Extração de Compostos Fenólicos a Partir da Casca de Dióspiro, Notas de estudo de Materiais

Baixe Extração de Compostos Fenólicos a Partir da Casca de Dióspiro e outras Notas de estudo em PDF para Materiais, somente na Docsity! 1 Operações Unitárias em Biotecnologia Docente: Inês Seabra Licenciatura em Biotecnologia Extração de Compostos Fenólicos a Partir da Casca de Dióspiro João Pereira 20150267 Mafalda Galvão 20140309 Patrícia Maia 20150241 Coimbra, 2018 Índice Resumo ................................................................................................................................... 3 Abstract ................................................................................................................................... 4 1- Introdução .............................................................................................................................. 5 1.1 Dióspiro ............................................................................................................................... 5 1.2 Compostos fenólicos ........................................................................................................... 6 1.2.1 Descrição geral ............................................................................................................. 6 1.2.2 Compostos presentes no dióspiro ................................................................................ 7 1.3 Fundamentos teóricos da extração sólido-líquido convencional ..................................... 10 1.3.1. Principais parâmetros que influenciam o rendimento de uma extração ................. 11 1.4 Objetivo ............................................................................................................................. 12 2- Materiais e Métodos ........................................................................................................... 12 2.1. Preparação da matéria-prima e determinação da humidade pelo método gravimétrico ................................................................................................................................................. 12 2.2. Extração sólido-liquido ..................................................................................................... 13 2.2.3. Cálculo do rendimento da extração .......................................................................... 14 2.3 Teor de compostos fenólicos no extrato .......................................................................... 15 2.3.2. Preparação das soluções ........................................................................................... 15 2.3.3. Preparação dos extratos para análise ....................................................................... 15 2.3.4. Construção da reta de calibração .............................................................................. 15 2.3.5. Análise das amostras de extrato ............................................................................... 16 2.4. Atividade antioxidante usando o radical DPPH ................................................................ 17 3 - Resultados e Discussão ........................................................................................................ 18 4 - Conclusão............................................................................................................................. 20 Referências Bibliográficas ......................................................................................................... 21 Anexos ...................................................................................................................................... 22 5 1- Introdução 1.1 Dióspiro O dióspiro Diospyros kaki L., é uma baga da família das Ebenaceae (Tabela 1), por excelência do Outono. Tem geralmente uma forma esférica, mais ou menos achatada, dependendo da sua variedade de cor avermelhada ou amarelo-alaranjada, consoante o seu conteúdo em carotenos (OMAIAA, 2011). Tabela 1- Quadro alusivo à classificação botânica do dióspiro. (UTAD,2017) Originário a Este da Ásia, mais exatamente da China, o dióspiro difundiu-se para a Índia e para o Japão, onde se cultiva desde o século XVII, adaptando-se bem em clima temperado ou até mesmo mediterrâneo (OMAIAA, 2011). Com o passar do tempo, irradiou-se também pelos cinco continentes. No entanto, Itália, Espanha, Coreia, Japão e China, atualmente, são os principais países produtores deste fruto (Ferrão, 1999). De acordo com a Direção Regional de Agricultura e Pescas do Algarve (2011), as exportações do fruto são praticamente nulas, sendo que cerca de 95% dos dióspiros à venda em Portugal provêm de Espanha. No que toca à produção nacional, cerca de 85% a 90% destina-se aos mercados abastecedores dos grandes centros urbanos e 5% a 10% às grandes superfícies de venda. Na região do Algarve, existe alguns pomares, mas a maioria do dióspiro é proveniente de árvores dispersas ou em bordadura, espalhadas por todo o país (DRAPA,2011). Os produtores algarvios têm intenção de apostar no mercado externo, nomeadamente em França e Itália (OMAIA,2011). Na região norte do pais, esta cultura não assume importância comercial devido à baixa quantidade de produção e organização comercial deste fruto (DRAPA, 2011). Reino: Plantae Divisão: Spermatophyta Classe: Magnoliopsida Ordem: Ericales Família: Ebenaceae Espécie: Diospyros kaki L. 6 O dióspiro tem diversas aplicações, sendo que as principais são: comercialização dos frutos, para fabricação de compotas (Serralves, 2017) e por último, na produção de uma espécie de água ardente – Saqué – usado no Japão. Segundo OMAIAA (2011), habitualmente, o fruto do diospireiro é constituído só por polpa, de aparência gelatinosa e fria, composta basicamente de mucilagem e pectina (responsáveis pela aparência característica da fruta). Também na sua constituição consta, principalmente, a água, sais minerais como: potássio, cálcio, fósforo, ferro, vitaminas (A, B1, B2 e C); carotenos, hidratos de carbono, sobretudo frutose. Ainda no seu conteúdo, há a presença de um elevado numero de taninos, o que faz com que nós diferenciemos os frutos adstringentes dos não-adstringentes. (OMAIAA,2011) 1.2 Compostos fenólicos 1.2.1 Descrição geral Os compostos fenólicos são metabolitos secundários que estão nas plantas (Lattanzio, 2013). São uma parte essencial da dieta humana e são de especial interesse pelas suas propriedades antioxidantes que podem variar pela estrutura, principalmente pelo número e posição dos grupos hidroxilos (Balasundram et al, 2006). Os antioxidantes podem ser divididos em dois grupos: o grupo com atividade enzimática e o grupo sem atividade enzimática. No primeiro grupo estão, as enzimas que removem os compostos que reagem ao oxigénio. No segundo grupo, estão moléculas que interagem com as espécies radiculares e são consumidas durante a reação. Assim, podem se classificar antioxidantes naturais e sintéticos como compostos fenólicos. (Angelo & Jorge, 2007) De acordo com Shaidi & Naczk (2004) os compostos fenólicos funcionam como antibióticos, pesticidas naturais, e agentes protetores contra a luz UV. Segundo Balasundram (2006) estes compostos possuem um anel aromático com grupos hidroxilos, e as suas estruturas podem variar entre uma molécula simples a moléculas complexas. Existem cerca de mil fenóis, destacando-se os flavonóides, ácidos fenólicos, taninos, 7 fenóis simples, proantocianidinas, entre outros, onde os três primeiros são os antioxidantes mais comuns de origem natural. 1.2.2 Compostos presentes no dióspiro Segundo Terry (2011) o dióspiro pode ser dividido em dois tipos, adstrigente e não adstrigente. Ambos ricos em compostos fenólicos, principalmente ácidos fenólicos nomeadamente ácido cafeico e ácido clorogénico, taninos e flavonóides. O total de compostos que pode ser observado é de 1,45 mg/ 100g (Butt, 2015). 1.2.2 a) Ácidos fenólicos De acordo com Soares (2002) os ácidos fenólicos estão divididos em três grupos: benzóicos, cinâmicos e cumarinas. Os ácidos benzóicos possuem sete átomos de carbono (C6-C1) e são os mais simples. Os ácidos cinâmicos possuem nove átomos de carbono (C6-C3), e encontram-se facilmente nas plantas. É nos ácidos cinâmicos que podemos encontrar o ácido cafeico. (Fig.1) Classe Estrutura Fenólicos simples, benzoquinonas C6 Ácidos hidroxibenzóicos C6-C1 Acetofenol, ácidos fenilácéticos C6-C2 Ácidos hidroxicinâmicos, fenilpropanóides C6-C3 Naftoquinonas C6-C4 Xantonas C6-C1-C6 Estilbenos, antoquinonas C6-C2-C6 Flavonóides, isoflavonóides C6-C3-C6 Lignanas, neoliganas (C6-C3)2 Biflavonóides (C6-C3-C6)2 Ligninas (C6-C3)n Taninos condensados (C6-C3-C6)n Tabela 2- Classe de compostos fenólicos em plantas (Angelo & Jorge, 2007) 10 Taninos condensados, ou proantocianidinas são polímeros de catequina ou seja são formados por uma ou mais unidades de flavanóis (Seabra, 2017) e os taninos hidrolisáveis são descompensáveis na água, reagem para criar outras substâncias. Segundo Porto (2002) possuem um núcleo central de glicose, estrificado com ácido gálico e hidrolisáveis com ácidos, bases ou enzimas. 1.3 Fundamentos teóricos da extração sólido-líquido convencional A extração sólido-líquido consiste na separação de um ou mais componentes de uma mistura sólida por meio de um solvente líquido (hidrófilo ou hidrofóbico, ácido, neutro ou básico). O objetivo de uma extração deste tipo, ou também conhecida por extração de fase sólida, é separar os analitos que estão dissolvidos ou suspensos numa mistura líquida, e seguidamente isolá-los de acordo com as propriedades físicas e químicas do analito em questão (Hielscher, s.d.). A esta técnica de isolar os analitos do solvente com outro solvente apropriado, denomina-se eluição. O material insolúvel pode ser separado por variados processos como a, filtração, a sedimentação e o vácuo. Segundo Hielscher (s.d.), as técnicas convencionais de extração sólido-liquido são, a extração de Soxhlet que é utilizada principalmente quando uma substância tem uma limitada solubilidade em solvente. A percolação, que consiste na extração exaustiva das substâncias ativa. A maceração, que é uma operação na qual a extração da matéria- prima vegetal é realizada em recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator. Outra técnica é a combinação de destilação de refluxo e vapor ou uma mistura de alta velocidade/turbo-extração. Porém, existem desvantagens e vantagens da extração sólido-líquido. Nas desvantagens, temos a grande quantidade de solventes que requer sendo estes, na sua maioria ambientalmente perigosos e fortes poluentes, e a demora nos resultados. É de salientar o cuidado com as temperaturas, se estas forem elevadas podem levar à destruição de extratos com sensibilidade térmica. 11 1.3.1. Principais parâmetros que influenciam o rendimento de uma extração Segundo Júnior (2015) o rendimento de uma extração sólido-liquido pode ser influenciado por três fatores, sendo estes: • Fatores vinculados ao material vegetal: - Quantidade; - Natureza; - Teor de humidade; - Tamanho da partícula; - Capacidade de intumescimento (inchar). • Fatores vinculados ao liquido de extração: -Seletividade; - Quantidade. • Fatores vinculados ao sistema: - Proporções; - Liquido de extração; - Temperatura; - Agitação; - pH; - Tempo de extração. Figura 6 Método de estração sólido-líquido Fonte: http://player.slideplayer.com.br/2/360408/data/images/img16.jpg) 12 1.4 Objetivo Esta atividade experimental tem como objetivos, extrair parte dos compostos fenólicos presentes na matéria prima e determinar o efeito de diversas condições experimentais (tais como o tempo, a razão sólido-solvente e composição do solvente (mistura de etanol e água)) no rendimento de extração, de teor de fenólicos e na atividade antioxidante (ensaio de DPPH). 2- Materiais e Métodos Este trabalho experimental teve como base quatro protocolos laboratoriais fornecidos pela docente. Todas as alterações feitas nos protocolos serão descritas ao longo de relatório. 2.1. Preparação da matéria-prima e determinação da humidade pelo método gravimétrico Como matéria-prima, foi utilizada a casca de dióspiro (Diospyros kaki L.). Para a preparação da matéria-prima removeu-se a polpa do dióspiro e triturou-se as cascas, obtendo assim uma polpa. 2.1.1. Materiais: • Matéria prima triturada; • Placas de Petri sem tampa (3); • Espátula; • Excicador; • Estufa (103 oC); • Balança analítica; • Caneta de acetato. 2.1.2. Procedimento: Colocou-se as placas de Petri na estufa a aproximadamente 103 oC durante 30 minutos, para garantir a remoção da humidade que poderia existir nas placas. 15 2.3 Teor de compostos fenólicos no extrato 2.3.1. Materiais: • Espátula; • Copo de precipitação de 500 Ml; • Tubos de ensaio; • Pipetas automáticas (100 µL; 1mL; 5mL); • Espectrofotómetro e cuvetes de plástico; • Vórtex; • Cronómetro; Solventes e Padrão utilizados: • Água destilada; • Reagente de Folin; • Na2CO3; • Etanol; • Padrão de composto fenólico (ácido gálico). 2.3.2. Preparação das soluções Primeiramente preparou-se soluções com as seguintes características: uma solução de carbonato de sódio a 17% (m/v) e a solução mãe de ácido gálico (1,6 mg/mL), o qual se dissolveu em etanol. 2.3.3. Preparação dos extratos para análise Seguidamente preparou-se 6 extratos: 1 eppendorf de cada extração, reservados na atividade anterior, para análise, e para tal dilui-se cada um dos extratos, adicionando- se 1 mL de etanol ou água, consoante o solvente de extração, recorrendo-se ao Vórtex e ao equipamento de ultra-sons. c) Posteriormente retirou-se 500 µL de cada tubo e adicionou-se 500 µL de água num novo eppendorf para diluir ainda mais os extratos. 2.3.4. Construção da reta de calibração 16 De seguida, foi feita a análise da solução padrão para que pudesse ser feita posteriormente a construção da reta de calibração, com a finalidade de determinar o teor de compostos fenólicos totais. Para tal, foi preparado um suporte com 6 tubos de ensaio, em que um dos quais foi o branco. Nestes tubos de ensaio colocou-se entre 0 e 20 µL (0, 4, 8, 12, 16, 20) da solução mãe e adicionou-se etanol para perfazer um volume final de 20 µL, em que o primeiro tubo foi o de controlo. A todos estes tubos foram adicionados 1580 µL de água destilada, usando uma micropipeta de 5 mL. Seguidamente, foi iniciada uma contagem de tempo, no momento que se adicionou 100 μL de reagente de Folin ao primeiro tubo, passado 30 segundos, adicionaram-se 300 μL da solução de carbonato de sódio e agitou-se, utilizando o vórtex para homogeneizar a solução. Este procedimento foi repetido, sequencialmente para os restantes tubos, de seguida colocou-se os tubos num banho termoestatizado a 40ºC durante 30 minutos. Por fim, fez-se as leituras dos valores de absorvância num espectrofotómetro Lange Spectrophotometry XION 500 a 765nm e foram registados os valores obtidos, como se pode ver no ficheiro Excel, e através desta, procedeu-se à construção da reta de calibração, ambos em anexo. 2.3.5. Análise das amostras de extrato A análise das amostras foi feita em triplicado, isto é, foram utilizados 18 tubos de ensaio (como referido anteriormente), 3 por cada extrato, aos quais foram adicionados 20 µL das amostras a analisar e mais um tubo ao qual foi adicionado a mesma quantidade em água, este foi o “branco”. Após isto, foram repetidos os mesmos passos utilizados na construção da reta de calibração, portanto foram adicionadas as mesmas substâncias de igual modo e foram lidas as absorvâncias. Os resultados desta leitura podem ser observados no ficheiro Excel. Posteriormente foi determinado o teor de compostos fenólicos de cada amostra, obtendo-se o teor de fenólicos expresso em mg EAG/mL solução. Para este fim, foi utilizada a equação da reta de calibração. Por fim, foi calculado também o teor de fenólicos expresso em % EAG (m/m). Os resultados estão em anexo no ficheiro Excel. 17 2.4. Atividade antioxidante usando o radical DPPH 2.4.1. Materiais: • Espátula; • Balança analítica; • Tubos de ensaio; • Suporte para tubos de ensaio; • Pipetas automáticas; • Espectrofotómetro e cuvetes de plástico; • Vórtex; • Cronómetro. Solventes e Reagente: • Radical DPPH; • Etanol; • Água destilada. 2.4.2. Procedimento: Preparou-se uma solução de DPPH em etanol com uma concentração molar de 0,3 mM. Sendo necessário 1 mL por amostra. Dilui-se os extratos em água e etanol (250 µL H2O e 750 µL de etanol puro), e de seguida, preparou-se uma solução para cada estrato (com a mesma concentração 7,6 mg/mL, que foi calculada pela fórmula c = m x v) num tubo de ensaio com 10 mL de etanol a 75%. Depois adicionou-se 2,5 mL da solução de cada extrato em 3 tubos de ensaio (ou seja, o ensaio foi feito em triplicado). Noutros 3 tubos de ensaio foram adicionados 2,5mL de etanol 75% e estes foram o controlo. Foi ligado o cronómetro e adicionado 1 mL da solução DPPH de 15 em 15 segundos. Após isto, os tubos foram guardados na ausência de luz. Foi feito também um “branco” para cada extrato que consistiu na adição de 2,5 mL de extrato com 1 mL de etanol num novo tubo de ensaio. Foram lidas as absorvâncias no espectrofotómetro. Com estas absorvâncias foi possível calcular a percentagem de atividade antioxidante (%AA) através da seguinte equação: 20 Na figura 8 onde avaliamos as diferentes concentrações para tempos iguais (45 minutos), o rendimento diminui à medida que a concentração de etanol aumenta, como podemos verificar que o rendimento é maior no extrato 1 que contém 100% água comparativamente ao extrato 5 que contém 100% etanol. Portanto, podemos concluir que no dióspiro há mais compostos hidrossolúveis, pois quanto maior a presença de água maior o rendimento. No caso da percentagem de fenólicos e da atividade antioxidante, a concentração destes aumenta com o aumento de teor de etanol no solvente, como se comprova pela observação da figura 8 (extrato 5 contem 100% de etanol é o que tem maior percentagem de teor fenólicos e o segundo com maior percentagem antioxidante). Apurou-se que, os solventes são mais seletivos para os extratos extraídos com maior concentração de etanol. No entanto, para se obter resultados mais conclusivos e ideais, é necessário realizar mais ensaios com concentrações diferentes para determinar o IC50 e ainda extratos de outras matérias-primas. 4 - Conclusão Em suma, através destas 4 atividades laboratoriais pode-se retirar diversas conclusões da razão sólido-solvente 1:10, tais como: a água é necessário para a obtenção de rendimentos elevados dos respetivos extratos; quanto maior o rendimento menor o tempo de extração; com o aumento de etanol, haverá um aumento de compostos fenólicos e por fim, a atividade antioxidante é aceitável perante diferentes concentrações de extratos. Para a matéria-prima analisada (casca de dióspiro) ser utilizada como antioxidante na indústria cosmética, alimentar, farmacêutica entre outras, são necessários outros tipos de atividades antioxidantes; verificar que tipos de fenólicos estão presentes através da técnica HPLC; realizar mais ensaios, nomeadamente in vivo. 21 Por último, se se tivesse de escolher um solvente com extratos interessantes, seria numa proporção de 75:25, pois é o que possui um rendimento aceitável na ordem dos 30%, com elevado teor de fenólicos e também com elevada atividade antioxidante. Referências Bibliográficas Angelo & Jorge (2007) Compostos fenólicos em alimentos - uma breve revisão. Ver. Inst. Adolfo Lutz São Paulo. vol.66 [Consultado a: 15 de Outubro de 2017]. 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