Identificação rápida de bactérias por espectroscopia no infravermelho, Redação de Biofísica

Baixe Identificação rápida de bactérias por espectroscopia no infravermelho e outras Redação em PDF para Biofísica, somente na Docsity! Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento INGLID FONTOURA DA SILVA CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE BACTÉRIAS EM CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR São José dos Campos, SP 2010 INGLID FONTOURA DA SILVA CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO RÁPIDA DE BACTÉRIAS EM CULTURAS PURAS E MISTAS POR MICROESPECTROSCOPIA FT-IR Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Profº. Dr. Airton A. Martin. Co-orientadora: Prof?. Dr. Maria Angélica G. Cardoso. São José dos Campos, SP 2010 Aos meu pais pelo amor incondicional, por mais uma vez confiarem em mim e por mais uma vez abrirem mãos de sonhos. Aos meu tios, meus pais em São José dos Campos, pela dedicação, pelo ombro e pelo colo. Ao meu irmão e meus primos (Anderson e Cléia) pela amizade, companheirismo e favores prestados durante todo o mestrado. Ao meu tio Germino (in memoriam) por ter sido um GRANDE tio e por ter me ensinado tantos valores. A Frei Dilson e Dewar por me ajudarem dar o primeiro passo rumo a este mestrado. A Mara por me ensinar a me encontrar. A Primeira Igreja Batista, ao PG e ao meu grupo de apoio por me conduzirem ao caminho do Pai. Ao Pr. Paulo Mizoguchi, Min. Flávio, Diogo, Douglas, Robson e Priscila pelas orações. A Deus (meu Pai) por abrir caminhos, por me sustentar, por ter me dado forças e por ter colocado tantas pessoas essenciais na execução deste trabalho. Ao Prof. Airton pela orientação, pela paciência, pela confiança, por acreditar nos meus sonhos e por ter me apresentado a família LEVB. A Prof Dr? Maria Angélica Gargione Cardoso pela co-orientação deste trabalho, pela sinceridade e por abrir as portas de seu laboratório, onde foi possível dar os primeiros passos deste trabalho. Ao CNPq por bolsa de mestrado concedida. As professoras: Ms. Sônia Khouri e Drº. Kumiko Sakane, que me ensinaram a base de microbiologia e espectroscopia no infravermelho e não mediram esforços para me ajudar. Ao Prof. Dr. Leandro Raniero por ter me acompanhado no início do trabalho, quando tudo era sonho, no término, nas traduções e nas discussões. O seu apoio foi essencial. Ao Prof. Dr. Mituo Uehara pela preparação de trabalho (Uberlândia). A Ricardo Belo, meu anjinho da guarda, sem ele dificilmente este trabalho seria realizado, obrigada por sonhar comigo e me ajudar na execução do mesmo. A Maira, minha amiga, que tanto me ouviu, que tanto me aconselhou e que tanto me ajudou. Perua, não tenho palavras para lhe agradecer. Origin, Minitab, cálculo de número de onda e etc. Ah o meu foco é?...e está em?...no alto!.. JESUS! As minhas amigas: Vanessa Santos, Elizângela Carvalho, Ludmila Guimarães, Nikele Nadur, Simone Lapena e Maria; por passarem comigo esta jornada de aulas, trabalhos, provas e apresentações. Saudades! A família LEVB, alunos e professores, por TUDO, ensinamentos, amizade...quantas histórias. Amo vocês! A família NUFABI (Carol e Ana Carla) pelo apoio, por me socorrer. A professora Sandra e a Maria Alice pelo apoio na fase final do mestrado. A Rúbia, Valéria, D. Ivone e D. Neuza pelo carinho. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a execução deste trabalho, o meu muito obrigada! Fiz mais do que posso Vi mais do que agúento E a areia dos meus olhos é a mesma Que acolheu minhas pegadas Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Eu lutei contra tudo Eu fugi do que era seguro Descobri que é possível viver só Mas num mundo sem verdade. Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Sem medo de Te pertencer. Voltam pra Você. Depois de tanto caminhar Depois de quase desistir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. Meus pés cansados de lutar Meus pés cansados de fugir Os mesmos pés cansados voltam pra Você. Pra Você. (S. Leah) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Principais formas das bactérias ............ aa 23 Figura 2 - Estrutura do Fosfolipídeo ........... eres 26 Figura 3 - Arranjo das proteínas em estrutura secundária... 27 Figura 4 - Componentes de ácidos nucléicos .............. aa 28 Figura 5 - Esquema básico de estrutura de célula bacteriana .................i. 29 Figura 6 - Estrutura do peptideoglicano ............ eai 31 Figura 7 - Parede celular de bactérias Gram-positivas .............i 32 Figura 8 - Unidades de ácidos teicóicos ............ eee 33 Figura 9 - Parede celular de bactérias Gram-negativas .............i 34 Figura 10 - Estrutura do Lipopolissacarídeo ............. aa 35 Figura 11 - Curva de Crescimento bacteriano... 37 Figura 12 - Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis 39 Figura 13 - Escherichia coli, Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa 41 Figura 14 - Espectro eletromagnético ... 44 Figura 15 - Diagrama de níveis de energia. 44 Figura 16 - Variação do momento dipolar .............. eia 45 Figura 17 - Vibrações de um grupo de átomos... 47 Figura 18 - Componentes básicos de um espectrômetro FTIR..................... 50 Figura 19 - Princípio de funcionamento de um Interferômetro de Michelson....... 51 Figura 20 - Comparação do microscópio com luz branca com o microscópio IR. 53 Figura 21 - Espectro de bactéria com diversos tratamentos... 56 Figura 22 - Espectros típicos de microrganismos patogênicos ....................... 57 Figura 23 - Dendograma resultado da análise de cluster de células microbianas intactas... ereta rate tata reera aeee teceaartetnaaa 61 Figura 24 - Etapas da preparação de cultura bacteriana para análise em FT-IR. 62 Figura 25 — Etapas da preparação de amostra bacteriana para análise em FT- Figura 26 - Espectrofotômetro utilizado no experimento... 64 Figura 27 - Micrografia dos filmes finos de bactérias Gram-negativas e bactérias Gram-positivas ............ ice ceeeee re aeea aeee aerea aeee acena aeraranaerananaaa 68 Figura 28 - Espectro de absorção da janela de CaF>............. Figura 29 - Espectro típico de fundo... aereas Figura 30 - Mapa da amostra de Proteus mirabilis associado aos vinte espectros realizados aleatoriamente na amostra e mapa da amostra de Staphylococcus aureus associado aos vinte espectros realizados na borda da amostra Figura 31 — Regiões do filme fino de Staphylococcus aureus . Figura 32 - Espectro característico de bactéria com as principais bandas de vibrações moleculares............... ss eeaeeeaeeaaieaaeeaaeeaaaaaaaaannãa Figura 33 - Movimentos moleculares de amida | e amida Il de proteínas............. Figura 34 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis........... eee Figura 35 - Primeira derivada de ordem espectral em regiões significativamente diferentes de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ..... Figura 36 - Dendograma resultado da análise de cluster das seis bactérias examinadas em triplicata ............. ee eereneerenaeerenaeearanaeenanaaa Figura 37 - Dendograma resultado da análise de cluster da triplicata de Escherichia... ecra tecer cacera a raceaaa tear teta teceaartetnaa Figura 38 - Micrografia dos filmes finos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus ........iii Figura 39 - Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus ..........iii Figura 40 - Primeira derivada da média espectral das amostras utilizadas no estudo, demonstrando diferenças de absorção nas regiões de 3000-2800 cm, 1470-1410 cm! e 1176-950 cm... eis Figura 41 - Dendograma resultado da análise de cluster das três inoculações examinadas em triplicata ............. ee eereneerenaeerenaeearanaeenanaaa Figura 42 — Filme fino de Escherichia coli associado ao mapa de absorção química de uma amostra e aos 64 espectros extraídos da matriz .................... Figura 43 — Filme fino de Staphylococcus aureus associado ao mapa de absorção química de uma amostra e aos 64 espectros extraídos da matriz ....... 70 71 1 72 75 TT 78 79 80 81 82 84 85 Figura 44 — Filme fino de Escherichia coli com Staphylococcus aureus associado ao mapa de absorção química de uma amostra e aos 64 espectros extraídos da matriz... eeeeeeeeaaeeceaaeeceaae errar Figura 45 — Espectro FT-IR extraído da matriz de imagem representativo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus AUIOUS ..... irei teeree tacar aeee reatar area ra eta ereeaaeaaraeranta Figura 46 - Espectros de primeira derivada da cultura mista mostrando regiões espectrais heterogêneas.... Figura 47 - Dendograma resultado da análise de cluster das três inoculações examinadas em triplicata em modo de imagem ...........e Figura 48 - Identificação de três diferentes microrganismos em cultura mista pela técnica de estampa ........... e eeeeeeneeeanaeeeanaeeeenaanaaentanos Figura 49 - Método de estampagem ........ eee 87 88 89 PCA (Principal Component Analysis) - análise de componentes principais RNA - ácido ribonucléico rRNA - RNA ribossômico s - segundo s — simétrico S. aureus — Staphylococcus aureus SIMCA (soft independent modeling by class analogy) — Modelagem independente flexível por analogia de classe T-timina U - uracila U.A. - unidades de absorbância ZnSe - seleneto de zinco LISTA DE SÍMBOLOS a-alfa PB - beta x - constante de ligação ô - deformação v- estiramento º- grau | - mi (massa reduzida) - - negativo n-pi % - por cento + - positivo SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .. 2 OBJETIVOS ... 21 GERAL .... 2.2 ESPECÍFICOS ........ aaa 22 3 REVISÃO DE LITERATURA ....... ienes 23 3.1 BACTÉRIAS ......... eee 23 3.1.1 Estrutura química e composição de células ..............i 24 3.1.1.1 Carboidratos ............ ereta 25 3.1.1.2 Lipídeos .... 3.1.1.3 Proteínas .. 3.1.1.4 Ácidos Nucléicos ... 3.1.2 Citologia Bacteriana ........... e eeeeneeaneeeeeeneeneanaa 29 3.1.2.1 Parede Celular ......... eae 30 3.1.2.1.1 Parede celular de bactérias Gram-positivas ............... 32 3.1.2.1.2 Parede celular de bactérias Gram-negativas ............ 33 3.1.2.1.2.1 Lipopolissacarídeo.............eeeeneeeenernena 34 3.1.3 Fases de crescimento 3.1.4 Bactérias Gram-Positivas 3.1.4.1 Enterococcus faecalis 3.1.4.2 Staphylococcus aureus ....... eita 38 3.1.4.3 Staphylococcus epidermidis ......... ee 39 3.1.5 Bactérias Gram-Negativas ........... eee 39 3.1.5.1 Escherichia coli... errar 39 3.1.5.2 Proteus mirabilis ......... ereta 40 3.1.5.3 Pseudomonas aeruginosa 3.1.6 Identificação de bactérias pelo método tradicional.. 3.2 Espectroscopia no Infravermelho 3.2.1 Absorção no Infravermelho .......... aos 43 3.2.2 Vibração Molecular ............ ienes 45 3.2.3 Espectro de Infravermelho ........... eee 47 3.2.4 Instrumentação ............ aeee aaaaaaaaatannoa 48 19 de identificação, é comum a administração do tratamento empírico com antibióticos de largo-espectro baseado na experiência clínica e conhecimento da patogênese e epidemiologia das infecções. O risco desta prática pode conduzir efeitos secundários tóxicos adversos, entre eles à resistência aos agentes antimicrobianos e a nefrotoxicidade (ATLAS, SNYDER, 2006; SANDT et al., 2006; STENDER et al., 2002, MAQUELIN et al., 2003). A administração inicial inadequada da terapia antimicrobiana aos pacientes criticamente doentes com infecção está também associada a uma mortalidade maior (IBRAHIM et a!., 2000). Estudos conduzidos por Barefanger, Drake e Kacich (1999), Doem et al. (1994) e Kerremans et aí. (2008) demonstram que a identificação do microrganismo, em um menor tempo, permite ao clínico administrar um antimicrobiano mais específico e consequentemente mais eficaz, o que reduziria a duração de permanência em leito hospitalar, dos custos associados à doença e da taxa de morbidade e mortalidade. A questão da identificação rápida do microrganismo ainda são dificuldades encontradas nos dias atuais. Nos últimos anos novas técnicas têm sido desenvolvidas para a identificação de microrganismos, existindo um interesse na descoberta de novos métodos analíticos, principalmente aqueles que permitem a execução mais rápida da análise do material de pacientes com suspeita de infecção. Entre as técnicas que oferecem possibilidades para a análise rápida, os métodos de biologia molecular se destacam por serem sensíveis para a identificação de microrganismos patogênicos. A maioria dos testes é baseada em sequências específicas de DNA permitindo a identificação específica. Entretanto, estas técnicas diagnósticas moleculares possuem custos elevados e são pouco práticas para utilização em laboratórios de rotina, principalmente para estudos em controle de infecção que exige uma rápida e simples metodologia para a identificação (ERUKHIMOVITCH et al. 2005; KIRSCHNER et aí, 2001). Uma técnica diferente aos métodos tradicionais de identificação de microrganismo é baseada em espectroscopia no infravermelho. Esta técnica é caracterizada por mínima manipulação da amostra, e não são exigidos testes bioquímicos fornecendo uma alternativa potencial aos métodos convencionais. Com esta técnica é possível fazer a análise do microrganismo em um tempo de cultura reduzido em comparação com os métodos comumente utilizados, permitindo a discriminação de células microbianas intactas, sem a sua destruição e fornecendo 20 impressões bioquímicas específicas que são reprodutíveis e distintas para diferentes microrganismos (MAQUELIN et a/., 2002). O método fornece um espectro de absorção bioquímica devido às vibrações de ligações químicas de componentes celulares, tais como proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios de membrana e componentes de parede celular; fornecendo assim a informação sobre a composição bioquímica da célula microbiana (BALDAUF et al., 2007; AMIALI et al, 2007; KIRSCHNER et al., 2001). O sistema de FT-IR pode ainda ser acoplado a um microscópio fornecendo um versátil instrumento para a análise microbiológica rápida. A detecção, a identificação e a diferenciação microbiana podem estar disponíveis dentro de um único instrumento, fornecendo resultados diagnósticos potenciais em um dia de trabalho (MAQUELIN et al., 2002). O método é aplicável em microbiologia, pois realiza com alta especificidade identificação rápida de microrganismos patogênicos, permite investigações epidemiológicas, estudo de populações bacterianas sob condições diferentes de cultura, conduz estudos de caso, elucida correntes de infecção, controle de terapia e detecção de infecções periódicas (NAUMANN, 2000; BECKER et al., 2006). Diante deste contexto é de fundamental importância a identificação rápida de bactérias responsáveis pela infecção. Aliada a esta realidade apresentada, evidenciou-se a necessidade da avaliação do potencial da microespectroscopia de FT-IR para rápida identificação de bactérias. Esta dissertação encontra-se dividida em sete seções. Na seção 2 é apresentado os objetivos gerais e específicos do trabalho. Na seção 3 é feita uma revisão sobre bactérias, sua composição bioquímica e estruturas celulares e mecanismo de crescimento, além da descrição das principais bactérias responsáveis por infecção e uma breve descrição do método tradicional de identificação de bactérias. Ainda na seção 3 é feita uma revisão sobre espectroscopia no infravermelho onde são explicados seus principais conceitos, descreve-se a instrumentação necessária para obter um espectro infravermelho, bem como um breve relato sobre análise e pré-processamento espectral; em sequência são apresentados trabalhos recentes que envolvem a espectroscopia no infravermelho como método para identificação de bactérias e análise estatística multivariada utilizada frequentemente para análise. pal Na seção 4 é redigido a metodologia empregada para a realização dos experimentos, desde o protocolo de cultura bacteriana e preparação de amostra, passando pelos parâmetros adotados para aquisição de espectros e análise estatística. Nas seções 5e 6 são apresentados os resultados e as discussões. Na seção 7 são apresentadas as principais conclusões deste trabalho e as seções 8 e 9 são apresentadas algumas sugestões e trabalhos futuros, bem como a divulgação dos resultados da pesquisa. 24 Quanto à nutrição, muitas bactérias utilizam compostos orgânicos encontrados na natureza a partir de organismos vivos ou mortos. Algumas bactérias sintetizam seu próprio alimento por fotossíntese, e algumas obtêm seu alimento a partir de substâncias inorgânicas. Estes organismos se reproduzem assexuadamente por fissão binária, processo pelo qual uma célula parenteral dá origem a duas células- filhas (HOGG, 2005; TORTORA et al., 2008; RYAN; RAY, 2004). 3.1.1 Estrutura química e composição de células As células de todos os organismos vivos, desde os microrganismos até o homem, das células mais simples a mais complexa compartilham certas propriedades fundamentais e características estruturais, todas elas são constituídas por compostos químicos. Vários compostos inorgânicos (sódio, potássio, ferro, magnésio, cálcio, cloro) são encontrados em todos os organismos, porém os compostos orgânicos têm um maior significado biológico, atuando em muitas etapas cruciais do metabolismo e na definição de estruturas celulares. Existem milhares desses compostos orgânicos, a maioria dos quais podem ser agrupados em uma das quatro categorias principais: carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos (DNA e RNA) (TRUN; TREMPY, 2003). Alguns dos grupos funcionais mais comuns que ocorrem em moléculas orgânicas simples, bem como nas macromoléculas são apresentados na Tabela 1. Tabela 1 - Ocorrência e características de alguns grupos funcionais. Fonte: Hogg, 2005 (adaptado). Grupo Funcional Lo duriE] Tipo de molécula Encontrado em Hidroxila Álcoois Carboidratos -OH Carbonila o Aldeídos Carboidratos A = Cy Cetonas Carboidratos 25 Carboxila -COOH Ácidos carboxílicos Carboidratos, Lipídeos e Proteínas Amino -NH, Aminas Proteínas Amida (carbonila e O Amidas Proteínas . A amino) — > NH» Sulfidril sH Tióis Proteínas Fosfato o Fosforil Fosfolipídeos, h Ácidos nucléicos —0—P— O" I Fi 3.1.1.1 Carboidratos Os carboidratos são um grande grupo de compostos orgânicos que inclui açúcares e amidos, são compostos de átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio; tem a fórmula geral (CH>0)n, são encontrados em paredes celulares das células bacterianas e atuam como fonte de reserva nutritiva e precursores de proteinas, lipídeos e ácidos nucléicos. Sua função principal é fornecer combustível para as atividades celulares. Podem ser classificados em três grupos principais, com base no tamanho: monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos (MARZZOCO; TORRES, 2007; BERG; TYMOCZKO; STRYER, 2004). 3.1.1.2 Lipídeos Os lipídeos são o segundo maior grupo de compostos orgânicos encontrados na matéria viva. Assim como os carboidratos, são compostos de átomos de carbono, 26 hidrogênio e oxigênio. Existem três categorias principais de lipídeos biologicamente importantes: triglicerídeos, fosfolipídeos e esteróis. Os triglicerídeos, denominados gorduras ou lipídeos simples são constituídos de dois tipos de grupamentos: glicerol e ácidos graxos. Os lipídeos complexos conhecidos como fosfolipideos são componentes importantes de membrana celulares, são compostos de: glicerol, dois ácidos graxos e em um lugar de um terceiro ácido graxo um grupo fosfato ligado a um dentre vários grupos orgânicos (Figura 2). fo Hm CH —c—c— Lo DI SSL Sa CHy— Ne HH poe! A l, 4 f Toe 3 a H [Dem W Figura 2 — Estrutura do Fosfolipídeo: grupo orgânico, fosfato, glicerol e ácidos graxos. Fonte:( HOGG, 2005). Os esteróis são constituintes importantes das membranas plasmáticas das células animais e são constituídos de vários anéis de átomos de carbono ligados entre si. 3.1.1.3 Proteínas As proteínas são macromoléculas orgânicas que contêm carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio, são longos polímeros de aminoácidos. A complexidade da estrutura protéica é analisada considerando-se a molécula em termos de quatro 29 3.1.2 Citologia Bacteriana A célula bacteriana possui, como qualquer célula viva, um genoma, um citoplasma e uma membrana citoplasmática (com exceção dos micoplasmas) todas as bactérias possuem também uma parede celular e algumas possuem ainda uma cápsula externa. A figura 5 apresenta esquematicamente uma célula bacteriana típica com as principais estruturas externas e internas à membrana citoplasmática. Na tabela 2 são listadas estas estruturas associada a sua composição química. Nucleóide Flagelo Parede Celular hi Membrana externa observada somente em bactérias Gram- negativas Peptideoglicano Cápsula Plasmídeo Pili (Pilus) Grânulos . (Substâncias de depósito) Ribossomos 70S . metafosfatos (Volutina) - Glicogênio (Granulose) Membrana Citoplasmática Figura 5 — Esquema básico de estrutura de célula bacteriana. Fonte: (KAYSER et al., 2005) Tabela 2 — Estruturas bacterianas correlacionadas à composição química. FonteO LEVINSON; JAWETZ etal., 1998) Estrutura Componentes essenciais Parede celular Peptideoglicano Esqueleto de carboidrato com cadeias laterais peptídicas entrecruzadas Membrana externa Organismos gram positivos Ácido teicóico Organismos gram negativos Polissacarídeos 30 Membrana Citoplasmática Bicamada lipoprotéica sem esteróis Ribossomo RNA e proteína em subunidades 50S e 30s Nucleóide DNA Componentes não-essenciais Cápsula Polissacarídeo Pili (fimbria) Protreína (pilina) Flagelo Proteína (flagelina) Plasmídeo DNA Grânulos Glicogênio, lipídeos, polifosfatos 3.1.2.1 Parede Celular As bactérias se diferenciam pela estrutura da parede celular, seus componentes e suas funções, em relação à estrutura de parede celular são classificadas em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, de acordo com a capacidade de retenção do corante de Gram. Esta é uma divisão empírica clássica que, de acordo com a coloração revela diferenças importantes na composição química e na estrutura de parede celular (MURRAY; ROSENTAHL; PFALLER, 2006; BARBOZA; TORRES, 2005). A parede celular é uma estrutura comum a todas as bactérias que, promove rigidez estrutural, conferindo forma à célula e criando uma barreira física contra o ambiente externo, possui componentes de superfície como: a capsula, o flagelo e o pili Possui uma estrutura com camadas múltiplas localizada externamente à membrana citoplasmática. É composta por uma camada interna de peptideoglicano, envolta por uma membrana externa, que varia em espessura e em composição química dependendo do tipo de bactéria (LEVINSON; JAWETZ et al., 1998, KONEMAN et al., 2001). O peptideoglicano é uma rede macromolecular, conhecido também como mureina, que está presente isoladamente ou em combinação com outras substâncias. Consiste em um dissacarídeo repetitivo unido por polipeptídeos para 31 formar uma rede que circunda e protege toda a célula. É formado por um esqueleto de resíduos de carboidratos formados por unidades alternadas de N- acetilglicosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM). A este último encontram- se ligadas, covalentemente, cadeias laterais de tetrapeptídeos (CLT). A maior parte das CLTs é composta de L-alanina, D-glutamato, mesodiaminopimelato e D-alanina (Figura 6). As CLTs podem-se interligar diretamente como na maioria das bactérias Gram-negativas ou por meio de outros aminoácidos como ocorre nas bactérias Gram-positivas (KONEMAN et al., 2001; TORTORA et al.,2008; TRABULSI et al,, 2008). N-acetilglicosamina cHooH N-acetilmurâmico o, CHOH oH No o OH HO N NH co A Ny I “Co Ho cHoCH 1 [o €H co f º NR L-alanina cy, ca 'c=0 A cooH NH Na 'ch Hooc CH; N IA . CH; cH D-alanina D-glutamato N N CH, NH N | GP co N-cH Hi fi CH, mesodiaminopimelato ! fe AR HAN” “COOH Figura 6 - Estrutura do peptideoglicano. O peptideoglicano é um polímero composto de altemância moléculas de N-acetilglicosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM). Uma cadeia de tetra peptídeo está ligada aos resíduos NAM (ver texto para detalhes). Esta configuração é importante para a formação de uma rede rígida. Fonte: (TRUN; TREMPY, 2003) 34 Tabela 3 - Comparação da parede celular de bactérias Gram-positivas e gram-negativas. Fonte: LEVINSON; JAWETZ, 1998) Componente Células Gram Positivas Células Gram Negativas Peptideoglicano Espessa (15-80 nm) Fina; -2 nm; camada camadas múltiplas única Ácido teicóico Presente Ausente Lipopolissacarídeo Ausente Presente Lipoproteina e Ausente Presente Fosfolipídeos AntigenoK CadeiaO Ceme | Lipídio A Lipopolissacarídeo (LPS) Membrana externa ——p> Fosfolipídeo Espaço — Periplasmático H Peptideoglicano Lo Membrana Citoplasmática Figura 9 — Parede celular de bactérias Gram-negativas. Fonte: ( KAYSER et al., 2005.) 3.1.2.1.2.1 Lipopolissacarídeo (LPS) LPS, um componente da membrana externa de bactérias gram-negativas, aparentemente, é uma das principais toxinas responsáveis pelo início de reações fisiopatológicas observadas durante graves infecções e choques sépticos. Essas 35 reações frequentemente observadas são: febre, leucopenia, taquicardia, taquipnéia, hipotensão, coagulação intravascular disseminada e insuficiência de múltiplos órgãos. (LAMPING et al, 1998; ULMER et aí, 2000). Os LPSs são compostos por três segmentos ligados covalentemente: (1) lipídeo A, firmemente embebido na membrana; (2) cerne do polissacarídeo, localizado na superfície da membrana; e (3) cadeia O (antígenos O), que são polissacarídeos que se estendem como pêlos a partir da superfície da membrana em direção ao meio circundante. O lipídio A consiste em unidades dissacarídicas de glicosamina fosforilada, às quais estão ligados vários ácidos graxos de cadeia longa (Figura 10 A). O cerne do polissacarídeo (Figura 10 B) é semelhante em todas as espécies de bactérias Gram- negativas que possuem LPS. Em geral, as unidades de repetição consistem em trissacarídeos lineares, tetrassacarídeos ou pentassacarídeos ramificados. A cadeia O é um polissacarídeo externo consistindo de até 25 unidades repetidas de três a oito açúcares(Figura 10 C) (KAYSER etal., 2005). A porção hidrofóbica do lipídio A tem sido identificado como o princípio endotóxico do LPS (ULMER et al, 2000). Lipídio Cerne do Cadeia O o polissacarídeo Lipídio A - Diglucosamina - Ácidos graxos Ácidos graxos Diglucosamina Fosfato (A) (B) (Cc) Figura 10 — Estrutura do Lipopolissacarídeo: lipídio A (A), cerne do polissacarídeo (B) e cadeia O (C) Fonte: (KAYSER etal., 2005) 36 3.1.3 Fases de crescimento A curva de crescimento bacteriano típico de uma população ilustra os eventos que ocorrem ao longo do tempo. Esta curva pode ser traçada ao inocular um meio com números de células conhecidas, determinando a população microbiana em intervalos de tempo e então estabelecidos os valores logaritimicos de células viáveis. Fases distintas de crescimento ocorrem: (A) fase lag (latente), (B) fase de aceleração,(C) fase logarítmica (crescimento exponencial), (D) fase de desaceleração, (E) fase estacionária e (F) fase de declínio (morte celular) (Figura 11) (PELCZAR; CHAN; KRIEG 1997; KAYSER et al. 2005; POMMERVILLE, 2004). (A) Fase lag (latente) — Representa um período durante o qual as células estão passando por uma intensa atividade metabólica, principalmente síntese de enzimas e de moléculas variadas, é considerado um período de adaptação ao novo meio para que haja um reinício do crescimento. (C) Fase logaritímica (crescimento exponencial) — Após a adaptação ao novo meio e síntese das enzimas necessárias para utilizar os substratos disponíveis, as bactérias são capazes de iniciar a divisão celular por fissão binária. Este evento leva ao crescimento exponencial da população bacteriana presente na cultura. Esta situação prossegue até que ocorra uma de duas alternativas: um ou mais nutrientes no meio se esgotam ou ocorre acúmulo de produtos metabólicos tóxicos, que inibem o crescimento. (E) Fase estacionária — Como discutido acima a fase logaritímica é limitada por fatores no ambiente (meio), e como a taxa de crescimento desacelera, a cultura entra em uma próxima fase. O nivelamento da curva de crescimento não significa que a divisão celular tenha cessado completamente, mas sim que o aumento (devido às células recém-formadas) é similar ao de mortes celular. (F) Fase de declínio — Se os nutrientes no ambiente externo continuam sendo limitados, a população entra em fase de declínio (morte). Agora, o número de morte celular se torna superior ao número de novas células formadas. O glicocálice bacteriano pode evitar a morte, agindo como um tampão para o ambiente, flagelos podem permitir que determinadas bactérias movam para um novo local, porém para muitas espécies, a história da população termina com a morte da última célula. 39 Staphylococcus epidermidis é um dos principais membros da microbiota normal do ser humano, está regularmente presente na pele e nas mucosas, é a causa predominante de infecções associadas a corpo estranho (cateteres, sondas). Além disso, S. epidermidis é isolado com frequência como o patógeno causador da sepse hospitalar e outras infecções nosocomiais, classificado entre os cinco mais frequentes patógenos hospitalares. A patogênese das infecções S. epidermidis é correlacionada com a capacidade de formar biofilmes em superfícies de polímeros. São cocos Gram-positivos arranjados em cachos e tétrades (Figura 12 C) (KNOBLOCH, 2001; TRABULSI et al., 2008). Figura 12 - Enterococcus faecalis (A), Staphylococcus aureus (B) e Staphylococcus epidermidis (C). Fonte: (ARE et al., 2008; TODAR, 2008; TRABULSI et a!., 2008) 3.1.5 Bactérias Gram-Negativas 3.1.5.1 Escherichia coli Escherichia coli, gênero da espécie Escherichia, foi descrita pela primeira vez, em 1885, por Theobald Escherich. Este gênero é um membro típico de enterobactérias que habitam principalmente no intestino de humanos e animais, colonizando o trato gastro-intestinal infantil poucas horas após o nascimento. Geralmente três síndromes clínicas podem resultar de infecções por cepas patogênicas de E. coli: sepse como consequência de meningite , infecção do trato urinário e diarréia. É uma bactéria frequentemente isolada em hemoculturas de pacientes internados em Unidades de Terapia Intensiva. Elas são classificadas 40 como bacilos Gram-negativos, não esporulados, anaeróbios facultativos; possuem motilidade através de flagelos ou são imóveis, a cápsula ou microcápsula são frequentemente presentes (Figura 13 A) (SUSSMAN, 1997, STENUTZ; WEINTRAUB; WIDMALM, 2006; ALCAMO, 1996). 3.1.5.2 Proteus mirabilis Proteus mirabilis, espécie de bactéria do gênero Proteus são bacilos Gram- negativos pertencentes à família de Enterobactérias. Estas bactérias causam infecções oportunistas principalmente em imunodeprimidos e é considerada uma das bactérias mais importantes entre as uropatogênicas, produzem grandes quantidades de uréase que degrada a uréia formando amônia e outros produtos. Possuem motilidade através de flagelo e possuem fímbrias que promovem a aderência bacteriana (Figura 13 B) (ALLISON, 1992). 3.1.5.3 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa, o mais frequente bacilo gram-negativo não fermentador, é um patógeno humano oportunista que causa uma variedade de infecções em imunodeprimidos e portadores de fibrose cística, é um dos mais importantes agentes de infecção hospitalar. São fisiologicamente aeróbios (podendo crescer anaerobicamente quando há presença de nitrato), não esporulados, móvel por um simples flagelo polar, aderentes às células epiteliais através das fimbrias (Figura 13 C) (PASSADOR, 1993). 41 Figura 13 — Escherichia coli (A), Proteus mirabilis (B) e Pseudomonas aeruginosa (C). Fonte: (KUNKEL, 2004) 3.1.6 Identificação de bactérias pelo método tradicional Inúmeras técnicas de identificação de bactérias têm sido descritas na literatura, entretanto é indiscutível o sucesso da identificação de bactérias pelo método tradicional de cultura, considerado padrão ouro. Este método requer o uso de diversas técnicas para a determinação bacteriana guiados pelo Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. O princípio essencial é atribuição de uma cultura desconhecida dentro do sistema de classificação taxonômica com base na observação de um conjunto complexo de características tais como; composição de parede celular, morfologia, características culturais e fisiológicas. A forma, o tamanho e o arranjo da bactéria, observados ao microscópio após coloração diferencial; a capacidade de metabolização de substratos particulares são alguns dos indicadores utilizados na identificação de uma bactéria, algumas dessas características são apresentadas na tabela 4 (COLWELL, GRIGOROVA, 1987; KAYSER et al, 2005; WILKINS; LAY, 2006). Tabela 4 — Características usadas para identificação de bactérias. Fonte: (KAYSER et al, 2005) [or LETeiC] icas usadas para identificação de bactérias Características morfológicas Forma (coco, bacilo, espirilo); Tamanho, agrupamento (cachos, cadeias, diplococos); Coloração (Gram-positiva, Gram-negativa), flagelos (presente, ausente), cápsula (presente, ausente), esporos (forma, na formação de células). 44 nível eletrônico é chamado de estado fundamental e os demais são estados excitados (WARTEVIG, 2003; FREIFELDER et aí, 1982). Comprimentode TTTTIT TTTUTTTTT onda 10º 1 1 107? 17 102 | 103 em . IH he im imm tum inm TTTTT Número de onda 110 1001000 10000 em? v T T T T T Frequência 108 doD ho? ao! qo! qo!s s v — Visible IR já se| 8 |eê ; Região espectral T & Sé lõglo | oepuv | Xrays |rerays [a o= |==|u | =]2 Figura 14 — Espectro eletromagnético. Fonte: (NAUMANN, 2000) A energia pode residir nas moléculas em diversas formas, entre as mais importantes estão à energia rotacional, vibracional e eletrônica. A espectroscopia no infravermelho é baseada em vibrações moleculares e monitora a transição entre os níveis de energia vibracionais. Primeiro estado excitado Níveis Vibracionais Estado fundamental ENERGIA Figura 15 - Diagrama de níveis de energia mostrando o estado fundamental e o primeiro estado excitado. Fonte: Adaptado de (FREIFELDER, 1982). A condição para que ocorra absorção da radiação infravermelha é que haja variação do momento de dipolo elétrico da molécula como consequência de seu movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo é determinado pela magnitude da diferença de carga e a distância entre dois centros de carga) (Figura 16). Somente nessas circunstâncias, o campo elétrico alternante da radiação 45 incidente interage com a molécula, originando os espectros. De outra forma, pode-se dizer que o espectro de absorção no infravermelho tem origem quando a radiação eletromagnética incidente tem uma componente com frequência correspondente a uma transição entre dois níveis vibracionais, quando sua frequência é idêntica ao da O) vibração molecular. F = — +«— Figura 16 - Variação do momento dipolar. Fonte: (STUART, 2004) A grande maioria das moléculas têm bandas de infravermelho na faixa espectral entre 400 e 4000 cm! (MIR), isso se deve, principalmente, ao fato de nessa região ocorrerem, essencialmente, transições fundamentais e à existência de uma faixa espectral conhecida como região de impressão digital. Nessa região, pequenas alterações na estrutura e na constituição de uma molécula resultam em mudanças significativas na distribuição das bandas de absorção do espectro, que são relacionados com a estrutura da molécula (NAUMANN, 2000; WARTEWIG, 2003). 3.2.2 Vibração Molecular Uma molécula não é uma associação rígida de átomos. Uma molécula pode ser comparada a um sistema de massas variáveis, correspondentes aos átomos da molécula, e molas de diversos comprimentos, correspondente às ligações químicas da molécula. A espectroscopia vibracional analisa as vibrações periódicas dos átomos dentro de uma molécula. Essas vibrações não ocorrem aleatoriamente, mas de uma forma rigorosamente definida. As vibrações moleculares podem ir desde simples 46 movimentos associados de dois átomos em uma molécula diatômica a movimentos mais complexos de cada átomo em uma grande molécula poliatômica. As ligações covalentes que constituem as moléculas orgânicas estão em constantes movimentos axiais e angulares (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008; GRIFFITHS; HASETH, 2007). Em uma molécula poliatômica, cada átomo possui três graus de liberdade: ele pode se mover de forma independente ao longo de cada um dos eixos de um sistema de coordenadas cartesianas. Se N átomos constituem uma molécula, existem 3N graus de movimentos livres. Para moléculas não-lineares, três destes graus - os translacionais — envolvem movimentos de todos os átomos que se deslocam simultaneamente na mesma direção paralela aos eixos de um sistema de coordenadas cartesianas não alterando a distância entre os átomos. Outros três graus de liberdade, os rotacionais, também não alteram a distância entre os átomos, por exemplo, sobre os eixos principais da molécula. O restante 3N - 6 graus alteram as distâncias entre os átomos, os comprimentos das ligações químicas e os ângulos entre eles. Uma vez que estas ligações são elásticas, movimentos periódicos ocorrem. Estes 3N-6 graus de liberdade determinam o número de modos de vibração molecular. As moléculas lineares possuem apenas dois graus de liberdade rotacional e, portanto tem 3n-5 graus de liberdade vibracional (DIAS, 1986; SHRADER, 1995; CHALMERS; GRIFTHS, 2002). Esses graus de liberdade correspondem aos diferentes modos normais de vibração de uma molécula. Um modo normal de vibração é aquele em que cada núcleo realiza uma oscilação harmônica simples em torno de sua posição de equilíbrio, todos os núcleos se movem com a mesma frequência e em fase e o centro de gravidade da molécula permanece inalterado. Existem dois modos fundamentais de vibração de moléculas: estiramento ou deformação axial, em que à distância entre dois átomos aumenta ou diminui, mas os átomos permanecem no mesmo eixo de ligação; e deformação angular, em que a posição do átomo muda em relação ao eixo original da ligação. Vibrações de estiramentos podem ocorrer em fase (estiramento simétrico) ou fora de fase (estiramento assimétrico). Vibrações de deformação podem ocorrer no plano (tesoura e balanço) ou fora do plano (sacudida e torção) (Figura 17) (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008; STUART, 2004). 49 baseados em princípios interferométricos (GAUGLITZ; VO-DINH, 2003; TWARDOWSKI; ANZENBACHHER, 1994). Desde a década de 40 os espectrômetros dispersivos vem sendo utilizados; no entanto no final da década de 70 começaram a ser progressivamente substituídos por espectrômetros com transformada de Fourier (FT), estes tem melhorado a aquisição espectral de forma significativa, revolucionando este campo. Atualmente os espectrômetros IR que trabalham em rotina ou instrumentos de pesquisa são baseados neste princípio (SIEBERT; HILDEBRANDT, 2008). A vantagem mais significativa dos espectrômetros FT é que a radiação de todos os comprimentos de onda é medida simultaneamente enquanto que em espectrômetros dispersivos todos os comprimentos de onda são avaliados de forma consecutiva. Portanto, um espectrômetro FT é muito mais rápido e mais sensível, permite a aquisição de centenas de espectros de infravermelho em apenas alguns minutos (GAUGLITZ; VO-DINH, 2003). 3.2.4.1 Espectrômetro FT-IR Um espectrômetro FT-IR é um instrumento baseado na idéia da interferência entre dois feixes de radiação para produzir um interferograma de um sinal de amostra usando um interferômetro. Este interferograma pode ser tratado por meio de um processo matemático, denominado transformada de Fourier, originando um espectro ou padrão de absorção da amostra. Possui três componentes básicos: a fonte, o interferômetro e o detector. Um diagrama esquemático do espectrômetro FT- IR é apresentado na figura 18. A radiação emergente da fonte é transmitida através de um interferômetro à amostra antes de chegar a um detector. Após a amplificação do sinal, em que as contribuições de alta frequência foram eliminadas por um filtro, os dados são convertidos em formato digital por um conversor analógico-digital (A/D) e transferido para o computador por transformada de Fourier (STUART, 2004 ; WATERWIG, 2003). 50 Conversor Interferômetro H Amostra Detector Fonte Amplificador Computador Analógico-Digital Figura 18 - Componentes básicos de um espectrômetro FTIR. Fonte: (STUART, 2004; NAUMANN, 2000) 3.2.4.1.1 Fonte de Radiação Infravermelha Todos os espectrômetros de infravermelho possuem uma fonte de radiação infravermelha que é geralmente um material sólido inerte aquecido eletricamente a uma temperatura entre 1.500 e 2.200 K, o resultado é uma radiação contínua. O emissor de Nernst é uma fonte composta principalmente de óxidos de terras raras como o zircônio, ítrio e tório; e o emissor Globar é uma barra de carbeto de silício. A principal desvantagem do emissor de Nernst é o fato de que a emissividade dos óxidos é bastante baixa, acima de 2000 cm. Se a região abaixo de 2000 cm! é de interesse, a melhor fonte é um emissor Globar. Outros materiais para emissão também tem sido utilizados com sucesso, como o arco de mercúrio e a lâmpada de filamento de tungstênio. Todas estas fontes são emissores bastante eficientes de radiação infravermelha (COLTHUP, 1990; GRIFTHS, 2007, STUART, 2004). 3.2.4.1.2 Interferômetro O interferômetro mais comum usado em espectroscopia FT-IR é o interferômetro de Michelson, que consiste em dois espelhos (um fixo e um móvel) e um divisor de feixe (beam-splitter) que transmite 50% da radiação incidente da fonte para o espelho móvel e reflete os outros 50% para o espelho fixo. Os espelhos, por sua vez, refletem os dois feixes para o divisor, onde se recombinam. Se os dois espelhos encontram-se 'equidistantes do divisor, as amplitudes | combinam-se construtivamente. Se o espelho móvel mover-se a uma distância de 1/4 do divisor, as amplitudes combinam-se destrutivamente. Para a radiação no infravermelho, a soma de todas as interações construtivas e destrutivas para cada componente resulta num 51 sinal complexo denominado interferograma. Após a aquisição do interferograma, é aplicada a transformada de Fourier que converte os dados obtidos no interferômetro em um espectro ou padrão de absorção da amostra, que relaciona a intensidade versus frequência (número de onda) (Figura 19) ( WATERWEG, 2003; GRIFTHS, 2007). Espelho fixo (A) Espelho móvel Amostra 8=0 s=kAS=kA Pita da Toto dot Detector -— — + i RR A La ta ua 1 Divisor de feixe 1 A ! o | ' Fonte i | 1 Frequência única ! 1 i S=4A 1 Hv) (5) 1 (B) (C) Sinal do detector ”-4 v | S=kà Fonte de luz branca lv) WS) (D) Sinal do detector Fa E s=0 5 Figura 19 — Princípio de funcionamento de um Interferômetro de Michelson consistindo de uma fonte de luz, divisor de feixe, espelho fixo, espelho móvel, detector e amostra (A). Uma fonte de luz com frequência única (B) é modulado para um sinal senoidal observada pelo detector (C). Uma fonte de luz branca (por exemplo, proveniente de uma fonte globar) é transformado para o interferograma (D). Fonte: (NAUMANN, 2000) s4 3.2.6 Análise Espectral 3.2.6.1 Interpretação A combinação das vibrações fundamentais ou rotações de vários grupos funcionais e as sutis interações destes grupos funcionais com outros átomos da molécula resultam, em geral, em um espectro IR complexo que precisa ser interpretado. Felizmente, a interpretação do espectro é simplificada pelo fato de que as bandas que aparecem geralmente podem ser atribuídas a determinadas regiões de uma molécula, produzindo o que são conhecidas como grupos de frequências (STUART, 2004). Os principais grupos de frequências associado aos grupos funcionais são apresentados na tabela 5. Tabela 5 — Principais grupos funcionais e suas respectivas energias vibracionais. Fonte: COATES, 2000. Grupo Funcional Grupos de frequência [eu Hidroxila (estiramento O-H) 3570-3200 Carbonila Aldeídos 1740-1725/(2800-2700º) Cetonas 1725-1705 Carboxila Ácidos carboxílicos 1725-1700 Amino (estiramento N-H) 3400-3380? Amida (estiramento C=0) 1680-1630 Sulfidril (estiramento S-H) 2600-2550 Fosfato (estiramento P=0) 1350-1250 a Ana. tati É : ci : Banda de alta frequência característica de aldeídos, associado com o aldeídico terminal (estiramento C-H). * amino primário. 55 3.2.6.2 Pré-processamento espectral A manipulação de espectros envolve alterações ou execuções de cálculo sobre o espectro original. O objetivo de manipular um espectro é melhorar a sua aparência, ou extrair mais informações dele. Vários tratamentos podem, então, ser realizados: e Suavização espectral (usando geralmente o algoritmo Savitsky Golay com 9 pontos) — usada para diminuir o nível de ruídos. e Correção de linha de base - usada para evitar a heterogeneidade entre espectros devido ao desvio da linha de base. e Normalização - usada para excluir diferenças de espessura da amostra. Os espectros são normalizados pela banda mais intensa, ou com a mesma intensidade integrada numa dada região espectral. e Derivação - usada para minimizar a variabilidade da linha de base e aumentar a resolução. Em identificação de microrganismos os melhores resultados parecem ser obtidos com a primeira derivada, conforme estudos anteriores já concluídos (MARIEY et al., 2001). Alguns exemplos de tratamento são apresentados na figura 21. Sem suavização espectral Com suavização espectral | é o 8 3 2 9 2 o mr o o o 5 > » o o o s q o 56 Sem normalização Com normalização Sem derivar Com primeira derivada À | A] epa | I Figura 21 — Espectro de bactéria com os diversos tratamentos: suavização espectral, correção de linha de base, normalização e derivação. 3.3 Identificação de bactérias por espectroscopia no infravermelho A espectroscopia no infravermelho tem sido descrita na literatura como uma importante técnica para discriminação e identificação de microrganismos. De acordo com Naumann (2000) e Essendoubi et al.(2007) esta técnica representa um método analítico, não destrutivo e dinâmico para investigar uma população de células com pouca biomassa. Para eles, os espectros de FT-IR fornecem impressões digitais altamente específicas dos microrganismos permitindo a identificação da espécie à sub-espécie, devido a diversidade microbiana ser sempre uma diversidade estrutural e bioquímica. Para Maquelin et al. (2002) um fotomicroscópio acoplado a um espectrômetro de FT-IR fornece um versátil instrumento para a microanálise biológica rápida, com espectros podendo ser obtidos de microcolônias após 6 a 10 h de cultura em placas de ágar (dependendo do tipo de microrganismo), tornando possível a detecção, a enumeração e a diferenciação microbiana dentro de um único instrumento, 59 ser uma ferramenta complementar, rápida e confiável para a discriminação de microrganismos, em nível de espécies e sub-espécies. Amiali et a/ (2007) identificou e discriminou 92 cepas de Staphylococus aureus e Staphylococcus coagulase negativa de isolados clínicos, incluindo cepas resistentes a antibióticos, com 100 % de diferenciação. Os resultados indicam uma alta eficácia para a discriminação entre Staphylococcus e oferece uma nova, rápida e simples ferramenta para a diferenciação entre bactérias no diagnóstico clínico. Rebuffo-Scheer et al. (2007) identificou 28 cepas ATCC de 10 diferentes espécies do gênero Mycobacterium, incluindo as espécies mais frequentes isoladas em laboratórios clínicos. Uma excelente reprodutibilidade foi alcançada, uma clara separação das diferentes espécies foi observada. Estes resultados demonstram o potencial de 'microespectroscopia FT-IR para diferenciar rapidamente Mycobacterium. Os resultados sugerem que um banco de dados de espectro estendido, contendo as espécies mais comuns de Mycobacterium e abrangendo uma ampla variação biológica, pode fornecer uma solução prática para identificar rapidamente Mycobacterium de isolados desconhecidos na rotina de laboratórios clínicos. Bosch e colaboradores (2008) identificou bactérias Gram-negativas isoladas de amostras de secreção de pacientes com fibrose cística. Para o estudo foram utilizados 15 cepas de referência e 169 isolados clínicos de 150 pacientes, com 98,1% de amostras identificadas corretamente. Segundo Bosh o método desenvolvido no estudo demonstrou ser confiável, rápido e preciso para uso prático na diferenciação e identificação de bactérias Gram-negativas. Recentemente Khum et al (2009) identificou Yersinia enterocolitica e outras espécies de Yersinia, tais como: Y. pseudotuberculosis, Y. bercovieri, e Y. intermédia associado a redes neurais artificiais. Foram analisadas 123 cepas de Yersinia isoladas de pacientes humanos e porcos, com 98,3 %, 92,5% e 98,5% das amostras classificadas corretamente. Para Khum et al a espectroscopia FT-IR é um método flexível para a identificação de bactérias com gêneros, espécies ou sub- espécies diferentes. 3.3.1 Análise Estatística Multivariada 60 A discriminação entre microorganismos exige uma avaliação e uma comparação completa entre as diferenças e similaridades espectrais. Com esta finalidade, os espectros de alta qualidade de IR são pré-requisitos, que necessitam ser complementados com técnicas de compressão de dados e reconhecimento padrão. Vários métodos estatísticos são utilizados para o reconhecimento padrão de bactérias por espectroscopia FT-IR. Entre os métodos usados frequentemente estão: análise de cluster (Hierarchical Cluster Analysis — HCA), análise de componentes principais (Principal Component Analysis — PCA) e as redes neurais artificiais (Artificial Neural Networks - ANNs). PCA e HCA são métodos usados para avaliação de similaridade entre os espectros, onde são calculadas as distâncias espectrais tornando possível a identificação de um microrganismo desconhecido. Para a HCA normalmente são utilizadas as primeiras derivadas de ordem espectral e o algoritmo Ward's com dimensionamento de primeiro intervalo (scaling to first range) são aplicados. ANN são utilizados como sistema de auto-treinamento supervisionado, este tipo de inteligência artificial são inspirados na estrutura neural de organismos inteligentes e que adquirem conhecimento através da experiência; após um número adequado de ciclos de treinamento os espectros do conjunto de validação são testados (BEEKES; LASCH: NAUMANN, 2007; MARIEY et al., 2001; OUST etal., 2004). Mariey et al. (2001) em um estudo de revisão apontou o método HCA como o mais utilizado em estudos para identificação de microrganismos, com discriminação entre classes realizadas com sucesso. Nos últimos anos este método também sido utilizado com frequência, foram relatados nos trabalhos de: Ngo-Thi, Kirschner e Naumann (2003), Maquelin et al. (2003), Oust et al.(2004), Sandt et al. (2006), Rebuffo-Scheer et al. (2007) e Bosh et al (2008). Como exemplo a figura 23 apresenta um dendograma, resultado da HCA executado em 240 espectros de cepas diferentes de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e Leveduras, onde cada ramo representa uma cepa. A HCA foi executada usando-se a primeira derivada, sobre as escalas espectrais de 3000-2800, 1500-1400 e 1200-900 cm. As escalas espectrais foram equalizadas e o algoritmo Ward's aplicado. 61 Heterogeneidade e r 0005€ H 0000€ H 000sT - 00007 - 00051 - 00001 - 0005 > Cit. feundii 1 E, coli Gram-negativa > Ps. fluorescens Ps. aeruginosa, Str. faecalis Str. pyogenes Bac. subtilis St. aureus Gram-positiva St. aureus St. epidermidis. In ===. TVA Candida albicans Candida tropicalis Candida kefyr Candida glabrata Candida krusci Candida parapsilosis Leveduras Ward's Algorithim Frequency Ranges (Weights) = Secaling to Istrange 1200 - 900/em (1.0) st Derivative 3000 - 2800/em (1.0) 1500 - 1400em (1,0) Figura 23 — Dendograma resultado da análise de cluster (HCA) de células microbianas intactas. Fonte: (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007) 64 3 alçadas diluição em homogeneização 5 yl em janela Amostra em 120 ul de em agitador de de CaF, estufa a 50ºC salina 0,9% tubos por 1 hora Figura 25 — Etapas da preparação de amostra bacteriana para análise em FT-IR. 4.3 Microespectroscopia no infravermelho e mensuração Os espectros das amostras de bactérias em cultura pura foram obtidos em modo de ponto por transmissão, em cultura mista o modo de imagem foi associado, no intervalo de 4000-900 cm”, com 32 varreduras realizadas e resolução de 4 em! utilizando o espectrofotômetro Spectrum Spotlight 400 FT-IR (Perkin Elmer) equipado com detector MCT operando a temperatura do nitrogênio líquido (Figura 26). Para o modo de imagem uma área de 50 um X 50 um foi selecionada com o tamanho do pixel de 6,25 um? e velocidade do interferômetro de 1cm/s. Amostra I Perkincimor Figura 26 - Espectrofotômetro utilizado no experimento (Spectrum Spotlight 400, Perkin Elmer). 65 4.4 Tratamento dos dados e análise estatística Para o estudo em cultura pura, vinte espectros de cada amostra foram incluídos para análise, totalizando 360 espectros de seis cepas bacterianas estudadas em triplicata. Para o estudo de cultura mista, vinte espectros em modo de ponto de cada amostra foram incluídos para análise e um registro de imagem (64 espectros) de cada amostra foi utilizada, totalizando 756 espectros (180 espectros em modo de ponto e 576 espectros em modo de imagem) de cepas puras e mistas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus estudadas em triplicata (total de espectros estudados sumarizados na tabela 7). Os espectros da matriz de imagem foram extraídos no programa Cytospec em extensão Jcamp.dax. Os espectros em modo de ponto e modo de imagem, em extensão Jcamp.dx foram tratados utilizando o programa estatístico OPUS (versão 4.2, Bruker). Para minimizar a heterogeneidade espectral devido às diferenças de espessura da amostra foram feitas as correções de linha de base seguidos de normalização vetorial em todo range espectral e para tornar visível as variações entre os espectros o cálculo da primeira derivada com 9 pontos de suavização espectral foi realizado. Os dados foram analisados estatisticamente através da análise de cluster, três regiões espectrais discriminantes foram selecionadas: 3000-2800 cm!, 1470-1410 cm! e 1176-950 cm”, para calcular a distância da matriz. O dimensionamento de primeiro intervalo (Scaling first range) e o algoritmo Ward's foi aplicado. O algoritmo Ward's produz grupos de dados buscando minimizar a soma das diferenças (heterogeneidade) entre os elementos de cada grupo e o valor médio do grupo, minimizando o desvio padrão entre os dados de cada grupo formado, construindo grupos mais homogêneos (WARD, 1963). As atribuições de banda foram realizadas de acordo com a literatura e indicadas na tabela 8. 66 Tabela 7 — Sumários dos estudos realizados, espectros coletados e modo de aquisição. Cultura Pura Bactéria Modo de Número de espectros Número total aquisição coletados por amostra de espectros (triplicata) Escherichia coli Point mode Proteus mirabilis Point mode 20 60 Pseudomonas Point mode 20 60 aeruginosa Enterococcus Point mode 20 60 faecalis Staphylococcus Point mode 20 60 aureus Staphylococcus Point mode 20 60 epidermidis Total de espectros: 360 Bactéria Cultura Mista Modo de Número de espectros aquisição coletados por amostra Número total de espectros (triplicata) Escherichia coli Point mode 20 Escherichia coli Image mode 64 (imagem 50 X50 um?) 192 Staphylococcus Point mode 20 60 aureus Staphylococcus Image mode 64 (imagem 50 X50 um?) 192 aureus Escherichia coli + Point mode 20 60 Staphylococcus aureus (mista) Escherichia coli + Image mode 64 (imagem 50 X50 um?) 192 Staphylococcus aureus (mista) Total de espectros: 756 69 As amostras foram depositadas em janelas de fluoreto de cálcio (CaF>) e foram analisadas da região de 4000-900 cm”, região de transições fundamentais e transparência da janela no infravermelho, conforme figura 28. 19 $3) g Influência de Influência de Influência de 8 o vibrações da vibrações da vibrações da 2 º molécula de molécula de molécula de 9 Ho0 do CO; do H,0 do Be. ambiente ambiente ambiente 2s 5 | 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm”") Figura 28 — Espectro de absorção da janela de CaF» utilizada neste trabalho, sendo a mesma transparente na região espectral de interesse, situada entre 4000-900 em”, os ruídos presentes no espectro são devido a vibrações das moléculas de H,O e CO, do ambiente. Antes da obtenção do espectro da amostra o espectro de fundo (background) foi realizado para subtração de qualquer influência de vapor de água (H50) e gás carbônico (CO») do ambiente. A figura 29 mostra um típico espectro de fundo. e Influência de 8d vibrações da . molécula de Influência de Co, do s+4 vibrações da ambiente molécula de 2. H,O do “q ambiente Influência de vibrações da molécula de H,0 do 24 ambiente 4000 as00 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm!) Figura 29 — Espectro típico de fundo. 70 Em filmes de bactérias Gram-negativas foram realizadas medidas aleatórias devido à uniformidade dos filmes, porém em filmes de bactérias Gram-positivas foram realizadas medidas nas bordas onde apresentaram regiões com bandas e contornos de bandas bem definidos (figura 30 e 31). Ainda na figura 30 a presença do mesmo padrão espectral dos vinte espectros realizados na mesma amostra e a consistência entre as intensidades relativas das bandas demonstram a reprodutibilidade das medidas espectrais. Nas figuras 31 A e B apresentam os filmes e os espectros das regiões de borda e centro de Staphylococcus aureus (bactéria Gram-positiva), pode-se observar em 36 (A) que no centro da amostra na região de 1200-900 cm! não há definição de bandas e contornos de bandas ao passo que em 36 (B) nos espectros da borda da amostra já se observam bandas e contornos bem definidos, justificando a aquisição espectral nesta área. (A) 00 om 006 is a ai A ja. Sr 67] DR PS Unidades de absorbância or 0% 00 am so emo ao amo 15oo tão Número de onda (cm”") Unidades de absorbância om am oo om om qm sm o amo am am são mo Número de onda (cm'”) Figura 30 — (A) Mapa da amostra de Proteus mirabilis associado aos vinte espectros realizados aleatoriamente na amostra, (B) mapa da amostra de Staphylococcus aureus associado aos vinte espectros realizados aleatoriamente na borda da amostra. A 8 Região sem definição de bandas g 8 ã 8 ê £ $ Ê 5 Número de onda (cm"!) Região com definição de bandas Unidades de absorbância Número de onda (cm”") Figura 31 — Regiões do filme fino de Staphylococcus aureus. (A) centro da amostra associado ao espectro (B) borda da amostra associado ao espectro. A figura 32 ilustra um espectro característico de filme fino de bactéria utilizada no estudo com as principais bandas de vibrações moleculares. Unidades de absorbância 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm?!) Figura 32 - Espectro característico de bactéria com as principais bandas de vibrações moleculares. 74 3 1715 vs (C=0) de ésteres, Ácidos nucléicos (DNA: núcleo e RNA/DNA, plasmídeo, RNA: ribossomos e O citoplasma) —c? OH -1695 Amida | (vs C=O e à Proteínas (apêndice, parede celular, -1685 N-H) componentes ribossomos, inclusões) -1675 resultantes de folha-B de proteínas 4 -1655 Amida | de estruturas o-hélice 5 1548 Amida II (ôs N-H e v; C- Proteínas (apêndice, parede celular, N) ribossomos, inclusões) 1515 Banda “Tirosina” Proteína (aminoácido) 6 1468 da de C-Hse à de CH, Proteínas (apêndice, parede celular, ribossomos, inclusões) Carboidratos (polissacarídeos em cápsula, parede celular e inclusões) -1400 vs (C=0) de COO” Proteínas (apêndice, parede celular, ô. de C-Hse d, de CH, ribossomos, inclusões) Carboidratos (polissacarídeos em cápsula, parede celular e inclusões) 1310-1240 Amida III Proteínas (apêndice, parede celular, ribossomos, inclusões) 1250-1220 va (P=O) de TPOy Ácidos nucléicos (DNA: núcleo e plasmídeo, RNA: ribossomos e citoplasma) Lipídios (fosfolipídios em membrana citoplasmática e membrana extema de Gram-negativas) 7e8 | 1200-900 vs (C-0), vs (C-C), Carboidratos (polissacarídeos em cápsula, v: (C-O-C) e (C-O-P) parede celular e inclusões) 1085 vs de (P=O) de "PO; Ácidos nucléicos (DNA: núcleo e plasmídeo, RNA: ribossomos e citoplasma) Lipídios (fosfolipídios em membrana citoplasmática e membrana extema de Gram-negativas) v= estiramento, ô = deformação, a=assimétrico, s=simétrico. A figura 34 apresenta os espectros médios de FT-IR das bactérias utilizadas neste estudo. Uma rápida inspeção dos espectros demonstra que eles são muitos semelhantes. No entanto, numa análise mais cuidadosa, mudanças sutis podem ser observadas. Analisando a região espectral de 4000 a 3000 cm! (estiramento O-H e N-H), não foi notada alteração significativa para as diferentes bactérias, entretanto Unidades de absorbância 75 na região de 3000 a 2800 cm! (estiramento C-H de CH; e CH) e 1470-1410 cm! (deformação C-H de CH, e CHs), observam-se alterações em relação à intensidade relativa e contornos de banda nos espectros; as demais bandas não apresentaram mudanças significativas. Além das mudanças em relação à intensidade e contornos de bandas, através da análise dos espectros das bactérias podem-se notar padrões semelhantes em contornos de banda entre os grupos das bactérias. Em alguns aspectos podem-se diferenciar os grupos de bactérias por meio das alterações de intensidade (aumento ou diminuição) relativas de algumas destas bandas ou picos. As bactérias Gram- positivas na região de estiramento CH>-CHs (3000-2800 cm) apresentam a mesma intensidade entre os picos, característica não observada nas bactérias Gram- negativas que apresentaram um aumento de intensidade na banda e no segundo pico desta região. Na região de deformação CH>-CHs (1470-1410 em?) os grupos de bactérias também podem ser diferenciados, no primeiro pico desta região as bactérias Gram-positivas apresentam uma diminuição na intensidade do pico em relação às bactérias Gram-negativas e um aumento na intensidade do segundo pico desta região. 0,16 Staphylococcus epidermidis Enterococeus faecalis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Escherichia coli T T T T T T 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm?) Figura 34 — Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis (espectro Unidades de absorbância Unidades de absorbância 76 médio de uma amostra). Os dados foram transladados ao longo do eixo Y para melhor visualização. v = estiramento e ô = deformação. A fim de tornar pequenas diferenças espectrais visíveis, a primeira derivada de ordem espectral foi calculada. Na análise de primeira derivada observaram-se diferenças significativas, além das regiões mencionadas, na região de 1176-950 em! (região mista) (Figura 35). Analisando a primeira derivada notaram-se novas características e confirmaram- se as características observadas nos espectros sem derivação. Na figura 35 (A) as bactérias Gram-negativas apresentaram maior intensidade na banda de estiramento assimétrico e simétrico C-H de CH> (lipídios, proteínas e carboidratos). Em contrapartida as bactérias Gram-positivas apresentaram um aumento de intensidade na região atribuída ao estiramento simétrico C-H de CHs (lipídios e proteínas). Na figura 35 (B) as bactérias Gram-negativas mostraram maior intensidade da banda relacionada à deformação assimétrica C-H de CH; e deformação simétrica C-H de CHa, além da ocorrência de um ombro em -1420 cm”!. Na figura 35 (C) ocorreram alterações em intensidade e contornos de banda, principalmente na região de -1085 cm! atribuída ao estiramento simétrico de P=0. à (CH) e 0010, va Bactérias Gram-negativas og004. 8, (CH>) 0,0008 ) Ye (CHo) 0,0002. 0,0006 ) 0,0000. 0,0004 ) 0,002) -20002. «20004 Unidades de absorbância -0,0002) -20008 -0,0004 ) OO BO 280” ado” 260 | 260 20 pai tio uso 1450 ao náo ao aãto (A) Número de onda (cm”) (B) Número de onda (cm) 09008 | Y 90004 7 ---- Escherichia coli 00002 ) —— Pseudomonas aeruginosa so] —— Proteus mirabilis Enterococcus faecalis «90002 1 ---- Staphylococcus aureus «00004 | —— Staphylococcus epidermidis 00006] (Cão Ton Tons ado do Número de onda (em') 79 Heterogeneity Amostra tE 'Amostra1E +, jAmostra 1É (Amostra 1E Amostra 1E ! Amostra 1E Amostra 1E Amostra E. »jAmostra1E Amostra tE. Amostra 1E. «Amostra 1É Amosta3E. iAmostra3E. 'Amosta3E Amosta3E. « amostra3E E; jAmostatE ElAmostratE 'AmostraE. tAmostra 1E AmostraE. % JAmostraZE AmostraZE, —AmostraZE. Amostra3E, iAmostra3E, Amostra3E, “+= jAmostra3E P /amostra3E. “| amosta3E jAmostra3E 'Amostra3E, + JAmostraZE. “famostraZE. | tdlamostra3E, “amostraZE, jAmostra1E 'amostrafE, 'AmostrafE, Amostra3E, iAmostra3E. r Amostra3E, [| Amostra3E — —amostra3E, Amostra3E, A Data Preprocessing: First Derivative ward's Algorithm Frequency Ranges (Heights) = Correlation with 3000 - 2800 /cm (1.0) Scaling to Ist range 1470 - 1410 /em (1.0) Method File = TEMPVIEW.CLA 1176 - 950 /em (1.0) Figura 37 - Dendograma resultado da análise de cluster da triplicata de Escherichia coli, 20 espectros gravados em cada triplicata em modo de ponto. A análise de cluster foi realizada utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de 3000-2800 em”, 1470-1410 cm”, 1176-950 cm”. As amostras foram agrupadas aleatoriamente 5.2 Diferenciação de culturas puras e mistas Neste estudo três inoculações foram examinadas em triplicata: (a) Escherichia coli, (b) Staphylococcus aureus e (c) cultura mista de ambas (Escherichia coli e Staphylococcus aureus) com 50% de cada. As amostras foram analisadas em modo 80 de ponto e em modo de imagem, em modo de ponto o espectro da amostra é a média de uma área de 100 um? e em modo de imagem o espectro é o resultado de uma área de 6,25 um? (tamanho do pixel) ideal para se investigar amostras com composição heterogênea. A figura 38 mostra os filmes finos de cada triplicata utilizada no estudo. Figura 38 — Micrografia dos filmes finos de Escherichia coli (A), Staphylococcus aureus (B); e Escherichia coli e Staphylococcus aureus (C). Analisando os filmes de cultura mista (figura 38 C) é possível observar a associação das linhas características do filme de Escherichia coli (figura 38 A) com o centro do filme de Staphylococcus aureus (figura 38 B). A figura 39 apresenta os espectros médios (em modo de ponto) de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e cultura mista de Escherichia coli e Staphyloccocus aureus. Como em culturas puras as principais diferenças espectrais entre as amostras foram observadas na região de estiramento C-H de CH> e CH: (3000-2800 cm”) e deformação C-H de CH> e CHs (1470-1410 cm!). Os espectros da amostra 81 mista se assemelham ao espectro de Escherichia coli, esta semelhança pode ser justificada pelo provável aumento de E. coli na cultura. Visto que o tempo de geração de E. coli é menor que o de Staphylococcus aureus, 20 minutos (KAYSER et al., 2005) e 30 minutos (TATINI; STEIN; SOO, 2006), respectivamente. Na região de estiramento C-H de CH, e CHs o espectro de Staphylococcus aureus apresenta a mesma intensidade entre os picos e Escherichia coli apresenta maior intensidade na banda e nos picos e o segundo pico mais intenso. O espectro da junção de Escherichia coli e Staphylococcus aureus apresenta a banda e o segundo pico um pouco mais intenso quando comparado ao espectro de Escherichia coli. Na região de deformação C-H de CH> e CH: o espectro de Staphylococcus aureus apresenta o primeiro pico menos intenso e o segundo mais intenso quando comparado aos demais. O espectro de Escherichia coli comparado ao espectro da junção das bactérias apresenta o segundo pico mais intenso. 0,12 0,104 s e 0,084 «g e & 0,06) 5 CH; 2 -CHs Uv O 0,044 ND o To S 0024 5 Staphylococcus aureus 0,00 Escherichia coli + Staphylococcus aureus -0,02 À Escherichia coli T T T T T T T T T ” T 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm?) Figura 39 — Espectro FT-IR representativo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Escherichia coli com Staphylococcus aureus (espectro médio de uma amostra). Os dados foram transladados ao longo do eixo Y para melhor visualização. v = estiramento e ô = deformação. 84 dendrograma mostra uma clara discriminação entre as inoculações examinadas. Todas as amostras foram agrupadas corretamente, as triplicatas de cada bactéria foram organizadas no mesmo cluster e aleatoriamente. Os dados de cultura mista se aglomeraram no mesmo ramo de Escherichia coli, confirmando as semelhanças espectrais. Não houve nenhuma aglomeração de espectros de cultura mista dentro do cluster de Escherichia coli ou Staphylococcus aureus, indicando uma provável identificação em cultura mista. Heterogeneity Escherichia coli | Mista | Staphylococcus aureus Figura 41 — Dendograma resultado da análise de cluster das três inoculações examinadas em triplicata, 20 espectros gravados em cada triplicata em modo de ponto. A análise de cluster foi realizada utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de 3000-2800 cm”, 1470-1410 cm”, 1176-950 cm”. 5.2.1 Culturas mistas e análise de imagem FT-IR Com o objetivo de identificar bactérias em cultura mista o estudo no modo imagem foi realizado. As figuras 42, 43 e 44 apresentam os mapas de absorção química de uma região de 50um? x 50 um", representativos das triplicatas associado 85 à imagem do filme e aos 64 espectros extraídos da matriz. As diferentes cores no mapa indicam diferenças na absorção da luz infravermelha na amostra, que variou entre 0,4 a 1,0. A região branca do mapa indica uma região com maior absorção da radiação infravermelha e região roxa com menor absorção. As pequenas variações de absorção nos mapas indicam uma pequena diferença de espessura e, portanto homogeneidade da amostra. Os espectros extraídos da matriz também confirmam esta homogeneidade através da reprodutibilidade espectral. ns 0404 vam os os a os8c 010 Unidades de absorbância o cos o: 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm?) Figura 42 — Filme fino de Escherichia coli associado ao mapa de absorção química de uma amostra (resolução espacial de 50 X 50 um?) e aos 64 espectros extraídos da matriz. [| ] Área da amostra analisada. ae 3885 2214 2384 2374 pata 2215 2785 ame 2785 ares Unidades de absorbância 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Número de onda (cm?) Figura 43 — Filme fino de Staphylococcus aureus associado ao mapa de absorção química de uma amostra (resolução espacial de 50 X 50 um?) e aos 64 espectros extraídos da matriz. [ ]Áreada amostra analisada. 86 89 Unidades de absorbância Unidades de absorbância Número de onda (cm!) Número de onda (em?) pndatm) Unidades de absorbância. Número de onda (cm) Figura 46 - Espectros de primeira derivada da cultura mista mostrando regiões espectrais heterogêneas (-1450 cem! 1176-950 cm”). O dendograma da figura 47 apresenta os resultados da análise de cluster realizada em 576 espectros extraídos da matriz de imagem das três inoculações examinadas, como no modo de ponto as amostras analisadas foram agrupadas corretamente, os espectros da cultura mista foram aglomerados no mesmo ramo de Escherichia coli e não foi observada a aglomeração de nenhum espectro de cultura mista em cultura pura, indicando que as bactérias estão misturadas, sobrepostas em 6,25 um? e o espectro é uma composição delas. 90 Heterogeneity 8 cosst coort Escherichia coli Mista = ren Staphylococcus aureus Figura 47 - Dendograma resultado da análise de cluster das três inoculações examinadas em triplicata em modo de imagem, 64 espectros extraídos de cada mapa de absorção química. A análise de cluster foi realizada utilizando a primeira derivada de ordem espectral considerando os ranges espectrais de 3000-2800 cm'!, 1470-1410 cm”, 1176-950 cm”. 91 6 DISCUSSÃO Neste trabalho realizou-se um estudo sobre o potencial da microespectroscopia FT-IR na identificação rápida de bactérias. Os resultados ilustram o enorme potencial da técnica para uma rápida e correta identificação bacteriana em culturas puras e diferenciação entre culturas puras e mistas. O estudo foi realizado em triplicatas, obtendo-se excelentes resultados. Foram analisados estatisticamente 1116 espectros de FT-IR de culturas com 6 horas de incubação, obtendo-se a correta identificação em 100% das amostras. Um tempo relativamente menor quando comparado às técnicas tradicionais de identificação com tempo de incubação de 24 horas e aproximadamente 6 horas de provas bioquímicas para a identificação. Esta redução de tempo na identificação bacteriana é significativamente importante em ambientes como Unidade de Terapia Intensiva, onde ocorrem eventos adversos com necessidade de rápida intervenção. Estudos recentes têm demonstrado este potencial da espectroscopia no infravermelho em identificar bactérias com alta especificidade. A maioria dos estudos indica a técnica de FT-IR como uma ferramenta com um enorme potencial para o diagnóstico clínico (REBUFFO-SHEER et al, 2007; BOSH et al, 2008; KUHM et al, 2009). Os resultados do estudo de cultura pura corroboram com os apresentados por Erukmovitch et al. (2005), Helm et a! (1991), Maquelin et al. (2003), Ngo-Thi, Kirschner, Naumann (2003) e Sandt et al. (2006), os quais diferenciam e identificam, por FT-IR, as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e apontam esta técnica como uma importante ferramenta para análise microbiológica rápida e importante para o sucesso da terapia. Em relação ao tempo de incubação dos microrganismos, neste trabalho todos os microrganismos foram cultivados por seis horas, uma vantagem em relação aos demais trabalhos que variam o tempo de incubação entre 6 a 10 horas dependendo do microrganismo, utilizando uma técnica diferente de preparação de amostra (SANDT et al, 2006; MAQUELIN et aí, 2003; NGO-THI, KIRSCHNER, NAUMANN 2003). 94 Al Qadiri et al (2006 b) analisou uma cultura mista de Alicyclobacillus acidoterrestris e Alicyclobacillus spp. com variações espectrais nestas mesmas regiões, e com 80% das amostras classificadas corretamente utilizando novamente PCA e SIMCA para classificação espectral. Nenhum dos trabalhos reportou as diferenças dos contornos de banda nos espectros de cultura mista. Não foram encontrados na literatura estudo de cultura mista em modo de imagem. O modo de imagem é um modo relativamente novo em espectroscopia, que tem sido relatado em estudos com diferentes tipos de tecidos em linfonodos axilares (BIRD et aí, 2008 e 2009 ) e em placas ateromatosas em carótidas (ALÔ et al, 2009). Nestes trabalhos foram realizados a análise de cluster para análise dos dados e regiões discriminantes foram selecionadas. Em Bird et al (2009) todos os espectros foram convertidos em sua 1º derivada, normalizados vetorialmente e para a análise de cluster no programa CytoSpec o algoritmo Ward's foi aplicado. Em bactérias apenas o trabalho de Gilbert et al (2009) foi encontrado. Neste trabalho foram discriminadas três diferentes cepas de E. coli com tempo de incubação de 24 horas através da análise de componentes principais. Embora os resultados do nosso estudo sejam animadores, uma base de dados de espectros vibracionais de uma ampla gama de microrganismos com cepas clínicas e de coleção, sensível ou resistente a determinados antibióticos, são necessários. Podendo então tornar possível a identificação de agentes causais de infecções em ambientes clínicos. 95 7 CONCLUSÃO A Microespectroscopia FT-IR associada à análise de cluster mostrou-se uma ferramenta efetiva na discriminação e identificação de bactérias em culturas puras e na identificação de culturas puras e mistas com mínima manipulação de amostra e com tempo de incubação de apenas 6 horas e com 100% das amostras classificadas corretamente. No estudo de cultura pura através da avaliação da primeira derivada de ordem espectral, principalmente na região de estiramento assimétrico e simétrico C-H de CH», foi possível diferenciar as bactérias em dois principais grupos. Apesar dos espectros serem muito semelhantes, principalmente espectros de bactérias com a mesma composição de parede celular, a análise de cluster foi sensível o suficiente para a correta classificação. Os espectros das seis bactérias estudadas e as triplicatas foram agrupados corretamente demonstrando um excelente nível de reprodutibilidade do método. Os espectros e o dendograma refletiram diferenças entre os grupos das bactérias Gram-positivas e Gram- negativas. No estudo de cultura mista os espectros se apresentaram distintos de culturas puras e foram observadas regiões heterogêneas que sugerem maior concentração de um determinado microrganismo. Não foram observadas aglomeração de nenhum espectro da cultura mista em cultura pura, portanto não houve identificação de bactérias presentes na cultura mista com estas metodologias empregadas. Tanto no estudo de cultura de pura quanto no estudo de cultura mista a técnica de preparação de cultura e de amostra associada à metodologia de pré- processamento espectral e análise de dados foi essencial na classificação 100% correta das amostras. 96 8 SUGESTÕES/TRABALHOS FUTUROS Uma alternativa potencial para a identificação de microrganismo em cultura mista por microespectroscopia FT-IR é apontada por Beekes, Lasch e Naumann, 2007 (2007). De acordo com os autores as culturas mistas podem ser analisadas pela mensuração de microcolônias (50-100 um de diâmetro) crescendo separadamente em meio sólido, para isto os inóculos são diluídos e as microcolônias são estampadas em placas de Agar em janelas transparentes no infravermelho. A figura 48 apresenta a identificação de microrganismo em culturas mistas contendo três tipos diferentes de microrganismo depositados em janela de BaF> pela técnica de estampa (figura 49). fc) Hierarchical Clustering Heterogeneity Z E g o 5 ss g 00 F fa) Escherichia / coli ) Streptococcus / faecalis. |) susinioces + aureus Wars Algoridtem Frequency Ranges Choighs) = Seilimgto [st renge 1200. 1000/em (1.0) 1a Derivative 3000 280nem (1.0) 1500: gg/em (110) 1: St aureus 2: Str fuecalis Absorbance T T T T 800 1000 1200 1400 1600 1800 wavenumber/cm! Figura 48 — Identificação de três diferentes microrganismos em cultura mista pela técnica de estampa. Fonte: (BEEKES; LASCH; NAUMANN, 2007)