Microbiologia Práctica - Apostilas - Engenharia Biomédica, Notas de estudo de Engenharia Biomédica
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GloboTV31 de maio de 2013

Microbiologia Práctica - Apostilas - Engenharia Biomédica, Notas de estudo de Engenharia Biomédica

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Apostilas de Engenharia Biomédica sobre o estudo da Técnica asséptica, Técnica de cultura pura, Diluições decimais, Material necessário, Procedimento experimental.
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Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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Trabalho Experimental 3. Técnica asséptica. Técnica de cultura pura. Diluições decimais.

3.1 Técnica asséptica

Quando se pretende cultivar uma cultura de um único microrganismo é importante que não

existam contaminações provenientes dos meios e materiais utilizados na manipulação dessa

cultura e do meio ambiente, isto é, que se trabalhe em condições de assepsia. Todos os

cuidados de assepsia devem observar dois princípios fundamentais:

- Não permitir que microrganismos existentes no laboratório contaminem as amostras.

- Não permitir que as culturas em estudo contaminem o laboratório.

Todos os objectos que entrem em contacto com as culturas (incluindo os meios de cultura)

devem ser esterilizados. A transferência de culturas de um meio para outro deve ser realizada

junto a uma chama de um bico de Bunsen ou dentro de uma câmara de fluxo laminar.

3.2 Técnica de cultura pura.

Uma população microbiana, em condições naturais, contém muitas espécies diferentes. Quando

uma cultura de microrganismos se destina à sua identificação ou a estudos bioquímicos ou

fisiológicos, o primeiro passo reside na obtenção de uma cultura pura, i.e., uma cultura em que

apenas se encontra presente um tipo de microrganismo. Para obter uma cultura pura podem ser

utilizadas as técnicas de estrias, de espalhamento ou de incorporação em meio sólido.

A técnica de purificação pelo método das estrias baseia-se no espalhamento de um inóculo de

uma cultura mista várias vezes sobre o ágar e permite obter colónias isoladas podendo ser

utilizada para passar colónias de um meio sólido para outro, bem como para separar misturas de

microrganismos em suspensão (ver Figura 3.1).

Figura 3.1 Culturas obtidas pelo método das estrias.

Designa-se por colónia, uma população de células descendentes de um único microrganismo e,

apesar de muitas espécies de bactérias darem origem a colónias de aspecto similar, é possível

iniciar a identificação de espécies bacterianas pela morfologia das colónias formadas.

Passagem inicial

Colónias isoladas

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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Logo que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, é necessário manter as

culturas vivas pelo período de tempo necessário ao seu estudo e caracterização. Com este

intuito deve-se proceder à conservação dos microrganismos seja por períodos mais ou menos

longos.

À excepção de alguns microrganismos psicrófilos, a utilização de temperaturas abaixo de 0 ºC

previne o crescimento dos microrganismos, uma vez que inibe o seu metabolismo. A

conservação por refrigeração (temperaturas entre 4 a 10 ºC) é um método adequado para um

período de tempo curto (alguns meses), enquanto que os métodos de congelação a -20 ºC,

liofilização e armazenagem em azoto líquido (-196 ºC) permitem uma conservação de longa

duração (até alguns anos).

3.3 Diluições decimais

A quantidade de organismos presentes em água, leite ou outros alimentos pode ser determinada

utilizando o método da contagem de colónias formadas. É um método simples, aplicado

universalmente, produzindo, em geral, bons resultados. Esta técnica pode ser também utilizada

para calcular o número de organismos numa cultura de bactérias. Normalmente, numa amostra,

esse número é demasiado elevado para ser contado directamente. No entanto, se se diluir a

amostra colocando-a depois numa superfície de ágar de forma que uma só bactéria forme uma

colónia isolada visível, o número de colónias pode ser utilizado para quantificar o número de

células vivas viáveis correspondentes a essa diluição conhecida. Normalmente, a amostra é

diluída em factores de 10 e cultivada em ágar, como ilustrado na figura seguinte.

Depois da incubação, determina-se o número de colónias nas placas que apresentem entre 30 e

300 colónias. Esta gama de 30 a 300 colónias é escolhida por ser considerada estatisticamente

1/10 (10-1)

1/100 (10-2)

1/1000 (10-3)

1/104 (10-4)

1/105 (10-5)

1/106 (10-6)

Cultura

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml

Número demasiado 159 17 2 0 elevado de colónias colónias colónias colónias colónias

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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significativa. Se existirem menos de 30 colónias, pequenos erros na técnica de diluição ou a

presença de contaminantes terão um efeito drástico na contagem final. De forma semelhante, se

existirem mais de 300 colónias poderá ser difícil isolá-las claramente. Poderá obter-se uma maior

precisão nos resultados, utilizando mais do que uma placa de Petri para cada diluição.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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Material necessário

Reagentes

• Ágar nutritivo

• Meio NB

• Suspensão de E. coli em NB

S. cerevisiae em ágar nutritivo

• Água esterilizada

Material

• Ansa

• Espalhador

• Espátula

• Fósforos

• Funis

• Lamparina

• Marcador

• Placas de Petri

• Pontas de micropipeta esterilizadas

• Suportes para tubos de ensaio

• Tubos de ensaio

• Frasco

Equipamento

• Autoclave

• Estufa

• Medidor de pH

• Microondas

• Agitador magnético

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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Procedimento experimental

Parte A. Técnica asséptica

 Remoção de microrganismos de uma cultura em caldo NB (organismos em meio

líquido):

• Esterilizar a ansa passando-a através da chama até que todo o fio fique rubro. Desta forma

todos os contaminantes do fio são incinerados. Nunca afastar a ansa depois de esterilizá-la

ou poderá voltar a ficar contaminada. Esperar que a ansa arrefeça um pouco para evitar

eliminar o inóculo.

• Segurar o tubo com uma mão agitando ligeiramente o tubo de forma a suspender os

organismos e, na outra mão, segurar a ansa esterilizada como se fosse um lápis.

• Remover a tampa do tubo com cultura pura com o dedo mindinho da mão que tem a ansa.

Não pousar a tampa para que não fique contaminada.

• Passar muito brevemente a boca do tubo com cultura pela chama.

• Manter o tubo de cultura inclinado, inserir a ansa e remover inóculo.

• Novamente passar muito brevemente a boca do tubo com cultura pela chama.

• Recolocar a tampa no tubo.

 Transferência de microrganismos para um meio líquido estéril

• Remover a tampa do tubo esterilizado com o dedo mindinho da mão que tem a ansa. Não

pousar a tampa para que não fique contaminada.

• Passar muito brevemente a boca do tubo pela chama.

• Inocular o tubo. Não pousar a ansa!

• Novamente passar muito brevemente a boca do tubo com cultura pela chama.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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• Recolocar a tampa no tubo.

• Esterilizar novamente a ansa, flamejando-a. Agora, já é possível pousar a ansa até à sua

próxima utilização.

 Remoção de microrganismos de uma cultura em placa de Petri:

• Esterilizar a ansa.

• Levantar ligeiramente a tampa da placa de Petri e, para arrefecer a ansa, encoste-a no ágar

numa zona afastada da cultura.

• Remover uma pequena quantidade de microrganismos e fechar a tampa.

• Repetir o procedimento  relativo à transferência de microrganismos para um meio líquido

estéril.

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Parte B. Inoculação de meio sólido pela técnica de estriamento

• Esterilizar a ansa passando-a através da chama até que todo o fio fique rubro.

• Segurar o tubo com uma mão agitando ligeiramente o tubo contendo a cultura mista de

forma a suspender os organismos e, na outra mão, segurar a ansa esterilizada como se

fosse um lápis.

• Remover a tampa do tubo com cultura mista com o dedo mindinho da mão que tem a ansa.

Não pousar a tampa para que não fique contaminada.

• Passar muito brevemente a boca do tubo com cultura pela chama.

• Manter o tubo de cultura inclinado, inserir a ansa e remover inóculo.

• Novamente passar muito brevemente a boca do tubo com cultura pela chama.

• Recolocar a tampa no tubo.

• Inverter a placa de Petri contendo o meio ágar nutritivo a inocular.

• Abrir a placa, junto à chama.

• Tocar com a ansa na superfície do meio e espalhar o inóculo, mudando de direcção, tal

como ilustrado na figura adjacente.

• Inocular a zona 1 e esterilizar a ansa.

• Inocular a zona 2 e virar a ansa.

• Inocular a zona 3 e esterilizar a ansa.

• Inocular a zona 4 e esterilizar a ansa.

Parte C. Diluições decimais • Rotular 3 tubos de ensaio com as seguintes diluições: 1/10; 1/100 e 1/1000.

• Colocar, de forma asséptica, 9 ml de água esterilizada em cada tubo.

• Retirar a tampa do matraz que contém a suspensão de E. coli e passar pela boca da chama.

• Fazer as diluições em meio NB e condições de assepsia conforme indicado na figura

seguinte:

• Agitar os tubos no vórtex.

Cultura

1 ml 1 ml 1 ml

1 4 2 3

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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• Colocar uma ponta estéril numa micropipeta e retirar 1000 L do tubo da diluição 1/10 para

uma placa com meio NA.

• Molhar o espalhador em álcool e esterilizar em chama.

• Deixar arrefecer e espalhar a gota sobre a placa.

• Repetir o procedimento para as diluições 1/100 e 1/1000.

• Incubar a 37 ºC colocando a placa em posição invertida durante 18 horas.

• Após o tempo de incubação seleccionar as placas que contenham entre 30 a 300 colónias

para a contagem.

• Calcular o número de células presentes na suspensão utilizando a seguinte fórmula:

           

    



Utilização de pipetas:

Depois da sua utilização colocar a pipeta ou a ponta da micropipeta num goblé com desinfectante.

Utilizar sempre pipetadores mecânicos.

Para evitar contaminações, nunca tocar a ponta ou base de uma pipeta com os dedos.

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Trabalho Experimental 4. Observação de microrganismos ao microscópio. Coloração de componentes da célula bacteriana.



4.1 Observação de microrganismos ao microscópio.

A dificuldade de observar ao microscópio óptico as estruturas celulares é devida à transparência

e ao fraco contraste óptico das células quando colocadas em meio aquoso. As diferentes partes

das células deixam, em geral, passar quantidades de luz semelhantes, devido a serem

constituídas por uma percentagem de água muito elevada.

Para ultrapassar este problema recorre-se à coloração celular. Este processo vai permitir

destacar algumas estruturas celulares por contraste com as restantes, na medida em que alguns

componentes celulares têm a capacidade de absorver certos corantes, enquanto outros não.

A maioria das estruturas celulares só pode ser observada se for previamente corada. Usam-se

para isso soluções corantes. Quimicamente a maior parte dos corantes são compostos

orgânicos, que se ligam a determinadas regiões da célula, de acordo com a sua natureza

química (prótidos, glúcidos, lípidos, ácidos nucleicos, etc.), aumentando o seu contraste e

facilitando a observação.

Em microscopia óptica utilizam-se, frequentemente, duas técnicas para a aplicação do corante

no material biológico:

Por imersão: usa-se o corante como meio de montagem

Por irrigação: coloca-se a gota de corante num dos bordos da lamela e do lado oposto coloca-

se papel de filtro que vai arrastar o corante de um bordo ao outro.

Na coloração simples, que será utilizada neste trabalho, o esfregaço é corado com um só

reagente, ou seja, todas as estruturas ficam coradas da mesma cor. Os objectivos desta

coloração são elucidar sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas.

Os corantes básicos mais usados são o azul-de-metileno (cora de azul), o violeta de cristal (cora

de roxo), a safranina (cora de vermelho), o roxo de metilo (cora de roxo) e o verde de malaquite

(cora de verde).

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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4.2 Coloração de componentes da célula bacteriana.

Com o intuito de aumentar o contraste do microrganismo em relação ao fundo ou de evidenciar

algum organelo em especial, várias técnicas de coloração podem ser utilizadas. Em função do

tipo de microrganismo em causa (bactérias, fungos ou protozoários) diversos corantes ou

combinações destes podem ser aplicados. No caso particular das bactérias, as técnicas de

coloração mais usuais encontram-se seguidamente descritas:

Coloração com azul de metileno: Esta é uma técnica de coloração que permite evidenciar

melhor a forma das células em relação ao meio e que retém a viabilidade dos microrganismos.

Para este propósito podem ser utilizados corantes não tóxicos para as células tal como o azul-

de-metileno.

Coloração Gram: Esta técnica é comummente utilizada para distinguir dois tipos diferentes de

bactérias com base na estrutura da sua parede celular. As bactérias Gram + possuem uma

parede celular contendo uma elevada percentagem de peptidoglicano e ácido teicoico enquanto

a parede das bactérias Gram – é formada por uma menor percentagem de peptidoglicano e

possui também uma membrana mais externa formada essencialmente por fosfolípidos e

lipoproteínas (Figura 4.1). Deste facto resulta que após a coloração de Gram as bactérias Gram

+ retêm o corante cristal-violeta (diminuição da permeabilidade da membrana pela lavagem com

álcool etílico) e aparecem com cor violeta enquanto as bactérias Gram – libertam o cristal-violeta

após a lavagem com álcool etílico (aumento da permeabilidade da membrana) e após a

coloração com safranina aparecem com cor rosa.

Coloração de endósporos: Algumas espécies de bactérias formam estruturas altamente

resistentes que podem permanecer em estado de latência chamadas de esporos. Os esporos

podem resistir a elevadas temperaturas, desidratação e até a agentes químicos que causam a

destruição das células normais e dar origem a novas células quando em condições apropriadas.

A coloração dos esporos com um corante como o verde malaquite e das células com safranina

permite evidenciar os esporos presentes no interior das células (endósporos).

Coloração de grânulos de poli-hidroxibutirato (PHB): Esta técnica permite evidenciar os

grânulos de poli-hidroxibutirato que funcionam como uma reserva de carbono e energia nas

células bacterianas. A coloração dos grânulos com um corante como o negro de Sudão que cora

os substratos lipídicos e das células com safranina permite evidenciar os grânulos de PHB

presentes no interior das células.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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 Figura 4.1 Paredes celulares de bactérias Gram positivas e Gram negativas.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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Material necessário

Reagentes

• Solução Gram (Violeta Cristal / Oxalato de Amónia)

• Solução de Lugol

• Solução de Negro de Sudão (0,3%)

• Solução de Safranina (2,5%)

• Solução de Verde Malaquite (5%)

• Solução de Azul-de-metileno (2%)

• Álcool etílico (96%)

• Água destilada

Material

• Ansa

• Fósforos

• Lamelas

• Lâminas

• Lamparina

• Marcador

• Óleo de imersão

• Papel de filtro

• Papel de limpeza

• Pipetas Pasteur

• Tinas de vidro

Equipamento

• Microscópio óptico

Culturas

• Cultura em meio para leveduras de S. cerevisiae

• Cultura em meio Chapman de Staphylococcus sp.

• Cultura em ágar NA de E. coli

• Cultura em ágar NA de Bacillus cereus

• Cultura em ágarde Enterococcus

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Procedimento experimental

Parte A. Colorações

A.1 Coloração vital com azul-de-metileno:

• Colocar uma gota da cultura de S. cerevisiae em meio líquido numa lâmina.

• Colocar uma gota de solução de azul-de-metileno (2%) sobre a amostra na lâmina.

• Colocar uma lamela sobre a lâmina e espalhar a suspensão.

• Deixar secar ao ar.

• Observar ao microscópio óptico com a objectiva de imersão (100x).

• Depois da observação, limpar o óleo da objectiva de imersão com papel macio e álcool

etílico.

A.2 Preparação e fixação pelo calor de um esfregaço bacteriano: • Colocar uma gota água destilada sobre a lâmina.

• Retirar com a ansa um pouco da cultura bacteriana em meio sólido e suspender a massa

bacteriana na gota de água.

• Espalhar o líquido aproximadamente numa área de 1 cm2 e deixar secar ao ar durante 30 a

60 segundos.

• Segurar perto da chama para fixar o material.

• Com um marcador identificar a cultura na lâmina.

A.2.1 Coloração simples:

• Fixar um esfregaço de S. cerevisiae suspender a massa do microrganismo na gota de água.

• Colocar uma gota de solução de azul-de-metileno (2%) sobre a amostra na lâmina.

• Lavar com água destilada.

• Secar com papel de filtro.

• Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (100x).

A.2.2 Coloração de Gram (modificação de Hucker):

• Fixar um esfregaço de E. coli.

• Corar o esfregaço fixado com uma gota de solução de Gram, agitando suavemente durante

60 segundos.

• Inundar com solução de Lugol durante 60 segundos.

• Lavar com água destilada.

• Secar com papel de filtro.

• Descorar com álcool etílico a 96% agitando suavemente durante 60 segundos.

• Secar com papel de filtro.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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• Corar com a solução de Safranina a 2,5% durante 30 segundos.

• Lavar com água destilada.

• Secar com papel de filtro.

• Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (100x).

• Repetir para o Enterococcus.

A.2.3 Coloração de endósporos (método de Coklin):

• Aplicar sobre um esfregaço fixado (Bacillus cereus) uma gota de solução de Verde de

Malaquite a 5%.

• Aquecer à chama durante 5 minutos.

• Lavar com água.

• Corar com Safranina a 0.25% durante 60 segundos.

• Lavar com água e deixar secar ao ar.

• Observar ao microscópio óptico com a objectiva de imersão (100x).

A.2.4 Coloração lipídica (Grânulos de poli--hidroxibutirato):

• Corar um esfregaço fixado de Bacillus cereus com negro de Sudão a 0,3% durante 10

minutos.

• Escorrer e secar com papel de filtro.

• Corar com Safranina a 2,5% durante 30 segundos.

• Lavar com água e deixar secar ao ar.

• Observar ao microscópio óptico com a objectiva de imersão (100x).

Parte B. Observação ao Microscópio

• Certifique-se que a parte óptica do microscópio se encontra limpa. Caso seja necessário

limpá-la, utilize um pano fino que não largue pêlo, levemente embebido em álcool.

• Verifique se a objectiva de menor ampliação se encontra em posição de observação. Se tal

não se verificar, seleccione-a rodando o revólver. Quando ouvir um estalido a objectiva está

em posição.

• Ilumine o campo do microscópio. Verifique se o diagrama está aberto e ligue a fonte

luminosa.

• Coloque a preparação na platina e, após estar centrada na “janela”, prenda-a com as

pinças.

• Regule a abertura do diafragma, iluminando o campo do microscópio de acordo com o

material que está a observar. Se necessário desça um pouco o condensador.

Protocolos de Microbiologia – Engenharia Biomédica

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• Aproxime cuidadosamente a platina da objectiva, com o auxílio do parafuso macrométrico.

Colocando-se numa posição lateral relativamente ao microscópio, vá controlando estes

movimentos.

• Observando através da ocular, afaste lentamente a platina até obter a primeira imagem.

• Logo que obtenha uma imagem suficientemente nítida, ajuste a focagem utilizando apenas o

parafuso micrométrico.

• Rodando o revólver, coloque a objectiva de ampliação imediatamente superior (10x). Ajuste

a focagem unicamente com o parafuso micrométrico e melhore a iluminação do objecto

abrindo ligeiramente o diafragma.

• Coloque a objectiva de ampliação imediatamente superior (40x) e proceda como

anteriormente.

• Rode a objectiva de 40x ligeiramente para a direita e coloque uma gota de óleo sobre a

preparação.

• Coloque a objectiva de ampliação 100x e proceda ao ajuste da focagem.

• Desenhe o que observa e tire anotações.

Cuidados gerais a ter após a utilização do microscópio O microscópio é um aparelho sensível pelo que a sua utilização se reveste de alguns cuidados.

Assim, o final de cada utilização deve:

- Descer a platina e retirar a preparação.

- Colocar a objectiva de menor ampliação no prolongamento do tubo.

- Verificar se o microscópio se encontra perfeitamente limpo (certifique-se que a platina e

as lentes das objectivas e da ocular ficaram limpas).

- Apagar a fonte de luz, no caso do microscópio apresentar luz incorporada.

- Tapar o microscópio com a protecção de plástico.

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