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CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

C A P Í T U L O 2 0

ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

INTRODUÇÃO

Os ensaios imunológicos foram e têm sido os principais responsáveis pelo conhecimento que

se tem do sistema imune. Além deste aspecto relacionado ao conhecimento científico básico, estes

ensaios são importantes, na clínica, para a detecção de infecções, de doenças auto-imunes e de estados

de imunodeficiência. Os ensaios imunológicos podem ser utilizados não só para detectar a produção de

anticorpos bem como para detectar a presença de antígenos, diferenciar o estágio de uma doença de

acordo com a classe de Ig produzida, selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes,

avaliar o prognóstico da doença, da eficácia de um tipo de terapia, dentre outros.

Nos últimos anos, houve uma grande evolução no sentido de que com a técnica de anticorpos

monoclonais (produzidos por um único clone celular) podem ser obtidos anticorpos altamente

purificados e específicos, tais como os anticorpos anti-CD4 e anti-CD8, que identificam

respectivamente linfócitos T auxiliares e citotóxicos. Além dos anticorpos, os antígenos também são

produzidos por meio de técnicas de síntese proteíca e de recombinação, propiciando que antígenos

purificados possam ser utilizados nas técnicas de ELISA, por exemplo.

Os ensaios imunológicos podem ser realizados por meio de técnicas não quantitativas,

visualizadas por meio de reações de precipitação e aglutinação ou podem ser quantitativas, com

utilização de marcadores enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioisótopos

(Radioimunoensaio).

Os testes de precipitação e aglutinação têm menor sensibilidade que os imunoenzimáticos,

porque os complexos Antígeno-Anticorpo para serem visualizados devem apresentar um tamanho

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

273

adequado (ver abaixo). Os testes de precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis

(proteínas, glicoproteínas) enquanto que os de aglutinação para a detecção de antígenos particulados

(hemácias, bactérias, células diversas).

ENSAIOS DE PRECIPITAÇÃO

O ensaio de precipitação é utilizado para detectar os anticorpos produzidos contra antígenos

solúveis em concentrações entre 20 e 2 mg/ml. Para que a reação de precipitação seja visível deve haver

uma relação de equivalência entre as concentrações do antígeno e do anticorpo. Em caso de excesso de

antígeno ou de anticorpo ocorre uma redução na formação do precipitado. Quando as concentrações de

antígeno e anticorpo são equivalentes, formam-se complexos de tamanho que permite a sua

visualização; nestas concentrações encontra-se a zona de equivalência (Figura 1A). Quando o plasma ou

soro a ser analisado apresenta uma alta concentração de anticorpos, estes se associam aos antígenos,

formando pequenos complexos, não visualizados por precipitação; nesta concentração de anticorpos

ocorre o efeito de pró-zona (Figura 1B). Quando o anticorpo está pouco concentrado em relação ao

antígeno, também são formados pequenos complexos e ocorre o efeito denominado de pós-zona (Figura 1C).

Título do anticorpo

Quando os ensaios não são quantitativos, a produção de anticorpos contra um determinado

antígeno pode ser correlacionada às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste. Nestes

ensaios, as partículas antigênicas são misturadas com diferentes diluições do soro do paciente e

considera-se como resultado de produção de anticorpos a maior diluição em que ocorre a visualização

(precipitação ou aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. A esta diluição dá-se o nome de título do

anticorpo. Por exemplo, suponhamos que vamos estudar a produção de anticorpos contra espécies de

Leishmania, que causam calazar,em uma população de área endêmica, no Brasil. É comum ser

observada aglutinação de formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título) na

maioria das pessoas porque a infecção com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma,

Plasmodium, Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção de anticorpos que

apresentam reação cruzada com Leishmania donovani. Por outro lado, o soro de pacientes infectados,

que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a diluição de 1:6.400 (título). Como pode

ser observado, neste exemplo, o título de anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica

é de 1:600 enquanto que nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez vezes.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

274

Figura 1 – Reação de Precipitação: A. Ponto de Equivalência, B. Efeito de Pró-zona e C. Efeito de Pós-zona

Ac1

Ac2

Ag

Ac1

Ac2

Ac1

Ac2

A.

B.

C.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

275

1. Teste do anelou ring test

Um dos testes mais rápidos e simples, utilizado em laboratórios de pesquisa, é o teste do anel

ou ring test. Utiliza-se este teste quando o objetivo é saber se um animal está produzindo anticorpos

contra um determinado antígeno solúvel, durante o processo de imunização. Suponhamos que estamos

imunizando um coelho com Igs isoladas do soro de camundongos. Depois de algumas semanas,

podemos colher o soro do coelho e colocá-lo cuidadosamente num tubo de vidro e sobre este uma

solução do antígeno, no caso as Igs de camundongo (Figura 2B). Quando o animal produziu anticorpos

específicos contra o antígeno, após alguns minutos, surge na interface entre as duas soluções, quando é

atingida a equivalência, um precipitado, visível a olho nu,. Pode-se utilizar como controle negativo, o

soro do animal colhido antes da imunização; neste caso, não haverá a formação da linha de precipitação

na interface entre o soro e o antígeno (Figura 2A).

Figura 2 – Ensaio do Anel A. Reação Negativa: soro antes da imunização, B. Reação Positiva: soro pós-imunização

2. Imunodifusão

A técnica de imunodifusão é realizada em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose, que

permite uma difusão mais homogênea que em meio líquido, mas que tem o inconveniente de demorar

entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados no gel

depende do tamanho destes; quando são grandes ficam maior que o diâmetro dos poros, o que impede a

sua difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla; é simples, quando ou o antígeno ou o anticorpo

é fixado a um suporte e o outro componente se difunde no meio, até ocorrer precipitação; é dupla,

quando os dois componentes migram um em direção ao outro.

Ag1

Soro

Ag1

Soro

Linha de precipitação

A. B.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

276

A imunodifusão dupla pode ser realizada numa lâmina de microscópio revestida de ágar,

contendo orifícios onde são colocadas concentrações de Ag e Ac (Figura 3). Quando o Ag e os

anticorpos específicos encontram-se, em concentrações correspondentes à zona de equivalência, são

formados complexos precipitantes.

Figura 3 – Imunodifusão dupla

Na figura 3, observa-se que o antígeno X precipitou próximo ao orifício, onde ele foi

depositado, enquanto que os antígenos Y e Z, precipitaram na região média entre os orifícios onde

foram depositados o antígeno e o anticorpo. O fenômeno observado com o antígeno X, pode ter várias

explicações: o antígeno pode estar em baixas concentrações e a zona de equivalência, ocorreu próximo

ao orifício onde foi depositado ou o PM ou a carga do antígeno interferiu na sua capacidade de

migração.

3. Imunodifusão dupla, segundo Ouchterlony

O método de imunodifusão, segundo Ouchterlony, é utilizado quando se deseja identificar um

antígeno comparando-o a outros já conhecidos. Nas lâminas ou placas de Petri, revestidas de ágar, são

feitos orifícios adjacentes: em um destes orifícios é colocado o soro e nos outros, o antígeno de origem

conhecida e aquele a ser identificado (Figura 4). Nesta figura, observa-se que existem três padrões de

resultado conforme a relação estrutural entre o antígeno conhecido (padrão) e o que se quer analisar.

Quando o antígeno conhecido (HSA – Albumina Sérica Humana) é similar ao analisado (Antígeno A),

os anticorpos e os antígenos migram, formando uma linha de precipitação contínua, na concentração

correspondente à zona de equivalência (Figura 4A). Quando os antígenos são semelhantes mas não

idênticos, é formado um esporão; na figura 4B, por exemplo, os anticorpos reconhecem o antígeno

padrão (HSA) e o A2 (BSA – Albumina Sérica Bovina), que são similares; no entanto, o esporão

Ag XAgs Y e ZAntisoro

Lâmina revestida de agar

Migração no agar

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

277

corresponde aos determinantes antigênicos, reconhecidos pelos anticorpos anti-HSA, presentes apenas

no HSA. Quando os anticorpos reconhecem os dois antígenos mas estes são distintos (HSA e HGG –

Gamaglobulina Humana), são observadas duas linhas que se cruzam, formando dois esporões, o que

demonstra que determinantes antigênicos diferentes presentes nestes antígenos são reconhecidos pelos

anticorpos (Figura 4C). A presença de mais de uma linha de precipitação significa que os anticorpos

estão reconhecendo outros componentes e que a solução antigênica não está purificada.

Este é um método semi-quantitativo, de baixa sensibilidade, ainda utilizado para caracterizar

antígenos em processos infecciosos ou anticorpos em doenças auto-imune. Uma das limitações deste

teste é o tempo (18-24 horas) requerido para a obtenção dos resultados, além de detectar apenas reações

Ag-Ac nas quais há formação de precipitados. Atualmente, este teste tem sido substituído por ensaios

imunoenzimáticos.

Figura 4 – Imunodifusão de Ouchterlony

4. Imunodifusão radial simples

A imunodifusão radial simples, introduzida por Mancini, em 1965, além de ser uma técnica de

fácil realização e de baixo custo, é quantitativa. É realizada em placas ou lâminas revestidas de ágar, no

qual é incorporado um antisoro específico para a molécula a ser quantificada (Figura 5B). No gel de

ágar são feitos orifícios onde são depositadas pelo menos três concentrações conhecidas da molécula

estudada (solução padrão) e as amostras de concentração desconhecida. Estas moléculas difundem-se no

ágar e quando reagem com o anticorpo, na concentração correspondente à zona de equivalência, forma-

HSA

Soro anti-HSA

esporão

Soro anti-HSASoro anti-HSA e anti-HGG

Ag A HSA Ag A2 HSA Ag B

Resultado: Ag A = HSA

Identidade Total

Ag A2 = BSA

Identidade parcial

Ag B = HGG

Não identidade

A. B. C.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

278

se a linha de precipitação, o que ocorre entre 48-72 horas. O diâmetro do halo que se forma ao redor do

orifício onde foram depositadas as amostras corresponde à concentração da molécula, de acordo com a

curva padrão obtida (Figura 5A). Para a obtenção da curva padrão são utilizadas concentrações

conhecidas da solução padrão e após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos.

Por exemplo, se quisermos dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes; para a obtenção da

curva padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de concentração conhecida.

Esta técnica é utilizada para quantificar IgG, IgM e IgA e moléculas do sistema Complemento.

Figura 5 – Imunodifusão radial simples A. Curva padrão, B. Placa com concentrações do Ag e da solução padrão

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 concentração do Ag (mg/ml)

di âm

et ro

d o

an el

(m m

)

5. Imunoeletroforese

A imunoeletroforese é um método qualitativo que combina as técnicas de eletroforese e

imunodifusão. A associação das duas técnicas permite que um maior número de componentes

antigênicos de um líquido biológico (soro, urina) sejam identificados; no caso do soro, mais de 30

componentes são identificados pela imunoeletroferese enquanto que na eletroforese entre 5 e 6 o são.

É realizada também em lâminas ou placas de vidro recobertas de ágar, onde são feitos orifícios

e canaletas para a colocação dos reagentes. Na primeira etapa, que geralmente dura entre 60-90

minutos, a solução antigênica é colocada num orifício do ágar e a lâmina é submetida à eletroforese.

Nesta fase, os componentes antigênicos são separados de acordo com as suas cargas elétricas. Vários

fatores dos componentes antigênicos (além da carga elétrica, o tamanho, a forma e a concentração), do

A. Gel contendo anticorpo

Diluições do Ag

Concentrações do padrão

B.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

279

solvente (a força iônica e o pH), do meio (temperatura e viscosidade do ágar) e do campo elétrico

podem interferir na migração. Na Figura 6A, está representada a separação de proteínas séricas de uma

pessoa normal e de uma que apresenta mieloma de IgG. Na segunda etapa, é cortada uma canaleta no

ágar submetido a eletroferese, onde é depositado o antisoro (Figura 6B). Quando os anticorpos

associam-se aos componentes antigênicos separados pela eletroforese, formam-se linhas de precipitação

(Figura 6C). A difusão e a formação das linhas de precipitação ocorre num período entre 18-24 horas.

Na Figura 6C, o soro de coelho anti-proteínas séricas humana reconhece as moléculas de albumina, do

sistema complemento, as classes de imunoglobulinas, dentre outras não mostradas.

Quando a produção de algumas destas moléculas está alterada, sendo produzidas em

concentrações abaixo (imunodeficiências, doenças auto-imunes) ou acima (tumores de plasmócitos, tal

como os mielomas) do normal, esta alteração pode ser detectada qualitativamente, como observado na Figura 6C.

Este método é eficiente para detectar qualquer substância solúvel imunogênica, sendo

adequado para a caracterização de proteínas e detecção de alterações estruturais e nas concentrações.

Nos laboratórios de análises clínicas, é utilizado para o diagnóstico de gamopatias monoclonais tais

como o mieloma múltiplo e a macroglobulinemia.

ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO

A reação de aglutinação ocorre quando um antígeno particulado associa-se com o anticorpo

específico. É uma reação de rápida visualização e que ocorre em duas etapas:

! a primeira etapa consiste na associação dos anticorpos aos determinantes antigênicos.

! a segunda etapa, ocorre em decorrência das colisões entre as partículas, o que resulta na

dissociação dos anticorpos e a associação a partículas vizinhas. Desta forma forma-se a

malha de interações visíveis a olho nu (Figura 7).

O ensaio de aglutinação pode ser realizado com partículas que apresentam determinantes

antigênicos naturais, tais como as hemácias, bactérias (aglutinação direta) ou pode ser realizado com

partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita) adsorvidas com antígenos na sua superfície

(aglutinação passiva ou indireta).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

280

Figura 6 – Imunoeletroforese A. Separação do antígeno por eletroforese: Lâmina vista de cima na cuba de eletroforese. B. Adição do Anticorpo na canaleta C. Difusão e precipitação

- +

Ag-soro humano

Ag-soro de paciente com mieloma de IgG

TampãoPapel de filtro

EletrodoA.

Antisoro - soro de coelho anti- proteínas séricas humana

IgGIgAIgMC3Albumina

B.

IgG

IgAIgMC3 Albumina

C.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

281

Figura 7 – Aglutinação. A. Ausência de anticorpos, B. Presença de anticorpos

Vários fatores podem interferir neste tipo de ensaio: o tipo de Ig (a IgM é 750 vezes mais

eficiente que a IgG), o pH do meio (entre 6 e 8, é o ideal), enzimas, tempo e temperatura. Estes testes

podem ser realizados em lâminas, placas ou tubos.

Quando o soro tem altas concentrações de anticorpos pode ser observado o efeito de pró-zona,

com resultados falso-negativos; para eliminar este efeito necessita-se diluir o soro. Na figura 8, por

exemplo, nos poços C1 a C3 e C10 a C12 não houve aglutinação enquanto que nos poços de C4 a C9

houve. Pode-se considerar que os anticorpos presentes nos poços de C1-C3, estão muito concentrados

causando um efeito de pró-zona, entre C4 e C9, está ocorrendo a zona de equivalência e entre C10 e

C12, os anticorpos estão muito diluídos, causando um efeito de pós-zona.

A. B.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

282

Figura 8 – Hemaglutinação em placa

1. Aglutinação direta

Na reação de aglutinação direta as partículas antigênicas (bactérias, hemácias, fungos,

protozoários) podem estar na forma íntegra ou fragmentada. As reações de aglutinação direta que

utilizam as hemácias podem identificar os tipos sanguíneos humano ABO e Rh (Figura 9). No caso da

identificação do sistema ABO, as hemácias da pessoa são colocadas para incubar com anticorpos anti-A

ou anti-B, em lâminas. Se a aglutinação ocorrer quando a incubação é feita com anti-A ou anti-B, as

células serão respectivamente, A ou B; se a aglutinação ocorrer com os dois anticorpos em questão as

hemácias serão do tipo AB e caso não ocorra aglutinação, o tipo sanguíneo será O.

Além das hemácias, bactérias podem ser aglutinadas por anticorpos específicos, como no caso

do teste para detecção de Salmonella (teste de Widal) e para o dianóstico da brucelose (teste de Wright).

Testes de aglutinação para identificar infecção com Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma e

Leptospira também são realizados.

1: 512

1: 64

1: 256

1: 128

1: 16

1: 128

ausência

1: 4096

aglutinação Ausência de aglutinação

Diluição do Soro: 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096

A B C D E F G H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Título do Anticorpo

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

283

Figura 9 – Aglutinação direta na identificação dos antígenos do sistema ABO

2. Aglutinação direta por anticorpos anti-Rh - Teste de Coombs direto e Teste de Coombs indireto

A doença hemolítica do recém-nascido é uma patologia que se enquadra no grupo das

hipersensibilidades do tipo II (Capítulo 12), na qual uma mulher Rh negativa é sensibilizada por

hemácias Rh positivas do filho, durante o parto, e a partir deste contato, IgG anti-Rh é passada pela

placenta, durante a gravidez, causando anemia hemolítica nos filhos Rh positivos. A presença de

anticorpos anti-Rh na membrana das hemácias fetais pode ser detectada pelo Teste de Coombs direto

(Figura 10A) enquanto que a de anticorpos anti-Rh no soro materno pode ser detectada pelo Teste de

Coombs indireto (Figura 10B).

No teste de Coombs direto, as hemácias fetais estão revestidas in vivo pelos anticorpos anti-Rh,

no entanto, não aglutinam. A adição in vitro de soro anti-Ig humana proporciona a aglutinação (Figura

10A). No teste de Coombs indireto, hemácias Rh positivas são incubadas com o soro da paciente (mãe

Rh negativa sensibilizada), no entanto, a aglutinação também é visualizada pela incubação de anti-Ig

humana (Figura 10B).

Anti-A Anti-BAnti-A Anti-B

+++

---

-

+

B

A

AB

O

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

284

Figura 10 – Teste de Coombs. A. Teste direto, B. Teste indireto

3. Hemaglutinação e aglutinação passiva

Os testes de aglutinação passiva podem ser realizados com hemácias (hemaglutinação) ou com

partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita). As hemácias são utilizadas, nos ensaios de aglutinação, por apresentarem uma superfície rica em moléculas, o que propicia a adsorção de vários tipos de

antígenos. As hemácias mais utilizadas para esta finalidade, pela facilidade de obtenção, são as de

carneiro e as humanas, que podem ser fixadas em formaldeído, permitindo que sejam estocadas por um tempo maior.

Antígenos polissacarídicos geralmente conseguem adsorver de forma passiva na superfície das

hemácias enquanto que os antígenos proteícos associam-se a hemácias taninizadas (pré-tratadas com

ácido tânico). O teste de hemaglutinação para antígenos proteícos é mais sensível que os ensaios de

precipitação, podendo detectar anticorpos em concentrações de até 0,01 µg/ml. Anticorpos contra

Hemácias fetais Rh+ sensibilizadas in vivo com anti-Rh

+ anti-Ig humana

Aglutinação

A.

Hemácias Rh+

+

Soro de mulher Rh- sensibilizada com

hemácias Rh+

Hemácias Rh+ e anti-Rh materno Aglutinação

+ anti-Ig humana

B.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

285

antígenos de Trypanosoma, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii entre outros podem ser detectados

por meio desta técnica (Figura 11).

A aglutinação passiva com partículas de látex é mais aplicada na detecção do Fator

Reumatóide (FR), que é uma Ig (geralmente IgM), que reconhece a porção Fc da IgG, presente em

algumas doenças auto-imunes reumáticas (Capítulo 15). Além da IgM, o FR pode ser uma IgG ou IgA

que reconhece não só a porção Fc da IgG como também da IgA, da IgM ou da IgE. Neste teste a IgG é

passivamente adsorvida às partículas de látex e quando o plasma contendo FR é incubado com estas,

ocorre aglutinação.

Figura 11 – Aglutinação passiva

4. Teste de inibição da aglutinação passiva

O teste de inibição da Aglutinação ou Hemaglutinação Passiva é um ensaio competitivo

sensível para a detecção de concentrações entre 0,1-10 µg/ml de antígenos solúveis, haptenos ou

anticorpos. Este teste consiste na incubação do líquido corporal do paciente (plasma, urina) com

anticorpos específicos para o antígeno que se quer detectar e posterior incubação com hemácias

adsorvidas com o mesmo antígeno. Na figura 12, queremos detectar a presença do hormônio

Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG), presente na urina de mulheres grávidas. Quando a mulher

está gravida e a urina é incubada com anticorpos anti-HCG, formam-se complexos HCG-anti-HCG que

impedem a aglutinação de partículas de látex adsorvidas com HCG (Figura 12A). A urina da mulher

normal como não contém HCG, propicia que os anticorpos anti-HCG associem-se ao látex adsorvido

com o HCG, tornando a aglutinação possível (Figura 12B).

Hemácea ou látex Ags:Toxoplasma gondii Plasmodium falciparum

+ soro do paciente

Hemaglutinação

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

286

Figura 12 – Inibição da aglutinação passiva. A. Mulher grávida, B. mulher não grávida

5. Aglutinação passiva reversa

Enquanto que na Aglutinação Passiva, as partículas são revestidas de antígenos, na

Aglutinação Passiva Reversa, as partículas são revestidas de anticorpos. Para a realização do teste, as

partículas revestidas com anticorpos adsorvidos são incubadas com o plasma, a urina ou o líquido

encelaforraquidiano do paciente. Quando existem antígenos nestes líquidos que são reconhecidos pelos

anticorpos adsorvidos nas partículas, estas aglutinam. É um teste geralmente utilizado em fases da

infecção em que a concentração dos anticorpos é baixa e pode-se detectar a presença do agente

infeccioso. Na Figura 13, as partículas estão revestidas de anticorpos contra o vírus da Hepatite; quando

estas partículas são colocadas em contato com plasma contendo os vírus, estas aglutinam.

Este ensaio é utilizado para detectar também alfa-fetoproteína e hemoglobina, além de diversos

microorganismos (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophyllus influenzae,

Mycobacterium tuberculosis). A sensibilidade deste ensaio é alta, detectando, por exemplo, entre 0,3-

0,6 ng/ml de polissacarídeo grupo-específico solúvel de H. influenzae.

Urina - HCG solúvel

+

Anti-HCG Partículas de látex+HCG Inibição da aglutinação

A.

+

Anti-HCG Partículas de látex+HCG Aglutinação

B.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

287

Figura 13 – Inibição da aglutinação passiva reversa

ENSAIOS DE IMUNO - MARCAÇÃO

1. Imunofluorescência e imunoperoxidase

A imunofluorescência, assim como a imunoperoxidase, são técnicas, realizadas em lâminas de

microscópio, que permitem a detecção e localização de antígenos ou anticorpos em células ou tecidos.

O que diferencia a imunofluorescência da imunoperoxidase, é que na primeira os anticorpos para a

detecção do antígeno são marcados com moléculas que emitem luz fluorescente (fluoresceína,

rodamina) enquanto que na segunda, os anticorpos são marcados com uma enzima (peroxidase,

fosfatase alcalina).

A técnica de imunofluorescência é de uso mais limitado que a imunoperoxidase, porque

necessita de uma infraestrutura mais complexa: microscópio de fluorescência e uma sala escura para

visualização da emissão da luz fluorescente. Além disso, os resultados precisam ser rapidamente

analisados, porque a fluorescência vai sendo reduzida gradativamente, e é uma técnica que não pode ser

adaptada à microscopia eletrônica. As vantagens da imunoperoxidase é que as lâminas submetidas à

análise podem ser guardadas por vários anos, os resultados podem ser observados em qualquer

microscópio óptico e a marcação enzimática pode ser adaptada às técnicas de microscopia eletrônica.

Estas técnicas podem ser utilizadas para detectar microorganismos presentes em células e

tecidos, auto-anticorpos ou moléculas do sistema Complemento, depositadas nos tecidos,

Látex + Anti - vírus da hepatite

Partículas virais presentes no soro

+

Aglutinação

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

288

imunoglobulinas presentes nas células, antígenos tumorais, identificação de células por meio da

detecção de moléculas específicas de cada população, dentre outras.

A imunofluorescência e a imunoperoxidase podem ser de dois tipos:

! Direta ou

! Indireta.

1.1 Imunofluorescência e imunoperoxidase direta

Nas técnicas diretas, o antígeno tecidual é reconhecido por um anticorpo marcado com uma

molécula fluorescente (imunofluorescência) ou uma enzima (imunoperoxidase). Por exemplo, se

quisermos identificar simultaneamente por imunofluorescência, células CD4+ e CD8+ presentes no

sangue ou no linfonodo de um paciente (Figura 14); neste caso, as células serão colhidas, aderidas em

lâmina de microscópio, adequadamente fixadas e incubadas com anticorpos monoclonais (ver abaixo)

anti-CD4 marcados com fluoresceína (emite luz verde) e anti-CD8 marcados com rodamina (emite luz

vermelha). Após um tempo de incubação pré-estabelecido, as lâminas são lavadas para retirar os

anticorpos que não se associaram e observadas ao microscópio de fluorescência. As células CD4+

apresentarão marcação de membrana em verde enquanto que as CD8+, marcação em vermelho. Se

contarmos o número de células marcadas em verde e em vermelho, teremos, neste caso, a proporção de

linfócitos Tauxiliares e Tcitotoxicos, respectivamente.

No caso de utilizarmos a imunoperoxidase direta para identificar os linfócitos T e B, teremos

que fazer duas lâminas, uma incubada com anti-CD4 e outra com anti-CD8, ambos marcados com

Peroxidase; isto porque não é possível identificar pelas cores os padrões de marcação. Nesta técnica,

depois da adição do anticorpo e posterior lavagem, deve-se incubar a lâmina com o substrato da enzima,

no caso o Peróxido de Hidrogênio, e um doador de elétrons, tal como a diaminobenzidina (DAB).

Durante a reação enzimática, esta substância sofre oxidação e polimeriza numa substância insolúvel, de

cor castanha visível ao microscópio óptico.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

289

Figura 14 – Imunofluorescência direta para identificação das moléculas CD4 e CD8

1.2 Imunofluorescência e imunoperoxidase indireta

Na imunofluorescência ou na imunoperoxidase indireta, os antígenos teciduais ou celulares são

detectados pela incubação com dois tipos de anticorpos:

! O primeiro que reage diretamente com o antígeno, como o anticorpo monoclonal anti-CD4,

que reconhece moléculas CD4 presentes na membrana de Linfócitos T auxiliares (Figura 15).

! E o segundo, que reage com o primeiro anticorpo, sendo este marcado com o fluorocromo

ou com a enzima. Suponhamos que o primeiro anticorpo (anti-CD4) tenha sido produzido

em rato, ou seja, temos um anticorpo monoclonal de rato anti-CD4 humano. Neste caso, o

segundo anticorpo deve ser um anticorpo produzido em outra espécie (carneiro, coelho,

cavalo) que reaja com a Ig de rato. Caso o anticorpo monoclonal de rato anti-CD4, seja

uma IgG, temos que ter um soro de carneiro (ou de cavalo, de coelho) anti-IgG de rato marcado

com o fluorocromo ou a enzima.

Lâmina apresentando células isoladas de linfonodo ou do sangue, em duplicata

Anti-CD4 marcado com fluoresceína

Anti-CD8 marcado com rodamina

CD8

Visualização ao microscópio de fluorescência

CD4

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

290

Figura 15 - Imunofluorescência indireta para identificação da molécula CD4

A imunofluorescência e a imunoperoxidase indireta apresentam mais vantagens que a direta

em vários aspectos. A primeira vantagem é que, nos laboratórios clínicos, se utilizássemos a técnica

direta para identificar anticorpos anti-HIV ou outro microorganismo em pacientes, por exemplo,

teríamos que marcar os anticorpos, de todos, com fluorocromo ou enzima e isto é impraticável. Outra

vantagem é que o fato de utilizarmos dois anticorpos aumenta a sensibilidade da técnica e podemos

utilizar menores concentrações do primeiro anticorpo, o que reduz os custos, principalmente quando

estes são anticorpos monoclonais.

A técnica de imunofluorescência é muito utilizada na pesquisa de Imunoglobulinas e moléculas

do sistema Complemento, presentes nos rins e na pele em doenças auto-imunes. É utilizado também em

casos de pesquisa de agentes infecciosos tais como: vírus respiratórios (influenza, para-influenza,

adenovírus, vírus respiratório sincicial), vírus da família herpes (herpes simples, citomegalovírus),

Treponema pallidum, Chlamydia, Legionella, Escherichia coli, estreptococcus beta hemolítico, dentre

outros. Estes antígenos podem ser detectados em diferentes tipos de amostras: biópsias, urina, lavado

broncoalveolar ou preparado de leucócitos. Os resultados podem ser analisados por meio da titulação do

Soro de carneiro anti – IgG de rato marcado com fluoresceína

IgG de camundongo Anti-CD4

Primeiro AnticorpoSegundo Anticorpo marcado

CD4

Visualização ao microscópio de fluorescência

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

291

soro; por exemplo, a detecção de IgM e IgG anti-Chlamydia pneumoniae em títulos maiores,

respectivamente, que 1:32 e 1:2000 indica infecção ativa.

2. Citometria de fluxo

A citometria de fluxo permite, pelo uso de anticorpos monoclonais marcados com

fluorocromos, quantificar células, expressando moléculas de diferenciação (CDs) ou outros antígenos,

em amostras de células colhidas do sangue, de órgãos linfóides, dentre outros tecidos. Apesar da

semelhança com a imunofluorescência, a citometria de fluxo é uma técnica automatizada na qual se

utiliza um aparelho denominado fluorímetro (Figura 16).

As células são previamente incubadas com diferentes anticorpos monoclonais marcados com

dois ou mais fluorocromos e a quantidade de fluorocromo associada a cada célula é medida passando as

células isoladamente num fluorímetro. Neste aparelho, à medida que as células passam por uma cânula,

um feixe de raio laser é incidido sobre elas, refletindo a luz emitida, o que permite que esta luz seja

identificada num sistema computadorizado, e seja feita a quantificação da molécula expressa por cada

célula. Por exemplo, se quisermos avaliar a produção de células CD4+ (LTa) e CD8+ (LTc) presentes

no sangue periférico de pessoas normais e infectadas pelo HIV. As células brancas do sangue de cada

paciente são isoladas, incubadas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 marcados, respectivamente, com

fluoresceína (fluorocromo verde) e rodamina (fluorocromo vermelho), e colocadas num fluorímetro.

Estas células, à medida que passam pela cânula do aparelho, vão sofrer a ação de um feixe de raio laser

e a luz emitida (verde ou vermelha) será identificada e a informação enviada para um computador. Os

resultados obtidos são expressos, em gráficos, pelo computador. Num dos possíveis tipos de gráfico,

cada célula é visualizada num quadrante, no qual observa-se a distribuição das células que expressam

um dos fluorocromos (fluoresceína – LT CD4+ ou rodamina – LT CD8+), as que são negativas (DN-

duplo negativas) ou positivas para os dois fluorocromos (Figura 16).

3. Separador de células ativadas por fluorescência (FACS – Fluorescent Activated Cell Sorter)

Este aparelho, FACS - mais sofisticado que o fluorímetro, permite que além de quantificadas,

as células sejam separadas de acordo com a sua ligação com o anticorpo monoclonal marcado com o

fluorocromo. A separação ocorre porque as células são carregadas eletricamente e passam por campos

magnéticos, cuja força e direção variam de acordo com a intensidade do sinal fluorescente emitido (Figura 16).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

292

Figura 16 – Citometria de fluxo e FACS

Meio

de cultura

Células marcadas com anticorpos monoclonais fluoresceína – anti-CD4

rodamina – anti-CD8

Fluorescência

FLUOROCROMO 2 (F2)

F L U O R O C R O M O 1 (F1)

%DN

%F1+

%F2+

%F1/F2+

Campos eletromagnéticos

Detector de comprimento de onda e analisador

Raio Laser

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

293

Estas células podem ser reutilizadas para outros ensaios porque são mantidas a integridade e a

esterilidade da amostra.

4. Ensaios imunoenzimáticos (ELISA - Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay) e radioimunoensaios (RIA-Radio-Immuno Assay)

Os ensaios imunoenzimáticos e os radioimunoensaios apresentam os mesmos princípios

técnicos com a diferença que no primeiro, a revelação da reação é realizada com anticorpos marcados

com enzima, como na imunoperoxidase, e no segundo, a revelação é realizada com anticorpos marcados

com isótopos radioativos (geralmente 125I ou 131I). Pelos efeitos deletérios da radiação, os

radioimunoensaios estão sendo substituídos pelos ensaios imunoenzimáticos.

Estes métodos podem ser utilizados para a detecção de antígenos (hormônios, drogas,

marcadores tumorais, alérgenos) e de anticorpos (contra bactérias, vírus, fungos e protozoários). A

sensibilidade de detecção destes ensaios é na ordem de nanogramas (ng) ou picogramas (pg).

Será dada ênfase aos ensaios de ELISA, e dentre as variações empregadas na realização deste,

serão focalizados os do tipo indireto e de captura. O método indireto propicia a detecção de anticorpos

na amostra enquanto que no de captura são detectados antígenos, que podem ser inclusive Imunoglobulinas.

Estas técnicas são geralmente realizadas em placas de poliestireno de 96 poços, o que propicia

a utilização de um maior número de amostras num único ensaio (Figura 17).

No método indireto, as placas são pré-incubadas com os antígenos contra os quais se quer

detectar a produção de anticorpos; atualmente compram-se placas contendo alguns tipos de antígenos já

padronizados (Figura 17A). Depois da pré-incubação, as placas devem ser lavadas para retirar os

antígenos não aderidos e incubadas com soluções proteícas (leite desnatado, gelatina, albumina sérica

bovina, caseína) para bloquear os locais não ocupados pelos antígenos. Esta etapa é importante porque

como estas placas apresentam capacidade de adsorver proteínas, os anticorpos ou outras moléculas

presentes nos líquidos analisados podem se associar à placa e alterar os resultados. Após o bloqueio, as

amostras de soro/plasma são incubadas, por períodos de tempo e temperatura padronizados (Figura 17B);

em seguida, as placas são lavadas para retirar os anticorpos não específicos e incubadas com anticorpos

específicos para o primeiro anticorpo, marcados com uma enzima (fosfatase alcalina, por exemplo) (Figura 17C).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

294

Figura 17 - ELISA

Placa de 96 cavidadesA. Sensibilização da placa com o Ag

Lavagem

B. Adição do primeiro anticorpo

Lavagem

C. Adição do anticorpo marcado com enzima (ELISA) ou radioisótopo (RIA)

Lavagem

D. ELISA - adição do substrato e cromógeno

E. Reação enzimática - reação colorida – leitura da Densidade Óptica (DO) no espectrofotômetro

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B

C

D

E

F

G

H

Curva padrão

Amostras

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

295

A revelação da reação antígeno-anticorpo é feita pela incubação com o substrato da enzima e

com os doadores de hidrogênio, sendo os mais comumente utilizados o ácido 5-aminosalicílico

(castanho), o 2,2’-diazino (3-etilbenzotiazolino–6- ácido sulfônico-ABTS) (verde) e a

tetrametilbenzidina-TMB (azul) (Figura 17D). A intensidade da cor no final da reação é proporcional a

concentração dos anticorpos presentes na amostra (Figura 17E); e por isso este ensaio é colorimétrico.

A leitura da intensidade da cor é obtida em espectrofotômetros, adaptados à leitura de placas, e

estes resultados são dados em Densidade Óptica (DO), a qual é proporcional à concentração de

anticorpos na amostra. Além das amostras dos pacientes, estes ensaios devem utilizar como controle

anticorpos específicos, de concentração conhecida, de forma que se possa quantificar a concentração de

anticorpos presentes nas amostras (curva - padrão). Tendo-se a curva - padrão onde se tem a correlação

entre concentrações conhecidas do anticorpo com a DO, pode-se calcular a partir das DOs de soros dos

pacientes, a concentração de anticorpos específicos. Como exemplo, examinemos a Figura 18.

Figura 18 – Curva padrão Curva Padrão

D O

( x

n m

)

0.0

0.5

1.0

1.5

e as c

atravé

conce

dados

regres

dados

Concentração (mg/ml)

DO

2 1

1 0,694

0,5 0,347

0,25 0,168

X 0,894

Y 0,325

Concentração do Anticorpo (mg/ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Na Figura 18, temos na tabela as concentrações de um anticorpo padrão (entre 2 e 0,25mg/ml)

orrespondentes DOs; estes resultados propiciam que se tenha uma curva - padrão, a partir da qual,

s da análise de regressão linear (por exemplo, Programa GraphPad Prism), pode-se calcular as

ntrações x e y, cujas DOs são conhecidas. Na curva - padrão, a linha azul foi obtida a partir dos

de DOs e a concentração de anticorpos e a linha vermelha corresponde ao resultado da análise de

são linear, que nos dá a segurança de que existe realmente uma correlação linear entre os dois

. A análise de regressão linear proporciona um índice de correlação entre os dados, o qual deve ser

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

296

o mais próximo possível de 1,0, o que indica uma boa correlação entre os dados analisados. No caso da

Figura 18, o índice de correlação da curva foi de 0,99071, o que nos indica que existe uma correlação

linear entre a DO e as concentrações de anticorpos. A partir da equação obtida, tem-se que os valores

desconhecidos X e Y correspondem às concentrações de anticorpos de 1,73 e 0,503 mg/ml, respectivamente.

No método de captura (ou ELISA sanduíche), anticorpos específicos são aderidos à placa e a

amostra contendo a molécula a ser reconhecida (hormônio, citocina, droga, Imunoglobulina, antígenos

tumorais ou alérgenos) é colocada. Após os procedimentos normais de incubação e de lavagem, a placa

é incubada com um soro policlonal marcado com enzima, que reconhece o antígeno associado ao

anticorpo aderido à placa. Esta técnica é chamada de sanduíche porque o antígeno fica entre dois

anticorpos, o aderido à placa e o anticorpo marcado com a enzima. Neste tipo de técnica quando o

anticorpo aderido à placa é monoclonal deve-se ter o cuidado do segundo anticorpo marcado ser

policlonal ou um monoclonal que reconheça um epítopo diferente do reconhecido pelo primeiro

anticorpo.

5. Western Blotting

O termo blotting significa, em biologia molecular, transferir macromoléculas de um meio

semi-sólido como o gel de poliacrilamida para um papel de filtro. A primeira técnica deste tipo descrita

foi o Southern Blotting, na qual são transferidas moléculas de DNA; este nome foi dado à técnica por

causa do sobrenome do cientista que a descreveu – E.M.Southern. Como uma brincadeira, a técnica

descrita para a transferência de RNA foi denominada Northern Blotting e para proteínas, Western

Blotting. A técnica de Western Blotting permite que peptídeos antigênicos sejam separados, por Peso

Molecular (entre 5.000 e 250.000 daltons), e reconhecidos por anticorpos específicos. Vários antígenos,

principalmente os patógenos, já são conhecidos em termos moleculares e apresentam um padrão

característico de peptídeos e portanto, pode-se identificar, com alto grau de precisão, se um indivíduo

apresenta uma infecção com um determinado tipo de patógeno.

Na técnica de Western Blotting, peptídeos oriundos de um antígeno, por exemplo, dos HIV são

separados por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo um detergente aniônico - o SDS (dodecil

sulfato de sódio) (Figura 19). O SDS associa-se às regiões hidrofóbicas das proteínas conferindo-lhes

cargas negativas, o que propicia a migração na eletroforese de acordo com o PM. Após a eletroforese,

os peptídeos separados são transferidos por capilaridade (blotting) ou por corrente elétrica (eletroforese)

para um papel de nitrocelulose. O papel de nitrocelulose apresenta a partir deste procedimento uma

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

297

cópia dos antígenos que foram separados no gel e durante esta passagem do gel para o papel, o SDS é

deslocado das proteínas e os determinantes antigênicos nativos são re-expostos. Na etapa seguinte, o

papel contendo os peptídeos isolados é incubado com o soro dos pacientes em análise. Após lavagem,

para a retirada dos anticorpos não associados, as fitas são incubadas com um soro anti-Ig humana

marcado com uma enzima, com o substrato e o cromógeno. Quando o paciente apresenta anticorpos

contra os peptídeos isolados, após a revelação pelo cromógeno, aparecem bandas (manchas) nos locais

onde os anticorpos específicos se associaram. Além da revelação enzimática, podem ser utilizados

anticorpos marcados com radioisótopos e assim o papel é submetido a autoradiografia (revelação com

emulsão fotográfica), para que sejam visualizadas as bandas.

Na figura 19, temos três padrões de resultado:

! No papel de nitrocelulose referente ao paciente 1 estão presentes bandas nos locais

correspondentes às proteínas de PM 120, 64, 55, 41, 33, 24 e 18 kD, demonstrando que

apresenta anticorpos que reconhecem todos os componentes do HIV (Capítulo 19).

! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 2 não apresenta bandas o que significa que

este não apresenta anticorpos específicos contra os peptídeos presentes na fita.

! O papel de nitrocelulose referente ao paciente 3 apresenta banda apenas no local

correspondente à p24, o que pode sugerir, que ele tenha uma infecção por um outro

retrovírus, com peptídeos similares ao do HIV ou outro tipo de microorganismo que

apresenta uma proteína de 24 kD.

TÉCNICAS DE CULTURA CELULAR

1. Cultura de células e ensaios de proliferação

A grande maioria dos conhecimentos relativos à ativação celular, indução de citocinas,

moléculas co-estimulatórias e outras tem sido obtidos com células cultivadas in vitro. Vários destes

mecanismos têm sido, nos últimos anos, comprovados em sofisticados modelos in vivo utilizando

animais nocauteados (nos quais genes foram inativados) e transgênicos (nos quais genes foram implantados).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

298

Figura 19 – Western Blotting A. Gel de separação, B. Tanque de Blotting (transferência para papel de nitrocelulose), C. Incubação com soro de paciente, Ig marcada e substrato, D. Visualização dos resultados

A2 A3

Soro dos pacientes

A1

Lavagem

A1 A2 A3

+anti-Ig humana marcada com enzima + substrato + cromógeno

Polo -

Polo +

Amostras –Ags do HIV

Peptídeos separados

A A A

Papel de filtro

Membrana de nitrocelulose

Gel com peptídeos separados

Papel de filtro Solução tampão

A1 A2 A3

120 64 55 41 33 24 18

Interpretação dos resultados: A1- Paciente 1 –HIV+ A2- Paciente 2 – negativo A3 – Paciente 3 – p24+ (outro Ag que expressa p24, além do HIV).

Padrão de PM (kDa)

A. B.

C.

D.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

299

As células cultivadas in vitro podem ser obtidas do sangue periférico ou de órgãos linfóides

primários (medula óssea e timo) e secundários (linfonodos e baço). As culturas também podem ser

feitas com linhagens obtidas de células tumorais que foram isoladas de seres humanos ou animais; estas

linhagens podem ser de macrófagos, mastócitos, linfócitos ou outros tipos celulares; no entanto, estas

células apesar de serem homogêneas apresentam alterações patológicas que podem interferir nos

mecanismos em estudo. Desta forma, resultados obtidos com células de linhagens tumorais devem ser

corroborados por resultados obtidos com células de padrão normal.

As células isoladas do sangue (geralmente as principais células obtidas em seres humanos pela

facilidade de coleta) ou de órgãos linfóides (geralmente, de animais de experimentação, na maioria dos

casos, de camundongos) são colocadas em placas estéreis de plástico, em meios de cultura com

suplementos importantes para a sua sobrevivência (Figura 20).

Nestas placas, as células são submetidas a estímulos inespecíficos ou específicos. Os estímulos

inespecíficos que ativam os linfócitos de forma policlonal, ou seja, independentemente de sua

especificidade, são denominados mitógenos. Alguns mitógenos induzem a proliferação de linfócitos T

enquanto que outros, a de linfócitos B. A concanavalina A (ConA), lectina isolada do feijão da espécie

Canavalia ensiformis, induz a proliferação de linfócitos T de camundongos, enquanto que a

Fitohemaglutinina (PMA), isolada do feijão da espécie Phaseolus vulgaris, induz a de linfócitos T

humanos (Figura 20). O Lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) obtido de Salmonella ou de Escherichia

coli ativa de forma policlonal os linfócitos B de camundongos, além de ativar os macrófagos, induzindo

a produção de citocinas pró-inflamatórias e os produtos tóxicos de oxigênio e nitrogênio.

Estes mitógenos geralmente são utilizados para avaliar o estado funcional celular porque pela

sua capacidade de associação a açúcares da membrana celular, ativam entre 30 e 60% das células. Por

outro lado, a ativação específica dos linfócitos nem sempre induz proliferação mensurável porque o

percentual de células específicas para um determinado antígeno é muito pequeno (entre 0,2 e 0,01%).

A utilização de antígenos na ativação celular in vitro é mais eficiente quando as células são

oriunda+++++++s de animais ativados in vivo com altas doses do antígeno, o que propicia um aumento

do número de células específicas. Em seres humanos, com exceção de alguns casos patológicos, é mais

difícil ativar as células com antígenos isolados. No entanto, quando pessoas são vacinadas, suas células

podem ser cultivadas na presença de antígenos da vacina para serem estudados os tipos de resposta

induzidos: proliferação dos linfócitos, produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias.

Como por exemplo: se quisermos estudar o tipo de resposta que uma vacina contra a leishmaniose está

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

300

induzindo, teremos que isolar os leucócitos do sangue periférico das pessoas vacinadas e não vacinadas

residentes no local região e cultivá-las com antígenos de Leishmania presentes na vacina e avaliarmos a

resposta proliferativa e a secreção de citocinas, dentre outras possibilidades.

Figura 20 – Cultura de células e ensaio de proliferação

2. Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais

Quando inoculamos um antígeno em um animal e coletamos o seu sangue, no plasma são

encontrados os anticorpos específicos contra os determinantes antigênicos deste antígeno. Este plasma é

um antisoro policlonal porque os anticorpos ali presentes são oriundos de vários clones de linfócitos B

específicos para cada um dos determinantes antigênicos. Por exemplo, se inocularmos linfócitos T

1 2 3 4 5 6

A

B

C

D

Sem estímulo

+ PMA

Coleta de sangue periférico

Separação dos linfócitos do sangue

Hemácias, plaquetas, granulócitos

Linfócitos/monócitos

Plasma

Proliferação celular

Citocinas (ELISA)

Placa estéril de 24 poços

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

301

humanos num camundongo, ocorrerá ativação de linfócitos T e B específicos contra as principais

moléculas presentes na superfície da célula humana inoculada (Figura 21) e teremos, ao coletar o

plasma dos camundongos, um conjunto de anticorpos que reconhecem estes determinantes antigênicos.

No entanto, para se obter estes anticorpos específicos contra os determinantes antigênicos de

forma isolada podemos utilizar a técnica de anticorpos monoclonais, desenvolvida em 1975, por Köhler

e Milstein. Nesta técnica, o animal inoculado com o antígeno, no nosso caso os linfócitos T humanos,

terá o seu baço ou linfonodo coletado e os linfócitos B isolados são fundidos com células de mieloma

(um tumor de linfócitos B, não produtor de anticorpos), pelo uso de uma substância denominada

Polietilenoglicol (PEG). Estas células são cultivadas em meios seletivos, que propiciam que apenas as

células fundidas (hibridomas) sobrevivam. Os hibridomas obtidos da fusão de linfócitos B e das células

do mieloma são células que apresentam a capacidade de secretar anticorpos e sobreviver

indefinidamente em cultura, o que não ocorre com os plasmócitos. As células do hibridoma são diluídas

em placas de plástico estéril de forma que em cada poço seja inserida uma única célula (ensaio de

diluição limitante). Quando a célula prolifera, ela secreta anticorpos mono-específicos, ou seja, os

anticorpos monoclonais, oriundos de um único clone. Foi exatamente desta forma que foram

descobertas as moléculas (CDs) presentes na membrana dos linfócitos T, B, macrófagos, NK e outras.

TÉCNICAS DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE ANIMAIS

1. Camundongos transgênicos

Os camundongos transgênicos são aqueles nos quais foram introduzidos no genoma, durante a

fase embrionária, novos genes pré-existentes ou não (seqüências clonadas e denominadas transgenes). A

primeira etapa na criação de um camundongo transgênico é a indução de superovulação em um

camundongo fêmea, pelo inóculo de Hormônio Folículo Estimulante e Gonadotrofina Coriônica. Após a

indução da ovulação, o camundongo fêmea é acasalado e o oócito fertilizado removido e a seqüência do

gene injetado no pró-núcleo masculino. Estes oócitos fertilizados são inoculados no útero de fêmeas

pseudo-grávidas. Das centenas de cópias de genes injetadas no pró-núcleo, cerca de 25% são integradas

no genoma e originam os camundongos transgênicos. Estes camundongos transgênicos geralmente são

heterozigotos e devem ser endocruzados para originar a linhagem homozigota.

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

302

Figura 21 – Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais

Da2 Da4

Da3

Da1

Ag - Linfócitos T humano Inóculo em camundongos

Coleta de sangue

Coleta do baço

Antisoro policlonal

Células do baço Células de mieloma

Fusão

Hibridomas

Separação dos clones de linfócitos B

1 2 3 4 5 6

A

B C

D

Coleta do sobrenadante das culturas

Anticorpos monoclonais

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

303

Estes camundongos são importantes nos estudos das atividades da grande variedade de moléculas que o

organismo produz. Por exemplo: se o gene da IL-4 foi clonado e queremos observar o efeito desta

citocina na infecção contra a Leishmania, podemos criar um camundongo que expresse em excesso a

IL-4 (transgênico para IL-4) e após a infecção, acompanhar comparativamente em relação ao

camundongo normal da mesma linhagem, o desenvolvimento da lesão, o número de parasitas na lesão e

nos órgãos linfóides, a indução de outras citocinas e a resposta imune nestas condições.

2. Camundongos nocauteados (knock out)

A técnica de nocaute gênico permite que genes mutados in vitro e inseridos, durante o

desenvolvimento embrionário no blastocisto, originem camundongos deficientes na produção da

molécula induzida pelo gene. Assim como foram utilizadas, nos primórdios da Imunologia, as técnicas

de timectomia, bursectomia, esplenectomia para serem estudadas as funções destes órgãos, hoje se pode

mutar qualquer gene, impedindo que ele seja expresso de forma adequada. Várias funções das citocinas,

de moléculas co-estimulátorias têm sido estudadas, em diferentes modelos experimentais, por meio desta técnica.

Para que seja produzido um camundongo nocauteado, a primeira etapa consiste na clonagem

do gene e da sua modificação in vitro. Estas modificações são obtidas pela inserção de dois genes (Figura 22):

! O da resistência a neomicina. Este gene insere-se em regiões intragênicas, modificando a

sua expressão, ou seja mutando o gene (Figura 22A); além disso, atua como marcador da

célula mutante, porque esta se torna resistente a neomicina, quando cultivada em meio

contendo este antibiótico (Figura 22C3).

! O da timidina quinase (tk), do vírus herpes. Este gene não é expresso quando a célula sofre

recombinação homóloga, ou seja, quando ocorre a troca do gene normal pelo mutado.

Como a célula mutante não expressa o gene tk, esta não é sensível ao ganciclovir, agente

anti-viral (Figura 22C3). Por outro lado, as células que apresentam inserção aleatória do

gene, continuam expressando o gene tk e são sensíveis ao ganciclovir (Figura 22C2).

Após a mutação, estes genes são inseridos num vetor e introduzidos em células embrionárias

primordiais (ES – Embryonic Stem Cells) de camundongo (linhagem 1). Estas células são capazes de

originar qualquer tipo de tecido (Figura 22B).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

304

Figura 22 – Clonagem do gene e inserção em células in vitro. A. Clonagem do gene (IL-4, por exemplo) e mutação do gene in vitro (inserção do gene da resistência à neomicina (neo) e o gene timidina quinase –tk- do vírus herpes), B

Inserção in vitro do gene mutado em células tronco embrionárias (transfecção), C.Tipos de inserção:1. ausência de inserção, 2. Inserção ao acaso e 3. Inserção por recombinação homóloga

Gene da IL-4 neo Tk

Gene excisado

Cultivo em Neomicina e ganciclovir

Morte Morte

Sobrevivência

Proliferação

Céls.Tronco

Cromossomos (linhagem 1)

A.

B.

C. 1. 2. 3.

CAP. 20 - ENSAIOS IMUNOLÓGICOS

305

Estes genes introduzidos podem apresentar três destinos diferentes na célula: ausência de inserção,

inserção aleatória e inserção por recombinação homóloga. Desta forma, apenas uma pequena população

das células apresenta o gene inserido de forma correta, ou seja, os que apresentaram recombinação

homóloga; para que ocorra seleção destas células, elas são cultivadas em meio contendo neomicina e

ganciclovir, como acima referido.

O resultado desta cultura em meio contendo neomicina e ganciclovir é o seguinte:

! As células que não tiveram o gene inserido, são sensíveis a neomicina e morrem (Figura 22C1).

! As células que apresentam inserção aleatória, não perdem o gene da tk e são sensíveis ao

ganciclovir e morrem (Figura 22C2).

! As células que sofreram recombinação homóloga do gene mutado apresentam resistência a

neomicina e por não expressarem a tk são resistentes ao ganciclovir e sobrevivem (Figura 22C3).

Na próxima etapa, estas células sobreviventes são inseridas in vitro em blastocisto de

camundongo fêmea de cor de pelagem diferente (linhagem 2) daquela da qual foram coletadas as

células embrionárias (linhagem 1) (Figura 23A). Após a introdução das células no blastocisto, este é

inserido em camundongos fêmea na qual foi induzida a gravidez hormonal. O blastocisto desenvolve-se

e origina uma prole formada por camundongos quiméricos, ou seja, apresentando características das

duas linhagens. A utilização de camundongos de pelagens diferentes é importante para a identificação

dos camundongos quiméricos que herdaram os genes mutantes: estes apresentam um padrão mesclado

de cor de pelagem. Por exemplo, as células embrionárias (linhagem 1) podem ser oriundas de

camundongos de pelagem marrom enquanto que o blastocisto de fêmeas de pelagem negra (linhagem 2).

Os camundongos quiméricos apresentam a cor negra mesclada com faixas marrons e são heterozigotos

para o gene mutado. Estes camundongos quiméricos são cruzados com camundongos normais, para que

seja obtida uma linhagem homozigota para o gene mutante (Figura 23B).

FILOMENA M. P. BALESTIERI - IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

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Figura 23 – Obtenção de camundongos nocauteados A. Inóculo das Células Tronco Embrionárias de camundongo marrom em blastocisto de fêmeas pretas B. cruzamento dos camundongos quiméricos

Blastocisto Células tronco Reimplante do blastocisto em fêmea pseudo-grávida

Filhote quimérico

Cromossomos (linhagem 2) Cromossomo com

gene mutado

Cromossomos normais

Cromossomo mutado

A.

B.

Imuno...dificilllllll
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