Dna modificirajući enzimi (poglavlje 4, stranice 55. 60.), Skripte od Biologija životne sredine

Preuzmite Dna modificirajući enzimi (poglavlje 4, stranice 55. 60.) i više Skripte u PDF od Biologija životne sredine samo na Docsity! 4.2.DNA modificirajući enzimi Restrikcijski enzimi (opisani ranije) i DNA ligaze (odlomak 3.) omogućuju rezanje i povezivanje (spajanje) funkcija koje su prijeko potrebne za proizvodnju rekombinantnih DNA molekula. Ostali enzimi korišteni u genetičkom inženjeringu mogu se slobodno nazvati DNA modificirajućim enzimima, pod uvjetom da njihovo korištenje uključuje degradaciju (propadanje), sintezu i izmjene DNA. Neki od najčešće korištenih enzima su opisani u daljnjem tekstu. 4.2.1. Nukleaze Osim restrikcijskih endonukleaza, postoji još nekoliko drugih vrsta nukleaznih enzima koji su važni u manipulaciji DNA. Nukleazni enzimi razgrađuju (degradiraju) nukleinske kiseline kidanjem fosfodiesterskih veza koje drže nukleotide zajedno. Restrikcijski enzimi su dobri primjeri endonukleaza, koje režu unutrašnjost DNA uzvojnice. Druga skupina nukleaza, koje degradiraju (razgrađuju) DNA na ( krajevima molekule, poznate su kao egzonukleaze. Osim restrikcijskih enzima, postoje četiri korisne nukleaze koje su često korištene u genetičkom inženjerstvu. To su Bal 31 i egzonukleaza III (egzonukleaze), i deoksiribonukleaze I (DNaza I) i S1-nukleaza (endonukleaze). Ovi enzimi se razlikuju u svom preciznom načinu djelovanja i omogućuju genetičko inženjerstvo s različitim strategijama za napad DNA. Njihove značajke su navedene na slici 4.5. Pored DNA – specifičnih nukleaza, postoje ribonukleaze (RNaze), koje djeluju na RNA. Mogu biti potrebne za mnoge korake u pripremi i analizi rekombinanata i obično se koriste za uklanjanje (oslobađanje) od neželjenih RNA u pripremi. Međutim, isto tako kao korisne, ribonukleaze mogu stvarati neke neželjene Način djelovanja različitih nukleaza. (a) Nukleaza Bal 31 je kompleks enzima. Njegova primarna djelatnost je brzo djelovanje 3' egzonukleaze, koja je po – vezana sa sporo – djelujućom endonukleazom. Visoke koncentracije nukleaze Bal 31 učinko – vito djeluju na način da skraćuju DNA molekule na oba kraja. (b) Egzonukleaza III je 3' egzonukleaza koja stvara molekule s istaknutim (stršećim) 5' krajevima. (c) DNaza I reže ili jednolančane ili dvo – lančane DNA uglavnom na slučajnim mjestima. (d) Nukleaza S1 je specifična za jednolančane RNA ili DNA. Izmijenjeno od Brown (1990), Gene Cloning, Chapman i Hall; i Williams i Patient (1988),Genetic Engineering, IRL Press. Reproducirano s dopuštenjem. Slika. 4.5. 4.5. probleme. One se znatno teško inaktiviraju i mogu biti skrivene u znoju. Dakle, zagađenost (kontaminacija) RNazama može biti problem za (u) pripremu rekombinantne DNA, posebno tamo gdje je cDNA pripremljena iz mRNA kalupa. U tom slučaju je važno izbjeći zagađenje RNazama, što je moguće ako se nose rukavice i pobrine se da je sva staklena i plastična oprema tretirana kako bi se izbjeglo zagađenje RNazama. Nisu sve nukleaze korisne! Ribonukleaze mogu biti problem kada se radi s pročišćenim preparatima RNA, i mora se biti na oprezu kako bi se uklonila Ili onesposobila aktivnost RNaze. 4.2.2. Polimeraze Polimerazni enzimi sintetiziraju kopije molekula nukleinskih kiselina i koriste se u mnogim postupcima genetičkog inženjerstva. Kod opisivanja polimeraznih enzima, pojmovi „DNA – ovisna“ i „RNA – ovisna“ mogu se koristiti za označavanje vrste kalupa nukleinskih kiselina koji enzim koristi. Stoga, DNA – ovisna DNA polimeraza kopira DNA u DNA, RNA – ovisna DNA polimeraza kopira RNA u DNA, a DNA- ovisna RNA polimeraza prepisuje DNA u RNA. Ovi enzimi sintetiziraju nukleinske kiseline spajajući zajedno nukleotide čije su baze komplementarne s bazama kalupa lanca. Sinteza se odvija u 5' → 3' smjeru, dok svaki slijedeći dodani nukleotid treba slobodnu 3' OH skupinu za stvaranje (formiranje) fosfodiesterske veze. Ovaj uvjet svakako znači da je kratka dvolančana regija s izloženom 3' OH skupinom (početnica) nužna za početak sinteze. Enzim DNA polimeraza I ima, pored svoje polimerazne funkcije, 5'→3' i 3'→5' egzonukleaznu aktivnost. Enzim katalizira reakciju produljivanja lanca, gdje 5'→3' egzonukleazna funkcija degradira (razgrađuje) kodirajući lanac, dok polimeraza sintetizira novu kopiju. Glavna uloga ovih enzima je u „nick“ translacijskom postupku za radioaktivno označavanje DNA (navedeno u točki 3.4.3). 5'→3' egzonukleazno djelovanje DNA polimaraze I može biti uklonjena cijepanjem, koje se odvija djelovanjem enzima koji je poznat kao Klenowljev fragment. Kao takav zadržava polimeraznu i 3'→5' egzonukleaznu aktivnost. Klenowljev fragment se koristi tamo gdje jednolančana DNA molekula treba biti kopirana; jer 5'→3' egzonukleazno djelovanje nedostaje, enzim ne može razgraditi (degradirati) kodirajući (netranskribirani) lanac dvolančane DNA tijekom sinteze nove DNA. 3'→5' egzonukleazna aktivnost je potisnuta pod normalnim uvjetima koji se korišteni u reakciji. Glavne upotrebe Klenowljevog fragmenta uključuju radioaktivno obilježavanje primarnom sintezom i DNA sekvenciranje pomoću Sangerove (dideoksi) metode (pogledati odjeljke 3.4.4 i 3.7.4), pored toga i kopiranje jednolančanih DNA molekula tijekom proizvodnje rekombinanata.