Viabilidade espermatica de semen ovino, Pesquisas de Medicina. Universidade não é definido
daian_heydt
daian_heydt27 de Abril de 2016

Viabilidade espermatica de semen ovino, Pesquisas de Medicina. Universidade não é definido

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Efeito de diferentes diluentes sobre a viabilidade espermática do sêmen

ovino mantido a 5°C por até 72 horas.

Heydt, D. R.; Cesca, S.; Tomasini, L.; Bragança, J. F. R.; Bennemann, P. E.

Universidade Do Oeste De Santa Catarina – UNOESC - Xanxerê-SC

RESUMO

A ovinocultura é uma importante fonte de subsistência, através do leite e da

carne para o consumo, de lã e pele para os vestuários. Desta forma, algumas técnicas

estão sendo desenvolvidas para aumentar os índices produtivos e reprodutivos, dentre

elas, esta a inseminação artificial (IA). Para que isso ocorra existe a necessidade de um

sêmen de boa qualidade e que esteja viável no momento da inseminação. Este estudo

utilizou dois tipos de diluentes, o Dilutris (T1) e Tris Salomon (T2) para conservação a

5°C por até 72 horas. Foi observado que T1 teve uma motilidade espermática e

integridade da membrana superior ao T2 nas 72 horas de armazenamento a 5°C.

INTRODUÇÃO

A ovinocultura sempre foi para a humanidade uma importante fonte de

subsistência, no fornecimento de leite e carne para a alimentação e de lã e pele para o

vestuário.

No Brasil, a ovinocultura está presente em todas as regiões e em grande difusão,

sendo que para isso, o manejo reprodutivo é importante para o bom desenvolvimento

dessa atividade.

Algumas biotecnologias vem sendo desenvolvidas visando o aumento dos

índices produtivos e reprodutivos da espécie ovina e, consequentemente, a sua

rentabilidade. Dentre estas podemos citar a criopreservação de sêmen e a inseminação

artificial (IA) (SIMPLICIO et al., 2007).

O uso de sêmen congelado na ovinocultura ainda apresenta resultados

insatisfatórios, tendo como principal agravante a dificuldade de transpor a cérvix devido

a sua anatomia. Dessa forma, é necessário o uso de laparoscopia para a deposição do

sêmen no interior do útero, tornando o procedimento laborioso (BICUDO et al. 2005).

Para simplificar o processo de IA, o método mais difundido é através da utilização do

sêmen fresco diluído. Atualmente a manutenção do gameta masculino em estado

refrigerado a 5º C surge como uma opção para a difusão da biotécnica da IA.

O sêmen refrigerado a 5ºC apresenta fertilidade mais elevada após a IA em

comparação ao sêmen congelado, pois mantém a viabilidade espermática por mais

tempo, sem que aconteça uma redução na capacidade fertilizante dos espermatozoides

devido às crioinjúrias.

Segundo Roca et. al. (2000), o uso do sêmen resfriado para IA, depende da

habilidade do diluidor em promover um ambiente propício para o espermatozoide

durante sua conservação, para que a viabilidade espermática seja prolongada. Isso

mostra a importância do uso de diluentes como suporte energético e proteção contra o

resfriamento. Para que isso ocorra, estes devem conter substâncias tamponantes como o

Fosfato de Sódio, Citrato de Sódio e TRIS (Tris-hidroximetil-aminometano), uma fonte

energética como glicose ou frutose, bem como crioprotetores internos e externos,

podendo ser glicerol e gema de ovo respectivamente (SILVA, 2001).

Diante deste contexto surge a necessidade do aperfeiçoamento dos processos de

tecnologia do sêmen, principalmente, quanto ao uso de diluentes, assim como avaliar as

alterações espermáticas após a diluição e a refrigeração. Por estes motivos, esta pesquisa

tem como objetivo avaliar a viabilidade do sêmen ovino refrigerado a 5º C, diluído em

TRIS-Gema e um diluente comercial por um período de até 72 horas.

MATERIAL E MÉTODOS

Como doadores de sêmen, foram utilizados 5 carneiros da raça Texel, com idade

de 1 a 3 anos, submetidos previamente a um exame andrológico. Os animais estavam no

Setor de Ovinocultura da Universidade do Oeste de Santa Catarina – Campus Xanxerê,

localizada no Município de Xanxerê (SC). Os cinco carneiros foram avaliados em

processados em split sample em pool de sêmen, sendo este fracionado em dois

tratamentos. O Sêmen diluído em diluente comercial Dilutris (Minitub) (T1) e Sêmen

diluído em diluente TRIS-Salomon (T2).

Os carneiros foram mantidos em um regime de uma coleta semanal, sendo

realizadas 10 coletas de cada carneiro. Foi utilizados somente ejaculados que atenderem

a um padrão mínimo de volume de 0,7 ml, 70% de motilidade, vigor 3, turbilhão 3 e

80% de espermatozoides normais.

O sêmen foi obtido através da técnica de colheita com vagina artificial. Os

ejaculados ovinos foram avaliados individualmente quanto ao turbilhão, motilidade,

vigor e morfologia espermática, sendo após processados em pool de sêmen (3

carneiros). Os carneiros foram submetidos a um regime de uma coleta semanal.

Imediatamente após a colheita as amostras foram colocadas em banho-maria a

34°C e avaliadas conforme os critérios:

 Volume: O volume foi mensurado através de um copo de coleta

graduado.

 Turbilhão: Uma gota de sêmen puro foi colocada, por meio de uma

pipeta Pasteur, sobre lâmina aquecida a 34°C e observada em microscopia de campo

claro a 40 aumentos. Os resultados foram expressos de acordo com a escala de

valorização de 0 a 5, segundo EVANS e MAXWELL (1987).

 Motilidade espermática: Em um frasco eppendorf foi adicionada uma

amostra de 50 microlitros de sêmen puro. Nesta amostra foi adicionado 500 microlitros

de solução salina previamente aquecida a 34 0 C. A seguir uma gota deste

homogeneizado foi colocada entre lâmina e lamínula aquecidas a 34°C, para avaliação

em microscopia de campo claro em 100 aumentos. Foram avaliados três campos, sendo

o resultado expresso em percentual de espermatozoides móveis.

 Vigor: Simultaneamente à determinação da motilidade foi avaliado o

vigor espermático, sendo o resultado expresso em escala de 0 a 5 conforme

CHEMINEAU e COGNIÉ (1991).

 Concentração espermática: Do pool de sêmen puro foi retirada uma

alíquota de 20 microlitros que foi adicionada a um frasco eppendorf contendo 7.980

microlitros de solução de formol citrato 2,94%, perfazendo uma diluição de 1:400. Após

homogeneização, uma alíquota de 30 microlitros foi depositada em cada lado da

Câmara de Neubauer (hemocitométrica) sendo realizada a determinação da

concentração espermática através da contagem dos espermatozoides em microscópio de

campo claro.

 Morfologia espermática: Imediatamente após a homogeneização dos

ejaculados, foi colhida uma alíquota de 50 microlitros que foi depositado em um frasco

eppendorf contendo 500 microlitros de solução de formol citrato 2,9% previamente

aquecido a 34 o C. Para a preparação das lâminas foi colocada uma gota do sêmen

conservado na solução formol-citrato entre lâmina e lamínula e foram contadas 200

células por lâmina em microscópio de contraste de fase (1000 X).

Imediatamente após a homogeneização dos ejaculados realizou-se a coloração

supra vital onde que foi colhida uma alíquota de 20 microlitros que foi depositado em

um frasco eppendorf. A esta amostra de sêmen in natura foi adicionado 20 microlitros

do corante Eosina Amarela 2%, sendo a amostra homogeneizada por 30 segundos. Após

este período foi adicionado ao frasco ependorff 20 microlitros de Negrosina 10% e

aguardado o período de 30 segundos. Foi realizado um esfregaço em lâmina de vidro

para avaliação em microscopia de campo claro em 1.000 aumentos. Foram contados 200

espermatozoides, os quais forma classificados em vivos (não corados) e mortos

(corados). O resultado foi expresso em percentual de espermatozoides vivos.

Foram testados os diluentes TRIS-Salomon e DILUTRIS. Os diluentes foram

preparados 30 minutos antes do início das coletas, sendo mantidos em banho-maria a

34°C até o momento da diluição.

Após a avaliação seminal começou-se o processo de refrigeração do sêmen,

onde, foi realizado o pool de sêmen e diluição do mesmo. Foi colocado em tubos de

ensaio tampados e logo após em um recipiente, contendo água a 34°C. Este conjunto foi

levado ao refrigerador, sendo acompanhado a queda da temperatura por um dataloger

até a temperatura de 5°C. A refrigeração para atingir 5°C foi feita gradualmente em 2

horas, correspondendo à diminuição progressiva de 0,3 a 0,5 °C/min.

A motilidade e vigor espermático foram avaliadas após a diluição, após o

resfriamento a 5°C, 12, 24, 36, 48,60 e 72 horas de armazenamento a 5°C. A morfologia

espermática e a coloração Supra Vital foi realizada nos tempos zero (sêmen puro), 24,

48 e 72 horas de armazenamento a 5°C.

O pool de sêmen foi utilizado como unidade experimental. Dessa forma o efeito

variação de machos foi controlado. Foram realizadas análises de medidas repetidas

comparando o efeito do diluente sobre os parâmetros de qualidade espermática. As

variáveis motilidade, morfologia espermática e percentual de espermatozoides vivos

foram avaliadas através da análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste

de Tukey-Kramer do pacote estatístico SAS. A variável vigor espermático foi

comparada através do teste de chi-quadrado.

RESULTADOS

O volume médio do pool de ejaculados foi de 2,94±0,13 ml, o turbilhão foi

4,35±0,11, o vigor médio foi de 4,4±0,11.

No sêmen diluído a média da motilidade espermática ao longo do período de 72

horas foi 73,68%±1,21 (média ± erro padrão) para o T1 e 64,37±1,21 para T2.

Os dados de motilidade e viabilidade espermática no sêmen ovino armazenado

por até 72 horas são apresentados na tabela 1.

Tabela 1. Motilidade e viabilidade espermática no sêmen ovino armazenado a

temperatura de 5°C por um período de até 72 horas de acordo com o tratamento

aplicado.

T1- diluente Dilutris, T2- diluente TRIS Salomon. Média±Desvio Padrão. Letras

diferentes no mesmo tempo de armazenamento diferem para um nível de significância

de 5%.

Nos valores de motilidade observou-se diferença significativa a partir de 24

horas de armazenamento. A analise dos dados obtidos com a coloração supravital

mostrou que a integridade da membrana do espermatozoide foi semelhante ao

percentual de espermatozoides moveis.

O vigor espermático e o percentual de células anormais armazenados á 5°C por

72 horas estão apresentados na tabela 2.

Tabela 2. Vigor espermático e percentual de células anormais no sêmen ovino

armazenado a temperatura de 5°C por um período de até 72 horas de acordo com o

tratamento aplicado.

Tratamento Tempo (h) Vigor (n±DP) Morfologia (%±DP)

1 0 4,00 12,46±1,23ª

2 3,95±0,12 14,00±1,24ª

1 24 3,55±0,11 16,00±2,19ª

2 3,25±0,12 11,60±1,72 b

1 48 3,15±0,08 a 18,53±1,99ª

2 2,85±0,11 b 11,20±1,26

b

1 72 2,90±0,07 a 16,86±2,52ª

2 2,55±0,15 b 11,80±1,28ª

T1- diluente Dilutris, T2- diluente TRIS Salomon. Média±Desvio Padrão. Letras

diferentes no mesmo tempo de armazenamento diferem para um nível de significância

de 5%.

Quando avaliado o vigor espermático, foi observada diferença significativa a

partir de 48 horas armazenamento entre os dois tratamentos, sendo favorável ao T1

(P<0,05).

Tratamento Tempo (h) Motilidade (%±DP) Supravital (%±DP)

1 0 83,25±0,75 a 76,86±1,38

2 79,75±0,93 a 73,87±2,11

1 24 76,25±1,01 a 71,87±1,77

2 69,00±1,87 b 67,33±1,72

1 48 71,75±1,78 a 65,33±1,97

2 58,25±2,30 b 62,00±2,00

1 72 63,50±1,92 a 61,20±2,52

2 50,50±2,92 b 56,60±2,91

A morfologia espermática não diferiu entre os tratamentos nos períodos 0 e 72

horas. Porém quando avaliado o período 24 e 48 horas foi observada diferença entre os

tratamentos (P<0,05).

DISCUSSÃO

De acordo com McKINNON (1996), quando as células espermáticas são

mantidas a 5ºC ocorre uma redução no metabolismo para valores de até 10%, quando

comparado com o das células mantidas à temperatura de 37ºC. Em consequência, a

peroxidação será mais lenta e a produção de catabólitos são menores, de modo que o

desgaste da célula não ocorra tão rápido. Porém, essas diferenças não se limitaram

apenas à curva de resfriamento, mas também ao diluente utilizado.

Observou-se os espermatozoides com maior vigor e motilidade no período 0, 24,

48 e 72 horas diluídos no T1 (Dilutris) comparado com o T2 (Tris-Salomon),

demonstrando que a composição dos mesmos pode ter interferido na manutenção da

motilidade e vigor espermáticos.

De acordo com Moscardini et al. (2014), a motilidade espermática apresentou

valores inferiores a 40% quando o sêmen foi armazenado a 5°C por até 72 horas. Este

dado difere dos resultados encontrados no presente estudo onde, no T1 foi observada

uma motilidade de 63,5% até 72 horas de armazenamento. Da mesma forma Milczewski

et al. (2000) avaliando o sêmen de ovino após 8 horas de armazenamento a 5°C

observou uma motilidade espermática de 42,17%. Este fato demonstra que o T1 foi

capaz de manter a viabilidade espermática por um período superior ao relatado pela

literatura, uma vez que este manteve uma motilidade espermática de 63,5% e

integridade de membrana de 61,2%.

Quando os dados são comparados até o período de 48 horas a motilidade e o

vigor espermático foram semelhantes aos observados por Sousa et al. (2010) o qual

obsevou uma motilidade de 68,33% e o vigor de 3,3.

CONCLUSÃO

Nas condições em que foi realizado o presente estudo, é possível concluir que o

sêmen ovino diluído em Dilutris ®

e armazenado a 5°C mantém os parâmetros mínimos

de motilidade espermática, vigor e integridade de membrana por até 72 horas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BICUDO,S.D. et al. Aspectos peculiares da inseminação artificial em ovinos. Acta

Scientiae Veterinariae. 33 (Supl 1): 127-130. 2005.

CHEMINEAU, P.; COGNIÉ, Y. Training manual on artificial insemination in sheep

and goats. Rome : FAO, p. 222, 1991.

EVANS, G.; MAXWELL, W. M. C. Salamon's Artificial Insemination of Sheep and

Goats. Sydney : Butterworths, 1987.

ROCA, J. et al. Viability and fertility af rabbit spermatozoa diluted in Tris-buffer

extenders and stored at 15ºC. Animal Reproduction Science, v.64, p.103-112, 2000.

MILCZEWSKI, V.; KOZICKI, L. E.; Neves, J.P. viabilidade do semen ovino

refrigerado em diferentes diluentes. Archives of veterinary Science, v.5, p29-33,

2000.

MOSCARDINI, M. M. et al. Viabilidad de espermatozoides ovniso mantenidos a 5°

y 15 °C en diferentes sistemas de refrigeración. R. bras. Ci. Vet., v. 21, n. 2, p. 122-

126, abr./jun. 2014

SILVA, L.D.M. Avanços da inseminação artificial na espécie canina. Revista

Brasileira de Reprodução Animal, v.25, p.107-111, 2001.

SIMPLÍCIO, A.A; FREITAS, V.J.F; FONSECA, J.F. Biotécnicas da reprodução

como técnicas de manejo reprodutivo em ovinos. Revista Brasileira Reprodução

Animal, Belo Horizonte, v.31, n.2, p.234-246, abr./jun. 2007.

SOUSA, B.P.A. et al. Viabilidade in vitro de células espermáticas de ovinas

submetidas a diferentes diluentes e a refrigeração. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.

v.62, n.3, p 528-535, 2010.

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