Relatório Microbiologia 1 - Coloração de Gram - Apostilas - Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
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Relatório Microbiologia 1 - Coloração de Gram - Apostilas - Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da importância da coloração de Gram, morfologias cocos, bacilos, Leveduras.
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– CURSO TÉCNICO DE BIOTECNOLOGIA       

TURMA                                                                                                ANO LETIVO: 2011  DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL                                          PROFª:   TEMA: COLORAÇÃO DE GRAM   

Amostras: Activia (Bifidobacterium animalis), Caldo de Cana, Yakult, Placa sem nome.   

Nome:  

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ATIVIDADE LABORATORIAL N.º1

Coloração de Gram

– CURSO TÉCNICO DE BIOTECNOLOGIA       

TURMA                                                                                                ANO LETIVO: 2011  DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL                                          PROFª:   TEMA: COLORAÇÃO DE GRAM   

Amostras: Activia (Bifidobacterium animalis), Caldo de Cana, Yakult, Placa sem nome.   

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ATIVIDADE LABORATORIAL N.º1

1. Introdução

A técnica de Gram ou coloração de Gram é uma técnica de coloração de preparações de amostras para observação ao microscópio, utilizada para corar diferencialmente microorganismos com base na composição química e integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, são classificados em gram-positivos (roxo) ou gram- negativos (vermelho). Tal método se deve ao médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. Esta técnica teve por objetivos determinar e interpretar o mecanismo de reação de Gram, como um método de coloração diferencial.

O método consiste no tratamento de uma amostra bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta- iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram- negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram- positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram- negativas em vermelho.

Desta forma, a diferente estrutural da parede bacteriana e, em particular a espessura da camada de peptideoglicano, é a responsável pelo diferente comportamento das bactérias face à coloração de gram.

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TURMA                                                                                                ANO LETIVO: 2011  DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL                                          PROFª:   TEMA: COLORAÇÃO DE GRAM   

Amostras: Activia (Bifidobacterium animalis), Caldo de Cana, Yakult, Placa sem nome.   

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2. Objetivos

Demonstrar a importância da coloração de Gram e estabelecer a distinção entre:  Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;  As morfologias cocos, bacilos;  Arranjos bacterianos (estafilococos, estreptococos, etc.;  Leveduras.

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3. Materiais Vidraria:

 Lâminas, Placas de Petri, Vidro de Relógio, Cadinho e Pistilo, Béquer, Frasco Álcool/Areia.

Reagentes:

 Água destilada, Óleo de Imersão.

Soluções:

 Solução de Cristal violeta, Lugol, Álcool-Acetona, Fucsina.

Equipamentos:

 Alça bacteriológica, Pisseta, Microscópio óptico, Bico de Bunsen, Balança analítica, Capela, Luvas.

Amostras:

 Activia (Bifidobacterium animalis), Caldo de cana, Yakult, Placa sem nome (cultura bacteriana), Placa com água do tanque de peixes.

4. Métodos e Preparação das soluções: As soluções de Cristal violeta e Fucsina que utilizamos, já estavam preparadas.

4.1 – Preparação do Lugol:

 Iodo.....................................0,25 g;

 Iodeto de Potássio...............0,50 g;

 Água destilada.......................75 ml;

 Cadinho, balança analítica, pistilo, pisseta e vidro de relógio. Colocou-se o vidro de relógio na balança analítica e tarou-se,

pesou-se os ingredientes sólidos (gramas) colocou-se no vidro de

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relógio, em seguida, colocou-se em um cadinho os ingredientes sólidos e triturou-se bem, juntou-se a água destilada misturando os ingredientes.

4.2 – Preparação do Álcool – Acetona:

 Álcool Etílico.........................................200 ml;

 Acetona..................................................50 ml;

 Béquer, pipeta e capela.

Mediu-se os ingredientes líquidos na capela utilizando uma

pipeta e colocou-se as soluções em um béquer, misturou-se bem. 4.3 - Preparo do esfregaço  Limpou-se bem uma lâmina de vidro com algodão embebido em

álcool e depois secou-se com papel toalha;  Passou-se a alça bacteriológica em uma solução de álcool/areia

para limpar a alça;  Flambou-se a alça bacteriológica no bico de bunsen até ficar

vermelha;  Líquido: Pegou-se uma porção da amostra a ser analisada e

preparou-se o esfregaço na lâmina;  Sólido: pingou-se uma gota de água destilada na lâmina, colheu-

se com a alça bacteriana uma porção da colônia bacteriano da placa de petri na superfície do Ágar e mistura-se com a gota de água na lâmina, até obter um esfregaço homogêneo;

 Seca-se ao ar livre;  Após fixa-se o esfregaço , passando a lâmina três vezes sobre a

chama do bico de bunsen;.

4.4 – Procedimento da coloração para todos os métodos  Cobriu-se o esfregaço com cristal violeta durante 1 minuto;

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 Lavou-se com água corrente (somente um fio de água) evitando incidir o jato diretamente sobre o esfregaço;

 Cobriu-se com lugol durante 1 minuto;  Repetiu-se a lavagem;  Descorou-se com álcool - acetona (gotejou-se a solução até que

não saia mais o corante);  Repetiu-se a lavagem;

 Cobriu-se com fucsina durante 30 segundos;  Repetiu-se a lavagem;  Esperou-se a lâmina secar naturalmente ao ar livre.

4.5 - Microscopia

Examinou-se a amostra ao microscópio. Colocou-se a lâmina com amostra corada ao microscópio e focalizou-se com a objetiva 10X, logo em seguida, mudou-se para a objetiva 20X e focalizou-se, após, mudou-se para a objetiva 50X e focalizou-se e antes de mudar para a última objetiva, pingou-se uma gota do óleo de imersão na lâmina contendo a amostra e mudou-se para a objetiva 100X e novamente focalizou-se.

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4.6 – Analisando os resultados: 1. Activia (Bifidobacterium animalis) - observou-se a presença

de cocos, diplococos e estaphylococus gram-positivos; 2. Yakult – Observou-se a presença de bactérias gram-positivos; 3. Caldo de cana – Observou-se a presença de muitas leveduras e

bacilus gram-positivos e gram-negativos; 4. Placa sem nome – Observou-se a presença de leveduras,

bacilus gram-negativos e gram-positivos; 5. Placa com água (tanque peixes) – Observou-se a presença de

bacilus gram-negativos. 6. Conclusão

A realização de testes básicos para identificação de bactérias, através do método de coloração de Gram, permitiu-se concluir que existem diferenças significativas na composição da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas.

O mecanismo de reação de Gram demonstrou-se um método eficiente de coloração diferencial, podendo-se, através dos resultados obtidos, diferenciar bactérias Gram positivas de Gram negativas, atuando como ferramenta auxiliar, na identificação de bactérias fitopatogênicas.

6. Bibliografia  Microbiologia Conceitos e aplicações – Vol.1 Michael J. Pelczar Junior  E.C.S Chan Noel R. Krieg  Sites

http://pt.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_de_Gram http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/ http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=306 http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2008/12/colorao-de- gram.html http://www.biomedicina3l.com/2009/08/coloracao-de-gram.html

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