Biohemija vezbe - Mokracna kiselina, Vežbe' predlog Biologija
antenym
antenym

Biohemija vezbe - Mokracna kiselina, Vežbe' predlog Biologija

5 str.
6broj poseta
Opis
Mokarcna kiselina mokarcna kiselina mokarcna kiselina medicinska biohemija
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 5
ovo je samo pregled
3 prikazano na 5 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 5 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 5 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 5 str.
Vezba 9-2013 - Mokracna kis

Vežbe iz medicinske biohemije

1

Mokraćna kiselina

Mokraćna kiselina je krajnji produkt razgradnje purina i spada u neproteinska azotna jedinjenja. Purini potiču od razgradnje nukleinskih kiselina unetih hranom, a jedan manji deo (oko jedne četvrtine) je poreklom iz endogenih nukleinskih kiselina. Oko 75% ukupne količine mokraćne kiseline se eliminiše putem bubrega, a ostatak gastrointestinalnim traktom. Izlučivanje putem bubrega je kompleksan proces i odvija se u sledećim fazama: filtracija u glomerulima, gotovo potpuna (98-100%) reapsorpcija u proksimalnim tubulima, naknadna sekrecija u distalnom delu proksimalnih tubula i dalja reapsorpcija u distalnim tubulima. Na ovaj način se izluči 6-12% neto količine mokraćne kiseline koja je filtrirana u glomerulima.

Pri fiziološkom pH plazme mokraćna kiselina je pretežno u jonizovanom obliku (jonizovan je atom azota u položaju 9), uglavnom kao mono-natrijum urat, koji je rastvorljiviji od slobodne mokraćne kiseline. Na koncentraciju mokraćne kiseline u krvi utiču tri važna faktora: endogena sinteza i razgradnja purinskih derivata, unošenje purina hranom i izlučivanje putem bubrega. Pored ovoga, važan je uticaj genetskih faktora, zatim uticaj pola i starosti. Muškarci imaju više koncentracije od žena (estrogen povećava ekskreciju mokraćne kiseline), ali se kod žena posle menopauze vrednosti mokraćne kiseline povećavaju i postaju gotovo iste kao kod muškaraca.

Koncentracija mokraćne kiseline se određuje kod pacijenata sa gihtom, za praćenje pacijenata sa renalnim oboljenjima i za praćenje efekata terapije pacijenata sa leukemijom.

Hiperurikemija je stanje kod koga je koncentracija mokraćne kiseline kod muškaraca veća od 420 µmol/L, odnosno kod žena veća od 360 µmol/L. Zbog slabe rastvorljivosti mokraćne kiseline, svako povećanje njene koncentracije u krvi i telesnim tečnostima dovodi do taloženja slobodne mokraćne kiseline ili njenih soli u zglobovima (urički artritis) i bubrezima (urički bubreg), ili do obrazovanja kamenaca u bubrezima ili mokraćnim putevima.

Kristali mokraćne kiseline u sinovijalnoj tećnosti poreklom su od mono-natrijum urata dok su oni iz bubrežnih kamenaca najčešće sastavljeni iz mokraćne kiseline. Kod uričkog artritisa urati se talože u tečnosti u zglobovima, ali i u mekim tkivima koja okružuju zglobove. Dokazana je korelacija između koncentracija mokraćne kiseline u serumu i sinovijalnoj tečnosti kod pacijenata sa artritisom.

Renalna bolest kao posledica hiperurikemije može da ima nekoliko oblika: urička nefropatija sa taloženjem urata u renalnom parenhimu, akutno intratubularno taloženje kristala urata i urička nefrolitijaza (urolitijaza). Odnos koncentracija mokraćne kiseline i kreatinina u urinu je veći od 1 kod osoba sa akutnim oštećenjem bubrega usled hiperurikemije (urički bubreg), a manji od 1 ako je akutno oštećenje bubrega posledica nekih drugih poremećaja.

Kod pacijenata sa hroničnom mijeloidnom leukemijom neophodno je pratiti koncentraciju mokraćne kiseline tokom terapije. Usled povećanog broja leukocita i njihove ubrzane razgradnje (kao odgovor na citostatsku terapiju) povećana je koncentracija mokraćne kiseline što može da dovede do nefropatije i posledične azotemije i oštećenja bubrega. Zbog toga je kod ovih pacijenata osim koncentracije mokraćne kiseline potrebno pratiti i koncentracije ureje i kreatinina.

Odnos koncentracija mokraćne kiseline i kreatinina u prvom jutarnjem uzorku urina se koristi kao skrining test za Lesh-Nyhan-ov sindrom, koji se karakteriše potpunim nedostatkom aktivnosti enzima hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (HGPRT). Ovaj odnos se prati i u 24-časovnom uzorku urina odraslih osoba sa gihtom za detekciju delimične deficijencije HGPRT.

Vežbe iz medicinske biohemije

2

Metode za određivanje koncentracije mokraćne kiseline

Redukcione metode. Mokraćna kiselina ima sposobnost da u alkalnoj sredini redukuje fosfovolframovu kiselinu do jedinjenja plave boje, čiji sastav nije tačno poznat (verovatno je smeša oksida IV- i V-valentnog volframa).

Nedostatak ove metode je što mnoge endogene supstance (glukoza, askorbinska kiselina, glutation, cistein) i egzogene supstance (acetilsalicilna kiselina, acetaminofen, kofein, teobromin, teofilin) mogu da redukuju fosfolframovu kiselinu i daju lažno povišene vrednosti. Proteini prisutni u plazmi takođe pozitivno interferiraju jer izazivaju turbiditet. Zbog toga je prilikom određivanja koncentracije mokraćne kiseline ovom metodom potrebno izvršiti deproteinizaciju (dijalizom ili taloženjem sa trihlorsirćetnom kiselinom, volframovom kiselinom ili samom fosfovolframovom kiselinom).

Enzimske metode. Sve enzimske metode se zasnivaju na reakciji u kojoj urikaza katalizuje oksidaciju mokraćne kiseline do alantoina, pri čemu nastaju još vodonik peroksid i ugljendioksid:

222 urikaza

22 OCOHalantoinO2HOkiselinamokr. ++ →++

Nastali ugljendioksid u alkalnoj sredini prelazi u bikarbonat, što sprečava nastajanje mehurića koji bi mogli da ometaju spektrofotometrijsko merenje. Kod enzimskih metoda nije neophodno uklanjanje proteina, a pozitivno interferiraju samo jedinjenja koja su strukturno slična mokraćnoj kiselini (guanin, ksantin), ali je njihova koncentracija u serumu jako mala.

Koncentracija mokraćne kiseline se može odrediti direktno ili preko nastalog vodonik-peroksida, odnosno utrošenog kiseonika.

Direktno određivanje mokraćne kiseline podrazumeva merenje apsorbancije na 290-293 nm, pre i posle delovanja urikaze. Na ovoj talasnoj dužini apsorbuje samo mokraćna kiselina ali ne i nastali alantoin. Direktno merenje apsorbancije na ovoj talasnoj dužini otežava činjenica da je osnovna apsorbancija seruma vrlo visoka, te je neophodno da se paralelno radi slepa proba analize.

Određivanje mokraćne kiseline preko vodonik-peroksida podrazumeva da se nastali vodonik- peroksid dalje uključuje u reakciju koju katalizuje peroksidaza, pri čemu se odgovarajući hromogen prevodi iz leuko u oksidovani (obojen) oblik.

Kao hromogeni se mogu koristiti o-dianizidin, odnosno 4-amino-fenazon (4-aminoantipirin) i 2,4- dihlorfenol (Trinderova reakcija), koji oksidacijom daju crveno obojene hinonimine čija se apsorbancija meri na 500-550 nm. Vodonik-peroksid može da se odredi i preko formaldehida koji nastaje u reakciji sa metanolom, uz katalitičko delovanje katalaze (Kageyama reakcija). Formaldehid zatim reaguje sa acetil-acetonom i amonijakom (Hantzsch-ova kondenzacija), stvarajući žuto obojeni supstituisani lutidin (3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidin), čija se apsorbancija meri na 410 nm.

Vežbe iz medicinske biohemije

3

U prisustvu katalaze vodonik-peroksid oksiduje etanol, a nastali acetaldehid se određuje dalje enzimski, uz pomoć aldehid-dehidrogenaze (optički test):

++ ++ →+

+ →+

HNADHCOOHCHNADCHOCH

OH2CHOCHOHCHCHOH

3 ADH

3

223 katalaza

2322

Određivanje koncentracije nastalog vodonik-peroksida u prisustvu katalaze uz nadovezivanje indikatorske reakcije sa NAD+/NADH sistemom je preporučeno od strane IFCC-a kao metoda izbora za rutinsku upotrebu zato što je dovoljno precizna, tačna i može se lako automatizovati.

Polarografsko određivanje mokraćne kiseline zasniva se na merenju količine utrošenog kiseonika u reakciji koju katalizuje urikaza. Ova metoda nema široku primenu, a u njoj pozitivno interferiraju alopurinol, ksantin i hipoksantin. Koncentracija mokraćne kiseline se takođe može odrediti merenjem ukupne količine redukujućih supstanci koje nastaju tokom kulometrijsketitracije jodom pre i posle reakcije sa urikazom. Kao i polarografsko, tako i kulometrijsko određivanje nema široku primenu.

Kod pacijenata sa gihtom na terapiji alopurinolom, prilikom određivanja koncentracije mokraćne kiseline metodama sa urikazom moguće je dobiti lažno niže rezultate. Alopurinol je kompetitivni inhibitor ksantin-oksidaze što dovodi do povećanja koncentracije ksantina, koji zatim ihnibira aktivnost urikaze.

HPLC metode za određivanje koncentracije mokraćne kiseline se zasnivaju na UV-detekciji nakon hromatografije na reverznoj fazi, odnosno na elektrohemijskoj detekciji posle hromatografije na jono-izmenjivačkoj stacionarnoj fazi. Zbog visoke tačnosti, osetljivosti i preciznosti i malih varijacije u rezultatima ova metoda je predložena za referentnu metodu, ali se za referentnu metodu smatra izotopska dilucija-MS.

Koncentracija mokraćne kiseline se može određivati u serumu ili plazmi (ne preporučuje se primena EDTA i NaF, jer dovode do pozitivne interferencije). Plazma mora odmah da se odvoji od eritrocita, jer stajanjem plazme koja je u kontaktu sa eritrocitima može da dođe do razlaganja mokraćne kiseline. Kod seruma koji stoji sa koagulumom nema promene u koncentraciji mokraćne kiseline, jer je mala površina kontakta između seruma i eritrocita. Mokraćna kiselina je stabilna 3-5

dana na 2-8°C i najmanje 6 meseci na -20°C.

Za određivanje koncentracije mokraćne kiseline u urinu treba koristiti 24-časovni uzorak. Za prikupljanje ovog uzorka u bocu treba dodati 10 mL NaOH (1,25 mol/L) da bi se sprečila precipitacija urata. Bakterije koje su prisutne u urinu mogu da razgrade mokraćnu kiselinu, pa dodavanje timola ili

Vežbe iz medicinske biohemije

4

fluorida može da poveća stabilnost. Pošto je koncentracija mokraćne kiseline u urinu mnogo viša nego u serumu, uzorak urina se mora razblažiti 10 puta.

Referentne vrednosti

Serum ili plazma:

Muškarci: 215-420 µmol/L

Žene: 150-360 µmol/L

Urin: 1,5 – 4,5 mmol/24 h

Vežbe iz medicinske biohemije

5

Eksperimentalni rad:

Određivanje koncentracije mokraćne kiseline u serumu

Princip metode

Katalitičkim dejstvom urikaze, mokraćna kiselina se oksiduje do alantoina uz nastajanje vodonik-

peroksida. Vodonok-peroksid se zatim uključuje u reakciju sa 4-aminoantipirinom i dihloro-fenil-

sulfonaton (DCFS) koju katalizuje peroksidaza. Boja nastalog hinonimina je proporcionalna

koncentraciji mokraćne kiseline.

Radni reagens

Fosfatni pufer pH 7,8 100 mmol/L

peroksidaza > 1 kU/L

urikaza 120 U/L

DCFS 4 mmol/L

4-aminoantipirin 0,5 mmol/L

Standardni rastvor

Standard mokraćne kiseline 357 µmol/L

Kao uzorak koristiti serum.

Analitički postupak

Pipetirati u epruvete AA AST ASP

Uzorak 25 µL - -

Standard - 25 µL -

Destilovana voda - - 25 µL

Radni reagens 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Sadržaj epruveta dobro promešati, pa inkubirati 5 minuta na 37˚C, a zatim izmeriti apsorbancije

analize i standarda prema slepoj probi reagensa na 520 nm.

Izračunavanje

St St

A A CA

A C ⋅=

nema postavljenih komentara
ovo je samo pregled
3 prikazano na 5 str.