espessura de membranas em biofísica, Notas de aula de Farmácia
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espessura de membranas em biofísica, Notas de aula de Farmácia

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Aula expositiva sobre a biofísica das membrans
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Bases iônicas do potencial de repouso

Compartimentalização: estabelecimento de 2 regiões no espaço, separadas fisicamente por uma barreira, e funcionalmente pelo trânsito seletivo

Trocas de Energia e Matéria

Compartimentalização

Tempo X Evolução

4.600.000.000 anos – Terra 3.500.000.000 anos – procariontes 2.000.000.000 anos – eucariontes 700.000.000 anos – multicelulares 70.000.000 anos – mamíferos 12.000 anos – Homem 72 anos – vida média 37 anos – membranas

Carioteca

eNOS L-Arg

NO

GCs

+GMPc

PKA

PKG

-

PDE1/3 GMPcAMPc

+ -

iNOS

nNOS

Dimensão da Membrana

7 a 9 nm – 10-9 metros

Ligações na Membrana

Estrutura Interações intermoleculares não covalentes

Como????? Porquê????

Energia

CANAIS IÔNICOS

Canais iônicos são seletivos

Canal de Na+:

• Diâmetro do poro • Tamanho do íon • Carga do canal • Carga do íon

Canais iônicos

canais para o potássio  são os mais simples e os mais antigos evolutivamente.

Os canais para o sódio evoluíram a partir dos canais para o potássio via canais para o cálcio, nos primeiros metazoários, há aproximadamente 800 milhões de anos atrás.

 Os canais para o potássio e para o cálcio são mais antigos, sendo que os primeiros surgiram, entre os procariontes, há mais de 2,4 bilhões de anos atrás.

 A subunidade α dos canais iônicos dependentes de voltagem possuem uma estrutura comum de seis segmentos alfa-hélice transmembrana (S1 – S6).

 O poro do canal está situado ao longo do eixo de simetria do oligômero. O quarto segmento, S4, têm um arranjo simétrico de resíduos carregados, lisina ou arginina, e funciona como um sensor de voltagem. Este segmento sofre uma mudança conformacional, promovida por alterações sutis do potencial de membrana (ex: despolarização) e promove a abertura do poro.

K+ K+

Na+ Na+ Cl-Cl-

permeabilidad e

Separação das cargas elétricas = Diferença de Potencial Elétrico / Voltagem

Ânions orgânicos

Funcionamento do coração

O2 e nutrientes remoção dos catabólitos gerados

Célula Ventricular Cardíaca

Representação Esquemática de uma Célula Ventricular Cardíaca

(Bers, 2002 – Nature)

contração

PA

Tú bu

lo T

miofilamentos

sarcolema

bu lo

T sarcolema

miofilamentos

PA contração

PARTICIPAÇÃO DE CANAIS IÔNICOS NA FUNÇÃO CARDÍACA

INa

Canais para Cálcio

 sensíveis à dihidropiridinas

 1953 – Fatt e Katz

 1963 – investigação eletrofisiológica

CLASSIFICAÇÃO – CANAIS DE CÁLCIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM

20 40 60 80 100

Cav1.1 Cav1.2 Cav1.3 Cav1.4

Porcentagem de similaridade por aminoácidos

Cav 2.1 Cav 2.2 Ca v 2.3 Cav 3.1 Ca v 3.2 Ca v3.3

L

T

HVA

LVA

N P/Q

R

S C

D F

A B E

G

H I

nome classe

L

T

N

P/Q

R

Ertel, 2000 Birnbaumer,1994

N – neurônio P – Purkinje R – resistente a tox L – large condutance T – tiny condutance

Canais para Cálcio  Responde a fase de platô  Canais identificados:

1- Canal tipo L (“large condutance”)  condutância de 25pS  é ativado em voltagens próximas a 0 mV  pode ser bloqueado pelas diidropiridinas (nifedipina, nitrendipina) verapamil,

D600 e cádmio  HVA (High Voltage) ativados em potenciais mais positivos

2- Canal tipo T (“tiny condutance”)  condutância de 8pS  é pouco sensível ao verapamil e ao D600  pode ser bloqueado pelo Ni++ e tetrametrim  LVA (Low Voltage) ativados em potenciais menos positivos

3- Canais do tipo N, P, Q e R  condutância de 13pS HVA (High Voltage) ativados em potenciais mais positivos

February 1, 2001 THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE Volume 110

Canais para Ca2+

Canais para Cálcio ativados por voltagem

Subunidade formadora do poro (1) Subunidade auxiliares ( 2, , , , )

1: 212-250kDa

4 unidades homólogas – Domínios

S4 - Arg e Lys

alças P – filtro seletivo (4 resíduos de glutamato - HVA)

Domínio I – inativação do canal

I II III + +

+

P

II + +

+ V

+ +

+ IV + +

+ +

VI

P

IIIV VIV +

IV +

533

VI IVI I II III +

IV

+

IVI II III V

PPKG

PKA

PKC

NH2

COOH

27/31

1928

 1

 NH2

NH2 P 478/479

PKA

COOH

COOH

I II III IV

S4 alça P

Permeabilidade Ca2+ Ba2+ e Sr2+

inativação do canal K

Bloqueadores:

La3+ > Co2+ >Mn2+ > Ni2+ > Mg2+

Ion Channels – David J. Aidley and Peter R. Stanfield (MODIFICADO)

F A

I

 Todos os canais têm um estado fechado e um aberto, e alguns têm também um estado inativo, no qual o poro, mesmo aberto, encontra-se ocluído por uma região própria do canal. A transição entre as formas fechada e aberta é alostericamente regulada por voltagem – movimento de gating - por regulação de uma molécula ou por modificação covalente.

Corrente

20 ms

100 pA

Cd2+ (100 M)

Ca2+ (5mM)

Ba2+(5mM)

Ba2+(5mM)

CORRENTES DE CALCIO

Inativação

 LVA – inativação rápida – processo sensível a voltagem

 HVA – inativação lenta – processo sensível a voltagem e a concentração de cálcio local livre. Processo mediado por moléculas de calmodulina C-terminal

CÁLCIO

 segundo mensageiro

 [Ca]i = 100nM repouso [Ca]e = 1 a 2mM

 pequeno influxo – sensibilidade

IMPORTÂNCIA

CANAIS DE CÁLCIO: CONTRAÇÃO

SECREÇÃO

NEUROTRANSMISSÃO

EXPRESSÃO GÊNICA

CASCATA DE FOSFORILAÇÃO DE PROTEÍNAS

IMPORTÂNCIA

ÍONS CÁLCIO: são SEGUNDO-MENSAGEIROS INTRACELULARES

capazes de ativar muitas funções celulares.

PA

IMPORTÂNCIA

CANAIS PARA CÁLCIO: CONTRAÇÃO

SECREÇÃO

NEUROTRANSMISSÃO

EXPRESSÃO GÊNICA

Canais para cálcio tem 2 papéis principais:

• Eletrogênico

• Regulatório

Neurotransmissão:

Era “patch clamp” 19

02

Be rn

st ei

n

17 80

Ga lv

an i

19 52

Ho dg

ki n,

Hu xl

e y 19

81 Sa

km an

n e

Ne he

r

Prêmio Nobel de 1991 Erwin Neher, 1944- B. Sakmann, 1942

Patch-Clamp

Fixação de voltagem

10m

Vc

Vm

i

Medidas da diferença de potencial elétrico em sistemas biológicos

10m

“patch” clamping

ESQUEMA DO SETUP

Soluções (em mM):

BanhoPerfusão

NaCl 140 CsCl 130 KCl 5 CaCl2 2 CaCl2 2 MgCl2 0,5 MgCl2 0,5 Hepes 10 Hepes 10 Glicose 5 Glicose 5

pH 7.4

Modo whole-cell patch-clamp

Solução usada na pipeta (em mM): CsCl 130 TeaCl 20 EGTA 10 Hepes 10

pH 7.2

MgCl2 0,5

mV -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

pA

-400

-300

-200

-100

0

ms 80 100 120 140 160 180 200 220 240

pA

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

m V

-120 -100 -80 -60 -40 -20

0 20 40 60

pA

pA

m V

100 ms

100 ms

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

pA

pA

m V

I.V.

canais de sódio dependentes de voltagem

-70 mV

-10 mV 5 ms

Corrente de sódio

Ferramentas farmacológicas

Tetrodotoxina (TTX)

Eletrofisiologia

Path-Clamp – Whole Cell

  Solução

da Pipeta pH 7.2

Sais [ ] mM CsCl 130 TeaCl 20 EGTA 5 Hepes 5

Mg-ATP 4

ICa

   

Solução da

Externa pH 7.4

Sais [ ] mM NaCl 140 CsCl 5 MgCl2 0.5 Ca Cl2 1.8 Hepes 5 Glicose 5

4-AP 4

Protocolo de voltagem utilizado para o registro de correntes de cálcio de tipo L nos experimentos eletrofisiológicos na modalidade de whole-cell voltage-clamp

Eletrofisiologia

   

Solução da

Externa pH 7.4

Sais [ ] mM NaCl 140 KCl 5.4

MgCl2 0.5 Ca Cl2 1.8 Hepes 5 Glicose 5 Cd Cl2 0.001

Ito  

Solução da

Pipeta pH 7.2

Sais [ ] mM

KCl 150

EGTA 5

Hepes 10

Mg-ATP 4

Protocolo de voltagem utilizado para o registro de correntes de potássio Ito nos experimentos eletrofisiológicos na modalidade de whole-cell voltage-clamp

Eletrofisiologia

   

Solução da

Externa pH 7.4

Sais [ ] mM NaCl 140 KCl 5.4

MgCl2 0.5 Ca Cl2 1.8 Hepes 5 Glicose 5 Cd Cl2 0.001

Ik1  

Solução da

Pipeta pH 7.2

Sais [ ] mM

KCl 150

EGTA 5

Hepes 10

Mg-ATP 4

Protocolo de voltagem utilizado para o registro de correntes de potássio IK1 nos experimentos eletrofisiológicos na modalidade de whole-cell voltage-clamp

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