Notas de aula bioquímica, Manuais, Projetos, Pesquisas de Bioquímica

Baixe Notas de aula bioquímica e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Bioquímica, somente na Docsity! 1 CURSO: Licenciatura em Química DISCIPLINA: Bioquímica I – 1º. Semestre DOCENTE: profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. da Silva 1a Aula prática PROTEÍNAS: REAÇÕES DE COLORAÇÃO E PRECIPITAÇÃO Objetivos: • Caracterizar a presença de proteínas em material biológico. • Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação. • Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais, estrutura e isolamento de proteínas. 1 Reações de coloração de proteínas Devido às ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos, as proteínas reagem com uma variedade de compostos formando produtos coloridos. Algumas reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na composição das proteínas, por exemplo: reação xantoproteica (tirosina, triptofano e fenilalamina), reação de Millon (tirosina), reação de Hopkins-Cole (triptofano), reação de Sakaguchi (arginina), etc. Estas reações são importantes tanto na detecção como na dosagem de aminoácidos e proteínas. Outras reações, mais importantes, são aquelas chamadas de gerais, porque irão caracterizar grupamentos comuns a todas as proteínas, ou seja, grupos amino e ligações peptídicas. 1.1 Reação da ninhidrina A reação que caracteriza grupos amino, reação da ninhidrina, é de extrema importância na análise de proteínas e aminoácidos. Esta dará positiva para grupos α amino de aminoácidos livres, grupos amino terminais de peptídeos e proteínas e grupos ε amino da lisina, presentes em proteínas. A amônia e o sulfato de amônio, este último um reagente muito empregado na purificação de proteínas, também desenvolvem cor com ninhidrina. A reação da ninhidrina é bastante sensível, podendo ser utilizada para mostrar a presença de aminoácidos em líquidos biológicos desproteinizados, ou para acompanhar o curso da hidrólise de uma proteína. Quando uma solução de ninhidrina é aquecida em mistura com uma solução de aminoácido, peptídeo ou proteína, desenvolve-se uma coloração AZUL VIOLÁCEA característica. O mecanismo de reação e formação da púrpura de Rühemann pode ser representado do seguinte modo: 2 Nota: com a prolina e hidroxiprolina, que são iminoácidos, forma-se um produto de cor amarela. Reativos: • Solução de ninhidrina a 0,1 % em tampão fosfato pH 7,0 (10 mM). • Solução de proteínas: clara de ovo a 10% v/v em solução salina 0,9%. • Solução de glicina 0,1%. Técnica: 1. Numerar 2 tubos de ensaio. No primeiro colocar 2 mL da solução de ninhidrina, juntar 5 gotas de proteínas e ferver em chama direta durante 2 minutos. Observar o aparecimento da coloração azul violeta. 2. No segundo tubo, colocar 2 mL da solução de ninhidrina, juntar 5 gotas de glicina e ferver em chama direta durante 2 minutos. Observar o aparecimento de coloração azul violeta forte. l.2 Reação do biureto A reação do biureto é devido às ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para as substâncias que contêm 2 grupos carbamínicos ( -CO-NH2 ) ligados diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Este é o caso do biureto: 5 As reações de precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desproteinização de líquidos biológicos para análise de componentes não protéicos. Reativos: • Solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo a 10% (v/v) com salina [NaCl 0,9g % (p/v) ]. • Ácido tricloroacético (TCA) a 10% (p/v). • Acetato de Chumbo a 5% (p/v). • Álcool etílico absoluto. Precipitação por ação de calor De maneira geral, o calor pode desnaturar a maioria das proteínas, uma vez que a agitação térmica afeta as interações que estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas, como por exemplo, as pontes de hidrogênio. Técnica: Em um tubo de ensaio colocar 2 mL da solução de proteínas e aquecer diretamente na chama. Observar a formação de coágulo branco de proteína desnaturada. Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides Os reagentes para alcalóides são ácidos que além de precipitarem alcalóides também podem combinar-se com as proteínas que possuam carga positiva (quando o pH da solução estiver no lado ácido do ponto isoelétrico da proteína) formando complexos insolúveis. Exemplos destes reagentes são: ácido pícrico, ácido tânico, ácido fosfotúngstico, ácido sulfossalicílico, ácido tricloroacético, etc. Por exemplo, a reação de proteínas com ácido tricloroacético leva à formação de um tricloroacetato de proteína, que é insolúvel. Técnica: Em um tubo de ensaio colocar 1 mL da solução de proteínas e 1 mL de ácido tricloroacético a 10% (TCA). Observar a formação de um precipitado branco de proteínas desnaturadas. Precipitação por reação com sais de metais pesados 6 Em pH situado no lado alcalino do seu ponto isoelétrico, algumas proteínas combinam-se com cátions de metais pesados, formando proteinatos insolúveis. Por exemplo, o tratamento de uma solução de proteínas com 1 ml de acetato de chumbo leva à formação de um proteinato de chumbo insolúvel. Técnica: Em um tubo de ensaio colocar 1 mL de solução de proteínas e 1 mL de acetato de chumbo a 5%. Observar a formação de um precipitado de proteína desnaturada. Precipitação por ação de solventes orgânicos A adição de solventes orgânicos, como o etanol, éter etílico e acetona, às soluções aquosas de proteínas podem levar à precipitação das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. A força de atração entre partículas com cargas opostas, pode ser expressa como: F = e+ e- /Dr2 ; onde e + e e- são partículas carregadas, D a constante dielétrica e r, a distância entre as cargas. A água tem uma alta constante dielétrica, assim a força de atração entre moléculas proteicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a interação proteína-água em vez da interação proteína-proteína. A adição de solventes pode inverter esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas proteicas. Solventes orgânicos em baixa temperatura (0ºC ou menos) são úteis para a separação de misturas protéicas, porque as proteínas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturação. Entretanto, em temperatura mais elevadas, os solventes orgânicos podem levar à desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica. Técnica: Em um tubo de ensaio colocar 1 mL da solução de proteína e álcool etílico (1 a 3 volumes) até a formação do precipitado de proteínas. 2.2 Reações de precipitação sem desnaturação As proteínas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por ação de solventes orgânicos, como foi explicado anteriormente, variação do pH e por alterações da força iônica do meio. A variação do pH pode ser usada para precipitar proteínas no seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima. As proteínas podem ser ressolubilizadas mantendo as suas características estruturais nativas por uma variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico. Efeito da força iônica sobre a solubilidade das proteínas A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal. A força iônica (I) é dada pela expressão: 7 I = 1/2 Σmi Zi2 sendo mi a molaridade do íon e Zi a sua valência. Em concentração reduzida, os sais aumentam a solubilidade de muitas proteínas, um fenômeno denominado "salting-in", provavelmente devido a interação da proteína com os sais causando diminuição da interação proteína-proteína e, portanto aumentando a solubilidade. Em altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um sal muito solúvel (por exemplo, o sulfato de amônio) a uma solução de proteína, pode ocorrer remoção da água de hidratação das moléculas, o que leva a predominância da interação proteína- proteína, resultando em precipitação. Este efeito é denominado "salting-out". A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitar diferentes proteínas é variável. Exemplo: efeito da força iônica sobre a solubilidade da ovoglobulina. Reativos: • Clara de ovo "in natura" • Cloreto de sódio 1M • Solução saturada de sulfato de amônio 76,6 g% (p/v) Técnica: 1. Solubilização ("salting-in") Colocar 3 mL de clara de ovo em um béquer pequeno. Diluir com pequeno volume de água destilada, agitando suavemente com um bastão de vidro, até notar o aparecimento de um precipitado (globulinas). Adicionar, em seguida, solução de cloreto de sódio, gota a gota, até redissolução do precipitado. Esta redissolução se deve a restauração da força iônica original e corresponde ao fenômeno de “salting–in”. 2. Precipitação (“salting–out”) Pipetar 2 mL da solução obtida na experiência anterior ("salting-in") em um tubo de ensaio. Adicionar, a seguir, 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observar a formação de precipitado de proteínas (globulinas), o que corresponde ao fenômeno de "salting-out". Juntar a seguir 4 a 6 mL de água destilada a fim de recompor a força iônica anterior e como conseqüência, redissolver o precipitado . As globulinas da clara de ovo precipitam com 50% de saturação com sulfato de amônio, enquanto que a ovoalbumina precipita com 100% de saturação com sulfato de amônio.