Técnicas de Análise de Amostras Ambientais, Transcrições de Química Analítica

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Técnicas  de  Preparo  de  Amostras     Extração  com  Solventes*         Resumo       O   objetivo   de   uma   análise   química   é   a   obtenção   de   dados   qualitativos   e/ou   quantitativos   a   respeito   de   um   ou   mais   componentes   de   uma   amostra.   Quando  a  técnica  analítica  escolhida  é  a  cromatografia,  o  procedimento  analítico   pode   ser   usualmente   dividido   em   3   etapas   principais:   pré-­‐cromatográfica,   cromatográfica  e  pós-­‐cromatográfica.       A   etapa   pré-­‐cromatográfica   envolve   a   amostragem,   o   transporte   da   amostra  até  o  laboratório  onde  sera  efetuada  a  análise,  e  a  etapa  de  preparo  da   amostra.   Técnicas   como   LLE,   SPE,   SFE,   ASE,   SPME,   dentre   outras,   são   empregadas  nesta  etapa.      A   etapa   cromatográfica   visa   a   separação   do   analito   de   seus   principais   contaminantes,   gerando   os   dados   necessários   para   a   identificação   e/ou   quantificação.  Técnicas  como  HPLC-­‐UV,  GC-­‐ECD,  LC/MS/MS,  GC/MS  e  outras  são   frequentemente  empregadas.       A   etapa   pós-­‐cromatográfica   visa   tratar   os   dados   qualitativos   e   quantitativos  obtidos.       No   presente   artigo,   uma   revisão   crítica   a   respeito   destas   3   etapas   envolvidas  em  uma  análise  cromatográfica  incluindo  os  fundamentos  teóricos,  a   instrumentação,   vantagens   e   limitações,   e   aplicações   das   principais   técnicas,   é   apresentada  e  discutida  criticamente,  do  ponto  de  vista  do  autor.       _____________________________________________________________________________________________   *  Fonte:   Fernando  M.  Lanças,  “Avanços  Recentes  e  Tendências  Futuras  das  Técnicas   de  Separação:  uma  visão  pessoal”.  Scientia  Chromatographica  vol.  0  número  0,   pag  17-­‐44  (2008).     1.  Introdução       A   segunda  metade   do   século   XX   observou   um   avanço   sem   precedentes   nas   técnicas  de  separação,  devido  aos  novos  desafios  gerados  pelo  aumento  da   população  mundial  e  a  demanda  por  serviços  a  partir  do  incremento  tecnológico   marcante  do  período  Pós-­‐Guerra.  Contrariamente  às  exigências  anteriores  a  este   período,  quase  sempre  razoavelmente  atendidas  por  métodos  físicos  simples  de   análise   como,   por   exemplo,   gravimetria,   a   complexidade   dos   problemas   ambientais,   de   saúde,   alimentação,   energia,   e   muitos   outros,   passou   a   exigir   técnicas   de   análise   mais   complexas.   Esta   necessidade   trouxe   a   exigência   de   técnicas   mais   rápidas,   eficientes   e,   principalmente,   capazes   de   serem   automatizadas  através  de  instrumentos  complexos  indisponíveis  até  a  década  de   1950.   A   popularização   dos   computadores,   graças   aos   preços   tornados   mais   accessíveis,   possibilitou   o   desenvolvimento   de   equipamentos   totalmente   comandados   por   um   computador   pessoal   de   grande   capacidade   de   processar   dados  e  armazená-­‐los,  a  um  custo  o  qual  é  hoje  apenas  uma  pequena  fração  do   custo  da  maioria  dos  equipamentos  que  ele  comanda.       A   complexidade   analítica   não   é   reservada   apenas   à   área   de   instrumentação:   métodos   mais   elaborados   (muitas   vezes   mais   de   um   método   usado  para  a  mesma  análise)   tem  que  ser  desenvolvidos  e  ou  adaptados  a  esta   nova  realidade,  além  de  passarem  por  etapas  extensas  de  validação  antes  do  uso   para  que  os  dados  sejam  reconhecidos  pelas  agencias  governamentais  as  quais   regulamentam  a  aceitação  de  resultados  de  análises  químicas.  No  caso  particular   de  métodos   analíticos   para   emprego   na   área   de   Saúde   Humana,   as   exigências   quanto   à   validação   das   metodologias   são   enormes,   variando   de   um   país   para   outro  e,  muitas  vezes,  de  um  órgão  para  outro  dentro  do  mesmo  país.  Na  análise   de   compostos-­‐alvo   (target   compounds)   presentes   em   matrizes   consideradas   complexas,   como   alimentos,   ambientais,   e   fluidos   biológicos,   regra   geral   o   objetivo  é  analisar  um  ou  alguns  compostos  em  uma  matriz  na  qual  está  presente   em   concentrações   muito   baixas   (geralmente   referida   como   análise   de   traços).   Nestes  casos,  usualmente  é  necessário,  empregar  uma  série  de  etapas,  incluindo:   extração   do   analito   da   amostra,   sua   purificação   para   eliminação   de   potenciais   contaminantes   e   interferentes,   os   quais   podem   comprometer   o   resultado     Neste   volume   inaugural   do   periódico   Scientia   Chromatographica,   cujo   objetivo  é  exatamente  discutir  estas  técnicas  de  preparo  de  amostra,  separação   (LC,  GC,  SFC  e  outras)  e  identificação  (Espectrometria  de  Massas,  dentre  outras),   este  trabalho  visa  apresentar,  de  forma  crítica  e  atual,  segundo  o  ponto  de  vista   do   autor,   os   recentes   avanços   na   área   e   as   tendências   futuras.   Esses   assuntos   serão  ampliados  e  discutidos  em  detalhes  nos  futuros  volumes  do  periódico  em   questão,   através   das   várias   sessões   dedicadas   às   etapas   pré-­‐cromatográficas,   diferentes  técnicas  de  separação  e  etapas  pós-­‐cromatografia.     2.  Técnicas  de  Amostragem       A   amostragem   é,   invariavelmente,   considerada   uma   das   etapas   mais   críticas  do  procedimento  analítico,  uma  vez  que  a  seleção  incorreta  do  material  a   ser  analisado  inviabiliza  qualquer  tentativa  de  correção  posterior  do  problema2.   Deve   ser   lembrado   que   a   amostragem   visa   o   isolamento   de   uma   quantidade   muito   pequena   de   uma   amostra   a   qual   faz   parte   de   um   universo  muito  maior   (exemplo:  alguns  litros  de  água  para  representar  a  condição  de  um  rio  inteiro!!!).   Neste  caso,  o  material  orgânico  presente  na  água  varia  de  ponto  a  ponto  tanto  na   extenção   quanto   na   profundidade,   dificultando   sobremaneira   o   projeto   de   amostragem.  Além  disso,  pelo  fato  do  rio  ser  um  sistema  dinâmico  e  não  estático,   o   momento   da   amostragem   também   é   importante,   o   que   requer   o   registro   também  do  momento  da  amostragem  para  futuras  correlações.     De   forma   análoga,   a   amostragem   de   sedimentos   de   rio   é   uma   etapa   igualmente  complexa  e  difícil,  ampliada  pelo  fato  de  poucos  guias  internacionais   a   este   respeito   (diferentemente   de   água   e   solo).   Apesar   dos   esforços   da   Comunidade  Européia  em  normatizar  as  técnicas  de  amostragem  de  solo,  pouco   avanço   foi   atingido   na   prática   3-­‐5.   Independentemente   da   matriz,   e   das   substâncias  de  interesse,  a  análise  de  matrizes  complexas  –  especialmente  as  de   alimentos,  ambiental,  e   fluidos  biológicos  –  deve  ser  precedida  de  um  plano  de   amostragem,   preferencialmente   validado.   O   planejamento,   execução,   interpretação   de   resultados,   e   redação   dos   relatórios   de   análise   deverão   estar   dentro  de  um  sistema  de  qualidade  compatível  com  sua  finalidade  6.   3.  Técnicas  de  Preparo  de  Amostras       Após   a   etapa   de   amostragem,   a   parte   isolada   a   qual   agora   deveria   ser   denominada   sub-­‐amostra   mas   que,   na   prática,   continua   sendo   denominada   amostra,   deveria   idealmente   ir   diretamente   para   a   análise   instrumental,   o   que   raramente  é  feito.  Isso  deve-­‐se  ao  fato  de  que  em  geral  o  produto  da  amostragem   contém  contaminantes  próprios  da  matriz,  além  de  outros  agregados  durante  o   processo   ou   transporte   (por   exemplo,   é   comum   recebermos   no   laboratório   amostras   de   batata,   para   análise   de   resíduos   de   pesticidas,   contendo   terra).   A   sub-­‐amostra,   contendo   os   compostos   de   interesse   e   os   contaminantes,   e   doravante  denominada  amostra  por  simplicidade  e  por  refletir  a  nomenclatura   efetivamente   utilizada   nos   laboratórios   de   análise,   deverá   então   ser   transformada  para  outra  forma  mais  apropriada  para  a  análise.           No   caso   de   análise   de   fármacos   em   fluidos   biológicos,   por   exemplo,   a   presença   de   proteínas   e   outras   macromoléculas,   assim   como   de   outras   substâncias  menores,  pode  interferir,de  diferentes  maneiras,  na  análise.  Deve  ser   lembrado  que  estas  matrizes  contem  centenas  de  compostos  químicos,  a  maioria   em   concentração   superior   à   do   fármaco,   o   que   dificulta   ainda   mais   sua   determinação  qualitativa  e  quantitativa.  Muitas  vezes  existe  ainda  a  necessidade   de   converter-­‐se  uma   substância  da   forma  na  qual   se   encontra  para  outra  mais   amena   para   a   análise   (devido   a   problemas   de   estabilidade   térmica,   falta   de   volatilidade,   ausência   de   grupos   funcionais   adequados   para   detecção   espectroscópica   e   outras),   através   de   procedimentos   de   derivatização.   Este   conjunto   de   ações,   usualmente   denominado   genericamente   de   preparo   de   amostras,  envolve  diversas  etapas  no  laboratório,  das  quais  a  mais  importante  e   complexa   é,   sem   dúvida,   a   etapa   de   extração.   Em   muitos   casos   atualmente,   a   etapa   de   extração   pode   ser   combinada   com   a   concentração   dos   analitos,   derivatização   e   outros   procedimentos,   em   uma   única   etapa   para   o   preparo   da   amostra.       Existem  várias  técnicas  de  extração,  dependendo  do  estado  físico,  químico   e   a   complexidade   da   amostra   e   dos   compostos   a   serem   extraídos,   sendo   as   principais  discutidas  a  seguir.   3.1.  Extração  Líquido-­‐Líquido  (LLE)     Na  extração  líquido-­‐líquido  (LLE,  “liquid-­‐liquid  extraction”)  duas  fases  imiscíveis   são  empregadas:  uma  fase  A,  a  qual  contém  o  solute  de  interesse  X,  e  uma  fase  B   a   qual   será   colocada   em   contacto   com   ela.   Desta   forma,   ocorrerá   uma   distribuição  do  soluto  X  entre  as  duas  fases,  após  o  que  o  componente  X  poderá   ser  submetido  a  outro  processo  de  extração  ou  encaminhado  para  a  análise  por   HPLC.     De   acordo   com   a   teoria   geral   do   equilíbrio   químico,   para   um   processo   reversível       A   constante   de   equilíbrio   pode   ser   expressa   pela   lei   de   distribuição   de   Nernst  como         onde   KD   é   a   constante   de   equilíbrio,   [X]B   a   concentração   de   X   na   fase   B   (numerador   da   expressão),   e   [X]A   a   concentração   de   X   na   fase   A.   A   situação   experimental   ideal  seria  aquela  na  qual  o  equilíbrio   fosse  altamente   favorecido   no  sentido  da  transferência  de  X  para  a  fase  B,  ou  seja,  que  o  valor  de  KD  fosse   elevado.  Valores  pequenos  de  KD  indicam  que  o  processo  é  desfavorecido  e  que  a   transferência   de   X   para   a   fase   B   ocorrerá   em   pequena   extensão.   Esta   equação   possui  3  restrições  principais,  as  quais  são  usualmente  observadas  para  extração   de  solutos  a  serem  analisados  por  LC:  (1)  a  concentração  de  X  deve  ser  bastante   baixa  em  A  e  em  B;  (2)  a  forma  molecular  de  X  deve  ser  a  mesma  nas  duas  fases;   (3)  as  duas  fases  devem  ser  imiscíveis.  Dependendo  da  forma  com  a  qual  as  duas   fases  são  colocadas  em  contacto,  três  modos  principais  de  extração  são  possíveis:   batelada,  contínua,  e  em  contra-­‐corrente.       O   processo   é   então   repetido.   A   Figura   2b   ilustra   extrator   empregado   quando   o   solvente   de   extração   é   mais   denso   do   que   a   solução   que   contém   a   amostra.  O  solvente  extrator  é  colocado  no  frasco  de  destilação  (A)  e  aquecido;   os  vapores  passam  para  a  parte  superior  do   tubo  diretamente  na  superfície  da   solução  a   ser  extraída   (D)  e,  por   serem  mais  densas,   as  gotículas  atravessam  a   solução  até  o  fundo,  extraindo  à  medida  em  que  descem.  A  pressão  hidrostática   forçará   o   extratante   através   do   braço   lateral   (E)   e   de   volta   para   o   frasco   de   destilação.  O  processo  é  então  repetido  até  que  todo  o  soluto  de  interesse  tenha   sido   removido.   Processos   de   extração   contínua   são,   usualmente,   bastante   demorados  (horas  até  dias).  A  vantagem  desta  técnica  é  que  solutos  com  valores   de   KD   pequenos,   os   quais   dificilmente   seriam   extraídos   por   processos   de   batelada,  podem  ser  removidos  da  amostra  através  de  uma  extração  contínua.     3.2.  Extração  Líquido-­‐Sólido       Existem  várias  técnicas  analíticas  empregadas  na  extração  dos  compostos   de  interesse  em  matrizes  sólidas  e  semi-­‐sólidas,  desde  simples  e  baratas  (porém   com   vários   inconvenientes)   como   a   extração   com   solvente   sob   agitação,   até   bastante   sofisticadas   como  as   técnicas  que  empregam  solventes  pressurizados.   Na   prática   atual,   as   técnicas   mais   empregadas   para   este   tipo   de   amostra   empregam   solventes   líquidos   ou   um   fluido   pressurizado   (SFE,   ASE,   SWE   e   outras).  Dentre  as  técnicas  que  empregam  solventes  líquidos  a  Extração  Soxhlet   (Sox)  e  a  Extração  em  Fase  Sólida  (SPE)  são  as  mais  utilizadas.     3.2.1.  Extração  Soxhlet       A  Extração  Soxhlet,  ou  alguma  de  suas  variações,  foi  uma  das  técnicas  de   extração  mais  empregadas  para  amostras  sólidas  na  segunda  metade  do  século   XX.  O  equipamento  utilizado  nesta  técnica  é  relativamente  simples  (Figura  3),  o   que   auxiliou   na   sua   popularização.   O   sólido   a   ser   extraído   é,   geralmente,   pulverizado  e  colocado  em  um  cartucho  feito  de  papel  de  filtro  ou  de  algodão  (E),   no  centro  da  câmara  (A).               Figura  3.  Extrator  Soxhlet.         O   solvente   extrator   é   aquecido   no   frasco   (B)   e   os   seus   vapores   sobem   através  do  braço   lateral   (C)   até  o   condensador   (D)  onde  é   liquefeito.  O   líquido   permanece  nesta  câmara  aumentando  de  volume  e  extraindo  o  sólido  até  que  o   nível   de   líquido   atinja   o   topo   do   braço   lateral   (F).   Neste   ponto,   a   pressão   hidrostática  dentro  da  câmara  faz  com  que  o  solvente  seja  sifonado  de  volta  ao   frasco   de   destilação.   Este   processo   continua   até   que   todo   o   soluto   tenha   sido   removido   do   sólido.   Trata-­‐se,   portanto,   de   uma   extração   contínua   do   tipo   líquido-­‐sólido.       A  principal  limitação  desta  técnica  é  o  tempo  necessário  para  obter  se  um   bom  rendimento  de  extração,  usualmente  variando  desde  muitas  horas  até  dias,   o  que   tem   feito   com  que  novas   técnicas  mais   rápidas  e   automatizadas  venham   sendo  desenvolvidas  com  a  intenção  de  substituí-­‐la.       Em  meados  da  década  de  1970,  uma  nova  técnica  foi  introduzida,  visando   solucionar   as   principais   limitações   da   Extração   com   Solventes,   havendo   sido   denominada  Extração  em  Fase  Sólida,  SFE  (“Solid  Phase  Extraction”),  a  qual  será   descrita  em  outras  partes  do  presente  trabalho.     Referencias  Bibliográficas     1.  Lanças,  F.M.,  J.Braz.  Chem.  Soc.  14,183(2003).   2.  Poole,  C. 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