Métodos Imunológicos, Notas de estudo de Bioquímica
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1

Métodos Imunológicos Guido Lenz

Biofísica, 2004 1. Introdução

Ter como função proteger um organismo de qualquer componente externo num mundo

de miriades de componentes internos e de uma imensidão de prováveis invasores fez do

sistema imunológico, ao longo da evolução, um dos sistemas biológicos mais complexas.

Pela sua importância vital e talvez pela sua transparente complexidade, o sistema

imunológico sempre produziu um grande fascínio sobre os cientistas, fascínio este

comparável ao dedicado ao sistema nervoso, talvez por suas semelhanças no que se refere à

memória, comunicação e inteligência (para usar os termos cunhados para este, mas

certamente úteis naquele).

O conhecimento adquirido sobre o sistema imunológico, principalmente sobre a produção

de anticorpos, conduziu a uma revolução nas técnicas usadas nas ciências biológicas.

Atualmente uma grande parte dos métodos bioquímicos e histológicos lança mão desta

poderosa ferramenta chamada anticorpo para alcançar os seus objetivos. Acredito que os

métodos imunológicos, ao lado da biologia molecular, estão entre os maiores avanços em

termos metodológicos conseguidos nos últimos 10 ou 20 anos.

Duas afirmações podem ser citadas para argumentar porque os métodos imunológicos

são um conhecimento imprescindível na formação de estudantes das áreas biológicas: 1. o

envolvimento direto com estes métodos, para estudantes que irão usá-los em trabalhos

experimentais e 2. melhor compreensão de assuntos que usam estes métodos, que são

largamente encontrados em todas os ramos das ciências biológicas.

Estes argumentos, aliás, valem para o estudo dos métodos como um todo, pois, para que

se possa analisar de forma crítica um texto científico, é necessário ter conhecimento dos

métodos usados para produzir os resultados, sem o qual a análise se torna no mínimo

superficial.

2. Anticorpos

Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta

afinidade. Discutiremos a seguir como estas proteínas são produzidas nos organismos pelos

linfócitos e como isto pode ser manipulado para fins específicos.

2

2.1 Produção

A descoberta dos mecanismos de produção de anticorpos é, sem sombra de dúvida, uma

das grandes vitórias das ciências biológicas neste século, devido a sua complexidade, mas

principalmente pelos benefícios que representa para a humanidade. Discutiremos apenas

superficialmente os mecanismos que levam à geração de anticorpos, pois a complexidade

deste assunto não permite a sua análise aprofundada neste texto (certamente isto será feito

em disciplinas específicas).

2.1.1 Mecanismo de Síntese de Anticorpos Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B, que se originam na medula, sendo

distribuídos pelo organismo inteiro através do sistema linfático. A quantidade de linfócitos no

corpo humano é estimado em cerca de dois trilhões (2 x 1012), sendo esta quantidade elevada

fundamental para o perfeito funcionamento do sistema imunológico, como veremos a seguir.

O funcionamento do sistema imunológico, e conseqüentemente da produção de

anticorpos é explicada pela teoria de seleção clonal. Esta teoria afirma que no embrião

sejam produzidos, por recombinação genética,1 uma imensa variedade de linfócitos cada qual

contendo um receptor diferente 2. No período embrionário, os receptores dos linfócitos que

reagirem com algum antígeno serão eliminados, fazendo com que os linfócitos que

respondem a componentes do próprio organismo morram. Se neste período estiverem

presentes antígenos externos, não se desenvolverá nenhuma imunidade contra este

antígeno. Por outro lado, se algum antígeno do organismo não puder ser “encontrado”,

futuramente este antígeno será interpretado como estranho e se desenvolverá uma reação

autoimune.

Quando um antígeno ingressa em um organismo adulto, o(s) linfócito(s) que tiver(em) o

receptor para este antígeno se reproduzem, e se diferenciam, voltando toda a sua atividade

para a síntese de anticorpos (o mesmo anticorpo que eles possuem como receptor - ou seja,

aquele que reage com o antígeno). Desta forma, um certo período após o antígeno ter

entrado em contato com o organismo, inicia-se um grande produção de anticorpos, que

poderá então precipitar o antígeno, tirando-o de circulação (Figura 1).

1 acredita-se que genes altamente variáveis possam se recombinar de inúmeras formas para produzir

uma variedade extremamente grande de anticorpos. 2 este receptor na realidade é um anticorpo produzido somente por este linfócito que pode se

comunicar com o interior, sinalizando tanto a morte (no embrião) como a proliferação (no adulto)

3

É necessário destacar que o sistema imunológico produz uma diversidade tão grande de

anticorpos que ligará em virtualmente tudo e depois seleciona o que é próprio e o que é

estranho, o que significa que os linfócitos são selecionados e não moldam o anticorpo de

acordo com o antígeno3.

Linfócitos imaturos quando ativados pelo antígeno se diferenciam em linfócitos maduros,

produtores de anticorpos e também linfócitos de memória, que, numa segunda exposição ao

antígeno, se ativam muito mais rapidamente do que as células virgens fazendo com que a

segunda resposta imunológica seja muito mais intensa e rápida do que a primeira.

2.1.2 Tipos Um certo antígeno pode ser reconhecido por vários linfócitos, levando a ativação de

vários clones de linfócitos B. Cada qual destes clones reconhece uma parte diferente ou se

liga de uma forma diferente ao antígeno, através de uma parte do antígeno denominada

epitopo, que é a parte do antígeno efetivamente reconhecida pelo anticorpo para que a

interação antígeno-anticorpo possa ocorrer. Até antígenos pequenos como a grupo dinitrofenil

podem ser reconhecidos por vários linfócitos, ou seja, possuem vários epitopos. Desta forma,

3 embora o anticorpo, após a seleção do linfócito B que o produz, pode ser alterado afim de produzir

um aumento na sua afinidade, o que parece ser um forma de moldagem antígeno específica.

Figura 1. Produção de anticorpos pelos linfócitos B.

4

um antígeno grande, como uma proteína, pode possuir inúmeros epitopos, cada qual

induzindo a produção de um anticorpo específico.

2.1.2.1 Policlonais Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de

diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epitopos do antígeno (por

exemplo, várias partes de uma proteína).

2.1.2.2 Monoclonais Este tipo de anticorpo provém de somente um linfócito B, selecionado artificialmente e

replicado diversas vezes como um clone. Desta forma, este anticorpo liga somente a um

epitopo de uma única forma.

2.1.3 Produção de Anticorpos Policlonais

2.1.3.1 Antígeno O primeiro passo para a produção de um anticorpo é a purificação do antígeno. Isto pode

ser realizado de diversas formas, usando técnicas de purificação como cromatografia e

eletroforese. Com o desenvolvimento e o barateamento da síntese de peptídeos, muitos

anticorpos são produzidos usando-se peptídeos de 10 a 14 aminoácidos acoplados a uma

proteína carreadora.

2.1.3.2 Imunização A imunização é realizada aplicando-se no animal (coelho, camundongo, cabra etc.) o

antígeno juntamente com conjunto de substâncias que ativam o sistema imunológico,

denominados de coadjuvantes, como por exemplo o coadjuvante de Freud. Após alguns dias,

o sangue do animal é recolhido e, através de centrifugação, é separado o plasma sanguíneo

(soro), na qual se encontram os anticorpos.

2.1.3.3 Purificação Algumas vezes é possível utilizar o soro, pois a grande maioria de anticorpos ali

presentes são os anticorpos sintetizados contra o antígeno injetado, mas geralmente é

importante separar a fração das imunoglobulinas ou de preferência do anticorpos específico.

Isto geralmente é realizado com cromatografia por afinidade, na qual se usa a a proteína A

(ver Pontes item 2.3.1) ou o próprio antígeno como fase estacionária numa coluna de

afinidade, sendo que o anticorpo purificado é liberado da coluna através do uso de uma

solução com pH 2,5.

5

2.1.4 Produção de Anticorpos Monoclonais A Figura 2 mostra um esquema da produção

de anticorpos monoclonais. Após imunizar o animal

(como descrito no item anterior), retira-se linfócitos

do baço e funde-se estas células com mielomas

(ver legenda da Figura 2) o que produz hibridomas

imortalizados. Após selecionar as células com um

meio de cultura que permite o crescimento

somente de hibridomas, estas são colocadas em

placas de cultura a uma densidade de uma célula

por poço, fazendo com que as células de cada

poço sejam descendentes de somente uma célula

de hibridoma, ou seja, um clone. Estes hibridomas

iniciarão a produção de anticorpos, que estarão

presentes no meio de cultura. O(s) clone(s) que

produzirem os anticorpos com maior afinidade e

mais específicos podem ser selecionados através

de testes usando técnicas imunológicas como a

imunodetecção.

Uma descoberta crucial para a produção de

anticorpos monoclonais foi a imortalização dos

linfócitos, fazendo com que, uma vez feito este

processo, se possa produzir anticorpos por um

tempo indeterminado. * 1. Injetar o rato com a proteína X; 2. Células de mieloma imortalizadas (tipo de cançer) e inaptas de crescer em um meio HAT (meio que contém certos inibidores que afetam somente estas

células); 3. retirar alguns linfócitos do baço do rato, sendo que alguns destes produzirão o anticorpo

desejado; 4. misturar e fundir as células e passar para um meio HAT; 5. células não fundidas

morrerão pois não são imortalizadas (linfócitos) ou não resistem ao HAT; 6. hibridomas crescem e se

multiplicam; 7. células únicas são cultivadas em poços individuais; 8. testar o sobrenadante de cada

poço contra a proteína X.

2.2 Estrutura

Os anticorpos, coletivamente denominados imunoglobulinas (Ig), são formados por

quatro subunidades ligadas entre si por quatro pontes dissulfeto, como mostra a Figura 3.

Camundongo Imunizado com antígeno X

Linfócitos do baço que produzem AC contra X são isolados.

Linfócitos são fundidos com mielomas (imortais)

Células híbridas são selecionadas

(mieloma/linfócito)

Células são clonadas

AC é produzido no meio de cultura e este meio é testado.

Linhagem que produz o melhor AC é crescida e o AC é purificado. Por serem células imortais, isto pode

ser realizado indefinidamente. Figura 2. Produção de anticorpos

monoclonais*

6

Estas quatro subunidades são constituídas de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias

leves (L). A forma dos anticorpos se assemelha a de um

“Y”, sendo que na parte de “cima” se encontram dois

sítios idênticos de ligação ao antígeno, o que possibilita a

ligação cruzada entre eles, podendo desta forma produzir

uma malha antígeno/anticorpo, isto é, um precipitado.

Os anticorpos são classificados em IgA, IgD, IgE, IgM

e IgG, sendo que o IgG representa 75% das Ig totais e

devido a isso é tão largamente utilizado nas técnicas

envolvendo anticorpos.

O sítio de reconhecimento dos antígenos está

localizado onde as partes variáveis de H e L se

encontram, fazendo com que variações tanto de H como

de L alterem este sítio, sendo que o responsável pela imensa variedade de anticorpos

possíveis parece ser a combinação das variações destes dois sítios.

2.3 Conjugados

Como foi discutido acima, os anticorpos têm como principal característica a

especificidade pelo antígeno. Para que estes possam ser usados na detecção de antígenos

específicos num universo de milhares, é necessário que os anticorpos estejam conjugados,

isto é, ligados, geralmente de forma covalente, a compostos que permitam a separação

(esferas de agarose) ou a detecção (peroxidase, flouróforos, ouro). A seguir, analisaremos as

características dos conjugados mais utilizados.

No caso da agarose, geralmente usa-se o brometo de cianogênio (NCBr), que reage com

os grupos OH da agarose formando a agarose ativada (contendo o grupo (-O-C(=NH2)-Br)).

Este grupo reage com aminas primárias, como é o caso do aminoácido lisina. Pode ocorrer

que esta forma de ligação não funcione adequadamente devido ao impedimento estérico (isto

é, a lisina da proteína não consegue atingir a agarose ativada). Para contornar este problema,

pode utilizar-se agarose ativada por grupos epoxi ligadas à agarose por espaçadores (por

exemplo contendo 12 carbonos). Estes grupos epoxi podem ligar-se a vários grupos químicos

como NH2, COOH, SH e OH, facilitando em muito a ligação da agarose ao anticorpo.

2.3.1 Pontes A modificação de anticorpos é um processo bastante trabalhoso. Devido a isso,

geralmente usa-se vários anticorpos, sendo o primeiro (que reconhece o antígeno - ver Figura

7), sem nenhuma modificação, reconhecido por um segundo anticorpo, que nada mais é do

Figura 3. Estrutura geral dos

anticorpos.

7

que um anticorpo contra a imunoglobulina do animal no qual foi produzido o primeiro

anticorpo, sendo este anticorpo ligado a alguma molécula de detecção, como por exemplo a

peroxidase ou moléculas fluorescentes.

2.3.2 Separação Para que se possa separar um antígeno do restante de componentes de um

homogeneizado, é necessário que o anticorpo específico para este antígeno esteja ligado a

algo facilmente separável. Geralmente liga-se o anticorpo a esferas de agarose que é um

material inerte e pode ser utilizado tanto em colunas cromatográficas como pode ser

facilmente separado por centrifugação (como no caso da imunoprecipitação). A ponte entre

as esferas de agarose e o anticorpo é geralmente feita pela proteína A, um polipeptídeo de 42

kDa, isolado do Stphylococcus aureus, que se liga fortemente à região Fc das

imunoglobulinas de várias espécie. Esta propriedade é muito útil para separar

imunoglobulinas, especialmente do tipo IgG, através de cromatografia de afinidade ou na

imunoprecipitação.

2.3.3 Detecção Para a detecção do anticorpo são utilizados diversos métodos, escolhidos de acordo com

a técnica.

2.3.3.1 Peroxidase A peroxidase é uma enzima que usa o H2O2 para oxidar os seus substratos. Estes

substratos são desenhados de tal forma que a sua oxidação possa ser detectada pela

liberação de luz (luminol), pela formação de uma precipitado colorido (DAB) ou então pela

transformação de um composto incolor num

composto colorido e que possa ser determinado

quantitativamente por espectroscopia.

O luminol, na presença de H2O2 e

peroxidase emite luz, que pode ser captada por

filmes de raio-X, sendo principalmente usada na imunodetecção.

A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma um polímero de cor

marrom, precipitando no local no qual se encontra a peroxidase, sendo principalmente

utilizada em estudos de imunocitoquímica. Existe uma grande variedade de compostos que

podem ser utilizados como cromóforos, fornecendo as mais variadas cores, utilizáveis na

técnica de ELISA, sendo o ABTS (2, 2'-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) um exemplo

de corante que se torna verde-azulado na presença de peroxidase.

NH

NH

O

O

NH2

O- N2

H2O2

Peroxidase

NH2

O

O

O- Luz+ +

Figura 4. Reação do luminol

8

2.3.3.2 Fosfatase alcalina A fosfatase alcalina é uma enzima que hidrolisa ligações fosfato. Desta forma, os

cromóforos são compostos que possuem grupos fosfato, e que com a perda deste grupo

fosfato adquiram cor, como é o caso do p-Nitrofenil-fosfato, que se torna amarelo ao perder o

grupo fosfato.

2.3.3.3 Fluoróforo Fluoróforo é um composto que emite luz de uma certo comprimento de onda (λ)

(coloração) quando excitado por uma luz de um outro λ. A tabela abaixo mostra alguns

fluoróforos:

Tabela 1. Fluoróforos com os seus λs de excitação, emissão e coloração.

Fluoróforo λ de excitação (nm) λ de emissão (nm) Coloração Fluoresceína 495 525 verde Rhodamina 552 570 vermelho

Fluoróforos com características diferentes torna possível marcar antígenos diferentes

com cores diferentes em um mesmo tecido ou célula, permitindo a observação simultânea de

dois ou mais componentes.

2.3.4 Metais pesados O principal metal pesado conjugado a anticorpos é ouro. Isto permite localizar antígenos

através da microscopia eletrônica, permitindo o estudos citológicos bastante específicos.

2.4 Amplificação do sinal

Uma das características mais importantes dos métodos imunológicos de detecção é a

sua alta sensibilidade. Para que isto seja possível, utiliza-se vários “truques” que amplificam o

sinal. Quando se utiliza uma enzima para a detecção, esta amplificação provém do fato de

que aquela enzima poderá produzir vários sinais (fótons de luz, cromóforos, etc), pois a

enzima continuará ativa enquanto tiver substrato.

3. Técnicas

3.1 Purificação

9

Como discutido anteriormente, uma das principais características dos anticorpos é a sua

especificidade pelo substrato. Parece óbvio que este especificidade possa ser utilizada para a

purificação de proteínas. Neste item abordaremos duas técnicas que utilizam anticorpos como

forma de purificação, a imunoprecipitação e a cromatografia por afinidade.

3.1.1 Imunoprecipitação Na imunoprecipitação usa-se um anticorpo

ligado à minúsculas esferas agarose (que é uma

resina) para precipitar o antígeno. Geralmente esta

ligação entre anticorpo e agarose é feita através de

uma proteína A, mas também pode ser feita através

de outras pontes como a biotina/estreptoavidina (ver

Ponte 2.3.1).

Nesta técnica é importante mencionar que o

lisado deve ser feito em um meio que permite a

ligação antígeno/anticorpo, isto é, contendo

reduzidas concentrações de detergentes não-

iônicos e condição de pH e força iônica adequadas.

A este lisados, adiciona-se o anticorpo contra o

antígeno que se deseja separar e depois a proteína

A ligada à agarose. Como as esferas de agarose

possuem um tamanho imenso quando comparadas com os componentes celulares

encontrados no lisado, pode-se precipitá-las com facilidade usando uma centrifugação a

baixa velocidade. Após esta centrifugação pode-se dissolver o precipitado (no qual está o

antígeno ligado à agarose) em uma solução de eletroforese para que esta antígeno possa ser

analisado através da técnica eletroforética.

3.1.2 Cromatografia por Afinidade A principal característica que se busca na fase estacionária de uma cromatografia é que

esta ligue de forma diferenciada os compostos a serem separados. Vários compostos podem

produzir esta ligação diferencial baseados principalmente em propriedades químicas dos

compostos. Os anticorpos tem como principal vantagem não ligar apenas de forma

diferenciada a certos compostos, mas sim selecionar de forma específica um composto. Para

conseguir isto, ligando-se um anticorpo a uma fase estacionária e se faz passar o lisado que

contém o antígeno.

Figura 5. Imunoprecipitação. A esquerda uma

sepação das proteínas da célula. A direita uma imunoprecipitação com anticorpo específico, que reconhece o antígeno e um outro um um anticorpo inespecífico

10

Após lavar a coluna cromatográfica por um certo período de tempo para retirar os

componentes não ligados, se elui o antígeno purificado com uma solução contendo condições

que diminuam a interação antígeno/anticorpo, como, força iônica mais elevada, pH diferente

do pH fisiológico, detergentes ou solventes apolares.

Quando comparado com outras cromatografias, a de afinidade geralmente é a que tem

um poder de purificação mais elevado.

3.2 Quantificação e análise

3.2.1 Imunodetecção A imunodetecção (também denominada “imunoblotting”) é uma técnica que possibilita

reconhecer e quantificar antígenos a partir de um gel de eletroforese, geralmente SDS-PAGE.

3.2.1.1 Transferência para a Membranas O gel de eletroforese é um meio pouco apropriado para a imunodetecção, isto é, não é

um bom suporte para as ligações antígeno/anticorpo. Assim sendo, utiliza-se membranas

constituídas geralmente de papel, isto é, de celulose, alterada quimicamente. Como exemplo

pode-se citar a nitrocelulose, que possui grupos nitro ligados à celulose produzindo desta

forma um suporte com alta afinidade

por proteínas, fazendo com que

estas permaneçam presas a sua

superfície.

Para transferir o antígeno do

gel de eletroforese para a

membrana utiliza-se um campo

elétrico (mesmo princípio da

eletroforese). Neste método, coloca-

se a membrana sobre o ânodo (+) coberto por vários papeis filtro e em seguida o gel, que

entrará em contato com o cátodo (-), também através de papéis filtro, fazendo com que as

proteínas, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar para o ânodo. Este “sanduíche” é

mostrado na Figura 6.

Um método alternativo, denominado “dot”, permite o uso do lisado celular para a

detecção do antígeno. Neste caso, não é necessário separar as proteínas por eletroforese,

sendo uma pequena quantidade do lisado celular (~0,3µl) pingado diretamente sobre a

membrana.

Figura 6. Transferência das proteínas para a membrana.

11

3.2.1.2 Bloqueio Como a membrana possui uma alta afinidade por proteínas é necessário bloqueá-la, pois

ao contrário os anticorpos se ligariam a toda a superfície da membrana e não, como

desejado, especificamente ao antígeno.

Para bloquear a membrana geralmente se usa leite em pó desnatado, mas polímeros

sintéticos como a poli-vinil-pilorridona (PVP) também podem ser usados, principalmente em

casos nos quais os componentes do leite prejudicam a ligação antígeno/anticorpo.

3.2.1.3 Primeiro anticorpo Feito isto, adiciona-se o primeiro anticorpo, ou seja, aquele que se ligará ao antígeno.

Este anticorpo é adicionado em uma solução que mimetiza a solução na qual ele foi

sintetizado, ou seja, o meio extracelular nos quais os linfócitos B estão embebidos na hora de

se ligarem ao antígeno e serem selecionados para produzí-lo (um tampão com pH 7,5 e força

iônica em torno de 1 0sm - 500mM NaCl). A diluição (título) e o tempo de reação, quando não

especificado pelo fabricante (no caso de anticorpos comerciais) precisam ser determinados

empiricamente.

3.2.1.4 Segundo anticorpo

Figura 7. Componentes da imunodetecção

12

Muitas vezes o primeiro anticorpo já possui um componente que possa ser detectado

(dispensando o presente item e o seguinte) ou uma molécula ponte que se ligue a uma

molécula de detecção, dispensando o segundo anticorpo. Quando isto não é o caso, o

segundo anticorpo se faz necessário. Este anticorpo é desenvolvido contra o IgG do animal

no qual foi desenvolvido o primeiro anticorpo.

Por exemplo: se o primeiro anticorpo foi desenvolvido

em camundongo, precisaremos neste passo um anticorpo

anti-IgG de camundongo (obviamente desenvolvido em

outro animal).

Este segundo anticorpo possui ou um componente do

tipo ponte ou um componente detectável. Mas por que da

existências deste passo, se estes componentes podem ser

colocados diretamente nos primeiros anticorpos? Isto está

principalmente relacionado com a dificuldade de se

modificar um anticorpo, ou seja, colocar nele algum

componente. Usando o segundo anticorpo, dispensa a

modificação do primeiro anticorpo, sendo possível desta

forma produzir primeiros anticorpos contra vários antígenos

e modificar somente o segundo anticorpo. A montagem de

todos os componentes da imunodetecção pode ser vista na

Figura 7.

A detecção pode ser feita de várias formas, como discutido no item 2.3.3.

3.2.2 Imunocitoquímica A imunocitoquímica usa o mesmo princípio da imunodetecção, isto é, a ligação

específica do anticorpo detectável ao antígeno. A única diferença está na apresentação do

antígeno, que em vez de estar sobre uma membrana se encontra no tecido fixado. Este

método tem uma precisão menor quando comparado com a imunodetecção, mas tem como

principal vantagem mostrar a localização cito e histológica do antígeno.

Os sistemas de detecção nesta técnica geralmente são a peroxidase / DAB

(diaminobenzidina) + H2O2 ou então os fluoróforos discutidos no item 2.3.3.3. Usando

diversos fluoróforos ligados a diferentes anticorpos é possível determinar em um mesmo

tecido a colocalização de dois ou mais antígenos, fato muito importante para a pesquisa em

biologia celular.

Figura 8. Especificidade da

imunodetecção. Somente a proteína específica é reconhecida.

13

Figura 9. Imunocitoquímica utilizando dois anticorpos. Foto da esquerda: Imunocitoquímica com um

anticorpo contra uma cinase (verde) sendo o DNA corado com DAPI (azul); figura do meio: a mesma célula, corado com um anticorpo que reconhece γ-tubulina (vermelho), um componente do centrosomo. Figura da direita, sobreposição das outras duas imagens, mostrando a co-localização no centrosomo.

3.2.3 Radioimunoensaio Este método usa o antígeno marcado radioativamente e anticorpos para determinar a

concentração de antígenos com uma precisão bastante elevada, sendo bastante usada para

a determinação da concentração de hormônios.

Este método se baseia basicamente na reação reversível antígeno anticorpo. Como

podemos ver na Figura 10 o antígeno marcado (At*)

compete pelo anticorpo (Ac) com o antígeno não marcado

(At) para formar o complexo AcAt (marcado ou não).

Quando se adiciona o antígeno não marcado (cuja

concentração é desconhecida) a reação Ac + At* em

equilíbrio com AcAt* será deslocada para a esquerda, pois a concentração de um dos

reagentes, isto é Ac, diminuiu, fazendo com que a concentração de AcAt* também diminua

(segundo a lei de equilíbrio de Le Chatelier). Assim sendo, isolando-se o complexo AcAt

(marcado ou não) e medindo-se a radiaoatividade deste complexo (com isso somente

detectando AcAt*) será possível determinar At, que é justamente a concentração de antígeno

que se pretende determinar.

Como em outros métodos quantitativos, estes métodos também exigem que se faça uma

curva padrão (usando concentrações conhecidas de At) e comparar estes valores com os

encontrados nas amostras desconhecidas.

Alguns variantes desta técnica podem usar, ao invés do antígeno marcado, anticorpo

marcado, sendo o procedimento experimental bastante semelhante.

Figura 10. Radioimunoensaio

14

3.2.4 ELISA Esta técnica usa um princípio semelhante à imunodeteção, com a diferença que na

ELISA o antígeno é preso a uma superfície (geralmente de poliestireno) através de um

anticorpo. Uma vez o antígeno ligado ao anticorpo imobilizado, este complexo pode ser

reconhecido por um outro anticorpo, desta vez ligado a uma enzima que possa produzir um

composto facilmente detectável.

A grande vantagem desta técnica é que, como a detecção é uma reação enzimática,

torna possível a detecção de quantidades muito reduzidas de antígeno pois permitindo que a

reaão ocorra por um tempo elevado cosegue-se produzir uma quantidade considerável de

alguma molécula detectável (fluoróforo). Um exemplo é a detecção do hormônio placental

ganadotrofina corínica, um teste de gravidez bastante confiável.

4. Conclusão

Os métodos imunológicos estão distribuído amplamente tanto na pesquisa como na

análise bioquímica. Dentre as diversas vantagens destas técnicas, duas parecem ser as mais

importantes para o grande sucesso destes métodos: A grande especificidade facilmente

conseguida com os anticorpos e a grande sensibilidade destes métodos além da imensa

diversidade e maleabilidade destas técnicas, uma vez que praticamente todos os

componentes usados nestes métodos podem ser interligados, basta utilizar as pontes

adequadas.

Estas características fizeram dos métodos imunológicos de grande utilidade em várias

áreas das ciências biológicas e médicas, sendo o seu conhecimento fundamental tanto nas

ciências básicas como nas aplicadas.

5. Referências

Alberts, B, Dennis, B., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D., Molecular Biology of the

Cell, 3rd Ed. Garland Publ. New York. (1995).

Voet, D. Voet, J., Biochemistry, 2nd Ed. John Wiley & Sons, New York, (1995).

Roitt, I., Brostoff, J., Male, D., Immunology, 2nd Ed. Gower Med. Publishing, London, (1989).

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