Terapia genica, Notas de estudo de Engenharia de Produção
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Microsoft Word - TERAPIAGENICA.doc

Monografia

Aplicações de Engenharia Genética à Biotecnologia

               

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N O V A S TE C N O L O G I A S T E R A P Ê U T I C A S – A TE R A P I A G É N I C A

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ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS 5

ÍNDICE DE TABELAS 6

ABREVIATURAS UTILIZADAS 7

1.PREÂMBULO 8

2.INTRODUÇÃO 9

Novas Tecnologias Terapêuticas 9

Terapia Génica 9

Abordagem histórica da terapia génica 9 1ª Metade do Século XX 9 2ª Metade do Século XX 10 Século XXI 10

Abordagem germinativa e somática 112.1.1. Terapia Génica Somática 11 2.1.2. Terapia Génica Germinal 11 2.1.3. Comparação entre TGS e TGG 11

Terapia Génica Humana vs. Terapia Génica Animal 11

3.ABORDAGENS EM TERAPIA GÉNICA 13

Tipos de Células-Alvo 133.1.1. Transferência Génica 13

3.1.1.1. ex vivo 13 3.1.1.2. in vivo 14

Métodos de Transferência Génica 143.1.2. Métodos Químicos 15 3.1.3. Métodos Biológicos 16 3.1.4. Métodos Físicos 18

Abordagem Clássica em Terapia Génica 183.1.5. Aumento do número de cópias de um gene 19 3.1.6. Morte assistida de células específicas 19

Abordagem não-clássica em Terapia Génica 193.1.7. Correcção assistida de mutações 19

3.1.7.1. Correcção a nível do DNA 19 Quimeroplastia 20

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Oligonucleótidos formadores de hélice tripla (OFHT) 20 Reparação por oligonucleótidos 20

3.1.7.2. Correcção genética a nível do RNA 20 Ribozimas 20

3.1.8. Inibição da expressão génica 21 3.1.8.1. Ao nível do DNA – Estratégias Antigene 21

Oligonucleótidos formadores de hélice tripla 21 Peptídeos de Ácidos Nucleicos (PANs) 21

3.1.8.2. Ao nível do RNA – Estratégias Antisense 21 Ácidos Nucleicos Antisense 21

3.1.8.3. Ao nível da Proteína 22 Anticorpos Intracelulares 22 Aptâmeros 22 Proteínas mutantes 22

3.1.9. Comparação entre Diferentes Abordagens da TG Não-Clássica 22

Terapia Génica Clássica vs. Terapia Génica Não-Clássica 24

Limitações à Terapia Génica 243.1.10. Limitações Tecnológicas 25

3.1.10.1. Curto tempo de vida 25 3.1.10.2. Problemas com Vectores Virais 25 3.1.10.3. Integração Génica 25

3.1.11. Doenças Multigénicas 25

4.TIPOS DE DOENÇAS TRATADAS EM TERAPIA GÉNICA 26

Doenças Genéticas 26

Sistema Imunitário 27

Doenças Infecciosas 28

Cancro 28

5.EXEMPLOS DE APLICAÇÃO DA TERAPIA GÉNICA 29

Glaucoma 295.1.1. Caracterização da doença 29 5.1.2. Estratégias de Tratamento Actuais 31 5.1.3. Terapia Génica para o Glaucoma 31

5.1.3.1. Tecidos alvo e Sistemas de Transferência Génica 31 Utilização de Factores Neurotróficos (BDNF) 33

Doença de Huntington 355.1.4. Caracterização da Doença 35

Base Genética da Doença de Huntington 35 5.1.5. Estratégias de Tratamento Actuais 36 5.1.6. Novas estratégias de Tratamento: Terapia Génica 36

Terapia Génica Neuroprotectora 36 Terapia Génica Baseada em RNA de Interferência 37

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Síndrome de Imunodeficiência Adquirida – SIDA 395.1.7. Caracterização da Doença 39

O Vírus 39 5.1.8. Estratégias de Tratamento Actuais 41 5.1.9. Estratégias para a Terapia Génica anti-HIV 42

5.1.9.1. Terapia Génica Baseada nos Ácidos Nucleicos 42 RNA Antisense 42

Ribozimas 42 Aptâmeros 43

5.1.9.2. Terapia Baseada em Proteína 43 PTNs 43 Proteínas do Hospedeiro Mutadas 43 Anticorpos Intracelulares 43

Tumores Cerebrais 445.1.10. Caracterização 44 5.1.11. Estratégias de Tratamento Actuais 45 5.1.12. Novas Estratégias de Tratamento: Terapia Génica 45

5.1.12.1. Activação de Pró-drogas 46 5.1.12.2. Supressores de tumor e apoptose 47 5.1.12.3. Angiogénese 47 5.1.12.4. Modificação da resposta imunitária: 48 5.1.12.5. Imunoterapia 48

Linfócitos Infiltrantes Tumorais 48 Modificação Genética das Células Tumorais 48

6.PERSPECTIVAS FUTURAS 50

7.QUESTÕES ÉTICAS, SÓCIO-ECONÓMICAS E FINANCEIRAS DA TERAPIA GÉNICA HUMANA 52

Questões éticas 52 Terapia génica somática vs. Terapia génica germinal 52 Terapia Génica vs. Aperfeiçoamento 52

Questões Sócio-económicas 53

Questões Financeiras 53

8.BIBLIOGRAFIA 54

Bibliografia Referenciada 54

Bibliografia Adicional 56

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ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 3-1 - MÉTODO DE INTRODUÇÃO DE GENES MODIFICADOS ATRAVÉS DE PROCESSOS IN

VIVO E EX VIVO 14

FIGURA 3-2 – DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE PROTOCOLOS EM FUNÇÃO DE CADA VECTOR

UTILIZADO, 15

FIGURA 3-3 – TRANSFERÊNCIA DE GENES UTILIZANDO UM RECEPTOR DE ENDOCITOSE. 15

FIGURA 3-4 – MECANISMO DA REPARAÇÃO DE RNA POR MEIO DE RIBOZIMAS TRANS-

ACTUANTES 21

FIGURA 4-1 – DISTRIBUIÇÃO DO NÚMERO DE PROTOCOLOS EM FUNÇÃO DA DOENÇA A

TRATAR 26

FIGURA 5-1 – MORFOLOGIA DE UM OLHO COM GLAUCOMA E PADRÃO APRESENTADO PELO

NERVO ÓPTICO NUMA SITUAÇÃO NORMAL E NUMA SITUAÇÃO GLAUCOMATOSA 29

FIGURA 5-2 – ESQUEMA REPRESENTATIVO DA PARTE FRONTAL DO OLHO 29

FIGURA 5-3 – IMAGEM ILUSTRATIVA DA PERDA DA VISÃO PERIFÉRICA – VISÃO TUBULAR 30

FIGURA 5-4 – MORFOLOGIA TÍPICA DENDRÍTICA DAS CÉLULAS RETINAIS GANGLIARES

VISUALIZADA COM PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE 32

FIGURA 5-5 – ESQUEMA DO OLHO DE RATO. 34

FIGURA 5-6 – FOTOGRAFIA DE UM CÉREBRO DE UM PACIENTE AFECTADO PELA DOENÇA DE

HUNTINGTON E DE UM CÉREBRO DE UM INDIVÍDUO NORMAL, 35

FIGURA 5-7 – DEGRADAÇÃO DE RNA PELO MECANISMO DE RNA DE INTERFERÊNCIA.

SOMENTE OS QUADRADOS AZUIS POSSUEM ACTIVIDADE NUCLEOLÍTICA 38

FIGURA 5-8 – ESTRUTURA DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA HUMANA 40

FIGURA 5-9 – ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV)

40

FIGURA 5-10 – CICLO DE REPLICAÇÃO DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) 41

FIGURA 5-11 – REGIÕES DO CÉREBRO ONDE SE LOCALIZAM OS PRINCIPAIS TIPOS DE TUMORES

44

FIGURA 5-12 - TERAPIA GÉNICA IN VIVO PARA O TRATAMENTO DE TUMORES CEREBRAIS 47

FIGURA 5-14 - MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE UMA CULTURA DE LINFÓCITOS INFILTRANTES DE

TUMOR 48

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ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 3-1 – COMPARAÇÃO ENTRE VÁRIOS MÉTODOS QUÍMICOS DE TRANSFERÊNCIA

GÉNICA. 16

TABELA 3-2 – COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS BIOLÓGICOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA17

TABELA 3-3 – COMPARAÇÃO ENTRE OS MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA 18

TABELA 3-4 – VANTAGENS, DESVANTAGENS E APLICAÇÕES CORRENTES DAS VÁRIAS

ABORDAGENS NÃO-CLÁSSICAS APLICADAS EM TG 23

TABELA 5-1 – SINTOMATOLOGIA E CONDIÇÕES ESPECIAIS PARA O DESENVOLVIMENTO DO

GLAUCOMA 30

TABELA 5-2 – EXEMPLOS DE GENES-ALVO E TECIDOS QUE PODEM SER UTILIZADOS NO

TRATAMENTO DO GLAUCOMA 32

TABELA 5-3 – TECIDOS/CÉLULAS RELEVANTES NO TRATAMENTO DO GLAUCOMA POR TGO E

VECTORES UTILIZADOS 33

TABELA 5-4 – ASPECTOS PRINCIPAIS NA TG APLICADA AO TRATAMENTO DO GLAUCOMA

UTILIZANDO UM AAV MODIFICADO COM INSERÇÃO DO BDNF 34

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ABREVIATURAS UTILIZADAS

TG – Terapia génica

TGG – Terapia Génica Germinal

TGS – Terapia Génica Somática

TR – Transcritase Reversa

LTR – Long Termination Repeat

dsDNA – double-strand DNA

wt – wild-type

ssDNA – single-strand DNA

ITR – Inverted Termination Repeat

rAAV –Vírus recombinante associado ao adenovírus

IRS – Inverted Repeat Sequence

E1 Ori – Origem de replicação em E. coli

OriS – Origem de replicação em HSV

RV – Retrovírus

LV – Lentivírus

AV – Adenovírus

AAV Vírus associado ao adenovírus

mtDNA – DNA mitocondrial

OFHT – Oligonucleótidos formadores de hélices triplas

PANs – peptídeos de ácidos nucleicos

ODNs – Oligodeoxinucleótidos

RNP – Ribonucleoproteínas

ADA – Adenosina Deaminase

PIO – Pressão Interna Ocular

CRG – Células gliares da retina

RT – Rede Trabecular

TGO – Terapia Génica Ocular

BDNF - brain-derived neurotrophic factor

EC - Epitélio ciliar

MC - Músculo ciliar

WPRE - Elemento regulatório pós- transcricional da hepatite de marmota

GFP – Proteína Verde Fluorescente

Htt – Huntingtina

BHK - baby hamster kidney cells

CNTF - ciliar neurotrophic factor

RNAi – RNA de interferência

siRNA – short-interfering RNA

SNP – Single-Nucleotide Polymorphism

CAH – Cromossoma Artificial Humano

PGL – Progressive Generalized Limphadenopathy

PTN – Proteínas transdominantes negativas

SNC – Sistema Nervoso Central

GBM – Glioblastoma multiforme

BHE - Barreira Hemato-Encefálica

CPVs - Células produtoras de vectores retrovirais

HSV –Vírus Herpes Simplex

TC – Timidina cinase

GCV – Ganciclovir

CD – Citosina desaminase

FC - 5-Fluorocitosina

CPA – Ciclofosfamida

FNTα - Factor α de necrose tumoral

FCEV - Factor de crescimento endotelial vascular

LITs - Linfócitos infiltrantes tumorais

IDSC – Imunodeficiência Severa Combinada

DOTC - Deficiência da ornitina transcarboxilase

1. PREÂMBULO

A área da Biotecnologia tem sofrido recentemente um grande desenvolvimento a nível ambiental, industrial, saúde humana, vegetal, agrária, microbiológica, genética, entre outras.

Em Abril de 2003, o anúncio do final da sequenciação do genoma humano ofereceu novos horizontes relativamente à prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças humanas. Além do mais, com o avanço da engenharia genética, têm emergindo novas tecnologias terapêuticas, entre as quais se destacam a terapia génica e a terapia baseada em produtos génicos.

Dentro das novas tecnologias terapêuticas escolhemos como aplicação da engenharia genética, a Terapia Génica, uma vez que consideramos ser de extrema importância estudar ou tomar consciência de alguns mecanismos envolvidos no tratamento de doenças por manipulação directa de um genoma. A terapia génica pretende dar resposta a algumas enfermidades hereditárias, sendo também aplicável ao tratamento de doenças actualmente “incuráveis”, entre as quais, o cancro e determinadas patologias infecciosas, doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, imunológicas, etc.

Assim sendo, este trabalho apresenta estratégias de terapia actuais, ou ainda em desenvolvimento, para doenças como o glaucoma, Huntington, SIDA e alguns tipos de tumores cerebrais de maior incidência, como os gliomas malignos.

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2. INTRODUÇÃO

NOVAS TECNOLOGIAS TERAPÊUTICAS A caracterização de doenças passa pela identificação de genes e estudo das suas funções assim como explorar os processos biológicos nos quais estão envolvidos. Esta informação tem sido utilizada pela farmacologia convencional para desenhar novas terapias que possam ser aplicadas no tratamento de doenças. Recentemente, avanços na genética molecular/engenharia genética forneceram uma variedade de novas tecnologias terapêuticas que podem ser caracterizadas em função do agente terapêutico utilizado: a Farmacogenética emprega produtos génicos e/ou vacinas e a Terapia Génica recorre a material genético.

A Farmacogenética procura estudar a base genética e bioquímica das variações observadas no metabolismo de cada indivíduo em resposta aos fármacos terapêuticos convencionais. Assim sendo, uma vez determinados os factores genéticos, é possível construir proteínas ou vacinas por engenharia genética, adequadas às necessidades e taxas metabólicas de cada indivíduo. Esta tecnologia terapêutica envolve a expressão de clones de produtos do gene normal e a produção de anticorpos e vacinas geneticamente modificadas.

No presente trabalho, debruçar-nos-emos apenas sobre o tratamento de doenças utilizando material genético, ou seja, na Terapia Génica.

TERAPIA GÉNICA

A Terapia Génica (TG) não é mais do que um qualquer procedimento realizado com o intuito de tratar (ou aliviar) uma doença através da modificação de células de um paciente. O seu principal objectivo é o desenvolvimento de novos tratamentos de doenças para as quais não há nenhum tratamento convencional efectivo.

Esta tecnologia terapêutica pode ser aplicada em todas as etapas da vida de um indivíduo, desde a fase intra-uterina até à fase adulta.

ABORDAGEM HISTÓRICA DA TERAPIA GÉNICA Desde a primeira experiência de transferência génica em humanos, final da década de 80, na qual um paciente com neoplasia maligna recebeu células T autólogas geneticamente modificadas, foram criadas cerca de 30 empresas, 3 jornais específicos, mais de 400 protocolos de terapia génica foram aprovados, e mais de 4000 pacientes receberam terapia génica [1,2].

No entanto, ainda nenhum produto foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), para venda em TG humana. Actualmente, a TG é apenas experimental, não se tendo ainda obtido muitos sucessos em termos clínicos.

Para entender melhor a actualidade, é necessário ter uma perspectiva histórica da TG:

1ª MET A DE DO SÉC ULO XX Na 1ª metade do século XX apareceram as primeiras antecipações do futuro da genética humana, ditadas por J. B. S. Haldane (1924), Aldous Hexley (1932) e Hermann J. Muller (1935). No entanto, foi a seguir à II Guerra Mundial que a Genética Humana emergiu como disciplina específica.

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A experiência de Avery, McLeod e McCarty, em 1944, contribuiu em muito para o surgimento da Genética Humana: é conhecida, em bactérias, a possibilidade de transferir informação genética de um organismo para outro – fundamento da terapia génica. Pensou- se então, pela primeira vez, em transformar genes com o intuito de curar doenças humanas. Foram, assim, desenvolvidas linhas de células geneticamente modificadas e criadas técnicas de DNA recombinante.

2ª MET A DE DO SÉC ULO XX Em 1959, Muller, no seu livro “The Guidance of Human Evolution”, expressou as suas dúvidas sobre a viabilidade de realizar alterações directas ou substituições em genes, gerando um importante estímulo para um debate sobre a ética da intervenção genética [3].

Em 1962, no simpósio Man and His Future, coordenado pela Fundação CIBA/NOVARTIS, começou a ser definida a ideia de que uma intervenção a nível molecular na linha germinativa seria muito mais difícil que a modificação das células somáticas.

Na década de 80, o grupo World Council of Churches defendeu quea terapia génica somática para a cura de doenças é eticamente aceitável, enquanto que a intervenção na linha germinativa para a prevenção, cura de doenças ou promoção das capacidades humanas é inaceitável - posição ortodoxa sobre a TG.

Os anos 80/90 destacaram-se pelas intensas discussões éticas sobre a cura de doenças utilizando a linha somática e a germinal. Para facilitar o diálogo entre as várias instituições então criadas, foi fundado, em 1990, o jornal “Human Gene Therapy”, nos Estados Unidos da América (EUA), assim como a publicação britânica “Gene Therapy”.

Ainda durante a década de 90, o National Institute of Health (NIH), juntamente com a FDA, aprovou o primeiro protocolo para teste de terapia génica em humanos: transferência de genes do sistema imunitário para um paciente em estado avançado de neoplasia maligna. No entanto, o objectivo deste estudo não era avaliar a eficiência terapêutica, mas sim demonstrar que a transferência génica é segura [4]. Nos EUA, Michael Blaese e W. French Anderson propuseram um protocolo para o tratamento de 2 crianças com deficiência da enzima adenosina deaminase (ADA) – imunodeficiência severa combinada (IDSC). Este foi o primeiro caso de sucesso da TG.

N o a n o d e 1 9 9 9 , a TG sofreu um grande contratempo aquando da morte do jovem Jesse Gelsinger [2]. Este adolescente de 18 anos participava num estudo de terapia génica somática na Universidade da Pensilvânia, onde recebeu tratamento para corrigir um distúrbio metabólico de origem genética, denominado deficiência da ornitina transcarboxilase (DOTC), que tem como principal consequência a retenção de amónia no organismo. Uma resposta do seu sistema imunitário aos elevados níveis de vectores adenovíricos, que transportavam o gene para a produção da referida enzima, causou a sua morte. Foi, então, o primeiro paciente a morrer num ensaio clínico de terapia génica. Todavia, mais de 400 ensaios envolvendo mais de 4000 pacientes, já haviam sido conduzidos sem qualquer registo de morte.

SÉC UL O XXI O desenvolvimento da terapia génica sofre outro contratempo, em Janeiro de 2003, quando é registado o segundo caso de leucemia em crianças tratadas com vectores retrovíricos. O tratamento incidia sobre a IDSC, também conhecida como "síndrome do menino da bolha". Após o primeiro diagnóstico de leucemia, o FDA suspendeu 3 testes similares nos EUA.

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Como precaução, a interrupção foi estendida às demais experiências até o caso ser esclarecido [2].

ABORDAGEM GERMINATIVA E SOMÁTICA A Terapia Génica pode ser dividida em dois ramos, somático e germinal, dependendo do tipo de células ou tecidos-alvo a que se destina. Não obstante, no presente trabalho focar- nos-emos somente na TG somática.

2.1.1. TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA

A TERAPIA GÉNICA SOMÁTICA (TGS) foca-se no corpo (soma), tentando corrigir um fenótipo doente mediante o tratamento de algumas células somáticas do indivíduo afectado. De facto, nem todas as células do tecido doente necessitam de se tornar transgénicas; em alguns casos, uma percentagem de células transgénicas é suficiente para melhorar a totalidade dos sintomas da doença [5].

2.1.2. TERAPIA GÉNICA GERMINAL

A TERAPIA GÉNICA GERMINAL (TGG) tem como alvos tecidos ou células germinais. Desta forma, se um gene for transferido com sucesso para a célula-alvo, é provável que seja transferido a todas as células somáticas do indivíduo. Logo, do ponto de vista técnico, é mais fácil que a Terapia Génica Somática, uma vez que pode ter como alvo uma única célula ou um agregado de células não-diferenciadas.

2.1.3. COMPARAÇÃO ENTRE TGS E TGG

A terapia génica somática possui menores riscos para os pacientes que a terapia génica germinal, uma vez que a expressão inadequada dos genes incorporados afecta somente os alvos (células ou tecidos específicos). Além disso, muitas vezes é possível reverter os efeitos da terapia génica somática, através de cirurgia ou tratamento com radioterapia e/ou quimioterapia. Já a terapia génica germinal possui um efeito sistémico e irreversível, pelo que qualquer erro pode afectar o desenvolvimento, a diferenciação celular, o crescimento e muitos aspectos do comportamento e fisiologia do paciente. Além disso, a terapia génica germinal possui maiores riscos para as gerações futuras que a terapia génica somática. Por outro lado, sendo também projectada para influenciar as futuras gerações, permite que os defeitos genéticos induzidos artificialmente possam ser propagados a mais indivíduos sob a forma de uma nova mutação patogénica hereditária.

TERAPIA GÉNICA HUMANA VS. TERAPIA GÉNICA ANIMAL A terapia génica, enquanto método de tratamento, pode ser aplicada não só em humanos, como também em animais. No entanto, a sua aplicação em animais não tem só fins terapêuticos. Um bom exemplo, é a sua aplicação em porcos [7]. Vários cientistas do “Baylor College of Medicine”, em Houston, introduziram uma hormona de crescimento em porcos, via TG. Os resultados mostraram que estes cresceram cerca de 40% mais que os animais não tratados. Sendo assim, visto os porcos serem saudáveis e apresentarem menos necessidades alimentares, este tratamento apresenta muitos benefícios na suinicultura.

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No presente trabalho, vamos apenas ter em conta a TG aplicada ao tratamento de doenças humanas, independentemente dos benefícios que os animais possam vir a ter.

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3. ABORDAGENS EM TERAPIA GÉNICA

TIPOS DE CÉLULAS-ALVO Em terapia génica, é necessário identificar as células-alvo dos tecidos doentes. Contudo, em algumas circunstâncias, é preferível usar como alvo células normais/não afectadas, como por exemplo:

destruição de células mediada pelo sistema imunitário: neste caso, as células-alvo são células saudáveis do sistema imunitário, de modo a induzir respostas imunológicas a células cancerígenas ou agentes infecciosos.

difusão de produtos génicos a células distantes: introdução de genes em tecidos não doentes, de forma a promover a distribuição do produto génico até às células do tecido doente.

3.1.1. TRANSFERÊNCIA GÉNICA

Em terapia génica, o tratamento de uma determinada doença é realizado pela transferência de material genético (genes, segmentos de genes ou oligonucleótidos) com o auxílio de um vector para as células-alvo.

Para que esta transferância seja eficiente, é necessário garantir o sucesso das seguintes etapas:

i. Entrega eficiente do transgene nas células-alvo do doente;

ii. Evitar a degradação lisossomal;

iii. Entrada no núcleo/ permanência no citoplasma;

Caso haja entrada no núcleo, as seguintes condições devem ser verificadas:

i. Permanência estável no núcleo, quer como um epissoma circular quer integrado no genoma do hospedeiro;

ii. expressão do gene terapêutico na célula-alvo, controlada pelo promotor e pelo enhancer;

iii. tradução e localização apropriada do produto do gene.

3.1.1.1. E X VIVO Neste tipo de terapia, as células-alvo são previamente retiradas do organismo, mantidas e multiplicadas em cultura, onde lhes é introduzido o material genético. São seleccionadas as que forem transformadas com sucesso, e posteriormente amplificadas/cultivadas in vitro, antes de serem reimplantadas no paciente (figura 3-1). É, então, uma técnica mais segura, uma vez que envolve o transplante de células autólogas geneticamente modificadas, evitando assim a sua rejeição pelo sistema imunitário.

Exemplos de tecidos-alvo onde esta técnica pode ser utilizada consistem em células do sistema hematopoético e da pele.

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3.1.1.2. IN VIVO A terapia génica in vivo é normalmente aplicada em tecidos cujas células não podem ser cultivadas in vitro em número suficiente, como as células cerebrais, e/ou onde células cultivadas não podem ser reimplantadas eficientemente em pacientes.

Neste método, os genes clonados são directamente transferidos para os tecidos do paciente. Para conseguirem circular e atingir as células-alvo, é necessário “mascará-los” de forma a evitarem as defesas do organismo (sistema imunitário). No caso de doenças neurodegenerativas, como por exemplo o glaucoma1, uma forma de atingir mais facilmente as células oculares é por injecção local.

Apesar de não ser tão segura como a TG ex vivo, a TG in vivo possui uma dificuldade adicional devido ao seu procedimento: entrega de vector terapêutico em quantidade suficiente ao tecido-alvo, sem que seja tóxico para outros tecidos. É também necessário um maior grau de especificidade neste tipo de transferência. De facto, em algumas situações a correcção de um defeito numa proporção mínima de células num tecido é suficiente para restaurar a normalidade. No caso do cancro, pelo contrário, a maioria das células (se não todas) têm de receber o gene terapêutico.

Figura 3-1 - Método de introdução de genes modificados através de processos in vivo (representado pela seta

laranja) e ex vivo (representado pelas setas azuis), in http://www.biomania.com.br/imunologia/terapiagenica.php.

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA GÉNICA

A escolha do método de transferência génica depende, principalmente, da natureza do tecido-alvo e da estratégia de terapia utilizada. Pela figura 3-2, que denota o número de protocolos de ensaios clínicos em função do vector utilizado, verifica-se que os vectores virais , em particular os retrovírus, são os mais usados seguidos dos lipossomas.

1 Doença descrita no capítulo 5 desta monografia.

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Figura 3-2 – Distribuição do número de protocolos em função de cada vector utilizado,

in http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical.

3.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS

Os métodos químicos de entrega genética operam fundamentalmente em três níveis: condensação e complexação de DNA, endocitose e sinalização/entrada no núcleo. As moléculas de DNA interagem electrostaticamente com reagentes catiónicos, sendo posteriormente incorporadas pelas células através de mecanismos de endocitose.

Figura 3-3 – Transferência de genes utilizando um receptor de endocitose.

Adaptado de Strachan and Read [6].

Dos métodos químicos mais usados in vitro, salienta-se a precipitação do DNA com Ca3(PO4)2 (fosfato de cálcio) e o uso de polielectrólitos, como o dextrano-DEAE.

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Relativamente ao uso in vivo, são de referir os lipossomas, os quais podem ser divididos em dois grandes grupos: virossomas, se possuírem proteínas virais ou peptídeos fusogénicos, ou imunolipossomas, caso possuam moléculas de sinalização incorporadas.

Tabela 3-1 – Comparação entre vários métodos químicos de transferência génica.

Método Aspectos gerais Vantagens Desvantagens Endocitose

mediada por receptor

- Complexo DNA/molécula para receptor de superfície celular

- Transfecção eficiente - Não há integração

Lipossomas

- Vesículas esféricas bilipídicas sintéticas - Empacotamento in vitro e usado in vivo

- Fácil preparação - Comporta grandes fragmentos - Elevado grau de pureza - Não-imunogénicos

- Não há integração - Baixa eficiência de transfecção

DNA-Ca3(PO4)2 - Precipitado formado por mistura de soluções de PO43-, CaCl2 e DNA

- Simples e barato - Vasto leque celular - Expressão transiente ou estável - Morte celular mínima.

- Baixa eficiência de transfecção e expressão - Só ex vivo

DNA-DEAE Dextrano

- Complexo catião polimérico/DNA.

- Vasto leque celular-alvo - Mais reprodutível que DNA-Ca3(PO4)2

- Tóxico - Só ex vivo - Baixa eficiência de transfecção - Expressão transiente

Cromossoma Artificial Humano

(CAH)

- Gene(s) terapêutico(s) e elementos regulatórios

- Maior capacidade de inserção - Não-tóxicos - Não-imunogénicos - Não necessitam de integração

- Em desenvolvimento

3.1.3. MÉTODOS BIOLÓGICOS

Um dos métodos biológicos mais usados são os vírus, os quais constituem um sistema natural de transferência de genes. A sua base de utilização, enquanto vectores, reside no facto de apresentarem um tropismo natural para determinados tecidos, introduzindo a sua informação genética e tornando-se parte integrante da célula hospedeira.

Ao encontrar-se formas de inactivar ou remover genes virais e substituí-los com o material genético terapêutico de interesse, torna-se possível tirar vantagem da elevada eficiência da transferência génica.

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Tabela 3-2 – Comparação entre os métodos biológicos de transferência génica.

Método Características Produção Vantagens Desvantagens

Retrovírus (RV)

- RNA TR - Sequências LTR - Tropismo para células do sangue e do tubo gastrointestinal

- Uso de células empacotadoras, sequências LTR, promotores e sinal de empacotamento

- Sistema muito bem estudado in vivo e ex vivo - Elevada taxa de transdução - Integração e propagação estável

- Comportam até 9 kb - Baixos títulos - Baixa taxa de entrega in vivo - Imunogénico - Células mitóticas - Mutagénese

Adenovírus (AV)

- dsDNA - Tropismo células epiteliais sistema respiratório e tracto gastrointestinal

- Uso de células empacotadoras: Clonagem directa e Recombinação homóloga

- Comportam até 36 kb - Elevados títulos - Transdução eficiente células mitóticas e pós-mitóticas - Epissoma

- Imunogénico - Baixo grau de selectividade - Expressão transiente - Depuração do epissoma - Reversão para wild-type (wt)

Vírus associados ao Adenovírus

(AAV)

- Parvovírus - ssDNA - Sequências ITR - Infecção latente - Dependente de vírus auxiliar

- rAAV - Plasmídeos com ITRs e gene exógeno - Empacotados mediante uma co-infecção

- Amplo espectro de hospedeiros - Usado células mitóticas e pós- mitóticas - Integração dirigida (AAVS1 cromossoma 19) - Não-patogénicos

- Comportam até 4,5 kb - Baixo título

Vírus Herpes simplex (HSV)

- dsDNA linear - Sequências IRL e IRS - Neurotrófico - Ciclo lítico ou lisogénico

- E1 Ori e OriS, sequências de emcapotamento e promotores Co-infecção

- Epissomal - Infecção latente - Comportam mais de 20 kb - Elevado título

- Imunogénicos - Baixa eficiência de transdução - Expressão transiente - Em desenvolvimento

Lentivírus (LV)

- Retrovírus complexos - Infectam macrófagos e linfócitos

- Alteração proteínas de envelope

- Tranfecção em células mitóticas - Tropismo para grande variedade de células

- Integração inespecífica - Reversão para wt - Comportam até 9 kb

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Outros métodos biológicos passíveis de serem utilizados são as mitocôndrias. Estas podem ser usadas para transferência de material genómico, visto possuírem o seu próprio DNA (mtDNA). O seu uso tem aplicação na reposição do mtDNA em células com deficiências no metabolismo energético a nível da fosforilação oxidativa. Pode ser utilizada na TG de síndromes degenerativos neuromusculares, característicos da idade avançada, como fraqueza muscular, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.

Visto que não existe um método de transferência génica ideal, por vezes, opta-se por combinações entre elementos virais e não-virais, de modo a ultrapassar algumas limitações práticas. Um dos exemplos desta estratégia passa pela construção de plasmídeos com sequências ITR (características de parvovírus) e posterior multiplicação em linhagens recombinantes de E.coli.

3.1.4. MÉTODOS FÍSICOS

A definição de métodos físicos de transferência de genes surge a partir da utilização de “DNA nú”2. Estes métodos têm sido usados frequentemente em culturas de tecidos, mas, em comparação com os vectores virais, não permitem uma transferência génica muito eficiente.

Tabela 3-3 – Comparação entre os métodos físicos de transferência génica

Método Aspectos gerais Vantagens Desvantagens

Bombardeamento de partículas

- Micropartículas de ouro revestidas de DNA - Fluxo de alta pressão de hélio - Uso em músculos e pele - Vacinação génica

- Dosagem precisa - Elevada taxa de transfecção

- Lesão celular - Expressão transiente

Microinjecção - Injecção directa com seringa de vidro

- Menor degradação citoplasmática - Elevada taxa de transfecção - Uso em TGG

- Não há integração - Uma célula de cada vez - Só ex vivo - Problemas técnicos e éticos na TGG

Electroporação - Impulsos eléctricos para permeabilização membrana celular

- Simples e barato - Maiores níveis de expressão

- Só ex vivo - Elevada taxa de morte celular

ABORDAGEM CLÁSSICA EM TERAPIA GÉNICA A terapia génica clássica engloba abordagens cujo fim é a introdução de genes em células- alvo e a sua máxima expressão. O gene incorporado poderá apresentar diferentes funções nas células-alvo.

2 Este conceito é empregue para caracterizar o material genómico que não está associado a qualquer molécula ou sistema biológico.

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3.1.5. AUMENTO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE UM GENE

Uma das estratégias usadas no tratamento de doenças em que a(s) mutação(ões) origina(m) a perda de função de um gene, é a introdução de cópias extra do gene normal funcional. Deste modo, a quantidade de produto do gene normal será incrementada na célula, sendo restaurado o fenótipo original.

A utilização de cDNA com sequências codificantes de uma determinada proteína (minigenes) é apelativa pela facilidade com que pode ser clonado e manipulado em bactérias antes de ser incorporado em células humanas. São de igual modo facilmente acomodados em vários vectores virais. Contudo, o facto de poucos ou nenhuns elementos regulatórios serem incorporados, origina uma baixa expressão do gene introduzido.

3.1.6. MORTE ASSISTIDA DE CÉLULAS ESPECÍFICAS

Nesta abordagem, os genes introduzidos nas células-alvo ou em outras células específicas, têm como objectivo causar a morte das primeiras. Esta é uma estratégia que é, geralmente, usada na terapia de cancro. A morte celular pode ser originada de um modo directo ou indirecto.

No método directo, o gene introduzido codifica para uma toxina letal para a célula - gene suicida – ou para um produto que torna a célula sensível a uma pró-droga a ser administrada posteriormente, conduzindo à morte celular.

No métodoindirecto, um gene imunoestimulatório é incorporado em células-alvo ou em células sãs do sistema imunitário, provocando ou aumentando uma resposta imunológica contra as células-alvo. Este gene poderá codificar para uma citoquina ou para um antigénio estranho ao organismo.

ABORDAGEM NÃO-CLÁSSICA EM TERAPIA GÉNICA Os novos avanços na área da biotecnologia permitiram o desenvolvimento de novas abordagens na TG, que têm como objectivo a inibição da expressão de genes associados a uma doença ou a correcção do defeito génico que lhe deu origem, restaurando assim, a expressão génica normal.

3.1.7. CORRECÇÃO ASSISTIDA DE MUTAÇÕES

3.1.7.1. COR RE CÇÃ O A NÍVEL DO DNA Um gene mutante associado a uma patologia poderá ser reparado por estratégias que activam os mecanismos endógenos de reparação de DNA, por exemplo, o sistema mismatch repair, e mecanismos de recombinação homóloga. Entre estas estratégias contam-se: a quimeroplastia, oligonucleótidos formadores de hélices triplas (OFHT) e pequenos oligonucleótidos.

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QUIME RO PL AST IA A quimeroplastia baseia-se na ligação de uma molécula quimérica de DNA/RNA3 à região genómica que contém a mutação. Essa ligação é feita por complementaridade entre ambas, à excepção do local da mutação, onde é originada uma perturbação estrutural, que activa mecanismos de reparação de DNA endógenos.

OL IG ONUC LE ÓT IDOS F ORMAD ORE S DE HÉ LICE T RIP L A (OFHT) Os OFHT ligam-se de forma específica a regiões genómicas polipurina/polipirimidina, comuns em genomas de mamíferos, por ligações de hidrogénio de Hoogsteen4. Essa propriedade pode ser explorada de modo a que seja possível a mutagénese dirigida do genoma, corrigindo defeitos genéticos.

RE PA RA ÇÃ O P OR OL IGONU CL EÓT IDOS O uso de pequenos oligonucleótidos na reparação génica baseia-se em fenómenos de recombinação homóloga. Os oligonucleótidos são constituídos por DNA em cadeia simples ou dupla, sendo em grande parte homólogos a sequências-alvo de DNA genómico ou epissomal, de modo a catalisar mecanismos intracelulares enzimáticos que medeiam a recombinação homóloga.

3.1.7.2. COR RE CÇÃ O G ENÉ T IC A A N ÍVEL DO RNA R IBO ZIMAS Ribozimas são pequenas moléculas de RNA com propriedades catalíticas e que apresentam dois componentes essenciais: uma sequência de reconhecimento do alvo, necessária para emparelhar por complementariedade com as moléculas de RNA-alvo e, uma componente catalítica, que cliva a molécula de RNA-alvo em dois produtos de RNA não-funcionais, sendo posteriormente degradados pela célula.

De entre as várias classes de ribozimas as mais referidas são as ribozimas hammerhead e as ribozimas hairpin, as quais são trans-actuantes. A reacção de trans-excisão é semelhante à reacção de auto-excisão, propriedade presente nos intrões do grupo I.

3 É uma molécula em cadeia simples, composta por nucleótidos de DNA e RNA, com 70 a 80 bases, que adopta uma conformação em “harpa”. 4 A ligação de Hoogsteen, refere-se a um padrão invulgar de emparelhamento, em que um par de bases se forma recorrendo a pontes de hidrogénio com o N7dos resíduos de adenina e guanina [8].

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Figura 3-4 – Mecanismo da reparação de RNA por meio de ribozimas trans-actuantes [9].

3.1.8. INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO GÉNICA

3.1.8.1. AO NÍVEL D O DNA – ESTR AT ÉG IA S ANT IGEN E

OL IG ONUC LE ÓT IDOS F ORMAD ORE S DE HÉ LICE T RIP L A Os OFHT podem ser também utilizados como um método de inibição da expressão de um determinado gene mutante. Um oligonucleótido poderá ser complementar a regiões de um gene, inibindo a sua expressão.

PEP TÍDE OS D E ÁC ID OS NUCL EIC OS (PANS) Os PANs são moléculas mímicas neutras de ácidos nucleicos. A cadeia açúcar-fosfato dos ácidos nucleicos naturais é substituído por um esqueleto peptídico sintético, geralmente formado por unidades N-(2-amino-etil)-glicina.

Os PANs são desenhados de modo a reconhecer e emparelhar com sequências complementares num dado gene, formando hélices triplas estáveis e, consequentemente, interferindo com a transcrição desse gene. A inibição da transcrição é conseguida devido a impedimentos estruturais, quer por bloqueio ou restrição da acção da RNA polimerase.

3.1.8.2. AO NÍVEL D O RNA – EST RA TÉ GIAS AN TISEN SE

ÁC ID OS NUCL E IC OS ANT ISENSE Ácidos nucleicos antisense são polímeros sintéticos ou naturais que emparelham com mRNAs alvo, inibindo a sua função. Existem várias classes de ácidos nucleicos antisense,

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entre as quais, oligodeoxinucleótidos (ODNs)5 modificados quimicamente, PANs e ribozimas.

A inibição da expressão de um transcrito mutante pode ser efectuada pela indução da degradação do mRNA recorrendo, por exemplo, à enzima RNase H (cliva RNA num híbrido RNA/DNA). Outros mecanismos antisense baseiam-se no bloqueio de sequências do mRNA para ligação aos ribossomas; na inibição da formação de complexos RNP- proteína; ou no sequestro de híbridos oligonucleótido-mRNA alvo no núcleo, impedindo a translocação do mRNA para o citoplasma.

3.1.8.3. AO NÍVEL D A PROT EÍNA

AN TICO RP OS INT RAC EL UL AR ES Os anticorpos possuem funções extracelulares, sendo excretados para o meio exterior ou transportados para a superfície de células B, de modo a funcionar como receptores de antigénio. Porém, avanços recentes permitiram desenhar genes codificantes de anticorpos intracelulares. Estes são modificados de modo a possuírem uma cadeia única por emparelhamento dos domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve através de uma ponte peptídica. Os anticorpos intracelulares podem ser direccionados para um dado compartimento celular onde poderão ligar-se a uma molécula celular específica, por exemplo uma proteína que origine uma patologia, inactivando-a.

AP T ÂMER OS Aptâmeros, são oligonucleótidos modificados em cadeia simples, que reconhecem sequências específicas de uma determinada proteína. Apesar da sua composição semelhante aos ácidos nucleicos naturais, possuem açúcares modificados no carbono 2, o que aumenta a sua resistência a nucleases.

O mecanismo de inibição dos aptâmeros é fundamentalmente diferente do dos oligonucleótidos antisense, uma vez que a inibição proteica advém da ligação específica aptâmero-proteína numa determinada conformação tridimensional. A elevada especificidade desta interacção faz com que os aptâmeros sejam, em geral, altamente direccionados para os seus alvos, mesmo entre isoformas de uma enzima [10].

PROT EÍNA S MUT ANT ES Em muitos casos, os polipéptidos wt associam-se naturalmente formando multímeros. A introdução de genes codificantes de proteínas mutantes com capacidade de ligação específica aos polipéptidos wt, torna possível a inibição da função dos mesmos, por interferência na formação dos agregados proteicos.

3.1.9. COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES ABORDAGENS DA TG NÃO-CLÁSSICA

A comparação entre as diferentes abordagens utilizadas na terapia génica não-clássica encontra-se sumariada na tabela da página seguinte.

5 Oligorribonucleótidos com um grupo hidroxilo na posição 2’ do açúcar.

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Tabela 3-4 – Vantagens, desvantagens e aplicações correntes das várias abordagens não-clássicas aplicadas em TG.

Abordagem Vantagens Desvantagens Aplicações correntes

Quimeroplastia -Resistência a nucleases -Impede a concatenação de moléculas dsDNA

------------- -Células de mamíferos -Modelos animais

OFHT

-Efeito permanente -Assegura o nível de expressão -Mantém o sistema de regulação endógeno -Não-imunogénico

-Nucleossomas impedem a acessibilidade ao DNA -Somente sequências polipurina/polipirimidina -Degradação por nucleases

-Células de mamíferos -Doenças infecciosas -Cancro

Pequenos oligonucleótidos

-Efeito permanente -Assegura o nível expressão -Mantém o sistema de regulação endógeno -Não-imunogénico

-Pouco conhecimento dos mecanismos moleculares -Baixa frequência de recombinação homóloga -Estimulação de apoptose

-Modificação até 4 pb -Células humanas epiteliais

Ribozimas -Maior especificidade -Degradação por ribonucleases -Doenças infecciosas -Cancro

PANs -Elevada estabilidade de ligação ao RNA -Resistência a nucleases -Métodos de incorporação ineficientes -Células de mamíferos

ODNS MODIFICADOS -Resistência a nucleases -Baixa especificidade -------------

Anticorpos Intracelulares -Elevada especificidade

-Penetração lenta nos tecidos -Longo tempo de residência no sangue

-------------

Aptâmeros -Não-imunogénico -Elevada especificidade -Elevado custo de síntese -Estudos inter-espécie

-------------

Proteínas Mutantes ------------- -Imunogénico -Doenças Infecciosas

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TERAPIA GÉNICA CLÁSSICA VS. TERAPIA GÉNICA NÃO-CLÁSSICA

As estratégias cujo fim é a correcção génica têm vantagens significativas a nível terapêutico e de segurança.

i. Sendo a informação genética mutante directamente reparada, o DNA ou RNA corrigido é mantido no contexto da sua sequência nativa, e, consequentemente, regulado por mecanismos endógenos.

ii. A reparação de um gene mutante, que codifica para uma proteína defectiva com perda de função ou com um efeito dominante negativo, causa simultaneamente produção regulada da proteína normal e a inactivação ou redução da expressão do produto génico mutante.

iii. A reparação de um produto génico defectivo é efectuada de forma específica. Logo, uma vez desenvolvidas adequadamente, estas estratégias irão resultar numa menor mutagénese aleatória do genoma, originando menos efeitos mutagénicos colaterais.

Comparando os diferentes níveis de correcção génica, a reparação a nível de RNA poderá representar um método mais seguro, pois dela não resulta uma mudança permanente do genoma, devido ao contínuo turnover do mRNA. Contudo, o tempo de vida limitado do RNA corrigido implica a reparação contínua do RNA mutante. Por outro lado, a reparação a nível do DNA corrige, permanentemente de uma só vez, a informação génica da célula. Todavia, como o DNA corrigido é estavelmente mantido e propagado, garantir a especificidade da correcção é um dos factores de segurança mais importantes.

As abordagens que envolvem a inibição de expressão de um determinado gene, RNA ou proteína, não originam a reparação do erro génico, mas são eficazes, especialmente, no tratamento de doenças associadas a mutações dominantes de ganho-de-função, onde mutações causam padrões de expressão inadequados e/ou a aquisição de novas funções. São também eficientes contra agentes infecciosos, tendo então aplicação no tratamento de doenças infecciosas.

As estratégias englobadas na TG clássica têm sido utilizadas no tratamento de distúrbios hereditários originados por deficiência genética, em particular, em doenças autossomáticas recessivas. O seu uso em doenças dominantes hereditárias não é eficaz, por exemplo, em mutações de perda de função seria necessário obter uma expressão eficiente do gene normal introduzido. Também não é apropriada em casos onde a mutação é de ganho de função, visto que o aumento do produto génico normal não mascara o efeito negativo da mutação.

LIMITAÇÕES À TERAPIA GÉNICA O conceito fundamental em terapia génica, referido em 2.2., parece ser simples e eficaz. No entanto, existem várias limitações inerentes que vão muito além dos obstáculos tecnológicos (vectores, abordagens utilizadas [2]). O avanço na TG passa também por um conhecimento mais profundo da base genética de cada doença e pela capacidade de utilização dos genes cujas mutações são patogénicas.

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3.1.10. LIMITAÇÕES TECNOLÓGICAS

3.1.10.1. CUR TO T EMPO DE VIDA Para que a TG possa ser eficiente, o DNA terapêutico tem de ser introduzido de forma estável e funcional, quer seja integrado no genoma quer sob a forma de epissoma. Ao integrar-se no genoma, o gene perpetua-se ao longo das várias gerações, expressando-se a longo-prazo. Por outro lado, ao permanecer em epissoma, a expressão do gene poderá diminuir com o tempo, fazendo com que o efeito terapêutico seja de curta-duração. Neste caso, os pacientes terão de ser submetidos a ciclos múltiplos de terapia para atingir resultados satisfatórios.

3.1.10.2. PR OBL E MA S CO M VE CT OR ES VIRA IS Os vírus apresentam uma variedade de potenciais problemas para o paciente: não controlo da expressão génica, toxicidade, respostas imunológicas e inflamatórias. Além disso, existe a possibilidade destes, uma vez introduzidos nas células do paciente, poderem não estar inactivos ou mesmo recuperar a sua capacidade de causar infecção. Outros problemas que advêm da utilização de vectores virais são a incapacidade de controlar a integração do transgene e a activação ocasional de fragmentos génicos latentes de outros vírus.

3.1.10.3. INTE GR AÇ ÃO GÉN IC A A integração dos genes no cromossoma do hospedeiro é, sem dúvida, um factor decisivo para alcançar uma expressão génica permanente. No entanto, visto a inserção ocorrer, por vezes, de forma aleatória, a expressão génica resultante pode ser baixa ou até mesmo nula. Note-se que a integração de um gene numa zona crucial pode causar morte celular, como por exemplo a inactivação de um gene supressor de tumores.

3.1.11. DOENÇAS MULTIGÉNICAS

Os melhores casos para a aplicação da TG são aqueles em que ocorrem alterações num só gene. Contudo, alguns dos distúrbios mais frequentes, tais como doenças cardiovasculares, pressão arterial elevada, doença de Alzheimer, artrite e diabetes, são causadas por efeitos combinados de variações em muitos genes e por condições ambientais. Deste modo, com o conhecimento actual, a TG revela-se pouco eficaz para o tratamento deste tipo de doenças.

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4. TIPOS DE DOENÇAS TRATADAS EM TERAPIA GÉNICA

A partir do momento em que a primeira experiência de terapia génica mostrou resultados positivos, a investigação nesta área aumentou exponencialmente. Actualmente, encontram- se em desenvolvimento uma série de estudos de forma a criar protocolos, com aplicação clínica, para um maior número de doenças. Verifica-se que a maioria de protocolos existentes incide sobre o tratamento de cancro (ver figura 4-1).

Figura 4-1 – Distribuição do número de protocolos em função da doença a tratar,

in http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/ .

DOENÇAS GENÉTICAS Entende-se por doenças genéticas distúrbios a nível do material genético. Este tipo de alterações pode ter origem em factores intrínsecos, tais como mutações originadas durante o crossing-over, sendo, portanto, passadas à descendência. Para além da casualidade genética, verifica-se que os factores ambientais também podem originar mutações, atingindo apenas células somáticas. É, ainda, de notar que as várias anomalias, resultantes da alteração do genótipo, podem expressar-se fenotipicamente de forma constante ou serem somente detectadas em determinadas condições.

Doenças Monogénicas (Single-gene ou Mendelianas) - Têm origem em mutações que ocorrem na sequência de DNA de um só gene. Exemplos deste tipo de doença são:

• Fibrose Cística

• Anemia Falciforme

• Deficiência no gene ADA

• Doença de Huntington6

6 Doença descrita no capítulo 5 desta monografia.

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Doenças Multigénicas - Resultam de mutações em vários genes e/ou em em diferentes cromossomas. Exemplos deste tipo de doença são:

• Doença de Alzheimer

• Algumas formas de Diabetes

• Cancro

• Obesidade

Doenças Cromossómicas – Resulta de anormalidades ao nível da estrutura dos cromossomas. Exemplos deste tipo de doença são:

• Síndrome de Down

• Síndrome de Klinefelter

• Síndrome de Turner

Doenças Mitocondriais – Resultam de mutações a nível do DNA mitocondrial. São doenças caracterizadas por deficiências a nível do metabolismo energético e por um padrão de herança materna. Exemplos deste tipo de doença são:

• Doença de Parkinson

• Doença de Alzheimer

SISTEMA IMUNITÁRIO

As imunodeficiências resultam da ausência ou falha da função normal dos elementos do sistema imunitário, devido a mutações nos genes das células envolvidas na resposta imunitária, tais como as imunoglobulinas, células B e células T. Exemplos deste tipo de doença são:

      – Distúrbio em que a perda de função enzimática conduz a uma acumulação de produtos tóxicos para as células do sistema imunitário, destruindo-as e, deste modo, debilitando-o.

Doenças autoimunes – Resposta excessiva do sistema imunitário e consequente ataque a células e moléculas do próprio organismo.

• Síndrome de DiGeorge

• Imunodeficiência Severa Combinada

• Asma

• Algumas formas de Diabetes

• Imunodeficiência com hiper-IgM

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DOENÇAS INFECCIOSAS

São resultado de uma infecção viral, bacteriana e fúngica num organismo. Podem originar distúrbios a nível do sistema imunitário ou do ciclo celular. Exemplos deste tipo de doença são:

• SIDA7 • Pneumonia • Alguns tipos de Meningite • Febre Tifóide

CANCRO

Caracterizado por um distúrbio no ciclo celular, devido a mutações nos genes que controlam o crescimento e a divisão celular. Exemplos deste tipo de doença são:

• Leucemia

• Carcinomas

• Tumores Cerebrais8

7,8 Doença descrita no capítulo 5 desta monografia. 8

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5. EXEMPLOS DE APLICAÇÃO DA TERAPIA GÉNICA GLAUCOMA

5.1.1. CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA

O glaucoma é uma neuropatia óptica progressiva caracterizada por um padrão particular do nervo óptico e por danos no campo de visão [11] (ver figura 5-1). Uma das maiores causas desta doença é o aumento anormal da pressão interna no globo ocular (PIO). A principal consequência é a morte das células gangliares da retina (CRGs), tendo já sido detectada a sua apoptose em ratos, macacos e humanos [12].

O glaucoma é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, juntamente com a mácula e a Retinitis Pigmentosa [13].

Figura 5-1 – Morfologia de um olho com glaucoma (lado esquerdo) e padrão apresentado pelo nervo óptico

numa situação normal e numa situação glaucomatosa (lado direito) [14].

O olho contém um líquido, humor aquoso, que circula continuamente no seu interior. É produzido no corpo ciliar e escoado pela rede trabecular (RT) (ver figura 5-2). No glaucoma existe uma diminuição desse escoamento, conduzindo a uma acumulação do líquido, com consequente aumento da PIO [15]. Este aumento poderá ocasionar lesões no olho devido a uma má irrigação sanguínea das estruturas visuais. A consequência é a morte das células da retina, provocando uma perda progressiva da visão, um estreitamento do campo visual (figura 5-3), e até mesmo cegueira [16].

Figura 5-2 – Esquema representativo da parte frontal do olho [17].

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Figura 5-3 – Imagem ilustrativa da perda da visão periférica – visão tubular [17].

O glaucoma resulta de diferentes doenças que afectam o olho, estando estas não só associadas a um aumento da PIO, como também ligadas a factores de desenvolvimento e/ou progressão dos danos glaucomatosos (por exemplo, doenças cardiovasculares, autorregulação vascular defectiva, apneia do sono, doenças autoimunes, etc). Estes últimos estão a tornar-se numa área de investigação de interesse crescente, principalmente no Japão e nos EUA onde representam, respectivamente, 70% e 80% dos factores causadores de glaucoma [11].

Os sintomas da doença, assim como os principais factores para o seu desenvolvimento, são descritos, sinteticamente, na tabela seguinte.

Tabela 5-1 – Sintomatologia e condições especiais para o desenvolvimento do glaucoma [14, 17].

SINTOMAS CONDIÇÕES PARA O DESENVOLVIMENTO - Trocar com frequência a graduação dos óculos - Dificuldade em adaptar à obscuridade; - Perda de visão lateral - Visão embaciada - Visão de halos coloridos ao redor das luzes - Cefaleia ou dor ocular, etc.

- Pessoas acima dos 45 anos - Pessoas com histórico clínico familiar - Pessoas com PIO anormalmente elevada - Pessoas com ascendência africana ou asiática - Pessoas com diabetes, miopia, uso prolongado de esteróides (corticóides) e lesão ocular prévia

T IPOS DE GLAUCOMA

De um modo geral, existem 4 tipos de glaucoma [14]:

 Glaucoma de ângulo aberto: a PIO aumenta lentamente; a córnea adapta-se às alterações sem sofrer muitos danos; não é acompanhado de sintomatologia.

 Glaucoma de ângulo fechado: pode manifestar-se através de picos intermitentes da PIO (embaciamento visual, halos coloridos, etc.) ou como uma crise de glaucoma agudo. Este último é caracterizado pela elevação abrupta da PIO (dor ocular, cefaleia, vómitos, vermelhidão).

 Glaucoma congénito: má formação no sistema de drenagem que ocorre do humor aquoso. Manifesta-se em recém nascidos e crianças; podendo ocorrer num olho ou em ambos.

 Glaucoma secundário: neste tipo de glaucoma, o aumento da pressão intra-ocular ocorre após doenças inflamatórias, catarata avançada, alteração dos pigmentos naturalmente existentes dentro dos olhos, entre outros.

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5.1.2. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS

Actualmente, o tratamento do glaucoma passa por uma tentativa em abrandar a perda de visão, mantendo a PIO em níveis aceitáveis e controlados. Esse tratamento pode ser realizado usando 3 tipos de terapia [17]:

1. Tratamento Clínico: o tratamento mais comum consiste em colírio, embora ocasionalmente não seja suficiente.

2. Tratamento por Laser: consiste em cirurgia por laser na RT, na tentativa de torná-la funcional; é um método popular como passo intermédio entre os fármacos e a cirurgia tradicional.

3. Tratamento cirúrgico: implica a criação de um novo sistema de drenagem para o olho, através de uma incisão. A mais comum das cirurgias é chamada de trabeculoplastia. Um efeito secundário (em mais de um terço dos pacientes) é o desenvolvimento de cataratas num prazo de 5 anos.

Os tratamentos actuais para esta disfunção não levam à cura. Para além dos efeitos secundários, apenas um diagnóstico precoce e eficaz da doença ajuda a prevenir a perda de visão total.

5.1.3. TERAPIA GÉNICA PARA O GLAUCOMA

Uma vez que o glaucoma resulta de diferentes doenças, oferece uma variedade de alvos para uma nova forma de tratamento – a terapia génica ocular (TGO).

Desde o aparecimento da TG que a sua aplicação às doenças oculares tem sido investigada, uma vez que o olho é um alvo atractivo devido à sua elevada acessibilidade [18]. No entanto, isso não significa que a TGO seja já um sucesso clínico [16].

5.1.3.1. TE CIDOS AL VO E SIST EMA S DE TR ANSF ER ÊN CIA GÉN IC A Apesar da base genética da maior parte dos glaucomas não estar ainda bem definida, a transferência e a expressão de genes cujos produtos são factores neuroprotectores e/ou factores que contribuem para a diminuição da PIO, podem servir para modificar a fisiologia de células relevantes e bloquear a patogénese [11]. De entre as alterações patológicas causadas no nervo óptico está a privação de factores neurotróficos9, por exemplo BDNF (brain-derived neurotrophic factor), e a libertação de agentes neurotóxicos para a retina, tais como glutamato, óxido nítrico e radicais livres.

Os potenciais alvos da TGO (ver tabela 5-2) incluem vários tecidos/células oculares, estando divididos em dois grupos: o segmento anterior, constituído pela RT, o epitélio ciliar (EC) e o músculo ciliar (MC); e o segmento posterior, do qual fazem parte as CRGs e as células de Müller.

9 Grupo de proteínas que regulam o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso.

N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A

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Figura 5-4 – Morfologia típica dendrítica das células retinais gangliares visualizada com Proteína verde

fluorescente. Escala da barra: 50µm. Adaptado de Martin et al [12].

Tabela 5-2 – Exemplos de genes-alvo e tecidos que podem ser utilizados no tratamento do glaucoma [12].

Tecido/Célula- Alvo Gene-Alvo Efeito Previsto

RT Proteínas reguladoras do citoesqueleto Estímulo do escoamento do humor aquoso por

disrupção do citoesqueleto celular

EC Receptores -Adrenérgicos Melhoramento da resposta das células do EC a substâncias que inibem a produção do humor

aquoso. Células do MC Gene Desconhecido Regulação da síntese de prostaglandina.

CRGs Factor Neurotrófico (BDNF) Efeito neuroprotector através da super-expressão

do BDNF transgénico.

Células Müller GLAST Regulação do transportador endógeno de glutamato para melhorar os seus níveis

extracelulares.

Até à data, foram testados 6 sistemas de transporte de genes terapêuticos para as células/tecidos de interesse [12], os quais se encontram sumariados na tabela 5-3. As diferenças encontradas entre os vectores estão relacionadas com o tropismo tecidular, capacidade do vector, respostas imunológicas, toxicidades, entre outras.

N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A

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Tabela 5-3 – Tecidos/Células relevantes no tratamento do Glaucoma por TGO e vectores utilizados.

Adaptado de Borrás et al [12].

Tecido/Célula Alvo

Vector Utilizado Abordagem em TGO

Eficiência do Vector

AV Injecção Intra-Cameral Alta Injecção Intra-Cameral Nula AAV

Cultura de Tecidos Nula VHS Injecção Intra-Cameral Média

Lentivírus Injecção Intra-Cameral Alta

RT

Lipossomas Injecção Intra-Cameral Baixa Injecção Intra-Cameral Alta

AD Cultura de Lentes Cristalinas Alta

EC

HSV Injecção Intra-Cameral Média MC HSV Cultura de Tecidos Média

AV Injecção Intra-Vitreal Baixa AAV Injecção Intra-Vitreal Alta CRGs HSV Injecção Intra-Vitreal Média

Tendo em conta que a morte das CRGs é, num estado avançado da doença, uma manifestação comum a todos os tipos de glaucoma, será interessante averiguar o que se tem feito para evitar a sua destruição. Nesse sentido, foi desenvolvido um estudo com o objectivo de, através de factores neurotróficos, proteger as CRGs [12].

UT IL IZ AÇÃ O D E FA CT OR ES NEU ROT RÓ FICOS (BDNF) O factor neurotrófico BDNF é importante para a sobrevivência das CRGs, não só durante o desenvolvimento humano como também durante a vida adulta. Este factor é produzido no colículo superior (ou pelo núcleo geniculado lateral nos mamíferos superiores), sendo depois transportado ligado ao receptor trkB, desde os axónios das CRGs até aos corpos celulares em vesículas microssomais [12].

Quando a PIO é elevada, o transporte no nervo óptico do complexo trkB-BDNF é obstruído, sendo este um factor importante na morte das CRGs. Estudos demonstram que, em ratinhos nos quais foi induzido o glaucoma, a injecção intra-vitreal da proteína BDNF aumenta a sobrevivência das CRGs . No entanto, a necessidade de múltiplas injecções reduz o benefício clínico que poderia advir da utilização deste factor como adjuvante no tratamento da glaucoma [12].

No sentido de minimizar o número de injecções, foi proposta a utilização de um vector AAV modificado capaz de efectuar uma transfecção eficiente nas CRGs. Esse vector incorpora cDNA que codifica BDNF, que de acordo com a hipótese em estudo, teria um efeito mais protector do que injecções isoladas com o factor neurotrófico. O uso deste tipo de vector justifica-se pelo facto de ser capaz de produzir uma expressão transgénica na retina, com reduzida inflamação na maior parte das espécies . Conjuntamente com o cDNA, foi incorporado um elemento regulatório pós-transcricional da hepatite de marmota (WPRE) com o intuito de aumentar a eficiência da transfecção [12].

N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A

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Os aspectos principais do método utilizado para o estudo da eficiência do vector desenvolvido no tratamento do glaucoma, são apresentados na tabela 5-4:

Tabela 5-4 – Aspectos principais na TG aplicada ao tratamento do glaucoma utilizando um AAV modificado

com inserção do BDNF.

Tipo de TG TGO Neuroprotectora

Abordagem Clássica: super-expressão de um factor neurotrófico

Factor Terapêutico BDNF

Técnica in vivo: Injecção Intra-Vitreal

Células-alvo CRGs

Método de Transferência Génica Biológico: utilização de um AAV modificado

Modelo Animal Ratinhos Wistar

Os ratinhos utilizados no estudo desenvolvido receberam uma injecção intra-vitreal unilateral (ver figura 5-6) com o vírus AAV-BDNF-WPRE. Um dos métodos para controlar a reacção ou avaliar a eficácia da expressão génica, consistiu na utilização de um vector AAV-GFP-WPRE, expressando uma proteína verde fluorescente (GFP).

Figura 5-5 – Esquema do olho de rato. É indicado o local de injecção Intra-Vitreal.

Adaptado de Ali et al [16].

Algum tempo após a injecção intra-vitreal, o glaucoma foi induzido pela aplicação de laser à RT do olho, o que levou ao aumento da PIO. As CRGs que sobreviveram a este tratamento foram estimadas pelo número de axónios existentes no nervo óptico. A expressão génica foi monitorizada por imunohistoquímica, Western blot e visualização directa por GFP.

Os resultados obtidos demonstraram um aumento significativo do número de CRGs sobreviventes. Note-se que o ensaio foi monitorizado apenas até à quarta semana após indução do aumento da PIO. Sendo assim, este estudo representa uma demonstração do vantajoso efeito neuroprotector aplicado em TG para o tratamento do glaucoma.

Neste estudo, o passo seguinte passará por demonstrar a viabilidade da expressão génica a longo prazo e pela aplicação do método a modelos animais filogeneticamente mais próximos do Homem (por exemplo, macacos).

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A TG para o tratamento do glaucoma é um método que se tornará muito eficiente na prevenção da cegueira causada por esta doença. No entanto, é ainda necessário um aperfeiçoamento em vários aspectos [11], nomeadamente:

papel da matriz extracelular e da sinalização celular na RT do olho;

regulação e produção do humor aquoso, assim como de factores libertados pelo EC que poderão modelar a RT;

conhecimento dos caminhos de activação da morte das CRGs;

modelos animais que traduzam melhor as alterações que ocorrem em todos os tecidos do olho humano;

identificação de genes adicionais envolvidos no desenvolvimento do glaucoma.

DOENÇA DE HUNTINGTON

5.1.4. CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA

A doença de Huntington (DH) é um distúrbio autossomático dominante neurodegenerativo hereditário, que afecta aproximadamente 1 em cada 10 000 indivíduos caucasianos. Indivíduos não-caucasianos apresentam uma frequência mais baixa [19]. Este distúrbio foi descrito pela primeira vez pelo médico George Huntington, em 1872.

É uma doença caracterizada por uma disfunção progressiva motora, psicológica e cognitiva, devida a uma perda gradual de massa neuronal. A neuropatologia é extremamente restricta, ocorrendo a atrofia no striatum e, em menor extensão, no córtex cerebral. A idade média de manifestação da doença é de 40 anos, sendo, aproximadamente, 15 anos o intervalo normal entre o diagnóstico e a morte de um paciente. Todavia, existem casos em que a doença se manifesta de um modo precoce ou tardio, dos 2 anos aos 90 anos, respectivamente. Ou seja, a doença exibe uma penetrância dependente da idade [19].

Figura 5-6 – Fotografia,à esquerda, de um cérebro de um paciente afectado pela doença de Huntington, à

direita, cérebro de um indivíduo normal, in http://pathology.mc.duke.edu/neuropath/CNSlecture4/CNSlecture4.htm .

BA SE GEN ÉT ICA DA DO ENÇ A D E HUNT INGT ON A DH tem origem numa mutação no gene IT15 situado no cromossoma 4. Este gene é constituído por 67 exões e codifica uma proteína com 3 144 aminoácidos, a huntingtina

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(Htt), cuja função é ainda desconhecida, mas que demonstra ser essencial para o desenvolvimento neuronal normal. O exão 1 contém uma repetição trinucleotídica CAG que codifica para o aminoácido glutamato, seguida por outra repetição codificante para o aminoácido prolina.

A mutação no gene IT15 que origina a DH altera o número de unidades da repetição trinucleotídica CAG. Esta repetição é polimórfica, compreendendo 10 a 35 unidades em alelos ditos normais. Nos alelos mutantes, a repetição é expandida para um número de unidades que varia de 36 a mais de 150. Contudo, a maioria dos alelos mutados contém 40 a 50 unidades CAG. Esta expansão tem como consequência o alongamento da região poliglutâmica na Htt. Embora não seja conhecido o efeito específico deste alongamento, indícios apontam para que a mutação que o origina, aja como uma mutação de “ganho-de- função”, isto é, conferindo à proteína novas propriedades sem, no entanto, eliminar a sua função normal. Esta propriedade parece ser incrementada com o aumento do número de unidades CAG, pois o número de unidades consecutivas é o principal determinante da severidade da doença. Alelos com 40 a 50 unidades estão associados a uma manifestação da doença numa fase adulta da vida. Quanto maior for o número de unidades presentes no alelo mutado, mais cedo esta se manifestará.

Estudos em ratos transgénicos indicam que a expansão das regiões ricas em aminoácidos glutamato originam a formação de agregados da proteína mutante Htt. Com o avançar do tempo, esses agregados proteicos atingem uma massa crítica, migrando para o núcleo dos neurónios, formando inclusões intranucleares. Esta migração torna as células neuronais mais vulneráveis a agentes químicos produzidos endogenamente, provocando a sua morte [20].

5.1.5. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS

Até aos dias de hoje, os tratamentos existentes para a DH baseiam-se no alívio sintomático. Alguns medicamentos têm sido utilizados, de modo eficiente, no alívio dos sintomas e no controlo da doença. Contudo, não detêm o seu progresso.

Inúmeros fármacos, como antidepressivos e neurolépticos, têm sido utilizados no tratamento de depressões e psicoses, respectivamente. Porém, a sua utilização origina graves efeitos secundários, como o desenvolvimento de discinesia tardia10 e parkinsonismo. Fármacos como a coenzima Q10 e a nicotinamida têm suscitado interesse, pois apresentam efeitos neuroprotectores [21,22].

Procedimentos neurocirúrgicos aplicados desde há vinte anos no tratamento da doença de Parkinson, começaram a ser utilizados na DH. Novas abordagens cirúrgicas têm também sido desenvolvidas, tais como o transplante de células neuronais em troca de células afectadas em locais específicos do cérebro de pacientes com DH, e implantes de cápsulas no cérebro que secretam um fármaco directamente no local danificado [22,23].

5.1.6. NOVAS ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO: TERAPIA GÉNICA TER AP IA GÉNIC A NEUR OP RO TE CT OR A Dos 636 ensaios clínicos de TG a decorrer, apenas um se centra na DH. Este baseia-se numa TG neuroprotectora em que células BHK (baby hamster kidney cells) geneticamente

10 Diminuição ou extinção de movimentos voluntários.

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modificadas encapsuladas, segregam o factor neurotrófico ciliar humano CNTF [Bachoud- Levi et al (2000)]. Vários factores neurotróficos possuem a capacidade de proteger neurónios do striatum em vários modelos experimentais da DH.

O ensaio clínico centra-se numa abordagem ex vivo onde são implantadas, no ventrículo lateral direito de 6 pacientes, células BHK. Estas encontram-se rodeadas por uma membrana semi-permeável, sendo usadas para secretar continuamente e a longo-prazo CNTF. Os sintomas associados à DH podem ser monitorizados com testes neurofisiológicos, neurológicos, motores e neuropsicológicos.

O ensaio encontra-se em fase I, ou seja, está actualmente a ser avaliada a segurança e tolerância que os pacientes apresentam ao tratamento realizado.

TER AP IA GÉN IC A BA SEA DA EM RNA D E INT ERF ER ÊN CIA A TG baseada em mecanismos de RNA de interferência (RNAi) tem como objectivo diminuir os efeitos citotóxicos que a proteína mutante Htt origina nas células neuronais. O RNAi representa uma defesa celular natural de controlo da expressão de genes exógenos presente na maioria dos eucariotas, incluindo os humanos.

Mecanismo de interferência

O processo inicia-se com moléculas de dsRNA com extremidades 3’ em cadeia simples. Estas moléculas são reconhecidas pela enzima Dicer (presente em D. melanogaster, e semelhante à RNase III), sendo clivadas em moléculas de dsRNA com 21-23 nucleótidos, denominadas short interfering RNA (siRNA). Estes siRNAs são incorporados num complexo contendo ribonucleoproteínas (siRNP), formando posteriormente o complexo RISC com actividade endonuclease.

O silenciamento de um dado transcrito é induzido por dois mecanismos: i) clivagem de mRNAs nos quais há uma sequência inteiramente complementar ao siRNA e ii) inibição da transcrição de mRNAs que são, quase na totalidade, complementares ao siRNA, por bloqueio da acção ribossomal. O silenciamento pode ser também efectuado a nível do DNA, sendo a inibição da expressão génica induzida pela metilação de DNA homólogo num promotor.

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Figura 5-7 – Degradação de RNA pelo mecanismo de RNA de interferência. Somente os quadrados azuis

possuem actividade nucleolítica [24].

A desintegração específica do transcrito mutante Htt, sem alterar a função do alelo normal, pode ser feita através de:

i. Direccionamento de siRNAs para um SNP específico do transcrito mutante;

ii. Introdução de um transgene normal da Htt resistente ao RNA terapêutico;

iii. Desenho de uma ribozima que clive apenas os transcritos com uma repetição poliglutâmica extensa.

A estratégia i) tem sido utilizada em vários estudos. Para esta ser possível é necessário, em primeiro lugar, efectuar um rastreio de possíveis SNPs presentes no gene IT15 mutante, de modo a definir um siRNA que reconheça apenas o transcrito mutante.

Considerando que a agregação proteica é promovida pelo fragmento N-terminal da Htt contendo a repetição poliglutâmica, será aconselhado desenhar um siRNA que reconheça essa região. Todavia, a região a montante da repetição CAG compreende menos de 400 pb e a frequência média de um SNP no genoma é apenas de 1 em cada 500 pb. Logo, a hipótese de encontrar um SNP nessa região é baixa. Porém o transcrito tem um tamanho total de 13,7 kb, providenciando outras potenciais regiões-alvo. Portanto, a identificação de SNP apropriados, em várias famílias afectadas com a DH é uma prioridade.

Na Universidade de Iowa decorre um estudo, realizado em células humanas, que incide sobre uma doença semelhante à DH [25]. A mutação que origina essa doença é uma expansão de repetições trinucleotídicas, tal como sucede na DH. Foi demonstrado, neste estudo, ser possível desenhar um siRNA capaz de reconhecer e silenciar somente o gene mutante, através da descoberta de um SNP presente em 70 % dos genes defectivos. Assim

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sendo, ao construírem um sistema de expressão contínuo de siRNAs complementares à mesma sequência do gene que o SNP, foi verificada uma diminuição de 80 % da expressão da proteína defectiva, não tendo sido afectada a produção da proteína normal.

O uso desta tecnologia como potencial terapia para o tratamento da DH, poderá basear-se na descoberta de um SNP presente em 40 % dos genes mutantes da Htt.

Uma alternativa ao knockdown específico do alelo mutante é a introdução de um transgene normal IT15 resistente ao siRNA. Este transgene poderia ser incluído no sistema de expressão do siRNA, de modo a ser incorporado nas células em que é utilizado o mecanismo de RNAi. Um dos obstáculos a esta estratégia é o facto de nem todos os vectores terem a capacidade de comportar todo o gene IT15. Um outro entrave é a possibilidade de ocorrer super-expressão do gene wt, embora ainda não tenham sido registados efeitos negativos causados pela sua super-expressão.

Várias questões relativas à segurança deste tipo de terapia têm se ser consideradas, como:

Eficiência do knockdown;

Especificidade do direccionamento do siRNA;

Controlo da expressão;

Toxicidade;

Efeito na função do striatum normal.

Os sistemas virais que demonstram ser mais apropriados para entrega de RNA/DNA no cérebro são: adenovírus gutless, AAV e LV (ver tabela 5-5). Os primeiros são vírus de segunda geração, em que foram removidos alguns genes com o intuito de diminuir a sua imunogeneicidade [26].

SÍNDROME DE IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA – SIDA 5.1.7. CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA

A SIDA é uma das maiores causas de mortalidade, tendo-se verificado a morte de 16 milhões de pessoas, desde o início da epidemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) nos anos 60 [27]. A SIDA resulta de uma infecção por HIV. Este vírus pode ser transmitido por contacto sexual, passado de mãe para filho através da placenta e/ou leite materno e, ainda, por transfusão de sangue ou de qualquer outro componente sérico.

A infecção manifesta-se através de sintomas como febres, inchaço dos nódulos linfáticos (PGL – Progressive Generalized Limphadenopathy) e inflamações repentinas. Num estado mais avançado, podem observar-se infecções oportunistas, tais como pneumonia ou herpes genital e anal. Outros aspectos da SIDA são o desenvolvimento de Sarcoma de Kaposi, um tumor das células endoepiteliais, linfomas de células B e doenças do sistema nervoso (por exemplo, demência e paralesia) [28].

O VÍRUS O HIV é um dos membros da numerosa família dos Retroviridae. O seu genoma é constituído por moléculas em cadeia simples de RNA, codificando, pelo menos, quatro regiões distintas: genes estruturais, regulatórios, de proteínas de maturação e sequências LTR [27].

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Figura 5-8 – Estrutura do Vírus da Imunodeficiência Humana Humana

in http://hiv.buffalo.edu/html/hiv_pharm.html.

Figura 5-9 – Organização do genoma do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Genes estruturais: gag (proteínas da Cápside); pol (enzimas virais); env (glicoproteínas especificas do receptor CD4).

Genes regulatórios. Genes codificantes de proteínas de maturação. Adaptado de: Human Immunodeficienct Virus (HIV), http://www.els.net .

O HIV apresenta determinadas particularidades que o tornam de difícil combate. Uma delas reside na capacidade da transcriptase reversa poder utilizar várias moléculas de RNA em simultâneo, da qual resulta uma elevada frequência de recombinação. Para além disso, é possível a síntese de DNA utilizando moléculas de RNA danificadas. Verifica-se, igualmente, que a ocorrência de erros durante a síntese do DNA é elevada (cerca de 3×10-5 erros/base em cada ciclo de replicação), o que constitui um factor muito importante para a diversidade genética [27].

O ciclo de replicação de qualquer retrovírus divide-se em nove etapas.

5´LTR gag

pol

vif

vpr

env

vpu

nef

3´LTR rev

tat

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Figura 5-10 – Ciclo de replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV). 1 – Ligação ao receptor

celular; 2 – Fusão com a membrana celular; 3 – Libertação do material vírico; 4 – Síntese de DNA, por acção da Transcriptase reversa; 5 – Integração do genoma do hospedeiro; 6 – Replicação do genoma vírico; 7 –

Síntese proteica; 8 – Maturação das proteínas víricas; 9 – Montagem e gemulação, In http://hiv.buffalo.edu/html/hiv_pharm.html .

Relativamente à primeira etapa do ciclo de replicação, a entrada no hospedeiro, verifica-se que o HIV se revela mais eficiente que outros retrovírus, uma vez que possui uma enorme variedade de proteínas do envelope. Esta característica permite, também, que o HIV não seja reconhecido pelo sistema imunitário.

O mecanismo de integração do genoma viral no cromossoma do hospedeiro ocorre de tal forma que é possível a produção de novos vírus com sequências celulares. Tal facto, permite que estes se expressem como oncogenes, para além de se incorporarem no genoma da linha germinal.

5.1.8. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS

Os actuais métodos de combate à doença apontam para o uso de vacinas e fármacos. No entanto, estes promovem apenas a atenuação dos efeitos secundários e não a cura

N O VA S TE C N O L O G I AS T E R A P Ê U T I C A S – A TE R AP I A G É N I C A

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definitiva. Assim sendo, a maioria dos esforços destina-se ao desenvolvimento de estratégias de TG para a inibição do HIV.

5.1.9. ESTRATÉGIAS PARA A TERAPIA GÉNICA ANTI-HIV

A TG para as doenças infecciosas encontra-se direccionada no sentido de bloquear a expressão génica e/ou inibir a função proteica, impedindo a replicação do agente infeccioso. Os meios utilizados para atingir tal objectivo, dividem-se em três categorias:

i. TG baseada nos ácidos nucleicos, incluindo DNA e RNA antisense, aptâmeros de RNA e ribozimas;

ii. Uso de proteínas transdominantes negativas (PTNs) ou anticorpos intracelulares;

iii. Imunoterapia através de vacinas génicas ou linfócitos específicos para cada agente patogénico.

Neste capítulo serão apresentados exemplos das duas primeiras abordagens.

5.1.9.1. TER AP IA GÉNIC A BA SEAD A N OS ÁCIDO S NU CL EICO S

RNA ANT ISE NSE O princípio base do funcionamento do RNA antisense é o bloqueio de regiões-chave do genoma viral. Vários estudos têm demostrado que as regiões com maior actividade anti- viral são as dos genes gag, tat e rev [Rittner and Sczakiel (1991);VandenDriessche et al (1994)]. Como resultado, consegue-se inibir a síntese destas proteínas (proteínas da nucleocápside, Tat e Rev, respectivamente) ao nível da transcrição.

Neste tipo de procedimento, verifica-se que o efeito anti-viral está dependente da intensidade da transcrição do gene antisense, a qual deve ser muito superior aos níveis de expressão do HIV. Assim sendo, o uso de um vector retroviral contendo um promotor forte, como por exemplo o da polIII, precedido do gene antisense de interesse (ambos flanqueados por sequências LTRs), permite aumentar os níveis de expressão do gene terapêutico [Sullenger et al (1991)].

R IBO ZIMAS A acção catalítica do RNA sobre determinadas regiões do genoma viral afecta o ciclo replicativo do HIV, na medida em que são destruídos vários genes. A ribozima do tipo hammerhead encontra-se direccionada para a sequência viral gag [Sarver et al (1990)], reduzindo a quantidade de moléculas completas. Por outro lado, as ribozimas do tipo hairpin inibem eficientemente a replicação do vírus, para além de impedir a integração do RNA viral [Ojwang et al (1992)]. Verificou-se, também, ser possível estabelecer, in vitro, uma protecção permanente da infecção do HIV em células T humanas [Leavitt et al (1994)].

As unidades transcripcionais das ribozimas são bastante pequenas, permitindo não só a incorporação de várias dentro de um só vector, como também a utilização de diferentes tipo de ribozimas. A produção de ribozimas multidireccionadas, torna possível o corte em vários locais com sequências altamente conservadas [Chen et al (1992)].

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No entanto, esta estratégia apresenta certas limitações uma vez que, apesar do corte na cadeia de RNA, a trancriptase reversa consegue sintetizar a molécula de DNA. Para além disso, a elevada frequência de mutações, associadas à replicação do HIV, leva à disrupção da sequência de corte do ribozima, inactivando-o.

AP T ÂMER OS O uso desta estratégia passa pela construção de análogos dos elementos cis-regulatórios TAR e RRE, aos quais se ligam às proteínas transactivadoras Tat e Rev, respectivamente. Desta forma, inibe-se a replicação do vírus, reduzindo a frequência de ligação das proteínas aos elementos regulatórios endógenos e, consequentemente, impedindo a activação da transcrição dos genes. A eficiência deste método foi demonstrada em pacientes em estádios avançados de SIDA [Lisziewicz et al (1995)], uma vez que se conseguiu inibir a replicação do vírus em linfócitos. Tais resultados são bastante promissores, mas persistem algumas incertezas acerca das consequências para o hospedeiro: a introdução de elevadas concentrações deste tipo de moléculas pode afectar o hospedeiro.

5.1.9.2. TER AP IA BASE AD A E M PROT E ÍN A PTNS As PTN mais utilizadas são mutantes das proteínas Rev (RevM10) [Malim et al (1992)] e Tat [Bahner et al (1993)], sendo construídas de forma a inibirem a replicação viral, por sequestro de co-factores necessários à transcrição. Vários estudos realizados permitem demonstrar que a transdução de PTN RevM10 nas células T dificulta a replicação do vírus sem qualquer efeito negativo para o hospedeiro. Como resultado, a célula fica protegida contra o HIV, para além de ser possível reverter infecções crónicas [Ragheb et al (1995)].

O conceito de utilização de um vector retrovírico capaz de expressar os dois tipos de PTN, levou ao desenvolvimento de uma PTN híbrida (Trev). Assim sendo, a Trev, que resulta da fusão de mutantes das proteínas Tat-Rev, inibe simultaneamente dois mecanismos do ciclo replicativo do HIV [Aguilar-Cordova et al (1995)].

PROT EÍNA S DO HOSP ED EIRO MU TA DA S Seguindo o mesmo raciocínio que levou à construção das PTN, foram igualmente desenvolvidos co-factores celulares mutantes. Este método pode ser utilizado na inibição do ciclo replicativo do HIV, uma vez que a proteína Rev interage com o factor de iniciação 5A (eIF-5A) eucariótico [Bevec et al (1996)].

ANT IC ORP OS INT RA CE LU LA RE S São vários os tipos de anticorpos intracelulares que podem ser usados para bloquear a produção de novos vírus. Note-se que a expressão de um anticorpo intracelular específico para os precursores das proteínas do envelope, permite aprisioná-los no retículo endoplasmático inibindo, por exemplo, as reacções de maturação da proteína gp120 (proteína viral que interage com o CD4) [Chen et al (1994)].

Um outro tipo de anticorpos intracelulares utilizados na TG aplicada à SIDA, destina-se a aprisionar a proteína Rev no citoplasma, impedindo a passagem dos RNAs virais através da membrana nuclear [Duan et al (1994)].

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Vários estudos apontam para a possibilidade de construir anticorpos intracelulares específicos para a transcriptase reversa, inactivando-a e tornando as células T resistentes ao HIV [Maciejewski et al (1995)].

TUMORES CEREBRAIS 5.1.10. CARACTERIZAÇÃO

Os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC) encontram-se entre os cancros de mais baixa incidência (1 em cada 10000 pessoas são afectadas), representando um total de 2%. No entanto, nos últimos 40 anos, a sua incidência aumentou cerca de 1/3 nos países desenvolvidos [29].

De acordo com as suas origens, os tumores cerebrais podem ser classificados em dois grandes tipos: primários ou secundários. Estes últimos diferem dos primários por derivarem de outros tumores cuja origem não é o cérebro, mas sim a mama, o cólon, o pâncreas, a língua, a próstata, a bexiga, a pele, o útero ou outros locais e, que devido à sua malignidade acabam por formar metástases no cérebro. Já os tumores primários, apesar de serem menos comuns, podem surgir nas meninges, nas células da glia (tecidos de suporte do cérebro), nas células que se situam no sistema ventricular, ou mais raramente, noutros tecidos, tais como vasos sanguíneos no interior do cérebro. Note-se que os tumores não se desenvolvem a partir dos neurónios, pois as células nervosas adultas já não são capazes de se dividirem.

Figura 5-11 – Regiões do cérebro onde se localizam os principais tipos de tumores

In http://www.methodisthealth.com/cancer/brain.htm.

De entre esta variedade de tumores primários destaca-se, pela sua frequência, os Gliomas, cuja incidência tem vindo a aumentar desde os anos 60 [30]. Estes tumores são classificados de acordo com o tipo de células gliais a partir da qual o neoplasma nasce: astrocitos, oligodendrocitos, células ependimais e células do plexus coróide.

O glioma mais comum é proveniente dos astrocitos, sendo chamado de astrocitoma. Aplica-se o nome de gliobastoma multiforme (GBM) a um astrocitoma que cresce rapidamente e é altamente diferenciado, podendo adquirir uma grande variedade de formas e aparências. Os GBM representam cerca de 50% de todos os astrocitomas e 25% dos tumores cerebrais primários em adultos [30]. A sua natureza maligna é evidenciada pela

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sua curta duração de sintomas, a qual é muitas vezes menor que 6 meses [30]. Este tipo de tumor apresenta como sintomas: dores de cabeça (manifestação inicial comum), devido ao volume ocupado pelo tumor no interior do crânio e, consequentemente, ao aumento da pressão intracranial; inchaço do nervo óptico (cegueira); vómitos; alterações do estado mental; e fraqueza corporal.

5.1.11. ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO ACTUAIS

Os tratamentos tradicionais para qualquer tumor cerebral consistem na remoção cirúrgica de toda ou parte da massa tumoral, radioterapia, quimioterapia e utilização de fármacos capazes de atravessar a Barreira Hemato-Encefálica (BHE). Esta, não estando presente em outros órgãos do corpo, é um sistema de defesa natural do cérebro, que restringe e controla a passagem de substâncias do sangue para o fluído extracelular cerebral, protegendo-o de compostos que possam alterar a sua função.

No entanto, apesar dos avanços destas técnicas nas últimas décadas, os tumores cerebrais e, em particular, os GBM, continuam a possuir um prognóstico sombrio devido a diversos factores [31]. Algumas destas dificuldades prendem-se com problemas operacionais da neurocirurgia, em particular a localização anatómica do tumor (possível inacessibilidade) e a capacidade de uma célula tumoral invadir tecidos cerebrais periféricos, levando ao aparecimento periódico de tumores nas vizinhanças da secção removida. Além disso, durante a migração, estas células tumorais saem temporariamente do ciclo celular, tornando-se resistentes a terapias que têm como alvo células em divisão. Mesmo no interior do tumor, a maioria das células não está em divisão durante um dado tratamento. Outras complicações advêm de danos cerebrais causados pelos procedimentos terapêuticos, a heterogeneidade genética das células tumorais e a impermeabilidade relativa da BHE.

Deste modo, apesar de serem bastante agressivas, as terapias correntes não representam propriamente uma cura, somente uma forma de controlar o rápido crescimento tumoral.

5.1.12. NOVAS ESTRATÉGIAS DE TRATAMENTO: TERAPIA GÉNICA

Apesar da cura ou regressão de gliomas malignos ser pouco provável num futuro próximo, este tipo de tumores cerebrais tem sido alvo de TG com o intuito de aumentar a longevidade dos doentes. Deste modo, a TG ambiciona não só aumentar as terapias cancerígenas tradicionais (ver ponto 5.4.2.), como também permitir a acção de novos tipos de tratamento com maior especificidade.

Assim sendo, os transgenes terapêuticos podem ser utilizados, por exemplo, para: i. Gerar compostos anti-cancerígenos no interior do tumor – activação pró-droga -

, permitindo o aumento da sua concentração intratumoral sem aumentar a sua toxicidade sistémica;

ii. Proteger tecidos normais periféricos ao tumor dos efeitos causados pela quimio e radioterapias;

iii. Permitir a entrega contínua de proteínas de fusão secretadas, que combinam um ligando-alvo com uma toxina/enzima;

iv. Permitir a expressão de proteínas supressoras de tumor ou apoptóticas, de forma a bloquear o crescimento ou causar a morte das células cancerígenas;

v. Inibir a angiogénese;

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vi. Estimular as respostas imunitárias contra antigénios tumorais;

vii. Bloquear a invasão das células tumorais a tecidos normais periféricos.

Note-se que estas potenciais estratégias terapêuticas podem ser aplicadas no tratamento de outros tipos de cancro, não sendo exclusivas dos tumores cerebrais. No entanto, neste trabalho, pretende-se somente abordar alguns destes procedimentos, elucidando, na generalidade, os seus princípios básicos.

Apesar de ser uma limitação prática geral da TG, a dificuldade encontrada na introdução de transgénicos terapêuticos adquire, no caso dos tumores cerebrais, um maior grau de importância. De facto, mesmo em tumores induzidos experimentalmente, é difícil conseguir uma entrega maior que 5% na massa tumoral [31]. Deste modo, é essencial que as células transdutadas sejam capazes de exercer um efeito terapêutico nas células vizinhas não transdutadas – efeito bystander. Estão a ser explorados novos métodos com o objectivo de conseguir aumentar a eficiência da entrega de transgenes nas células tumorais,

Até à data, todos os ensaios clínicos da TG para tumores cerebrais se basearam em estudos de fase I, focando-se na avaliação da toxicidade do tratamento realizado. Ao contrário dos promissores modelos pré-clínicos em roedores, nenhum destes ensaios mostrou uma eficácia notável, apontando para a elevada sensibilidade do cérebro, com consequências de febre, confusão, hemorragia e paralesia [31].

5.1.12.1. ACT IVA ÇÃ O D E PR Ó-DRO GAS Tal como referido em 3.3.1., esta estratégia clássica consiste na produção intratumoral de um fármaco anti-cancerígeno por conversão in situ de uma pró-droga administrada às células tumorais. Este tipo de TG in vivo baseia-se na implantação, por injecção em múltiplas áreas da massa tumoral em crescimento (figura 5-12 (A)), de células produtoras de vectores retrovirais (CPVs), contendo genes activadores.

Esta estratégia terapêutica tem como vantagem o alvo ser células em proliferação (por exemplo, células tumorais). Note-se que as células cerebrais normais encontram-se totalmente diferenciadas, pelo que não são afectadas.

Esta abordagem pode ainda ser utilizada para melhorar a acção da radioterapia, aumentando a sensibilidade dos tumores à radiação. Esta, por sua vez, pode ser usada para induzir a expressão de transgenes via promotores activados por radiação.

Um dos sistemas de activação de pró-droga mais usado, consiste na transferência de um gene do HSV de tipo-1 (codificante de uma timidina cinase (TC) [31]. O HSV-TC confere sensibilidade à pró-droga ganciclovir (GCV), posteriormente administrada, através da sua fosforilação intracelular (figura 5-12 (B) e (C)). Este composto trifosfatado, forma activa da pró-droga, pode ser incorporado no DNA em replicação, inibindo a DNA polimerase e causando a morte celular por terminação prematura da cadeia de DNA. O derivado fosforilado tem a capacidade de se difundir pelas junções gap e levar à morte as células tumorais vizinhas.

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Figura 5-12 - Terapia génica in vivo para o tratamento de tumores cerebrais,

adaptado de Strachan and Read [6].

Outros sistemas activadores de pró-drogas bem caracterizados, são a citosina desaminase de Escherichia coli/5-fluorocitosina (CD/5-FC) e o citocromo P450 2B1/ciclofosfamida (CPA) [31].

5.1.12.2. SUP RESSO RE S DE T UMO R E A POP T OSE O desenvolvimento de tumores malignos está intimamente relacionado com alterações nos genes envolvidos na regulação do ciclo celular - genes supressores de tumor e oncogenes [32].

Entre os vários genes supressores de tumor que conseguem desencadear a apoptose, o gene p53 tem sido o normalmente usado na terapia de tumores cerebrais. O objectivo é restaurar a função da TP53 e, consequentemente, inibir o crescimento tumoral, aumentando as acções de morte celular dos tratamentos tradicionais. Têm ainda sido feitos estudos [32] para inactivar os mecanismos de resistência à apoptose encontrados em algumas células gliomais, através da expressão de mutações dominantes negativas de Ras ou ribozimas contra a sua mensagem, para além da entrega de caspases e do factor α de necrose tumoral (FNTα).

5.1.12.3. ANGIOG ÉNE SE Tal como qualquer tipo de cancro, os tumores cerebrais necessitam da angiogénese para o seu crescimento exacerbado. Um número de factores que medeiam esta neovascularização, incluem angiopoetinas e o factor-1 inducível por hipoxia (que regula o factor de crescimento endotelial vascular (FCEV)) [31]. Os níveis de FCEV correlacionam-se com a progressão do tumor, sendo os níveis mais elevados encontrados nas formas mais malignas.

A TG tem procurado estratégias para bloquear a angiogénese consistem na expressão de agentes anti-angiogénicos, como por exemplo: uma versão negativa dominante do receptor

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FCEV (flk), um FCEV antisense e um antagonista do receptor Tie2. A angiogénese pode ser inibida via factores difusíveis, sendo os maiores desafios na TG a produção contínua ao longo do tempo.

5.1.12.4. MO DIF ICA ÇÃO DA RE SP OST A IMUNITÁ RIA : A falta de respostas imunitárias efectivas contra tumores gliais do cérebro é devida, em parte, ao status imunitário privilegiado do cérebro, conferido pela BHE, e à ausência dos linfócitos convencionais no SNC. Um outro problema encontrado advém das células neoplásticas produzirem factores supressivos imunitários típicos. Além disso, a grande maioria dos antigénios tumorais, seja pertencente ou não ao mesmo tumor, é heterogénica. Deste modo, os mecanismos alternativos tiram partido do facto de existirem linfócitos ou macrófagos no interior de alguns tipos de gliomas.

A imunoterapia pode ser mediada tanto pela injecção de vectores codificantes de citoquinas ou de células produtoras de citoquinas na massa tumoral, como por vacinação periférica de tais vectores ou células combinada com as terapias tradicionais.

5.1.12.5. IMUNOT ER AP IA L IN FÓC IT OS INF IL T RA NT ES TUMOR AIS Esta estratégia utiliza células do sistema imunitário, linfócitos infiltrantes tumorais (LITs), como vectores celulares para transferir directamente proteínas tóxicas para tumores. A população LIT é obtida por remoção de uma porção do tumor, sendo posteriormente, crescida em cultura, onde é geneticamente modificada por inserção de um gene codificante de uma citoquina anti-tumoral, factor α de necrose tumoral (FNTα). Assim, após serem novamente implantadas no tumor, a proteína FNT é expressa, levando à regressão da massa tumoral. Todavia, esta estratégia revelou-se pouco eficiente na transferência génica em LITs humanos.

Figura 5-13 - Modificação genética de uma cultura de linfócitos infiltrantes de tumor [6].

MOD IF IC AÇ ÃO GE NÉT ICA DA S CÉL UL AS TUMORA IS Esta estratégia consiste em imunizar especificamente os pacientes contra os seus

próprios tumores, através da modificação genética das células tumorais com um gene, cujo produto aumenta a reactividade imunitária do hospedeiro para o tumor. Um número de

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citoquinas que tem mostrado eficácia em modelos experimentais de tumores cerebrais incluem [31]:

i. diferentes interleucinas (IL-2, IL-12 e IL-4);

ii. TNFα;

iii. interferão (IFN)-γ;

iv. factor estimulador do crescimento de granulócitos-macrófagos (GM-CSF).

Para além dos genes citoquínicos, também se usam genes HLA não reconhecidos pelo hospedeiro, como por exemplo, os antigénios HLA-B7.

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6. PERSPECTIVAS FUTURAS

A morte do jovem Jesse Gelsinger (ver ponto 2.3) fez com que a imagem da TG, na opinião pública, ficasse danificada. Porém, a investigação continua a progredir, estando os investigadores confiantes de que, no espaço de uma década, a transferência génica seja elevada do seu estatuto experimental actual para uma modalidade terapêutica.

Para que essa transposição seja viável, vários problemas têm que ser ultrapassados, quer a nível tecnológico quer a nível de um maior entendimento sobre o genoma humano.

Um dos maiores desafios da TG é conseguir incorporar o gene desejado no local apropriado nas células apropriadas, minimizando quaisquer reacções adversas.

Muita da investigação tem sido concentrada no desenvolvimento do melhor vector para uma dada aplicação específica. Os sistemas de vectores actualmente utilizados apresentam uma baixa eficácia, fazendo com que os benefícios terapêuticos não sejam significativos. Contudo, têm sido feitos avanços na promoção da estabilidade vectorial, na redução de imunogeneicidade vectorial, na regulação da expressão génica, no desenvolvimento de estratégias de sucesso para direccionamento de vectores, novos sistemas de vectores lentivirais e estratégias de administração sistemática de partículas vectoriais imunogénicas [1].

Novas inovações poderão advir de sistemas híbridos com capacidade para incorporar componentes virais modificados para uma ligação específica e direccionada, a saber: genes imunossupressivos de várias viroses, mecanismos que permitirão a integração localizada específica (sequências de adenovírus associados, integrases retrovirais modificadas), utilização de sequências regulatórias da própria célula-alvo para um controlo fisiológico da expressão dos genes incorporados e cromossomas humanos artificiais (CAH) que comportam grupos inteiros de genes com os seus elementos regulatórios naturais.

A integração de novas abordagens da TG na prática clínica necessita da garantia de recursos adequados, visto ser uma metodologia altamente especializada e cara, necessitando de centros médicos especializados e bem equipados. Requer, igualmente, uma uniformização dos padrões de trabalho.

O alinhamento dos métodos de produção, purificação e armazenamento dos produtos obtidos com a indústria em relação à viabilidade económica do processo, é também um passo importante no futuro da TG.

NECESSIDADE DA TERAPIA GÉNICA GERMINAL

Embora nos dias de hoje a TGG não seja aplicável, devido tanto a questões éticas como a limitações práticas, o seu desenvolvimento será incontornável nos tempos vindouros. O facto desta abordagem ser feita a nível de células germinais garante que uma determinada modificação genómica seja herdada pelas gerações futuras, razão pela qual a sua utilização como meio de tratamento ou de alívio de doenças genéticas hereditárias é apelativa. Todavia, convém realçar que existem outras formas de prevenir doenças genéticas, tais como aconselhamento e/ou testes genéticos, terapia convencional ou somática.

Relativamente ao problema da irreversibilidade da TGG, pode ser possível desenhar a TGS para actuar contra os erros da TGG, assim como utilizar muitas terapias convencionais: radiação, quimioterapia e terapia hormonal [5].

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Será ainda possível minimizar os riscos da TGG para as gerações futuras, através do uso de transgenes que afectem somente o paciente mas não a sua descendência [5]. Poderá ser, também, viável a projecção de transgenes que possam somente ter efeito nas gerações futuras, mediante a toma de uma droga específica, ou seja, sejam apenas “disparados” quando necessários.

Assim sendo, a aplicação da TGG fará sentido quando for mais segura, mais barata, e mais efectiva na prevenção de patologias para o indivíduo e, consequentemente para a sua descendência.

Teoricamente, todos os genes humanos serão mapeados e identificados nas próximas duas décadas, bem como a descrição dos mecanismos genéticos de uma grande parte das doenças. Com isso, será possível tornar a medicina mais preventiva e, tanto o diagnóstico como a terapia serão mais específicos e eficazes, integrando-se no aconselhamento genético dentro do serviço médico. A expectativa é que a metodologia genética venha a ser uma abordagem básica para promover a saúde e controlar as doenças, e a TG, o método universal na prevenção de doenças e no desenvolvimento de tratamentos.

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7. QUESTÕES ÉTICAS, SÓCIO-ECONÓMICAS E FINANCEIRAS DA TERAPIA GÉNICA HUMANA

Nos últimos anos, a terapia génica tem sofrido grandes avanços a nível tecnológico, permitindo assim que esta modalidade terapêutica se torne mais segura. Todavia, à semelhança de outras intervenções biomédicas, apresenta várias questões sociais, éticas e financeiras que dificultam a sua aplicação prática.

QUESTÕES ÉTICAS Várias questões éticas que a TG levanta enquanto método clínico, são paralelas às que qualquer terapia inovadora tem de enfrentar. Entre estas contam-se:

Antecipação de benefícios e riscos;

Estabelecimento de regras para a selecção de pacientes, informação do processo clínico ao paciente e legalização de protocolos;

Necessidade de preservação da privacidade e confidencialidade de pacientes.

No entanto, de acordo com as limitações inerentes a esta tecnologia (ver ponto 3.6), são necessários esforços para garantir a segurança dos pacientes, em especial, possíveis consequências a curto e longo prazo. Como exemplo do primeiro caso, encontramos a morte de Jesse Gelsinger, já referida no ponto 2.3.. Em relação às consequências a longo- prazo, é evidenciado o caso em que duas crianças, que após terem encontrado cura para a doença IDSC, vieram a desenvolver leucemia.

Deste modo, a TG deverá somente ser efectuada quando: i) existe uma hipótese razoável em beneficiar o paciente e ii) ausência de qualquer outro tratamento eficaz.

TER AP IA GÉ NICA SOMÁT ICA VS . TER AP IA GÉ NICA GE RMIN AL Todos os ensaios clínicos correntes envolvem o tratamento de tecidos somáticos – TGS [6]. Esta forma de terapia, em princípio, não levanta um grande número de problemas éticos, visto se restringir somente aos indivíduos que foram submetidos ao tratamento.

Contrariamente, a TGG envolve tratamento a nível de tecidos germinais, afectando permanentemente não só os próprios pacientes, como também, a sua descendência. Isto é, o pool genético humano será permanentemente modificado. Apesar destas alterações genéticas serem benéficas, caso provoque algum efeito adverso (ver ponto 2.5.3), este será perpetuado, atingindo um maior número de pessoas. É essencialmente esta preocupação ética que impossibilita, actualmente, a aplicação prática deste tipo de terapia. Porém, um dos argumentos que é utilizado a favor da TGG incide sobre a maior eficácia de uma única intervenção a nível germinal do que repetidas intervenções geração após geração (TGS) no tratamento de uma doença.

Uma outra pergunta que é geralmente levantada, advém da negação dos direitos dos indivíduos da nova geração a qualquer escolha acerca da alteração da sua constituição genética.

TER AP IA GÉNIC A VS . APE RF EIÇ OAMENT O A tecnologia inerente à TG possibilita igualmente a alteração de caracteres fenotípicos não associados a doenças, como por exemplo, a altura, a cor da pele, a memória e a inteligência de um indivíduo. Este tipo de modificação genética não terapêutica pressupõe o

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aperfeiçoamento de uma variedade de características humanas, originando diversas implicações éticas acerca da sua validade clínica. A TG é moralmente aceite pois segue os objectivos médicos de prevenção e tratamento de doenças. O aperfeiçoamento, pelo contrário, tem pretensões menos aceitáveis e pode ter consequências danosas, em especial, a nível social.

QUESTÕES SÓCIO-ECONÓMICAS Em relação ao uso da TG, tanto a nível clínico como para aperfeiçoamento genético humano, há o receio de que esta manipulação se torne um luxo apenas disponível a indivíduos com poder económico. Este aperfeiçoamento pode também originar novas definições de “normal”, com consequente exclusão de indivíduos que não possuam as características ditas normais, como por exemplo indivíduos de inteligência média.

Outra questão social abordada é a associação, muitas vezes feita, entre a manipulação genética e o conceito de eugenia ou o melhoramento de qualidades genéticas através de reprodução selectiva.

QUESTÕES FINANCEIRAS Assim como noutros campos da medicina moderna, a TG tem sido perturbada por conflitos de interesse entre muitos dos principais investigadores. Interesses financeiros de investigadores clínicos em empresas farmacêuticas ou biotecnológicas são correctamente entendidos pelo público como incompatíveis com a experimentação ética e responsável em pacientes. Sendo assim, é necessária a ausência de relações financeiras pessoais, de qualquer magnitude, entre investigadores e empresas que poderão beneficiar com resultados provenientes dos ensaios clínicos.

Relativamente à aplicação de investimentos, dada a complexidade da TG, em termos de objectivos e aplicações práticas, o seu progresso encontra-se dependente, entre muitos aspectos, de avultados investimentos. Todavia, este aspecto não representa verdadeiramente uma limitação, pois as potencialidades desta modalidade terapêutica conseguem, por si só, despertar o interesse de eventuais investidores.

Deste modo, as questões financeiras parecem surgir das preocupações éticas e sociais que rodeiam a TG, para além das limitações tecnológicas inerentes.

Assim sendo, as questões que se colocam perante os investidores são:

1. Investir até que ponto?

2. Mesmo que se invista, qual a garantia de recuperação do investimento?

Entre os factores que mais importância têm na resposta a estas perguntas, contam-se a imagem que a opinião pública tem sobre este tipo de terapia e o estabelecimento e aprovação de protocolos clínicos por entidades reguladoras adequadas, tais como a FDA, NIH, a Organização Mundial de Saúde (OMS) e Comunidade Europeia (CE).

Resumindo, assim como aconteceu no passado com outros campos da medicina, a combinação apropriada de rigor científico, critério clínico e ética profissional fará com que a terapia génica avance de modo seguro e se estabeleça como uma ferramenta terapêutica.

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Cada vez mais me surpreendo com o imenso mundo desconhecido da Biologia . Me apaixono
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