do grau de desacetilação (As450), e a banda de referência que se altera com a retirada dos grupos acetil (Atess), permitindo o cálculo do grau de desacetilação por -sameio da Equação 5. Figura 24 - Espectros FTIR sobrepostos da duplicata genuína do fatorial 2º. o o E a Absorbância (u.a.) o o Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 — Experimento 4 - Experimento 5 - Experimento 6 — Experimento 7 — Experimento 8 1s5to 10bo Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. 70 Figura 25 - Espectros FTIR deslocados da duplicata genuína do fatorial 2º. — Experimento 1 Experimento 2 | Experimento 3 A) - 0.6 A - Experimento 4 g NA Experimento 5 3 04 | A Experimento 6 s E | — Experimento 7 & 02 | sa Experimento 8 e ' = 8 8 o « -0.2 3000 2000 1500 1000 do do Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. Nos resultados da duplicata nas Figuras 24 e 25, foi possível verificar um aumento de ruído nos espectros, sendo que todos os espectros dos 24 experimentos foram analisados cinco vezes cada amostra, para se ter certeza do espectro obtido em dias diferentes, e a confirmação dos graus de desacetilação obtidos. É importante mencionar, que ainda assim, alguns fatores podem ter influenciado nos resultados, como a umidade do ar, tratamento para formação da pastilha no que se refere à proporção ideal entre quitosana e KBr e a secagem adequada do material. Figura 26 - Espectros FTIR sobrepostos da triplicata genuína fatorial 2º Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 — Experimento 4 Experimento 5 Experimento 6 — Experimento 7 — Experimento 8 o o Absorbância (u.a.) o o N a o 30b0 2o0b0 15to 1obo ado sdo Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria 71 Figura 27 — Espectros FTIR deslocados da triplicata genuína do fatorial 2º. Experimento 1 ú Experimento 3 - Experimento 4 q 06 Experimento 5 3 Experimento 6 Ss o4 — Experimento 7 s — Experimento 8 2 oz 5 p 8 < o -0.2 2000 1800 Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. Após a obtenção dos espectros, verificaram-se os graus de desacetilação obtidos, em que foi possível fazer uma análise inicial da influência dos fatores envolvidos. Somente após uma análise estatística foi possível verificar a verdadeira influência de cada um dos fatores. No entanto, inicialmente foi possível verificar que os maiores graus de desacetilação foram obtidos nos experimentos na temperatura de 110 *C, na concentração de NaOH de 60% e tempo de reação de 6 horas. De acordo com os resultados que constam na Tabela 5, foi possível identificar que ocorreu uma repetibilidade efetiva nos resultados em triplicata, em que ao refazer os experimentos com os mesmos níveis dos fatores envolvidos, os resultados obtidos foram muito próximos, comprovando posteriormente nos resultados estatísticos a real repetibilidade na triplicata. As ordens aleatórias dos experimentos, podem ser também verificadas na Tabela 5. Os resultados dos graus de desacetilação obtidos foram um pouco acima da faixa encontrada na literatura em torno de 85%, partindo de uma quitosana de GD de 75. No entanto, de acordo com referências, a reação de desacetilação sob gás inerte de N> provavelmente influenciou no aumento dos graus de desacetilação obtidos, pois o uso do gás inerte diminui a despolimerização que ocorre durante a reação sob altas temperaturas e em soluções altamente alcalinas, facilitando o processo difusivo da solução alcalina aos sítios reativos. Isso foi comentado nos resultados encontrados 74 No gráfico de probabilidade normal de resíduos, os pontos devem estar mais próximos da linha contínua. Desta forma será validada a suposição de normalidade dos resíduos. De acordo com os resultados obtidos pelo MINITAB17, o gráfico de probabilidade normal analisando os resíduos dos 24 experimentos do fatorial 2º, apresentou os pontos bem próximos de uma linha reta como pode ser verificado na Figura 30. Figura 30 - Gráfico de probabilidade normal de análise de resíduos. Normal Probability Plot 99: E E * 8 so) Ê 104 . 1 2 4 0 1 2 Standardized Residual Fonte: Autoria própria. Após a verificação dos resíduos distribuídos normalmente, é possível afirmar que 95% cairão no intervalo entre (-2,+2) como pode ser visualizado na Figura 31, constatando que há ausência de outliers, que são pontos muito fora dos demais, dando a certeza que o procedimento experimental está correto dentro dos fatores necessários que influenciam significativamente o grau de desacetilação obtido. No gráfico demonstrado na Figura 32, é possível verificar que não existe padrão de comportamento dos resultados dos resíduos, podendo concluir que a variância dos erros é constante. Desta forma, garante uma maior confiabilidade nos resultados do experimental completo 2% que envolve a triplicata genuína dos resultados. 75 Figura 31 - Gráfico que demonstra ausencia de outliers. Versus Fits -n 2 q q “a. + º ê * a. q “ a [=] » + a] 4 & + e “ Ê . a . so Bs 55 ss so Fitted Value Fonte: Autoria própria. Figura 32 - Análise da variância de resíduos. Versus Order Standa dized Residual 2 4 6 B 10 12 14 16 18 20 22 24 Observation Order Fonte: Autoria própria. Dentro do nível de significancia de 5%, foi possível verificar no diagrama de pareto os efeitos e interações entre temperatura, concentração de NaOH e tempo de reação. Na teoria os três fatores têm influência; no entanto, na prática, a influência mais significativa na obtenção do maior grau de desdacetilação foi o tempo de reação 76 e posteriormente, a temperatura. Em relação as interações entre os fatores, concentração de NaOH e tempo de reação a influência foi muito baixa, assim como entre temperatura e tempo de reação. Por outro lado, não ocorreu interação alguma entre temperatura e tempo de reação e entre os três fatores. A representação do diagrama segue na Figura 33 onde pode ser verificado as afirmações acima comentadas. Figura 33 - Diagrama de pareto do Fatorial 23. Pareto Chart of the Standardized Effects (response is Grau de Desacetilação; « = 0,05) Factor Name A Temperatura (* C) 5 Concentração de NaOH e Tempo (Horas) 5 o 15 20 25 Standardized Effect Fonte: Autoria própria. Para confirmação dos efeitos principais e das interações entre os fatores, foram feitas novas análises separadamente pelo software MINITAB17. Em que foi possível confirmar que o efeito proncipal para o resultado dos maiores graus de desacetilação obtidos foi o tempo de reação, tendo a temperatura também sua relevância, ainda que em menor proporção. Na reta que consta desenhada no gráfico da Figura 34, relacionando o grau de desacetilação obtido com o tempo de reação, foi possível observar os maiores rendimentos. 79 Figura 37 - Gráfico de contorno da temperatura com a concentração de NaOH do fatorial 23. 10 Grau de Desacetilação «a & 8 % O 0 so e Ss E Ê E o e Bo, 2 30 “0 so Concentração de NaOH 8 Fonte: Autoria própria. No gráfico de contorno da temperatura (ºC) com o tempo de reação (horas) mostrado na Figura 38, é possível ver a evolução do grau de desacetilação em relação em quatro faixas de tonalidades de verde alcançando a faixa máxima, onde existe uma interação entre estes dois fatores de maior relevância, um pouco maior do que os outros fatores estudados neste experimento. De fato, os maiores resultados do grau de desacetilação foram obtidos nos maiores níveis de temperatura e de tempo de reação. Figura 38 - Gráfico de contorno do tempo de reação com a temperatura do fatorial 2º. Grau de Desacetilação <a 105 “% o ms ms -8 [ E mn - 90 > 90 8 Temperatura (ºC) s s 1 2 3 4 5 6 Tempo (Horas) Fonte: Autoria própria. 80 A superfície de resposta é uma técnica estatística utilizada para a modelagem e análise no fatorial completo, em que a variável resposta é influenciada pelos fatores envolvidos e com o objetivo de uma otimização da resposta. O deslocamento se dá sempre ao longo do caminho de máxima inclinação de um determinado modelo, que é a trajetória na qual a resposta varia de forma mais pronunciada. É possível verificar na Figura 39 a superfície de resposta entre o tempo e a temperatura com a maior inclinação nos níveis máximos. Figura 39 - Superfície de resposta (tempo x temperatura x GD) do fatorial completo 2º. so Grau de Desacetilação u no “ o Temperatura CO) a so Tempo (Horas) Fonte: Autoria própria. O deslocamento ocorre ao longo do caminho de máxima inclinação de um determinado modelo já que nas figuras obtidas não ocorreram uma curvatura significativa, que é a trajetória na qual a resposta varia de forma mais pronunciada, no entanto é possível verificar que na superfície de resposta entre os fatores concentração de NaOH e temperatura a superfície praticamente não ocorreu inclinação, ficando um plano reto, onde os efeitos destes fatores não influenciam de forma significativa nos resultados para encontrar o ponto ótimo dos experimentos. É possível verificar na Figura 40 a superfície de resposta entre o tempo e temperatura a maior inclinação nos níveis máximos. 81 Figura 40 - Superfície de resposta (concentração de NaOH x temperatura x GD) no fatorial completo 2º. Grau de Desacetilação *” a no “ 0 Temperatura (º O) Concentração de Na0H Fonte: Autoria própria. Na Figura 41, é possível verificar que a superfície de resposta entre o tempo e concentração de NaOH tiveram uma leve inclinação, tendo o ponto ótimo para os níveis máximos de ambos os fatores. Figura 41 - Superfície de resposta (tempo x Concentração de NaOH x GD) no fatorial completo 23. Grau de Desacetilação *7 a a 2 a Tempo (Horas) Fonte: Autoria própria. 84 Tabela 6 - Resultados do planejamento do fatorialexperimental 22 com tres repetiçoes no ponto central Ordem real a dos Experimentos Temperatura (ºC) Conceniao de NaOH experimentos 4 1 so 20 2 2 110 20 3 3 80 60 1 4 110 so 5 5 95 40 6 5 95 40 , 7 95 40 Nos primeiros 11 resultados dos espectros, foi possível verificar um aumento dos graus de desacetilação ao longo do tempo nos primeiros quarenta minutos iniciais de reação e após cerca de sessenta minutos os resultados tenderam a estabilizar . Estes resultados estão de acordo com os resultados dos artigos de referência sobre a cinética da desacetilação da quitosana como: (Jiang e Xu, 2006; Cardoso, 2008; Lamarque et al., 2004; Ahlafi et al., 2013; Chen et al., 2004; Martinou et al., 1995; Methacanon et al., 2003; Chang et al., 1997; Chebotok et al, 2006; Martins, 1995, Martins et al, 1995; Yaghobi e Hormozi, 2010; Liu et al, 2008). Figura 43 - Espectros FTIR da quitosana sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 1 do fatorial 22 Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. Espectro após 10min Espectro após 60 min. Espectro após 120 min. Espectro após 180 min. Espectro após 240 min. Espectro após 300 min. Espectro após 360 min. Absorbância (u.a.) Eu 30b0 20b0 1550 10bo ado edo Número de ondas (cm?) Fonte: Autoria própria. 85 Na Figura 43 onde esta demonstrado os espectros das 11 alíquotas do experimento 1, demarcados em setas azuis o grupo acetil da Amida | (Ar6ss) e o grupo hidroxila (As4s0), esta demonstrado os espectros sobrepostos para verificação da banda do grupo acetil que se altera e do grupo hidroxila que se mantém constante, e na Figura 44 os espectros estão mais separados e portanto deslocados para melhor verificação dos picos principais característicos da estrutura da quitosana. Figura 44 - Espectros FTIR da quitosana deslocados das 11 alíquotas do experimento 1 do fatorial 22. Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. Espectro após 10min. Espectro após 20 min. Espectro após 60 min. Espectro após 120 min. N Espectro após 180 min. Espectro após 240 mi Espectro após 300 mi | Espectro após 360 Absorbância (u.a.) o 3000 2000 1800 1000 ado edo Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. Figura 45 - Gráfico da evolução dos graus de desacetilação da quitosana referente às 11 alíquotas do experimento 1. 8600 8400 + 8200 + 8000 | É 7800 76,00 Grau de Desacetilação (%) 7800 + o so 100 150 200 250 300 350 400 Tempo (minutos) Fonte: Autoria própria. 86 No gráfico da Figura 45, as 11 alíquotas do experimento 1 do fatorial completo 22 pode ser verificado a alta velocidade inicial com que ocorre a reação de desacetilação da quitosana, e que os resultados dos GD obtidos foram os mais baixos entre os sete experimentos executados no fatorial 22 com três repetições no ponto central, onde foi feito com os níveis mínimos de concentracão de NaOH e temperatura. Na Figura 46 com os 11 espectros sobrepostos, referentes ao segundo experimento do fatorial completo 22, apartir dos resultados foi possível verificar que os valores dos graus de desacetilação obtidos foram um pouco mais altos do que do primeiro experimento, estes dados podem ser confirmados na Tabela 6. Nos espectros da mesma figura 46, podem ser verificados as bandas utilizadas para o cálculo do grau de desacetilação utilizadas com o uso da Equação 5, Asess e À 3450. Na Figura 47 mostra os espectros os espctros deslocados para melhor vizualização de seus picos. Figura 46 - Espectros FTIR da quitosana sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 2 do fatorial 22 Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. 10min. Espectro após 60 min. Espectro após 120 min. Espectro após 180 min. Espectro após 240 min. Espectro após 300 min. Espectro após 360 min. o o Absorbância (u.a.) o o Do E 3060 7” 20b0 1560 bo” "Tedo” "Todo" Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. 89 No gráfico 4 da Figura 51 referente aos resultados das alíquotas do experimento 3 do fatorial completo 22 pode-se verificar novamente a alta velocidade inicial com que ocorre a reação de desacetilação assim como no experimento 1 e 2, demonstradando um padrão de comportamento de reação da desacetilação e a evolução dos graus de desacetilação das 11 alíquotas do experimento 3. Figura 51 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação da quitosana referente as 11 alíquotas do experimento 3. E8,00 86,00 o . . . + 8400) 4 * 82,00 80,00 78,00 76,00 Grau de Desacetilação ( %) 74,00 o so 100 150 200 250 300 350 400 Tempo (Minutos) Fonte: Autoria própria. A seguir na Figura 52 com os 11 espectros referentes ao quarto experimento do fatorial completo 22, a partir dos resultados foi possível verificar os maiores valores de graus de desacetilação devido ao uso dos níveis máximos de temperatura e concentração de hidróxido de sódio. As setas azuis indicando as bandas de referência utilizadas na Equação 5 para cálculo dos graus de deaacetilação, onde os espectros estão sobrepostos, enquanto na Figura 53 os gráficos estão deslocados para a melhor verificação dos grupos funcionais característicos da quitosana. 90 Figura 52 — Espectros FTIR da quitosana sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 4 do fatorial 22 Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. Espectro após 10min. Espectro após 20 min v os Espectro após 60 min. 3 Espectro após 120 s Espectro após 180 D 06 Espectro após 240 s Espectro após 300 E 04 Espectro após 360 min. a & 0.2 o ' "TT aobo”"”" 20b0 15to 10bo” " “edo” "Tedo” ” Número de ondas (cm?) Fonte: Autoria própria. Figura 53 - Espectros FTIR da quitosana deslocados das 11 alíquotas do experimento 4 do fatorial 22. Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 Espectro após 101 Espectro após Espectro após 60 min. q Espectro após 120 min. s Espectro após 180 min. > Espectro após 240 min. o os Espectro após 300 min. e Espectro após 360 min. g 2 0º o « 0.5 3000 2000 1500 1000 ado edo Número de ondas (cm?) Fonte: Autoria própria. No gráfico 5 da Figura 54, referente aos resultados das alíquotas do experimento 4 do fatorial completo 22 podem ser verificados novamente a alta velocidade inicial com que ocorre a reação de desacetilação assim como no experimento 1, 2 e 3 demonstradando um padrão de comportamento de reação da desacetilação que permiti um estudo para aplicação de uma modelagem matemática adequada. 91 Figura 54 — Gráfico da evolução dos graus de desacetilação da quitosana referente as 11 alíquotas do experimento 4. 82,00 90,00 86,00 84,00 82,00 ++ 80,00 78,00 Grau de Desacetilação (%) + 76,00 88,00 + 74,00 + o 50 100 150 200 250 300 350 400 Tempo (Minutos) Fonte: Autoria própria. Seguem os espectros da triplicata do ponto central, referente aos experimentos 5,6 e 7, mostrando que os resultados tiveram uma grande semelhança de resultados e que os resultados tiveram graus de desacetilação após os 360 minutos em torno de 86%, nas Figuras 55,57 e 59 os espectros sobrepostos, e nas Figuras 56, 58 e 60, os espectros deslocados. Figura 55 - Espectros FTIR da quitosana sobrepostos das 11 alíquotas do experimento 5 do fatorial 22 Absorbância (u.a.) o » Quitosana al Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. Espectro após 10min. Espectro após 20 min Espectro após 60 min. Espectro após 120 min. Espectro após 180 min. Espectro após 240 min. Espectro após 300 min. Espectro após 360 min. 2obo 15to 10ho Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. 94 Figura 60 — Espectros FTIR da quitosana deslocados das 11 alíquotas do experimento 7 do fatorial 22 Quitosana inicial Espectro após 4 min. Espectro após 8 min. Espectro após 10min. Espectro após 20 min. Espectro após 60 min. Espectro após 120 min. - Espectro após 180 min. S Espectro após 240 min. 3 os Espectro após 300 min. o Espectro após 360 min. o e g 2 o S a 8 « -05 3000 2000 1500 1000 são sdo Número de ondas (cm!) Fonte: Autoria própria. Segue o gráfico com os resultados da triplicata genuína do ponto central na Figura 61, onde os primeiros quarenta minutos ocorreu o aumento do grau de desacetilação com alta velocidade e estabilizando a partir de sessenta minutos até atingir o tempo de seis horas de reação. Após os resultados obtidos, foi possível concluir que o comportamento do aumento do grau de desacetilação segue um padrão de cinética para os sete experimentos estudados, permitindo assim a aplicação de uma modelagem matemática adequada. Figura 61 - Gráfico da evolução dos graus de desacetilação da quitosana das 11 alíquotas da triplicata. 8800 x eso q 8 o ã a 84,00 ç a s O Experimentos o 82,00 a g a Dbpeimentos a so 3 o 78,00 £ Ê 4 Experimento? 3 Ts 76,00 S a 74,00 o 50 100 150 200 250 300 350 400 Tempo (minutos) Fonte: Autoria própria. 95 Na Tabela 7, constam os resultados das 11 alíquotas retiradas nos sete experimentos, referentes ao planejamento experimental 22 com três repetições no ponto central e logo abaixo no gráfico da Figura 62, é possível visualizar todos os pontos referentes as alíquotas retiradas em todos os sete experimentos, permitindo verificar o comportamento dos resultados seguem um padrão de comportamento com aumento significativo do GD, nos sessenta minutos iniciais e depois estabilizam. Tabela 7 - Resultados dos graus de desacetilação da quitosana das 11 alíquotas retiradas durante os sete experimentos do fatorial 22 com três repetições no ponto central Tempo (Min) Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4 Experimento 5 Experimento 6 Zyperimento 7 0 1310 1340 1340 1340 1340 1510 7310 2 Ta 7818 7840 1% TT 4 TI 4 7840 1915 8096 19% 7822 7840 7805 8 1910 8050 816 8015 7989 98 ENT 10 80,00 8150 2 8110 8099 81,00 8105 Pi) 80,80 8301 8 8325 8177 8187 8187 4 8190 8380 uu 8545 82% 829 83,00 60 8290 8452 85,00 8750 8390 8390 8382 1% 83,00 85,88 85,0 8810 8510 84 849 180 8410 8683 85,88 8895 8990 85,10 8577 24 84 8715 E 8899 8650 8690 8708 3 8522 87.98 8590 8937 868 8710 8117 E 8522 88,02 EX 8941 8085 871 8723 De acordo com os resultados apresentados na tabela acima, foi possível verificar os melhores resultados no experimento 4, onde foi utilizado a máxima concentração de NaOH e temperatura máxima de 110ºC, e que o resultado com o valor de grau de desacetilação mais baixo foi o obtido no experimento 1 nos níveis mínimos dos dois fatores envolvidos. 96 Figura 62 - Gráfico dos resultadosdos graus de desacetilação da quitosana dos sete experimentos do fatorial 22. 92,00 - sogo " = E E + Experimento 1 a 8800 E E E E BExperimento 2 o E 5 n k H f A Experimento 3 & 8500 ” : g 4 A z à + + + Mesperimento 4 v 8400 a o . q MEsperimento 5 É jubas â BO/.E + o Experimento 6 +. $ 2000 BEsperimento 7 3 q 6 7800 7600 7400 + T T T T T T T 1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Tempo (Min.) Fonte: Autoria própria. Após a comparação de resultados do fatorial 22, com o fatorial feito anteriormente 2º foi possível verificar que em ambos os fatorias, os melhores resultados foram obtidos utilizando os níveis máximos de concentração de NaOH e temperatura de 110ºC no tempo de seis horas de reação durante a desacetilação da quitosana, permitindo concluir uma grande confiabilidade nos resultados. Através da análise estatística utilizando o software MINITAB17, foi possível verificar que o efeito principal foi da temperatura e que as interações entre os fatores concentração de hidróxido de sódio e da temperatura que ocorreu a reação, nos sete experimentos estudados do fatorial completo 22 foram baixos. Inicialmente foi plotado os resultados referente a cada experimento nos eixos, e no centro a média dos resultados da repetição do ponto central. Na Figura 63 que segue, é possível verificar com maior clareza, que o maior resultado ocorreu nos níveis máximo dos dois fatores envolvidos.