M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb
tena_zovko
tena_zovko28 October 2017

M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb

PDF (5 MB)
48 str.
5broj preuzimanja
146broj poseta
100%od1broj ocena
1broj komentara
Opis
Molekularna biologija, 3. poglavlje, osnove molekularne biologija
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 48

ovo je samo pregled

3 prikazano na 48 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 48 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 48 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 48 str.

preuzmi dokument
03-pogl.indd

Poglavlje 3 Os no ve mo le ku lar ne bio lo gi je

Naslje|ivanje, geni i DNA 89

Ekspresija geneti~ke informacije 96

Rekombinantna DNA 104

Detekcija nukleinskih kiselina i proteina 117

Funkcija eukariotskih gena 123

KLJU^NI POKUS: Pretpostavka DNA provirusa 102

MOLEKULARNA MEDICINA: HIV i AIDS 105

S UVREMENA MOLEKULARNA BIOLOGIJA te ̀ i ra zum je ti me ha niz me od go vor ne za nas lje |i va nje i ek spre si ju ge ne ti~ ke in for ma ci je ko ja od re |u je struk tu- ru i fun kci ju sta ni ce. Kao {to je pri ka za no u pr vom pog lav lju, sve sta ni ce

di je le od re |e na os nov na svoj stva, a to te melj no je din stvo sta ni~ ne bio lo gi je po- se bi ce je vid lji vo na mo le ku lar noj ra zi ni. Pos to ja nje te melj no ga sta ni~ nog je din- stva omo gu }i lo je znan stve ni ci ma da iza be ru jed nos tav ni je or ga niz me, prim je ri- ce bak te ri je, kao mo del za pro vo |e nje mno gih fun da men tal nih ek spe ri me na ta u o~e ki va nju da }e mo le ku lar ni me ha niz mi i u or ga niz mima me|usobno raz li ~i- tim po put ~o vje ka i E. co li bi ti sli~ ni. Broj ni ek spe ri men ti pot vr di li su to~ no st te pret pos tav ke i da nas je jas no da je mo le ku lar na bio lo gi ja sta ni ce je din stve ni put ra zu mi je va nja raz no li kih oblika sta ni~ no ga po na {a nja.

Po ~et ni nap re dak u mo le ku lar noj bio lo gi ji pos tig nut je ko ri{ te njem pred no- sti br zog ras ta i jed nos tav ne ge ne ti ke bak te ri ja po put E. co li i nje zi nih vi ru sa. Raz voj re kom bi nan tne DNA teh no lo gi je, ko ji je us li je dio, omo gu }io je da se osnov ni prin ci pi i ek spe ri men tal ni pris tu pi raz vi je ni u pro ka rio ti ma pro {i re i na eu ka riot ske sta ni ce. Pos lje di ce raz vo ja re kom bi nan tne DNA teh no lo gi je su go le- me. U ra nim je fa za ma re kom bi nan tna DNA teh no lo gi ja omo gu }i la izo la ci ju i ka rak te ri za ci ju po je di nih ge na, a od ne dav no i od re |i va nje cje lo kup nih re dos li- je da nuk leo ti da u ge no mi ma slo ̀ e nih or ga niz ma po put bi lja ka i ̀ i vo ti nja, uk lju- ~uju}i i ~ov je ka.

Nas lje |i va nje, ge ni i DNA Mo gu} no st rep ro duk ci je te melj no je svoj stvo svih `i vih bi }a. Svi or ga niz mi ge- ne ti~ ku in for ma ci ju, ko ja od re |u je nji ho vu struk tu ru i fun kci ju, nas lje |u ju od svo jih ro di te lja. Is to ta ko, sve sta ni ce nas ta ju iz pret hod no pos to je }ih sta ni ca, i nu` no je da se ge ne ti~ ki ma te ri jal um no ̀ i i po di je li pri sva koj pod je li sta ni ce. Na ~in na ko ji se ge ne ti~ ka in for ma ci ja ud vos tru ~u je i pre no si sa sta ni ce na sta ni- cu, ili s or ga niz ma na or ga ni zam, sre di{ nje je pi ta nje bio lo gi je. Pre poz na va nje mo le ku le DNA kao no si te lja ge ne ti~ ke in for ma ci je i ot kri va nje me ha ni za ma nje- zi na pri je no sa stvo ri lo je te melj na {em da na{ njem ra zu mi je va nju bio lo gi je na mo le ku lar noj ra zi ni.

90 Poglavlje 3

Slika 3-1 Naslje|ivanje dominan- tnih i recesivnih gena. YY

YY

yy

yy

Y

Y Y

y

y y

roditeljski sojevi

Svaki roditeljski soj gra{ka sadr`ava po dvije ko- pije (alela) gena koji odre|uje boju sjemenke (npr. `uta (Y) ili zelena (y) boja sjemenke).

Roditelji stvaraju spolne stanice (gamete) od kojih svaka sadr`ava po jednu kopiju gena (ili po jedan alel odre|enoga gena). Dvije se gamete spajaju u novi organizam koji ~ini hibridno F1 potomstvo.

Budu}i da je Y dominantan alel, sve F1 biljke imat }e `ute sjemenke.

Kri`anjem dviju biljaka F1 generacije nastaje F2 generacija s karakteristi~nim 3 : 1 omjerom dominantnoga (`uto) i recesivnoga (zeleno) fenotipa.

gamete

gamete

F1 generacija

F2 generacija

Yy

YyYy

Ge ni i kro mo so mi Te melj ne prin ci pe ge ne ti ke pos ta vio je Gre gor Men del 1865. go di ne na osno vi po ku sa kri ̀ a nja gra{ ka. Is pi ti va njem nas lje |i va nja ne ko li ko dob ro de fi ni ra nih svoj sta va kao {to je prim je ri ce bo ja sje men ke, Men del je us pio ra zum je ti os nov ne prin ci pe nji ho va pri je no sa. Pret pos ta vio je da je sva ko svoj stvo od re |e no pa rom nas ljed nih ele me na ta ko je da nas zo ve mo ge ni- ma, i na taj je na ~in us pio ob jas ni ti sve re zul ta te do bi ve ne kri ̀ a njem. Po jed na ko pi ja ge na za sva ko svoj stvo (na zi va mo je alel) nas lje |u je se od sva- kog ro di te lja. Prim je ri ce, kri ̀ a nje dvi ju sor ti gra{ ka, jed ne sa `u tim, a dru- ge sa ze le nim sje men ka ma, da je po tom stvo pri ka za no na sli ci 3-1. Sva ka ro- di telj ska sor ta ima po dvi je iden ti~ ne ko pi je ge na ko ji od re |u je `u tu (Y – en gl. yel low) ili ze le nu (y) bo ju sje men ke. Bilj ke nas ta le kri ̀ a njem su hib ri- di ko ji su nas li je di li po jed nu ko pi ju ge na ko ji od re |u je `u tu (Y) i jed nu ko- pi ju ge na ko ji od re |u je ze le nu (y) bo ju sje men ke. Sve bilj ke po tom ci pri ka- za no ga kri ̀ a nja (pr va fi li jal na ili F1 ge ne ra ci ja) ima ju `u te sje men ke, sto ga ka ̀ e mo da je gen ko ji od re |u je `u tu bo ju sje men ki (Y) do mi nan tan, a gen ko ji od re |u je ze le nu bo ju sje men ki (y) re ce si van. Ge no tip (ge ne ti~ ki usroj) bi lja ka F1 ge ne ra ci je je sto ga Yy, a nji hov fe no tip (fi zi~ ki iz gled) je `u ta bo ja sje men ki. Kri ̀ a mo li me |u sob no dva po tom ka F1 ge ne ra ci je do bi va mo F2 ge ne ra ci ju u ko joj se ale li za `u tu i ze le nu bo ju sje men ke raz dva ja ju (seg re- gi ra ju) ta ko da je om jer bi lja ka F2 ge ne ra ci je sa `u tim i ze le nim sje men ka- ma 3 : 1.

Men de lo vo ot kri }e, ko je je o~i to bi lo is pred svog vre me na, ug lav nom je za pos tav lja no do 1900. go di ne ka d su Men de lo vi za ko ni nas lje |i va nja po- no vo ot kri ve ni te je ko na~ no spoz na ta nji ho va va` no st. Ub r zo na kon to ga pred lo ̀ e no je da su kro mo so mi no si te lji ge na. Uo ~e no je da je ve }i na sta ni- ca vi {ih bi lja ka i `i vo ti nja dip loid na, tj. da ima po dvi je ko pi je sva koga kro- mo so ma. Iz nim ka su spol ne sta ni ce (sper mi ji i jaj ne sta ni ce) ko je nas ta ju po seb nim ti pom dio be ko ji na zi va mo me jo za, a u ko joj se sa mo po je dan ~lan kro mo som skoga pa ra pre no si na sva ku no vo nas ta lu sta ni cu (sli ka 3-2).

Osnove molekularne biologije 91

mu{ki roditelj

spermij

embrio

jajna stanica

diploidan

haploidan

`enski roditelj

mejoza

oplodnja

diploidan

Diploidna stanica sadr`ava po dvije kopije svakoga kromosoma (homologni kromosomi jednoga kromosomskoga para)

Mejozom nastaju haploidne gamete koje imaju samo po jedan kromosom svakoga para.

Oplodnjom nastaje diploidni embrio koji ima kromosome obaju roditelja (po dva kromosoma svakoga para).

Slika 3-2. Kromosomi u mejozi i oplodnja. Prikazana su dva para kromosoma hipo- te ti~kog organizma.

Pos lje di~ no, sper mi ji i jaj ne sta ni ce su hap loid ne i imaju sa mo po jed nu ko- pi ju sva kog kro mo so ma. Sje di nje nje dvi ju tak vih hap loid nih sta ni ca pri oplod nji stva ra no vi dip loid ni or ga ni zam u ko jem je dan kro mo som sva ko- ga pa ra pot je ~e od mu{ ko ga, a dru gi od `en sko ga ro di te lja. Po na {a nje pa ro- va kro mo so ma ti je kom me jo ze sto ga os li ka va po na {a nje ale la ti je kom seg re- ga ci je, {to je re zul ti ra lo pret pos tav kom da su kro mo so mi no si te lji ge na.

Os no ve mu ta ci ja, po ve za nos ti ge na, i od no sa iz me |u ge na i kro mo so ma ve li kim su di je lom raz ja{ nje ne i po ku si ma pro ve de nim na vinskoj mu {i ci, Dro sop hi la me la no gas ter. Vinsku je mu {i cu mo gu }e jed nos tav no uz ga ja ti u la bo ra to rij skim uv je ti ma na od go va ra ju }im pod lo ga ma, a raz mno ̀ a va se prib li` no sva ka dva tjed na {to je zna ~aj na pred no st za ge ne ti~ ka is pi ti va- nja. Zbog tih je svoj sta va Dro sop hi la i da lje vr lo po pu la ran or ga ni zam za ge- ne ti~ ka is pi ti va nja na `i vo ti nja ma, po se bi ce u pod ru~ ju ge ne ti ke raz vo ja i di fe ren ci ja ci je.

Po ~et kom 20. sto lje }a ot kri ven je ve lik broj ge ne ti~ kih prom je na (mu ta ci- ja) kod vinske mu {i ce ko je su ug lav nom po ga |a le la ko uo~ lji va svoj stva po- put bo je o~i ju i ob li ka kri la. Po ku si kri ̀ a nja po ka za li su da se ne ki od ge na ko ji od re |u ju ta svoj stva nas lje |u ju neo vis no je dan o dru gom {to je upu }i- va lo na to da se na la ze na raz li ~i tim kro mo so mi ma ko ji se neo vis no raz dva- ja ju ti je kom me jo ze (sli ka 3-3). U is to vri je me, ne ki su se dru gi ge ni ~es to nas lje |i va li za jed no. U tom slu ~a ju go vo ri mo o ve za nim ge ni ma, a po ve zu- je ih smje{ taj na is tom kro mo so mu. Broj sku pi na ve za nih ge na jed nak je bro ju kro mo so ma ne kog or ga niz ma (~e ti ri kod vinske mu{ice) {to je do da- tno pod r ̀ a lo pret pos tav ku da su kro mo so mi no si te lji ge na. Do 1915. go di- ne go to vo je sto ti nu ge na iden ti fi ci ra no i kar ti ra no na ~e ti ri kro mo so ma vinske mu {i ce {to je do ve lo do op }eg prih va }a nja kro mo so ma kao no si te lja nas lje |i va nja.

Geni i en zi mi Rana ge ne ti~ ka is tra ̀ i va nja bi la su us mje re na na iden ti fi ka ci ju i kar ti ra nje ge na ko ji od re |u ju la ko uo~ lji va svoj stva po put bo je o~i ju vinske mu {i ce, no na ~in na ko ji ti ge ni od re |u ju fe no tip ni je bio poz nat. Pr ve spoz na je o

92 Poglavlje 3

roditeljski soj

gamete

gamete

(A) Razdvajanje dvaju hipoteti~kih gena smje{tena na dvama razli~itim kromosomima (A/a = ~etvrtast/okrugao i B/b = crveno/plavo)

Budu}i da se oba gena nalaze na istom kromosomu, tijekom mejoze ne dolazi do njihova me|usobnog razdvajanja, ve} oni zajedno odlaze u istu gametu s kromosomom koji ih nosi pa F1 generacija stvara samo dva razli~ita tipa gameta.

(B) Vezanost dvaju gena smje{tenih na istom kromosomu

aa BB

Aa bb

AA bb

Aa BB

Aa BB

aa bb

AA BB

AA BB

aB

Ab

AB

AB AB

Ab

AB

ab ab

aa Bb

aa Bb

Aa Bb

Aa Bb

Aa Bb

Aa Bb

Aa Bb

Aa Bb

AA Bb

AA Bb

A

B

B

a

B

A

B

a

b

b b

A b

a

F1 generacija

roditeljski soj

gamete

A

B

A a a

B

B

b b

A a

F1 generacija

aB

gamete

aa bb

ab ab

B

A

b

a

b

Aa bb

F2 generacija

Budu}i da se kromosomi neovisno razdvajaju tijekom mejoze, F1 generacija stvara ~etiri razli~ita tipa gameta.

Stoga F2 generacija dolazi

fenotipa: ~etvrtast crveni, ~etvrtast plavi, okrugli crveni i okrugli plavi, u omjeru 9 : 3 : 3 : 1.

Stoga F2 generacija dolazi u samo dva fenotipa: ~etvrtasti crveni i okrugli plavi, u omjeru 3 : 1 koji je svojstven naslje|ivanju samo jednoga gena.

F2 generacija

Slika 3-3. Razdvajanje (segregacija) i vezanost gena. (A) Razdvajanje dvaju hipoteti~kih ge na za oblik (A/a = ~etvrtast/okrugao) i bo ju (B/b = crveno/plavo) smje{tenih na razli~itim kromosomima. (B) Na slje- |ivanje gena smje{tenih na istom kro- mosomu (vezani geni).

ve zi iz me |u ge na i en zi ma po ja vi le su se 1909. go di ne, kad je uo ~e no da je nas ljed na bo le st fe nil ke to nu ri ja (vi di: Mo le ku lar na me di ci na u 2. pog la vlju) pos lje di ca ge ne ti~ ko ga po re me }a ja u me ta bo liz mu ami no ki se li ne fe ni la la- nina. Pret pos tav lje no je da je taj po re me }aj pos lje di ca ne dos tat ka en zi ma ko ji ka ta li zi ra od go va ra ju }e me ta bo li~ ke reak ci je, {to je po tak lo for mu li ra- nje ge ne ral ne hi po te ze da ge ni od re |u ju sin te zu en zi ma.

Jas ni ji do kaz po ve za nos ti ge na sa sin te zom en zi ma proi zi {ao je iz ek spe- ri men ta ko ji su 1941. go di ne na glji vi ci Neu ros po ra cras sa pro ve li Geor ge Bead le i Ed va rd Ta tum. U la bo ra to ri ju Neu ros po ra mo ̀ e bi ti uz ga ja na na mi-

Osnove molekularne biologije 93

ni mal nom ili bo ga tom me di ju sli~ nim oni ma opi sa nim u 1. pog lav lju za uz- goj E. co li. Za glji vi cu Neu ros po ra cras sa mi ni mal ni se me dij sas to ji sa mo od so li, glu ko ze i bio ti na. Bo ga ti me dij obo ga }en je ami no ki se li na ma, vi ta mi ni- ma, pu ri ni ma i pi ri mi di ni ma. Bead le i Ta tum izo li ra li su mu tan te ove glji vi- ce ko je nor mal no ras tu na bo ga tom me di ju, no ne mo gu ras ti na mi ni mal- nom me di ju. Ot kri li su da je sva koj mu tan ti za ra st pot re ban spe ci fi ~an preh ram be ni na dom jes tak, prim je ri ce od re |e na ami no ki se li na. [to vi {e, po- tre ba za od re |e nim preh ram be nim na dom jes tkom bi la je u ko re la ci ji s ne- mo gu} no{ }u sin te ze te is te mo le ku le. Na os no vi ovih pro mat ra nja Bead le i Ta tum su zak lju ~i li da sva ka mu ta ci ja re zul ti ra ne dos tat kom od re |e no ga me ta bo li~ ko ga pu ta. Ka ko je bi lo poz na to da me ta bo li~ kim pu to vi ma upra- vlja ju en zi mi, iz ek spe ri me na ta na glji vi ci Neu ros po ra cras sa proi zi {ao je za- klju ~ak da sva ki gen od re |u je struk tu ru jed nog en zi ma, tj. hi po te za je dan gen – je dan en zim. Da nas zna mo da se mno gi en zi mi sas to je od vi {e po li- pep ti da, pa je tre nut no prih va }en ob lik ove hi po te ze da sva ki gen od re |u- je struk tu ru jed no ga po li pep tid nog lan ca.

Molekula DNA no si telj je ge ne ti~ ke in for ma ci je Ra zu mi je va nje kro mo som ske os no ve nas lje |i va nja i od no sa iz me |u ge na i en zi ma ni je sa mo po se bi pru ̀ i lo mo le ku lar no ob ja{ nje nje ge na. Kro mo so- mi sad r ̀ avaju i pro tei ne i DNA, i pr vot no se mis li lo da su ge ni pro tei ni. Prvi do ka zi ko ji su vo di li pre ma sup rot noj ide ji da je mo le ku la DNA no si- telj ge ne ti~ ke in for ma ci je do{ li su iz ek spe ri me na ta pro ve de nih na bak te ri- ja ma. Ti ek spe ri men ti pred stav lja ju pro to tip suv re me nog pris tu pa od re |i- va nju ulo ge ge na uno {e njem no vih mo le ku la DNA u sta ni cu, {to }e bi ti ob ja{ nje no kas ni je u ovom pog lav lju.

Ulo ga mo le ku le DNA ot kri ve na je iz re zul ta ta ek spe ri me na ta pro ve de- nih na bak te ri ji ko ja uz ro ku je upa lu plu }a (Pneu mo coc cus). Vi ru len tni so je vi ove bak te ri je ok ru ̀ e ni su kap su lom iz gra |e nom od po li sa ha ri da ko ja {ti ti bak te ri je od na pa da imu no sus ta va do ma }i na. Bu du }i da kap su la bak te rij- skim ko lo ni ja ma da je glat ki iz gled u kul tu ri, soj bak te ri ja ko ji proiz vo di kap su lu oz na ~u je mo sa S (en gl.smoo th). Mu ti ra ni so je vi ko ji su iz gu bi li spo- sob no st stva ra nja kap su le (oz na ~e ni sa R, en gl. rou gh) tvo re ko lo ni je s hra- pa vim ru bom te ni su le tal ni ako nji ma za ra zi mo mi {a. Go di ne 1928. uo ~e no je da mi{ in fi ci ran smje som `ivu}ih hra pa vih (R) bak te ri ja i top li nom ubi je- nih glat kih (S) bak te ri ja raz vi ja upa lu plu }a i ub r zo umi re. Bak te ri je ko je su za tim izo li ra ne iz tak vog mi {a bi le su ti pa S. Kas ni ji su ek spe ri men ti po ka za- li da su ek strak ti bak te rij skih kul tu ra tipa S u ko ji ma ni je bi lo ~i ta vih bak te- rij skih sta ni ca ta ko |er u sta nju pre ves ti (tran sfor mi ra ti) bak te ri je tipa R u ob lik S. Zak lju ~e no je da je ne ka tvar u ek strak tu bak te ri ja tipa S (naz va na tran sfor mi ra ju }i prin cip) od go vor na za ge ne ti~ ku tran sfor ma ci ju R ob li ka u S ob lik bak te ri je.

Godine 1944. Oswa ld Ave ry, Co lin Mac Leod i Mac lyn McCar ty izo li ra li su DNA iz bak te rij skih ek stra ka ta i poka za li da en zi mi ko ji raz gra |u ju DNA uni{ ta va ju spo sob no st tran sfor ma ci je, dok en zi mi ko ji raz gra |u ju pro- tei ne ne ma ju ta kav u~i nak (sli ka 3-4). Na taj su na ~in do ka za li da je trans for- mi ra ju }i prin cip zap ra vo mo le ku la DNA. Ipak, tek }e ek spe ri men ti pro ve de- ni ti je kom slje de }ih ne ko li ko go di na na bak te rij skim vi ru si ma re zul ti ra ti prih va }a njem DNA kao geneti~kog ma te ri ja la. Nai me, kad bak te rij ski vi rus in fi ci ra sta ni cu, DNA vi ru sa, a ne nje go vi pro tei ni, mo ra u}i u sta ni cu ka ko bi omo gu }i la um na ̀ a nje vi ru sa. [to vi {e, DNA ro di telj skog vi ru sa (a ne nje- go vi pro tei ni) pre no si se na no vo nas ta le ~es ti ce vi ru sa. Us kla |e no st tih re- zul ta ta s nas tav kom is pi ti va nja ak tiv nos ti DNA u tran sfor ma ci ji bak te ri ja do ve la je do ko na~ nog prih va }a nja ide je da je DNA geneti~ki ma te ri jal.

94 Poglavlje 3

patogena S bakterija

S bakterija

pro~istititi DNA

kapsula

dodati pro~i{}enu DNA tipa S bakterijama tipa R

nepatogena R bakterija

DNA

Slika 3-4. Prijenos geneti~ke informacije s pomo}u DNA. DNA je izolirana iz patogenog tipa bakterije Pneumococcus koji je okru`en kapsulom i tvori glatke kolonije (S, engl. smooth). Dodatak DNA pro~i{}ene iz S tipa u kulturu nepatogenih bakterija koje ne tvoje kapsulu (R, engl.rough) dovodi do stvaranja S kolonija. Zaklju~ak je da pro~i{}ena DNA sadr`ava geneti~ku informaciju odgovornu za transformaciju tipa R u tip S bakterija.

Struktura DNA Poz na va nje tro di men zio nal ne struk tu re DNA ko ju su 1953. go di ne ot kri li Ja mes Wat son i Fran cis Cri ck te melj je suv re me ne mo le ku lar ne bio lo gi je. U vri je me kad su Wat son i Cri ck ra di li na struk tu ri DNA bi lo je poz na to da je DNA po li mer ko ji se sas to ji od ~e ti ri ti pa du {i ko vih ba za, dva pu ri na (ade- nin ¢A£ i gva nin ¢G£) i dva pi ri mi di na (ci to zin ¢C£ i ti min ¢T£), ve za nih za fos fo ri li ra ne {e }e re. S ob zi rom na sre di{ nju ulo gu DNA kao gen eti~kog ma- te ri ja la, ob ja{ nje nje nje zi ne tro di men zio nal ne struk tu re bi lo je kri ti~ no za ra zu mi je va nje nje zi ne fun kci je. Wat sonov i Cric kov pog led na taj prob lem bio je pod zna ~aj nim ut je ca jem Li nus Pau lin go va ob ja{ nje nja vo di ko ve ve- ze i a-uzvojnice, ~es tog ob li ka se kun dar ne struk tu re pro tei na (vi di 2. po- glav lje). Ek spe ri men tal ni po dat ci o struk tu ri DNA proi zi{ li su iz kris ta lo- graf skih is pi ti va nja Mau ri cea Wil kin sa i Ro sa li nd Fran klin. Ana li za tih po da ta ka ot kri la je da je mo le ku la DNA uz voj ni ca ko ja ~i ni za vo je od 3,4 nm. Po dat ci su po ka za li i da je raz mak iz me |u sus jed nih ba za 0,34 nm, sto- ga se je dan za voj uz voj ni ce sas to ji od 10 pa ro va ba za. Va` no je ot kri }e bi lo da je prom jer uz voj ni ce prib li` no 2 nm, {to je upu }i va lo na to da se mo le ku- la DNA sas to ji od dva ju, a ne od jed no ga lan ca DNA.

Na os no vi ovih po da ta ka Wat son i Cri ck su iz gra di li svoj mo del mo le ku- le DNA (sli ka 3-5). Os nov na svoj stva mo de la jesu da je DNA dvos tru ka uz- voj ni ca sa {e }er no-fos fat nom okos ni com na vanj skoj stra ni mo le ku le. Ba ze

Osnove molekularne biologije 95

3,4 nm

0,34 nm

2 nm

5' 3'

5'3'

G

AT

T A

G

A T

A T

T A

G

C

C

C

A T

T A

G C

A T

T A

G

A

G

C

C

G C

C

C

O

O

C

CGN

C

N

C C

C N

N

N H

N

N

N

H

H

CH3

H

CH H

C

C

C

O

O

C

CAN

N

C C

T N

N

NH

N

N

H

H

CH H

C

H

H

C H

H

3' kraj 5' kraj

3' kraj

5' kraj

O

O

O

–O P

O

C C{e}er

CC

HOH

CH2

O

O

–O

O

O

O

–O P

O

C C{e}er

CC

H

CH2 CH2

CH2

O

O

–O

Baze na suprotnim lancima povezuju se vodikovim vezama izme|u adenina (A) i timina (T), te izme|u gvanina (G) i citozina (C). Dva lanca u molekuli DNA su antiparalelni (usmjereni su u suprotnim smjerovima odre|enim slobodnim 5' odnosno 3' skupinama deoksiriboze).

DNA je dvostruka uzvojnica s bazama na unutarnjoj i {e}erno-fosfatnom okosnicom na vanjskoj strani molekule.

{e}er

{e}er CC

CC

O

H

CC

CC

O

Slika 3-5. Struktura molekule DNA.

su smje{ te ne u unut ra{ njos ti mo le ku le i ori jen ti ra ne ta ko da se vo di ko ve ve ze stva ra ju iz me |u na sup rot nih pu ri na i pi ri mi di na. Spa ri va nje ba za vrlo je spe ci fi~ no: A se uvi jek spa ru je s T, a G s C. Ova spe ci fi~ no st ob ja{ nja va ra ni ji re zul tat Erwi na Char gaf fa ko ji je ana li zi rao sas tav ba za u raz li ~i tim mo le ku la ma DNA i ut vr dio da je ko li ~i na ade ni na uvi jek jed na ka ko li ~i ni ti mi na, a ko li ~i na gva ni na jed na ka ko li ~i ni ci to zi na. Zbog spe ci fi~ nog su spa ri va nja ba za dva lan ca mo le ku le DNA kom ple men tar na i sva ki la nac sad r ̀ ava cje lo kup nu in for ma ci ju pot reb nu za od re |i va nje sli je da ba za u dru gom lan cu.

Replikacija DNA Ot kri }e kom ple men tar nog spa ri va nja ba za iz me |u dvaju lana ca u mo le-

ku li DNA da lo je od go vor na pi ta nje ka ko ge ne ti~ ki ma te ri jal mo ̀ e up ra- vlja ti svo jom vlas ti tom rep li ka ci jom, pro ce som ko ji se mo ra do go di ti pri sva koj dio bi sta ni ca. Pred lo ̀ e no je da se dva lanca DNA mo gu raz dvo ji ti i slu ̀ i ti kao ka lup za sin te zu no vo ga kom ple men tar nog lan ca ~i ji bi sli jed bio od re |en spe ci fi~ nim spa ri va njem ba za (sli ka 3-6). Ovaj pro ces na zi va-

96 Poglavlje 3

5'

stari lanac DNA

novi lanac DNA

G

AT

T A

G

A T

A T

T A

G

C

C

C

G

G

C

C

G C

3'

5' 3'

AT

A T

A T

T A

G C

T

T

G C

G

AT

G

C

C

C

5'

5' 3'

AT

A T

A T

T A

G C

T

C

A

A

T

G

G

C

G

AT

G

C

C

G

3'

C

T

G

A

Slika 3-6. Semikonzervativna replikacija DNA. Dva se lanca roditeljske DNA razdvajaju i svaki od njih slu`i kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj na~in nastaju dvije nove, potpuno identi~ne molekule DNA. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNA odre|en je komplementarnim sparivanjem baza.

mo semi kon zer va tiv nom rep li ka ci jom jer je u sva koj no vo nas ta loj mo le ku- li DNA sa ~u van po je dan sta ri la nac ro di telj ske DNA.

Iz rav nu pod r {ku mo de lu se mi kon zer va tiv ne rep li ka ci je DNA pru ̀ io je ele gan tni ek spe ri me nt ko ji su 1958. go di ne pro ve li Mat thew Mes sel son i Fra nk Sta hl obi lje ̀ iv {i DNA izo to pi ma ko ji su pro mi je ni li nje zi nu gus to }u (sli ka 3-7). E. co li je pr vo uz ga ja na u me di ju ko ji je sad r ̀ avao te{ ki izo top du {i ka (15N) um jes to nor mal no ga du {i ka (14N). DNA tih bak te ri ja um jes to nor mal no ga du {i ka 14N sad r ̀ ava la je te{ ki izo top 15N, te je sto ga bi la gu{ }a od DNA bak te ri ja uz ga ja nih u nor mal nom me di ju. Tak vu te{ ku DNA (15N) bi lo je mo gu }e raz dvo ji ti od nor mal ne DNA (14N) rav no te` nim cen tri fu gi ra- njem u gra di jen tu CsCl, {to je omo gu }i lo prou ~a va nje pro ce sa sin te ze DNA. E. co li ko ja je ras la u 15N me di ju pre ne se na je u nor mal ni me dij te joj je omo gu }e no da se po di je li jo{ jed nom. DNA bak te ri ja do bi ve nih dio bom je izo li ra na i ana li zi ra na cen tri fu gi ra njem u gra di jen tu gus to }e CsCl. Re zul- tat ove ana li ze po ka zao je da je sva te{ ka DNA za mi je nje na no vo sin te ti zi ra- nim mo le ku la ma DNA ~i ja je gus to }a iz me |u gus to }e te{ kih (15N) i la kih (14N) mo le ku la DNA. Ta kav re zul tat ob ja{ njen je mo de lom u ko jem ti je kom rep li ka ci je do la zi do raz dva ja nja dva ju te{ kih ro di telj skih la na ca DNA od ko jih sva ki slu ̀ i kao ka lup za sin te zu po jed no ga no vog la ko ga lan ca DNA. Re zul tat su mo le ku le DNA od ko jih sva ka sad r ̀ ava po je dan la ki i je dan te{ ki la nac te je nji ho va gus to }a iz me |u gus to }e te{ ke i la ke mo le ku le DNA. Ovaj ek spe ri me nt pru ̀ io je iz rav ni do kaz za se mi kon zer va tiv nu rep li ka ci- ju DNA i jas no nag la sio va` no st kom ple men tar nog spa ri va nja ba za iz me- |u dva ju la na ca DNA u dvos tru koj uz voj ni ci.

Spo sob no st DNA da slu ̀ i kao ka lup za vlas ti tu sin te zu do dat no je pot vr- |e na kad je ut vr |e no da en zim izo li ran iz E. co li (DNA-po li me ra za) mo ̀ e ka ta li zi ra ti rep li ka ci ju DNA in vit ro. U pri sut nos ti lan ca DNA ko ji slu ̀ i kao ka lup, DNA-po li me ra za mog la je ka ta li zi ra ti ug rad nju nuk leo ti da u kom- ple men tar ni la nac DNA.

Ek spre si ja ge ne ti~ ke in for ma ci je Ge ni dje lu ju ta ko da od re |u ju struk tu ru pro tei na ko ji su od go vor ni za funk- cio ni ra nje sta ni ce na mo le ku lar noj ra zi ni. Iden ti fi ka ci ja DNA kao ge ne ti- ~kog ma te ri ja la i raz ja{ nje nje nje zi ne struk tu re ot kri lo je da ge ne ti~ ka in for-

Osnove molekularne biologije 97

Slika 3-7. Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNA. Bakterije uzgajane u mediju ko ji je sa- dr`avao normalni izotop du {ika (14N) prenesene su u me dij koji sadr`ava te{ki izotop du{ika (15N) te su tu uzgajane tijekom nekoliko generacija. Zatim su prenesene ponovo u medij s 14N du {ikom i uzgajane tijekom jedne dodatne generacije. DNA izolirana iz tih bakterija analizirana je ravnote`nim ultracentri fugiranjem u otopini CsCl. Izlo`en ve likom gravitacijskom polju CsCl se dimentira i tvori gradijent gusto}e, a molekule DNA tvore vrpcu na polo`aju gdje je njihova gusto}a jednaka gusto}i otopine CsCl. DNA bakterija prenese nih iz 15N medija u 14N medij tijekom vremena koje je omogu}ilo samo jednu dodatnu replikaciju tvori vrpcu ~ija je gusto}a izme|u gusto}a 15N DNA i 14N DNA, {to upu}uje na to da se radi o hibridnoj molekuli koja se sastoji od jednoga te{kog i jednoga lakog lanca.

rastu}a gusto}a

Prijenos u 14N medij za jednu diobuBakterije uzgajane u 15N medijuBakterije uzgajane u 14N mediju

hibridna DNA

izolat DNA

centrifugirati u otopini CsCl

izolat DNA

centrifugirati u otopini CsCl

izolat DNA

centrifugirati u otopini CsCl

E. coli

rastu}a gusto}a

te{ka DNA

rastu}a gusto}a

lagana DNA

ma ci ja mo ra bi ti od re |e na re dos li je dom ~e ti ri ju ba za (A, C, G i T) ko je iz gra |u ju mo le ku lu DNA. S dru ge stra ne, pro tei ni su po li me ri iz gra |e ni od 20 raz li ~i tih ami no ki se li na ~i ji sli jed od re |u je nji ho vu struk tu ru i fun kci ju. Pr va iz rav na ve za iz me |u mu ta ci je ge na i prom je ne u sli je du ami no ki se li na po ka za na je 1957. go di ne, kad je ut vr |e no da je raz li ka iz me |u he mo glo bi- na pa ci je na ta obo lje lih od nas ljed ne bo les ti sr pas te ane mi je i nor mal no ga he mog lo bi na u sve ga jed noj ami no ki se li ni, no dub lje ra zu mi je va nje mo le- ku lar nog od no sa iz me |u DNA i pro tei na proi zi{ lo je iz se ri je eks pe ri me na- ta ko ji su is ko ris ti li pred nos ti E. co li i nje zi nih vi ru sa kao ge ne ti~ kih mo de la.

Kolinearnost ge na i pro tei na Naj jed nos tav ni ja pret pos tav ka ko ja bi ob jas ni la od nos ge na i pro tei na bi la je da re dos li jed nuk leo ti da u DNA od re |u je re dos li jed ami no ki se li na u pro- tei ni ma. Mu ta ci je u ge nu od go va ra le bi prom je na ma u sli je du nuk leo ti da u mo le ku li DNA ko je bi mog le nas ta ti zbog zam je ne jed nog nuk leo ti da ne- kim dru gim, zbog do da va nja (adi ci je) ili uk la nja nja (de le ci je) nuk leo ti da. Pro mje ne u sli je du nuk leo ti da u mo le ku li DNA ta da bi re zul ti ra le od go va- ra ju }im prom je na ma u sli je du ami no ki se li na u pro tei nu {to ga ko di ra mu ti- ra ni gen. Ova je pret pos tav ka pred vid je la da bi raz li ~i te mu ta ci je u is tom ge nu mog le pro mi je ni ti raz li ~i te ami no ki se li ne u pro tei nu {to ga taj gen ko- di ra, a da bi po lo ̀ aj mu ta ci je unu tar ge na tre bao od go va ra ti po lo ̀ a ju pro- mi je nje ne ami no ki se li ne u pro tei nu.

Br zo um na ̀ a nje i jed nos tav no st ge ne ti~ ko ga sus ta va E. co li bi li su od ve- li ke po mo }i pri tra ̀ e nju od go vo ra na ova pi ta nja. Bi lo je mo gu }e izo li ra ti raz li ~i te mu tan te bak te ri je E. co li, uk lju ~u ju }i i nut ri tiv ne mu tan te ko je (po- put mu tan ti glji vi ce Neu ros po ra cras sa pri ka za nih ra ni je) ras tu sa mo uz do- da tak od re |e ne ami no ki se li ne. Brz ra st bak te ri je E. co li omo gu }io je izo la ci- ju i kar ti ra nje vi {e mu ta ci ja unu tar jed no ga ge na, {to je re zul ti ra lo pr vim do ka zom li near nog od no sa iz me |u ge na i pro tei na. Char les Ya nof sky i nje- go vi ko le ge kar ti ra li su se ri ju mu ta ci ja u ge nu ko ji ko di ra en zim pot re ban za sin te zu ami no ki se li ne trip to fa na. Ana li za en zi ma ko je ko di ra ju ti mu ti ra- ni ge ni po ka za la je da re la tiv ni po lo ̀ aj prom je na u ami no ki se li na ma od go- va ra po lo ̀ a ju mu ta ci ja u ge nu (sli ka 3-8). Dak le, sli jed ami no ki se li na u pro- tei nu ko li nea ran je sa sli je dom nuk leo ti da u ge nu, {to je u skla du s pret po-

98 Poglavlje 3

DNA

normalni protein

zamjena aminokiseline kao posljedica mutacije

mutacije

Tyr Thr SerGlyGlyGlyLeu

Cys Arg Arg Val Asp LeuIle

Slika 3-8. Kolinearnost gena i proteina. Serija mutacija (strjelice) kartirana je u genu bakterije E. coli koji kodira triptofan- -sintetazu (gornji red). Promjene aminokiselina koje su proiza{le iz svake od tih mutacija utvr|ene su analizom slijeda aminokiselina u proteinima mutiranih bakterija (donji red). Ova ispitivanja pokazala su da redoslijed mutacija u DNA odgovara redoslijedu promijenjenih aminokiselina u proteinu {to ga taj gen kodira.

A

G

G

G

C

C

A

C

C

C

C

G

T

T

G

G

G

G

G

C

C

C

C

A

A

A

A

A

G

5'

5' RNA

DNA 3'

A

T

T

T

T

G

G

G

T

G

T

G C

G

C

5'3'

3'

G

AT

A T

C

A T

A

GC

C

C

C

A

C

C

T

C

C

G

U

U

U

U

U

U

Slika 3-9. Sinteza molekule RNA iz molekule DNA. Dva se lanca molekule DNA razmo ta- vaju, a jedan od njih se koristi kao ka- lup za sintezu komplementarnoga lanca molekule RNA.

stav kom da re dos li jed nuk leo ti da u mo le ku li DNA od re |u je re dos li jed ami no ki se li na u pro tei nu.

Uloga glas ni~ ke RNA Ia ko se ~i ni lo da sli jed nuk leo ti da u DNA od re |u je sli jed ami no ki se li na u pro tei nu, iz to ga ni je nu` no proiz la zi lo da sa ma mo le ku la DNA up rav lja sin- te zom pro tei na. [to vi {e, u pri log to mu ni je go vo ri la ni ~i nje ni ca da je DNA smje{ te na u jez gri eu ka riot ske sta ni ce, dok se sin te za pro tei na od vi ja u ci- top laz mi. ^i ni lo se pu no vje ro jat ni jim da ne ka dru ga mo le ku la pre no si ge- ne ti~ ku in for ma ci ju s mo le ku le DNA na mjes to sin te ze pro tei na (ri bo so mi).

RNA je dje lo va la kao vje ro jat ni kan di dat za tak vog pos red ni ka jer je sli- ~no st nje zi ne struk tu re sa struk tu rom DNA upu }i va la na to da bi RNA mog la bi ti sin te ti zi ra na na os no vi DNA-ka lu pa (sli ka 3-9). Mo le ku la se RNA raz li ku je od mo le ku le DNA po to me {to je jed no lan ~a na, a ne dvo lan ~a na, {to je nje zi na {e }er na kom po nen ta ri bo za, a ne deok si ri bo za, i {to sad r ̀ ava pi ri mi din sku ba zu ura cil (U) um jes to ti mi na (T) (vi di sli ku 2-10). No ni prom je na {e }e ra, ni ti zam je na ura ci la ti mi nom ne ut je ~e na spa ri va nje ba- za, sto ga je sin te zom RNA mo gu }e up rav lja ti ko ris te }i DNA kao ka lup. [to- vi {e, ka ko je RNA smje{ te na pog la vi to u ci top laz mi, ~i ni lo se da je ona lo gi- ~ni pos red nik u pri je no su in for ma ci je s DNA na ri bo so me. Ova svoj stva RNA su ge ri ra la su ti jek ge ne ti~ ke in for ma ci je ko ji pre poz na je mo kao sre- di{ nju dog mu mo le ku lar ne bio lo gi je:

DNA → RNA → pro tein. U skla du s ovim kon cep tom, mo le ku la RNA sin te ti zi ra se na os no vi DNA- ka lu pa (pro ces ko ji na zi va mo pre pi si va nje ili tran skrip ci ja), a pro tei ni se sin te ti zi ra ju na os no vi RNA-ka lu pa (pro ces ko ji na zi va mo pre vo |e nje ili tran sla ci ja).

Ek spe ri men tal ni do kaz pos to ja nja RNA pos red ni ka ko ji je pred vid je la sre di{ nja dog ma pru ̀ i li su Sid ney Bren ner, Fran cois Ja cob i Mat thew Me sel- son prou ~a va njem E. co li in fi ci ra ne bak te rio fa gom T4. Sin te za RNA E. co li pres ta je na kon in fek ci je bak te rio fa gom T4 i je di na no va RNA ko ja nas ta je u in fi ci ra nim bak te ri ja ma pre pi sa na je s DNA bakteriofaga T4. RNA bak te rio- fa ga T4 do la zi u kon ta kt s bak te rij skim ri bo so mi ma, te sto ga pre no si in for- ma ci ju s DNA na mjes to sin te ze pro tei na. Zbog svo je ulo ge u pri je no su ge- ne ti~ ke in for ma ci je mo le ku la RNA ko ja slu ̀ i kao ka lup za sin te zu pro tei na

Osnove molekularne biologije 99

His

5'

tRNAHis

3'

His

5'

»nabijena« tRNAHis

Histidil-tRNA- -sintetaza

3'

His5'

Komplementarno sparivanje baza

mRNA

3'

A

G G

U

G G

U

G G

U

C

C

Slika 3-10. Funkcija transportne RNA (tRNA). tRNA djeluje kao adaptor u sintezi proteina. Svaka aminokiselina (primjerice histi- din) ve`e se na 3' kraj specifi~ne tRNA s pomo}u odgovaraju}eg enzima (aminoacil- tRNA-sintetaze). »Nabijena« tRNA tada se povezuje s molekulom mRNA koja slu`i kao kalup na osnovi komplementarnog sparivanja baza.

naz va na je glas ni~ kom RNA (mR NA, od en gl. mes sen ger). Sin te zu RNA na os no vi DNA-ka lu pa ka ta li zi ra en zim naz van RNA-po li me ra za.

Osim mR NA, za sin te zu pro tei na va` na su i dva dru ga ti pa RNA – ri- bosomna RNA (rR NA) ko ja je sas tav ni dio ri bo so ma i tran spor tna RNA (tR NA) ko ja dje lu je kao adap tor ko ji do no si ami no ki se li ne na RNA-ka lup. Os no ve struk tu re i fun kci je tih mo le ku la opi sa ne su u nas tav ku ovo ga po- glav lja, a de talj ni je su pri ka za ne u pog lav lji ma 6 i 7.

Geneti~ki kod Na ko ji se na ~in sli jed nuk leo ti da u RNA pre vo di u sli jed ami no ki se li na u pro tei nu? U ovom ko ra ku ek spre si je ge na ge ne ti~ ka se in for ma ci ja pre no si s nuk lein skih ki se li na na pro tei ne, mo le ku le ko je su ke mij ski ja ko raz li ~i te, {to ot va ra dva no va prob le ma za ra zu mi je va nje dje lo va nja ge na.

Bu du }i da ami no ki se li ne ni su struk tur no srod ne du {i ko vim ba za ma, iz- rav no kom ple men tar no spa ri va nje mR NA i ami no ki se li na ti je kom ug rad- nje ami no ki se li na u pro tei ne ni je se ~i ni lo vje ro jat nim. Ka ko je on da mo gu- }e da se ami no ki se li ne sla ̀ u na mR NA-ka lup ti je kom sin te ze pro tei na? Ovaj pro blem ri je {en je ot kri }em tR NA ko je slu ̀ e kao adap to ri iz me |u ami- no ki se li na i mR NA ti je kom pre vo |e nja ge ne ti~ ke in for ma ci je (sli ka 3-10). Pri je nje zi ne upo ra be u sin te zi pro tei na, sva ka ami no ki se li na se s po mo }u spe ci fi~ nog en zi ma po ve zu je s od go va ra ju }om tR NA. U slje de }em ko ra ku spa ri va nje ba za iz me |u pre poz na va ju }eg sli je da na mo le ku li tR NA i kom- ple men tar nog sli je da na mR NA us mje ra va ami no ki se li nu ve za nu na tR NA na nje zin to ~an po lo ̀ aj na mR NA-ka lu pu.

Dru gi prob lem u pre vo |e nju sli je da nuk leo ti da u sli jed ami no ki se li na bio je od re |i va nje ge ne ti~ ko ga ko da. Na ko ji je na ~in mo gu }e in for ma ci ju sad r ̀ a nu u sli je du ~e ti riju raz li ~i tih nuk leo ti da pre ves ti u sli jed 20 raz li ~i tih ami no ki se li na u pro tei ni ma? Bu du }i da je 20 raz li ~i tih ami no ki se li na po- treb no od re di ti s po mo }u sve ga ~e ti ri nuk leo ti da, bi lo je nu` no da naj ma- nje tri nuk leo ti da bu du uk lju ~e na u ko di ra nje sva ke ami no ki se li ne. Ko ri{ te- ni po je di na~ no, ~e ti ri nuk leo ti da mog li bi ko di ra ti sve ga ~e ti ri ami no ki se li- ne, a ko ri{ te ni u pa ro vi ma, sve ga {es nae st (42) ami no ki se li na. Ko ri{ te ni u ob li ku trip le ta ~e ti ri nuk leo ti da mo gu ko di ra ti 64 (43) raz li ~i te ami no ki se li- ne, {to je vi {e ne go do volj no za 20 raz li ~i tih ami no ki se li na ko je dois ta iz gra- |u ju pro tei ne.

Da je ge ne ti~ ki kod zais ta or ga ni zi ran u trip le te pot vr |e no je ek spe ri- men ti ma pro ve de nim na bak te rio fa gu T4 ko ji je no sio mu ta ci je u in ten ziv- no prou~ava nom ge nu naz va nom rII. Fa gi s mu ta ci ja ma u tom ge nu tvo re ja ko ve li ke pla ko ve ko je je vr lo la ko raz li ko va ti od pla ko va ko je tvo re vi ru si div ljeg ti pa. Iden ti fi ka ci ja i kar ti ra nje mu ta ci ja u ge nu rII vr lo je jed nos tav- no pa je nap rav lje na de talj na ge ne ti~ ka kar ta ovog lo ku sa. Is pi ti va nje re- kom bi na na ta iz me |u rII mu ta na ta ko ji su nas ta li adi ci jom ili de le ci jom nuk leo ti da po ka za lo je da adi ci ja ili de le ci ja jed no ga ili dvaju nuk leo ti da uvi jek re zul ti ra mu tan tnim fe no ti pom. Na sup rot to mu, fa gi ko ji su ima li de le ci ju ili adi ci ju tri nuk leo ti da ~es to bi zad r ̀ a li fun kci ju div ljeg ti pa (sli ka 3-11). Ovo ot kri }e su ge ri ra lo je da se ge ni ~i ta ju od ne ke fik sne to~ ke u sku-

100 Poglavlje 3

ACG TCA TAT CCG CAT ACC GAG . . .

G . .

GAG

AG .

Thr

DNA normalni gen

aminokiselina aktivni protein WT fagSer Tyr Pro His Thr Glu

ACG GTC ATA TCC GCA TAC CGA

Thr

DNA

aminokiselina Val Ile Ser Ala Tyr Arg

ACG GAT CAT ATC CGC ATA CCG

Thr

DNA

aminokiselina Asp His Ile Arg Ile Pro

ACG GAC TAT CCG ACC

Thr

DNA

aminokiselina Asp Tyr Pro Thr

+1 nukleotid

neaktivni protein rII mutant

rII mutant

+2 nukleotida

neaktivni protein

+3 nukleotida

aktivni protein WT fag

Slika 3-11. Geneti~ki dokaz tripletnoga koda. Serija mutacija koje se sastoje od adi- cije jednoga, dvaju ili triju nukleotida ispitivane su u rII genu bakteriofaga T4. Adicija jednoga ili dvaju nukleotida mijenja okvir ~itanja ostatka gena, te su stoga sve sljede}e aminokiseline pogrje- {ne i daju nefunkcionalni protein koji re zultira mutiranim fenotipom faga. S druge strane, adicija triju nukleotida mi- jenja samo jednu aminokiselinu. Okvir ~itanja ostatka gena je normalan pa }e i protein {to ga kodira taj gen biti funkci- onalan, a fag }e imati normalni fenotip (divlji tip faga = WT).

Slika 3-12. Triplet UUU kodira fenilalanin. In vitro prevo|enje sinteti~ke RNA koja se sastoji od ponavljaju}ih uracila (poli- U kalup) rezultira sintezom polipeptida koji se sastoji samo od fenilalanina.

ribosomi aminokiseline tRNA aminoacil-tRNA sintetaze

poli-U kalup

In vitro prevo|enje

Phe Phe Phe Phe

U U U U U U U U U U U U

polipeptid

pi na ma od po tri nuk leo ti da. Adi ci ja ili de le ci ja jed no ga ili dvaju nuk leo ti- da po re me ti la bi ok vir ~i ta nja ~i ta vo ga ge na, {to bi do ve lo do ug rad nje po- gr je{ nih ami no ki se li na ~i ta vom du ̀ i nom ko di ra nog pro tei na. Na sup rot to- mu, adi ci ja ili de le ci ja tri nuk leo ti da re zul ti ra la bi sa mo do dat kom ili gu bit- kom jed ne ami no ki se li ne, dok bi os ta tak pro tei na bio nep ro mi je njen, a ~e sto bi i zad r ̀ ao pr vo bit nu fun kci ju.

Slje de }i ko rak u ot kri va nju ge ne ti~ ko ga ko da bio je prid ru ̀ i ti od go va ra- ju }u ami no ki se li nu sva kom trip le tu nuk leo ti da. Za rje {a va nje ovog prob le- ma pri mi je njen je sus tav ko ji je mo gao sin te ti zi ra ti pro tei ne in vit ro (in vit ro tran sla ci ja). Ta da je ve} bi lo poz na to da ek strak ti sta ni ca, ko ji sad r ̀ avaju ri- bo so me, ami no ki se li ne, tR NA i en zi me od go vor ne za ve za nje ami no ki se li- na na pri pa da ju }e tR NA (ami noa ci l-tRNA-sin te ta ze), mo gu ka ta li zi ra ti ugrad nju ami no ki se li na u pro tei ne. Ta kav na ~in sin te ze pro tei na ovi si o pri- sut nos ti mR NA ve za ne na ri bo so me, a sa mu je sin te zu mo gu }e zna ~aj no po ja ~a ti do dat kom pro ~i{ }e ne mR NA. Bu du }i da u tak vom sus ta vu do da- na stra na mRNA up rav lja sin te zom pro tei na, is pi ti va nje pre vo |e nja sin te- ti~ kih mRNA poz na to ga sli je da nuk leo ti da omo gu }i lo je de ko di ra nje ge ne- ti~ ko ga ko da.

Pr vi ek spe ri me nt toga ti pa pro ve li su Mar sha ll Ni ren be rg i Hein ri ch Mat- thaei ko ris te }i sin te ti~ ki po li mer RNA ko ji je sad r ̀ avao sa mo ura cil kao ka- lup za in vit ro sin te zu pro tei na (sli ka 3-12). Ut vr di li su da po li-U ka lup od re- |u je ug rad nju sa mo jed ne ami no ki se li ne, fe ni la la ni na, u po li pep tid koji se sas to ji od po nav lja ju }ih fe ni la la nin skih os ta ta ka. Sli~ ni ek spe ri men ti s RNA-po li me ri ma ko ji su sad r ̀ ava li sa mo jed nu vr stu nuk leo ti da po ka za li su da AAA ko di ra li zin, a CCC ko di ra pro lin. Os ta tak ge ne ti~ ko ga ko da de- ko di ran je ko ris te }i po li me re RNA ko ji su sad r ̀ ava li smje se nuk leo ti da. Na taj na ~in de {if ri ra na su sva 64 trip le ta (ko do na) (ta bl. 3-1). Od 64 ko do na 61 ko don od re |u je ami no ki se li ne, a preos ta la tri (UAA, UAG i UGA) pred stav- lja ju STOP ko do ne ko ji sig na li zi ra ju kraj sin te ze pro tei na. Ge ne ti~ ki kod je de ge ne ri ran {to zna ~i da su mno ge ami no ki se li ne od re |e ne s vi {e no jed- nim ko do nom. Uz ne ko li ko iz ni ma ka (pri ka za nih u 10. pog lav lju), svi se or- ga niz mi slu ̀ e is tim ge ne ti~ kim ko dom {to je ~vr st do kaz da su se sve da na- {nje sta ni ce raz vi le od is to ga za jed ni~ kog pret ka.

RNA-vi ru si i ob r nu to pre pi si va nje Na kon de ko di ra nja ge ne ti~ ko ga ko da ~i ni lo se da su te melj ni prin ci pi mo le- ku lar ne bio lo gi je pos tav lje ni. U skla du sa sre di{ njom dog mom, ge ne ti~ ki

Osnove molekularne biologije 101

Prvo Drugo mjesto Tre}e mjesto U C A G mjesto Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser stop stop A Leu Ser stop Trp G

Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G

Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G

Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G

Tablica 3-1. Geneti~ki kod

ma te ri jal sas to ji se od DNA ko ja ima svoj stvo sa mo rep li ka ci je i mo gu} no st pri je no sa in for ma ci je (pre pi si va nja) na mo le ku lu mR NA, ko ja on da slu ̀ i kao ka lup za sin te zu pro tei na. Ipak, kao {to je ve} na ve de no u pr vom po- glav lju, mno gi vi ru si kao ge ne ti~ ki ma te ri jal sad r ̀ avaju RNA um jes to DNA {to zah ti je va ne ki dru gi ob lik pri je no sa ge ne ti~ ke in for ma ci je.

RNA-ge no mi su is pr va ot kri ve ni kod bilj nih vi ru sa od ko jih se mno gi sas to je sa mo od mo le ku la RNA i pro tei na. Iz rav ni do kaz da RNA obav lja ulo gu ge ne ti~ kog ma te ri ja la tih vi ru sa pru ̀ i li su ek spe ri men ti pro ve de ni sre di nom 20. sto lje }a ko ji su po ka za li da pro ~i{ }e na RNA izo li ra na iz vi ru sa mo zai ka du ha na mo ̀ e in fi ci ra ti no ve sta ni ce do ma }i na u ko ji ma on da na- sta ju no ve in fek tiv ne vi rus ne ~es ti ce. Na ~in rep li ka ci je ve }i ne vi rus nih RNA-ge no ma raz ja{ njen je is pi ti va njem RNA bak te rio fa ga bak te ri je E. co li. Otkri ve no je da ti vi ru si no se in for ma ci ju za spe ci fi~ ni en zim ko ji ka ta li zi ra sin te zu mo le ku le RNA na os no vi RNA-ka lu pa (RNA-up rav lja na RNA-sin te- za) prim je nju ju }i is ti prin cip kom ple men tar nog spa ri va nja ba za ko ji se ra bi pri rep li ka ci ji DNA ili pre pi si va nju DNA u RNA.

Ia ko je ut vr |e no da se ve }i na `i vo tinj skih RNA-vi ru sa (prim je ri ce po lio vi rus ili vi rus in fluen ce) um no ̀ a va RNA-up rav lja nom sin te zom RNA, ovaj me ha ni zam ni je mo gao ob jas ni ti um no ̀ a va nje jed ne po ro di ce `i vo tinj skih vi ru sa (RNA tu mor skih vi ru sa) ko ji su bi li po se bi ce in te re san tni zbog svo je spo sob nos ti da uz ro ku ju tu mo re kod in fi ci ra nih `i vo ti nja. Ia ko ovi vi ru si sad r ̀ avaju ge nom sku RNA, ek spe ri men ti ko je je po ~et kom 1960-ih go di na pro veo Howa rd Te min po ka za li su da za um no ̀ a va nje vi rus nih ~es ti ca mo- ra do }i do sin te ze DNA u in fi ci ra nim sta ni ca ma, {to je do ve lo do pret po- stav ke da se RNA tu mor ski vi ru si (da nas ih na zi va mo ret ro vi ru si) um no ̀ a- va ju sin te zom DNA-pos red ni ka ko ji na zi va mo DNA-pro vi rus (sli ka 3-13). Ova je pret pos tav ka u po ~et ku nai la zi la na ve li ki ot por znan stve ni ka jer je uk lju ~i va la RNA-up rav lja nu sin te zu DNA {to se pro ti vi lo sre di{ njoj dog mi. Go di ne 1970. su Howard Te min i Da vid Bal ti mo re neo vis no je dan o dru go-

102 Poglavlje 3

Pretpostavka DNA-provirusa

KLJU^NI POKUS

»Nature of the Provirus of Rous Sarcoma«

Howard M. Temin McArdle Laboratory, University of Wisconsin, Madison, WI National Cancer Institute Monographs, Volume 17, 1964, pages 557–570

me ot kri li da ret ro vi ru si sad r ̀ avaju do sad ne poz na ti en zim ko ji ka ta li zi ra sin te zu DNA na os no vi RNA-ka lu pa, a do bi ve ni su i jas ni do ka zi pri sut no- sti vi rus ne DNA u in fi ci ra nim sta ni ca ma. S ovim je ot kri }i ma sin te za DNA na os no vi RNA-ka lu pa, ko ju da nas na zi va mo ob r nu to pre pi si va nje (re ver- zna tran skrip ci ja) prih va }e na kao ob lik pri je no sa ge ne ti~ ke in for ma ci je u bio lo{ kim sus ta vi ma.

Ob r nu to pre pi si va nje ni je va` no sa mo kao me ha ni zam um no ̀ a va nja ret ro vi ru sa, ve} i u jo{ naj ma nje dva dru ga {i ro ka pod ru~ ja mo le ku lar ne i sta ni~ ne bio lo gi je. Ob r nu to pre pi si va nje ni je og ra ni ~e no sa mo na ret ro vi ru- se. Od vi ja se i u sta ni ca ma i kao {to je pri ka za no u pog lav lji ma 4 i 5, ~es to je od go vor no za prem je{ ta nje (tran spo zi ci ju) sli je da nuk leo ti da s jed no ga na ne ko dru go mjes to u DNA nji ho vih kro mo so ma. [to vi {e, sek ven ci ra nje ge- no ma ~ov je ka po ka za lo je da je prib li` no 40% ge nom ske DNA ~ov je ka na- sta lo ob r nu tim pre pi si va njem. S dru ge stra ne, en zi mi ko ji ka ta li zi ra ju

Kon tek st

Rou sov sar kom ski vi rus (RSV) pr vi je opi sa ni vi rus ko ji mo ̀ e uz ro ko va ti tu mo re, te je pos lu ̀ io kao ek spe ri men- tal ni mo del za is tra ̀ i va nje mo le ku lar ne bio lo gi je tu mo ra. Howa rd Te min uk lju- ~io se u is tra ̀ i va nje ovog pod ru~ ja ka d je kao pos lije dip lo ma nd 1958. godine raz vio me to du tran sfor ma ci je nor- mal nih sta ni ca u kul tu ri u tu mor ske s pomo }u in fek ci je Rou so vim sar kom- skim vi ru som. Uvo |e nje ove kvan- ti ta tiv ne in vit ro me to de omo gu }i lo je dalj nja is tra ̀ i va nja tran sfor ma ci je sta ni ca i um na ̀ a nja vi ru sa. Pro vo de }i spo me nu te ek spe ri men te, Te min je do {ao do se ri je neo ~e ki va nih opa ̀ a nja ko ja su upu }i va la na to da je rep li ka ci ja RSV vi ru sa ba zi~ no raz li ~i ta od rep li ka- ci je os ta lih RNA-vi ru sa. Te min je pret- pos ta vio da se RNA vi ru sa pre pi su je u DNA u in fi ci ra nim sta ni ca ma {to se u to vri je me iz rav no su kob lja va lo s op }e prih va }e nom sre di{ njom dog mom mo le ku lar ne bio lo gi je (pret pos tav ka DNA-pro vi ru sa).

Ek spe ri men ti

Pretpostavka DNA-pro vi ru sa zas no- va na je na ne ko li ko raz li ~i tih ti po va ek spe ri men tal nih do ka za. Is pi ti va nja sta ni ca in fi ci ra nih mu ti ra nim RSV po ka za la su da su ne ka svoj stva tih sta ni ca od re |e na ge ne ti~ kom in for ma- ci jom vi ru sa. Ova se in for ma ci ja uvi jek pre no si la na sta ni ce k}e ri na kon dio be sta ni ca, ~ak i uko li ko ni je do la zi lo do um no ̀ a va nja vi ru sa. Na os no vi to ga opa ̀ a nja Te min je zak lju ~io da vi rus ni ge nom pos to ji u sta ni ca ma u sta bil nom ob li ku ko ji je mo gu }e nas li je di ti, te ga je naz vao pro vi ru som.

Do ka zi da je pro vi rus zais ta DNA iz ve de ni su iz ek spe ri me na ta ko ji su ko ris ti li me ta bo li~ ke in hi bi to re. Pro na- |e no je da ak ti no mi cin D, ko ji in hi bi ra sin te zu RNA na os no vi DNA-ka lu pa, one mo gu }u je proiz vod nju vi ru sa u sta ni ca ma in fi ci ra nim RSV (vi di sli ku). S dru ge stra ne, in hi bi to ri sin te ze DNA blo ki ra li su ra ne sta di je in fek ci je sta- ni ce vi ru som. ^i ni lo se da je u ra nim sta di ji ma in fek ci je pot reb na sin te za

DNA, a da je DNA-up rav lja na sin te za RNA pot reb na u kas ni jim sta di ji ma za proiz vod nju no vih vi rus nih ~es ti ca. Na te me lju ovih opa ̀ a nja pret pos ta vi lo se da je pro vi rus DNA-ko pi ja vi ral- no ga RNA-ge no ma. Te min je po ku {ao do dat no do ka za ti ovu pret pos tav ku ko ris te }i hib ri di za ci ju nuk lein skih ki se li na za de tek ci ju vi rus nih slijedova u DNA in fi ci ra nih sta ni ca. Ipak, os jet lji- vo st teh ni ka ko je su mu bi le na ras po la- ga nju ni je bi la dos tat na i re zul ta ti ni su bi li uv jer lji vi.

Utjecaj

Te mi no va pret pos tav ka da se RSV um no ̀ a va pri je no som in for ma ci je s RNA na DNA u os no vi je pred lo ̀ e na na te me lju ge ne ti~ kih ek spe ri me na ta i u~i na ka me ta bo li~ kih in hi bi to ra, a ko si la se s op }ep rih va }e nom sre di-

Howard Temin

Osnove molekularne biologije 103

ugradnja virusne DNA

RNA obrnuto prepisivanje

infekcija virusom

retrovirusna ~estica

RNA-genom

DNA

DNA-provirus

Nove virusne ~estice

Slika 3-13. Obrnuto prepisivanje i replikacija retrovirusa. Retrovirusi sadr`avaju RNA-genome u svo jim virusnim ~esticama. Tijekom in- fekcije stanice doma}ina retrovirus sin- tetizira DNA-kopiju svoga RNA-ge no- ma s po mo}u enzima reverzne trans- kriptaze. Virusna DNA tada se ugra|uje u kro mo somsku DNA doma}ina i tvori DNA-provirus koji se prepisuje kako bi stvorio RNA potrebnu za nastanak no- vih virusnih ~estica.

RNA- up rav lja nu sin te zu DNA (re ver zne tran skrip ta ze) mo gu bi ti upo rab- lje ni za sin te zu DNA ko pi ja bi lo ko je mo le ku le RNA u ek spe ri men tal nim sus ta vi ma. Prim je na re ver zne tran skrip ta ze omo gu }i la je is pi ti va nje eu ka- riot ske mR NA me to da ma ko je se ko ris te za ma ni pu li ra nje mo le ku la ma DNA, a ko je su opi sa ne u nas tav ku ovog pog lav lja.

{njom dog mom mo le ku lar ne bio lo gi je. U tom kon tek stu, ne sa mo da ni je bi la prih va }e na u znan stve noj za jed ni ci, ve} je bi la iz lo ̀ e na op }em od bi ja nju, go to vo pod smi je hu. Te min je ipak us tra jao i ti je kom 1960-ih nas ta vio pri- kup lja ti ek spe ri men tal ne do ka ze ko ji bi pot kri je pi li nje go vu pret pos tav ku. Ti su na po ri kul mi ni ra li 1970. go di ne kad su Te min i Sa tos hi Mi zu ta ni (u is to vri je me kad i Da vid Bal ti mo re) ot kri li vi rus ni en zim, da nas poz nat kao re ver zna tran skrip ta za, ko ji sin te- ti zi ra DNA na os no vi RNA-ka lu pa. To je bio ned voj be ni bio ke mij ski do kaz da je ti jek ge ne ti~ ke in for ma ci je mo gu }e i ob r nu ti i da sre di{ nju dog mu tre ba mo di fi ci ra ti.

U svom ra du ob jav lje nom 1970. go di ne Te min je zak lju ~io da nje go vi re zul ta ti »pred stav lja ju sna ̀ an do kaz

da je pret pos tav ka DNA-pro vi ru sa to~ na i da RNA tu mor ski vi ru si ima ju DNA-ge nom kad su u sta ni ca ma, a

RNA-ge nom kad su u vi rus nim ~es ti- ca ma. Ovaj re zul tat imao bi zna ~aj ne im pli ka ci je na teo ri ju vi rus ne kan ce ro- ge ne ze, a mo` da i na teo ri je pri je no sa in for ma ci je u dru gim bio lo{ kim sus ta- vi ma«. Kao {to je Te min i pred vi dio, ot kri }e RNA-up rav lja ne sin te ze DNA do ve lo je do zna ~aj no ga nap ret ka na {eg ra zu mi je va nja tu mo ra, hu ma- nih ret ro vi ru sa i preu re |i va nja ge na. En zim re ver zna tran skrip ta za omogu- }io je klo ni ra nje cDNA, te je sto ga imao u~i nak na prak ti~ no sva pod ru~ ja suv re- me ne sta ni~ ne i mo le ku lar ne bio lo gi je.

p ro

d u

kc ija

v ir

u sa

( p

o st

o ta

k p

o ~e

tn e

ko n tr

o ln

e b

rz in

e)

100

10

8 12

sati

2416 20

P ri

su ta

n ak

ti n o m

ic in

D

10 mg/ml

0.1 mg/ml

0 mg/ml

U~inak aktinomicina D na replikaciju RSV. Stanice inficirane RSV uzgajane su u kulturi u prisutnosti navedenih koncentracija aktinomicina tijekom 8 sati nakon ~ega je aktinomicin D uklonjen te je analizirana koli~ina nastalog virusa.

104 Poglavlje 3

Tablica 3-2. Mjesta prepoznavanja nekih restrikcijskih-endonukleaza

Enzimia Izvor Mjesto prepoznavanjab

BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC HpaII Haemophilus parainfluenzae CCGG MboI Moraxella bovis GATC NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC TaqI Thermus aquaticus TCGA a Imena restrikcijskih enzima izvode se iz imena organizma iz kojih su izolirani i rednoga broja koji omogu}uje razlikovanje razli~itih enzima izoliranih iz istog organizma (primjerice HpaI i HpaII – dvaju razli~itih enzima izoliranih iz bakterije Haemophilus parainfluenzae). b Mjesta prepoznavanja prikazana su samo kao slijed nukleotida jednoga lanca dvolan~ane DNA. »N« predstavlja bilo koju bazu.

Re kom bi nan tna DNA Kla si~ ni ek spe ri men ti u mo le ku lar noj bio lo gi ji zna ~aj no su unap ri je di li na- {e te melj no ra zu mi je va nje pri ro de i ek spre si je ge na. Bu du }i da su ta is tra ̀ i- va nja bi la zas no va na pog la vi to na ge ne ti~ kim ana li za ma, nji hov je us pjeh u zna ~aj noj mje ri ovi sio o ko ri{ te nju jed nos tav nih or ga ni za ma ko ji se br zo raz mno ̀ a va ju (kao {to su prim je ri ce bak te ri je i vi ru si). Ka ko su ge no mi ve }i- ne eu ka rio ta (prim je ri ce ge nom ~ov je ka) i do ti su }u pu ta slo ̀ e ni ji od ge no- ma bak te ri je E. co li, ni je bi lo jas no ka ko bi se ti te melj ni prin ci pi pri mi je ni li i na vi {e or ga niz me. Po ~et kom 1970-ih mo gu} no st is tra ̀ i va nja slo ̀ e nih ge no- ma na mo le ku lar noj ra zi ni ni je dje lo va la obe }a va ju }e. Po se bi ce se ~i ni lo da ne ma na ~i na na ko ji bi bi lo mo gu }e izo li ra ti i is pi ti va ti po je di na~ ne ge ne.

Ovu prep re ku nap ret ku mo le ku lar ne bio lo gi je sav la dao je raz voj teh no- lo gi je re kom bi nan tne DNA ko ja je znan stve ni ci ma pru ̀ i la mo gu} no st da izo li ra ju, sek ven ci ra ju i ma ni pu li ra ju ge ni ma izo li ra nim iz bi lo ko jeg ti pa sta ni ca, pa i onih slo ̀ e nih or ga ni za ma. Prim je na teh no logije re kom bi nant- ne DNA omo gu }i la je de talj na mo le ku lar na is pi ti va nja struk tu re i fun kci je eu ka riot skih ge na i ge no ma te je na taj na ~in pro du bi la na {e ra zu mi je va nje sta ni~ ne bio lo gi je.

Restrikcijske en do nuk lea ze Pr vi ko rak u raz vo ju teh no lo gi je re kom bi nan tne DNA bi la je ka rak te ri za ci- ja res trik cij skih-en do nuk lea za, en zi ma ko ji ki da ju DNA na spe ci fi~ nim re- dos li je di ma. Ovi en zi mi ot kri ve ni su u bak te ri ja gdje vje ro jat no slu ̀ e kao ob ram be ni me ha ni zam pro tiv ulas ka stra ne DNA (prim je ri ce vi rus ne) u sta- ni cu. Bak te ri je ima ju ve lik broj raz li ~i tih res trik cij skih-en do nuk lea za ko je ki da ju DNA na vi {e od sto ti nu spe ci fi~ nih mjes ta pre poz na va nja, a sva ko od tih mjes ta sas to ji se od spe ci fi~ nog sli je da od ~e ti ri do osam pa ro va ba za (prim je ri su na ve de ni u tab li ci 3-2).

Bu du }i da res trik cij ske-en do nuk lea ze raz gra |u ju DNA u spe ci fi~ nim re- dos li je di ma, mo gu }e ih je pri mi je ni ti za ki da nje mo le ku le DNA na je din- stve nim mjes ti ma. Prim je ri ce res trik cij ska-en do nuk lea za EcoRI pre poz na je sli jed od {e st pa ro va ba za GAATTC. Ova kav sli jed nuk leo ti da pri su tan je na pet mjes ta u DNA bak te rio fa ga l, te sto ga EcoRI raz gra |u je l DNA u {e st frag me na ta du lji ne od 3,6 do 21,2 ki lo ba ze (1 kb = 1.000 pa ro va ba za) (sli ka 3-14). Ti frag men ti mo gu bi ti raz dvo je ni pre ma ve li ~i ni ge l-e lek tro fo-

Osnove molekularne biologije 105

HIV i AIDS

MOLEKULARNA MEDIC INA

re zom, me to dom ko ja raz dva ja mo le ku le na os no vi raz li ka u br zi ni ko jom pu tu ju u elek tri~ nom po lju. Gel, ko ji je naj ~e{ }e na ~i njen od aga ro ze ili po- liak ri la mi da, smje{ ta se iz me |u dvaju re zer voa ra s pu fe rom u ko ji ma se na- la ze elek tro de. Za tim se uzo rak (prim je ri ce smje sa frag me na ta DNA ko je tre ba ana li zi ra ti) pi pe tom uno si u pret hod no nap rav lje ne bu na ri }e u ge lu i uk lju ~u je se elek tri~ no po lje. Nuk lein ske ki se li ne su ne ga tiv no na bi je ne

Bo le st

Sin drom ste ~e ne imu no de fi ci jen ci je (AIDS, en gl. acqui red im mu ne de fi cien cy syndro me) je no va bo le st ko ja je pr vi pu ta opi sa na 1981. go di ne. Do da nas se raz vi la u pan de mi ju s vi {e od 50 mi li ju na in fi ci ra nih lju di {i rom svi je ta od ko jih je prib li` no 20 mi li ju na um r lo od AI DS. Kli ni~ ka ma ni fes ta ci ja AI DS pog la vi to je pos lje di ca ne mo gu} nos ti imu no sus ta va da nor mal no fun kcio- ni ra. U ne dos tat ku nor mal ne imu nos ti pa ci jen ti obo lje li od AI DS pod lo` ni su opor tu nis ti~ kim in fek ci ja ma (vi ru sa, bak te ri ja, glji vi ca i pro to zoa) na ko je bi zdra va oso ba bi la ot por na. Lju di s AI DS ta ko |er ~es to obo li je va ju od od re |e nih vr sta tu mo ra, po se bi ce lim- fo ma i Ka po si je va sar ko ma, no za naj- ve }i dio smr tnos ti ipak su od go vor ne opor tu nis ti~ ke in fek ci je.

Mo le ku lar na i sta ni~ na os no va

AIDS je uz ro ko van ret ro vi ru som (vi rus hu ma ne imu no de fi ci jen ci je, HIV, en gl. hu man imu no de fi cien cy vi rus) {to su ga 1983. go di ne ot kri li is tra ̀ i va~ ki ti mo vi Ro ber ta Gal loa i Lu ca Mon tag nie ra. HIV pri mar no infi ci ra spe ci fi~ nu sku- pi nu lim fo ci ta (T4 lim fo ci te) ko ji su po treb ni za nor mal ni imu nood go vor. Za raz li ku od broj nih dru gih ret ro- vi ru sa, kao {to je prim je ri ce Rou sov sar kom ski vi rus, HIV ne uz ro ku je tran sfor ma ci ju in fi ci ra nih sta ni ca u tu mor ske sta ni ce. Um jes to to ga, HIV vre me nom ubi ja sta ni cu u ko joj se rep- li ci ra {to re zul ti ra sma nje njem bro ja T4 lim fo ci ta, te kra hom imu nood go vo ra in fi ci ra nih oso ba. Pos lje di ca ne dos tat- nog imu nood go vo ra su opor tu nis ti~ ke

in fek ci je i tu mo ri ko ji pred stav lja ju kli- ni~ ku ma ni fes ta ci ju AI DS.

Pre ven ci ja i lije~enje

Do da nas je je di ni na ~in pre ven ci je AI DS iz bje ga va nje in fek ci je HI V. HIV je vr lo kr hki vi rus ko ji iz van ti je la br zo gu bi in fek tiv no st, te sto ga ne mo ̀ e bi ti pre ne sen uo bi ~a je nim kon tak tom s in fi- ci ra nom oso bom. Tri su na ~i na na ko ji se pre no si: spol nim kon tak tom, kon ta- mi ni ra nim de ri va ti ma kr vi i s maj ke na di je te ti je kom trud no }e ili do je nja. Na kon ot kri }a HI V raz vi je ni su tes to vi ko ji su osi gu ra li da fak to ri zgru {a va nja i za li ha kr vi ko ji se ko ris te za tran sfu- zi ju bu du be zo pas ni za pri ma te lje. Pre- ven ci ja in fek ci je HI V os ta lim na ~i ni ma tre nut no ovi si o osob nom an ga` ma nu na mi ni ma li za ci ji ri zi ka in fek ci je. Pod

ti me se pod ra zu mi je va prid r ̀ a va nje pra vi la si gur nog sek sa, te iz bje ga va nje iz mje nji va nja iga la za in tra ve noz nu prim je nu dro ga.

Ot kri }e HIV vi ru sa kao uz ro~ ni ka AI DS ot vo ri lo je no ve mo gu} nos ti pre ven ci je i tret ma na. Ak tiv no se ra di na raz vo ju cje pi va ko je bi one mo gu- }i lo in fek ci ju HI V, no to me zna ~aj nu prep re ku pred stav lja ju ne ka bio lo{ ka svoj stva HIV viru sa. Al ter na tiv ni pri- s tup su li je ko vi ko ji one mo gu }u ju re p li ka ci ju vi ru sa na taj na ~in da in hi- bi ra ju re ver znu tran skrip ta zu ili pro- tea zu HI V. Kom bi na ci je tak vih li je ko va da nas mo gu pro du lji ti `i vot obo lje lih, no nu` no je pot re ban dalj nji rad na raz- vo ju no vih li je ko va ko ji }e bi ti ne sa mo u~in ko vi ti ji, ve} i jef ti ni ji i prak ti~ ni ji za prim je nu u zem lja ma u raz vo ju.

Pretra`na elektronska mikrofotografija HIV virusa koji »pupa« iz T limfocita (Cecil Fox/Photo Researches, Inc)

106 Poglavlje 3

putovanje DNA

(–) elektroda

(+) elektroda

gel-elektroforeza

fotografija gela

λ DNA

razgradnja enzimom EcoRI

48,5 kb

21,2 kb

7,5 kb

5,7 kb

5,6 kb

4,9 kb

3,6 kb

21,2 kb

7,5 kb

5,7 kb 5,6 kb 4,9 kb

3,6 kb

Slika 3-14. Razgradnja λ DNA enzimom EcoRI i gel-elektroforeza. Enzim EcoRI kida λ DNA na pet mjesta (strjelice) ~ime nastaje {est fragmenata. Ti se fragmenti razdvajaju elektrofore- zom u agaroznom gelu. Fragmenti DNA putuju prema pozitivnoj elektrodi s tim da se manji fragmenti kre}u br`e, a ve}i sporije. Nakon elektroforeze, DNA se boji fluorescentnom bojom i fotografira. Prikazana je veli~ina fragmenata DNA.

(zbog fos fa ta u nji ho vim okos ni ca ma) te sto ga pu tu ju pre ma po zi tiv noj elek tro di (ano di). Gel dje lu je kao si to ko je se lek tiv no us po ra va ve }e mo le- ku le. Ma nje mo le ku le se sto ga kroz gel kre }u br ̀ e {to omo gu }u je da se mo- le ku le u smje si raz dvo je na os no vi raz li ka u ve li ~i ni.

Raz li ~i tim me to da ma mo gu }e je ut vr di ti re dos li jed res trik cij skih frag me- na ta i do bi ti (prim je ri ce) kar tu EcoRI res trik cij skih mjes ta u DNA l fa ga. Ut- vr |e ni po lo ̀ a ji res trik cij skih mjes ta za broj ne raz li ~i te res trik cij ske en do- nuk lea ze mo gu se is ko ris ti ti za stva ra nje de talj nih res trik cij skih ka ra tamo- le ku la DNA kao {to su prim je ri ce ge no mi vi ru sa (sli ka 3-15). Osim to ga, na- kon elek tro fo re ze mo gu }e je izo li ra ti po je di ne frag men te nas ta le raz grad- njom res trik cij skim-en do nuk lea za ma {to omo gu }u je nji ho vo de talj no is pi ti- va nje, prim je ri ce od re |i va nje sli je da nuk leo ti da u mo le ku li DNA. Na taj je na ~in ka rak te ri zi ra na DNA broj nih vi ru sa.

Sa ma raz grad nja res trik cij skim-en do nuk lea za ma me |u tim ne ma do volj- no razlu~ivanje za ana li zu ve }ih mo le ku la DNA, kao {to su prim je ri ce sta- ni~ ni ge no mi. Res trik cij ska-en do nuk lea za s mjes tom pre poz na va nja od {e st pa ro va ba za (kao {to je prim je ri ce EcoRI) sta tis ti~ ki }e gle da no pre po- zna ti jed no mjes to sva kih 4.096 pa ro va ba za (1/46). Sto ga se mo ̀ e o~e ki va ti da }e raz grad njom mo le ku le ve li ~i ne l DNA (48,5 kb) nas ta ti oko de set EcoRI frag me na ta {to je u skla du s re zul ta tom pri ka za nim na sli ci 3-14. Me-

Osnove molekularne biologije 107

adenovirus

l

BamHI

EcoRI

HindIII

Slika 3-15. Restrikcijske karte DNA bakteriofaga λ i adenovirusa. Polo`aj mjesta kidanja DNA bakterio- faga λ E. coli (48,5 kb) i humanog adeno- virusa 2 (35,9 kb) enzimima BamHI, EcoRI i HindIII.

rekombinantna molekula

fragment humane DNA

spajanje fragmenta humane DNA i vektora

uno{enje u E. coli

replikacija DNA

bakteriofagi koji sadr`avaju proizvedenu rekombinantnu DNA

λ vektor

Slika 3-16. Proizvodnja rekombi- nantnih molekula DNA. Fragment humane DNA ugra|en je u DNA λ vektora. Takva rekombinantna molekula zatim se unosi u E. coli gdje se umno`ava i stvara rekombinantno potomstvo bakteriofaga koje sadr`ava umetnuti fragment humane DNA.

|u tim raz grad nja ve }ih ge no ma res trik cij skim-en do nuk lea za ma da je zna- ~aj no dru ga ~i je re zul ta te. Prim je ri ce ge nom ~ov je ka sas to ji se od prib li` no 3 × 106 kb i sto ga se mo ̀ e o~e ki va ti da }e mo res trik cij skom raz grad njom do- bi ti vi {e od 500.000 EcoRI frag me na ta. Ta ko ve lik broj frag me na ta ni je mo gu- }e raz dvo ji ti, te aga roz na ge l-e lek tro fo re za ge no ma ~ov je ka raz gra |e nog res trik cij skom en do nuk lea zom EcoRI um jes to raz dvo je nih frag me na ta da je sa mo kon ti nui ra ni raz maz DNA. Ka ko ni je mo gu }e izo li ra ti po je di ne re- strik cij ske frag men te iz tak ve smje se, sa ma raz grad nja res trik cij skim nu- klea za ma ni je od go va ra ju }a me to da za prip ra vu ho mo ge nog uzor ka DNA za dalj nju ana li zu. Ve li ku ko li ~i nu pro ~i{ }e nih frag me na ta DNA mo gu }e je prip ra vi ti mo le ku lar nim klo ni ra njem.

Proizvodnja re kom bi nan tnih mo le ku la DNA Te melj na je stra te gi ja mo le ku lar no ga klo ni ra nja uni je ti frag me nt DNA ko ji nas za ni ma (prim je ri ce ko ma di} DNA ~ov je ka) u ne ku dru gu mo le ku lu DNA (zo ve mo je vek tor) ko ja se mo ̀ e sa mos tal no um na ̀ a ti u sta ni ci do ma- }i nu. Ta ko nas ta la hib rid na (re kom bi nan tna) mo le ku la ili mo le ku lar ni klon sas to ji se od ug ra |e no ga `e lje nog frag men ta DNA po ve za no ga s DNA vek to ra. Omo gu }i mo li tak vom vek to ru da se um no ̀ i u od go va ra ju- }em do ma }i nu do bit }e mo ve lik broj ko pi ja ug ra |e no ga frag men ta DNA. Prim je ri ce frag me nt DNA ~ov je ka mo gu }e je ug ra di ti u l vek tor (sli ka 3- 16). Tak ve re kom bi nan tne mo le ku le ta da je mo gu }e uni je ti u bak te ri ju E. co li gdje se one u~in ko vi to raz mno ̀ a va ju, a mi li ju ni no vih bak te rio fa ga l sad r ̀ avat }e mi li ju ne ko pi ja ug ra |e no ga `e lje nog frag men ta hu ma ne DNA. Dok na{ ̀ e lje ni frag me nt pred stav lja mo` da jed nu sto ti su }in ku ge no- ma ~ov je ka, na kon ug rad nje u l vek tor on ~i ni prib li` no jed nu de se ti nu DNA vek to ra. Taj je frag me nt sa da la ko raz dvo ji ti od os tat ka DNA vek to ra raz grad njom res trik cij skim en do nuk lea za ma i ge l-e lek tro fo re zom. Re zul tat je ve lik broj ko pi ja ho mo ge no ga pro ~i{ }e nog frag men ta hu ma ne DNA ko ji mo ̀ e mo ana li zi ra ti i nji me da lje ru ko va ti.

Frag men te DNA ko ji ma se ko ris ti mo za stva ra nje re kom bi nan tnih mo le- ku la obi~ no prip rav lja mo raz grad njom res trik cij skim en do nuk lea za ma. Mno gi od tih en zi ma ki da ju u mjes tu pre poz na va nja ta ko da os tav lja ju na- zub lje ne (ljep lji ve) kra je ve jed no lan ~a ne DNA ko ji se me |u sob no mo gu po ve za ti kom ple men tar nim spa ri va njem ba za (sli ka 3-17). Ve zu iz me |u tih kra je va po ve za nih kom ple men tar nim spa ri va njem ba za mo gu }e je u~vr sti- ti tret ma nom s DNA-li ga zom, en zi mom ko ji zat va ra pre ki de u lan ci ma DNA (vi di 5. pog lav lje). Na taj je na ~in mo gu }e u re kom bi nan tnu mo le ku lu DNA po ve za ti dva raz li ~i ta frag men ta DNA (prim je ri ce frag me nt DNA ~o vje ka i DNA l vek tora) prip rav lje na raz grad njom s po mo }u is te res trik cij- ske endo nuk lea ze.

Frag men ti DNA ko je mo ̀ e mo klo ni ra ti ne mo ra ju nu` no zav r {a va ti od- go va ra ju }im sli je dom nuk leo ti da ko ji pre poz na ju res trik cij ske en do nu klea- ze). Nai me, na tu pe kra je ve bi lo ko jeg frag men ta DNA mo gu }e je do da ti sin te ti~ ke DNA-spoj ni ce ko je sad r ̀ avaju mjes ta pre poz na va nja za ve lik broj raz li ~i tih res trik cij skih en do nuk lea za. Te su spoj ni ce krat ki oli go nuk leo-

108 Poglavlje 3

C

G

G

C

A

T

5' 3'

fragment DNA koji se ugra|uje DNA vektora

rekombinanta molekula

EcoRI

3' 5'

A T T

T A A

C

G

G

C

A

T

5' 3'

3' 5'

A T T

T A A

EcoRI

EcoRI EcoRI

G

C T

5' 3'

3' 5'

T A A

G

C T

5'

3'

T A A

C

G

A

5' 3'

3' 5'

A T T

kidanje pomo}u EcoRI

komplementarno sparivanje baza

povezivanje DNA-ligazom

kidanje pomo}u EcoRI

C

G

A

3'

5'

A T T

G

C T

5'

3'

T A A

C

G

A

3'

5'

A T T

Kidanjem s pomo}u EcoRI nastaju ljepljivi krajevi jednolan~ane DNA.

Slika 3-17. Povezivanje molekula DNA. Vektor i fragment DNA koji treba ugra- diti raz gra|uju se istom restrikcijskom- en do nukleazom (primjerice EcoRI) ko ja kida DNA ostavljaju}i produ`ene jedno- lan~ane ljepljive krajeve. DNA vektora i fragmenta koji se ugra|uje prvo se povezu ju komplementarnim spariva- njem baza, a zatim djelovanjem DNA- ligaze nastaju kovalentne veze koje stabiliziraju rekombinantnu mole kulu.

cDNA klon

mRNA

cDNA

cDNA kopije molekule RNA pripravljaju se obrnutim pre- pisivanjem s pomo}u enzi- ma reverzne transkriptaze

Oligonukleotidne spojnice koje sadr`avaju mjesta pre- poznavanja za restrikcijske- endonukleaze dodaju se na krajeve cDNA.

cDNA se ugra|uje u odgovaraju}i vektor.

Slika 3-18. Kloniranje cDNA.

ti di ko je je la ko prip ra vi ti ke mij skom sin te zom, a omo gu }u ju da se prak ti- ~no bi lo ko ji frag me nt DNA prip re mi za ug rad nju u vek tor.

Osim molekula DNA mo gu }e je klo ni ra ti i molekule RNA (sli ka 3-18). Pr- vi je ko rak u tom pro ce su prip ra vi ti DNA ko pi ju mo le ku le RNA ko ris te }i en zim re ver znu tran skrip ta zu. Ta ko proiz ve de nu mo le ku lu DNA (na zi va- mo je cDNA jer je kom ple men tar na mo le ku li RNA ko ju smo ko ris ti li kao ka lup) mo gu }e je ug ra di ti u vek tor na ve} opi sa ni na ~in. Bu du }i da su eu ka- riot ski ge ni naj ~e{ }e is pre ki da ni ne ko di ra ju }im re dos li je di ma (in tro ni ma, vi di 4. pog lav lje) ko ji se prek ra ja njem (en gl. spli ci ng) uk la nja ju iz mR NA, mo gu} no st klo ni ra nja i cDNA i ge nom ske DNA bi la je klju~ na za ra zu mi je- va nje struk tu re i fun kci je ge na

Vektori za re kom bi nan tnu DNA Ovis no o ve li ~i ni frag men ta DNA ko ji ̀ e li mo ug ra di ti i svr si ek spe ri men-

ta ko ji pla ni ra mo, za prip ra vu re kom bi nan tnih mo le ku la na ras po la ga nju nam je vi{e raz li ~i tih ti po va vek to ra za klo ni ra nje. Pre ma nam je ni ih mo ̀ e- mo po di je li ti na tri os nov na sus ta va: vek to re za izo la ci ju i um na ̀ a nje klo ni- ra ne DNA, vek to re za ek spre si ju klo ni ra ne DNA i vek to re za unos re kom bi- nan tnih mo le ku la DNA u eu ka riot ske sta ni ce.

Osnove molekularne biologije 109

rekombinantni fagi

cos

cos cos

cos

bakterijska livada

plak faga

l vektor

pakiranje u ~estice faga

inficiranje bakterije E. coli

razgradnja pomo}u EcoRIi ligacija

fragmenti DNA ~ovjeka

svaki rekombinantni fag tvori odvojeni plak

EcoRI

Slika 3-19. Kloniranje u vektorima bakteriofaga λ. Vektor sadr`ava restrikcijsko mjesto (pri- mjerice mjesto prepoznavanja EcoRI) za ugradnju klonirane DNA. Osim toga, na oba kraja DNA vektora nalaze se cos mjesta (kohezivni krajevi) koji su potrebni za ugradnju DNA u ~estice faga. Umetak DNA (primjerice humane DNA) spaja se s vektorom, a takva se rekombinantna DNA ugra |uje u ~estice faga mije{anjem s proteinima bakte- riofaga. Takvim se rekombinantnim bakteriofagima zatim inficira E. coli. Svaki rekombinantni fag nosi po jedan specifi~ni umetak klonirane DNA i tvori odvojeni plak na bakterijskoj kulturi. Iz takvog je pojedinog plaka mogu}e izoli- rati i u velikoj koli~ini umno`iti potom- stvo faga koje sadr`ava kopije umetnute molekule DNA.

Vek to ri iz ve de ni iz bak te rio fa ga l ~es to se ko ris te za po ~et nu izo la ci ju ge- nom ske DNA ili cDNA iz eu ka riot skih sta ni ca (sli ka 3-19). Iz l vek to ra za klo ni ra nje uk lo nje ni su di je lo vi ge no ma bak te rio fa ga ko ji ni su nu` ni za u mna ̀ a nje vi ru sa, a za mi je nje ni su s je din stve nim res trik cij skim mjes ti ma za ug rad nju klo ni ra ne DNA. Ve li ~i na frag men ta DNA ko ji je mo gu }e ug ra- di ti u tak ve vek to re og ra ni ~e na je na prib li` no 15 kb zbog nu` nos ti pa ki ra- nja tak vog re kom bi nan tno ga ge no ma u ~es ti ce fa ga. @e li mo li prim je ri ce izo li ra ti ge nom ske klo no ve DNA ~ov je ka, spo jit }e mo na su mi~ ne frag men- te pros je~ ne ve li ~i ne oko 15 kb s kra je vi ma l vek to ra. Tak vu re kom bi nant- nu DNA mo gu }e je u~in ko vi to ug ra di ti u ~es ti ce fa ga mi je {a ju }i je s l pro tei- ni ma (ko je na zi va mo ek strak ti za pa ki ra nje) in vit ro. S tak vim ~es ti ca ma fa- ga za tim in fi ci ra mo kul tu re E. co li. Bu du }i da sva ka ~es ti ca fa ga stva ra od vo- je ni plak, mo gu }e je izo li ra ti re kom bi nan tne mo le ku le ko je sad r ̀ avaju sa- mo je dan spe ci fi~ ni frag me nt DNA ~ov je ka. Re kom bi nan tne vek to re ko ji sad r ̀ avaju spe ci fi~ ni gen ko ji nas za ni ma mo gu }e je iden ti fi ci ra ti hib ri di za- ci jom nuk lein skih ki se li na ili ne kim dru gim me to da ma pret ra ̀ i va nja (opi- sa no u nas tav ku ovo ga pog lav lja).

Plaz mid ni vek to ri (sli ka 3-20) omo gu }u ju lak {e ru ko va nje klo ni ra nim mo le ku la ma DNA od bak te rio fag nih vek to ra. Plaz mi di su ma le kru` ne mo- le ku le DNA ko je u bak te rij skim sta ni ca ma pos to je kao slo bod ne mo le ku le

110 Poglavlje 3

plazmidni vektor

rekombinantni plazmid

Ampr

Ampr

ori

ori

EcoRI razgradnja s EcoRI i ligacija

fragmenti DNA za ugradnju

transformacija E. coli s rekombinantnim plazmidima

medij koji sadr`ava ampicilin

izolacija pojedina~ne kolonije

umetak strane DNA

nasa|ivanje bakterija na medij s ampicilinom

kolonije bakterija koje su rezistentne na ampicilin

bakterija koja sadr`ava rekombinantni plazmid

E. coli DNA

Slika 3-20. Kloniranje u plazmidne vektore. Vektor je mala kru`na molekula koja ima ishodi{te replikacije (ori), gen koji nosi rezistenciju na ampicilin (Ampr) i restrikcijsko mjesto (primjerice EcoRI) u koje je mogu}e ugraditi stranu DNA. Fragment strane DNA ugra|uje se u ve- ktor i rekombinantnim se plazmidima transformira bakterija E. coli. Bakterije se nasa|uju na medij koji sadr`ava ampicilin na kojem kolonije stvaraju samo one bakterije koje sadr`avaju pla- zmidnu DNA zbog koje su postale re- zistentne na ampicilin. Klonove bakte- rija koji sadr`avaju pojedine plazmide mogu}e je izolirati i umno`iti u velikoj koli~ini radi izolacije rekombinantnih plazmida.

(ni su in teg ri ra ne u bak te rij ski »kro mo so m«) te se um no ̀ a va ju neo vis no o kro mo som skoj DNA. Sve {to je pot reb no ima ti u plaz mid noj DNA je is ho- di{ te rep li ka ci je (sli jed nuk leo ti da ko ji DNA-po li me ra zu sta ni ce do ma }i na upu }u je da rep li ci ra stra nu mo le ku lu DNA). Osim is ho di{ ta rep li ka ci je, plaz mid ni vek to ri sad r ̀ ava ge ne za re zis ten ci ju na an ti bio ti ke (prim je ri ce re zis ten ci ju na am pi ci lin) ko ji omo gu }u ju oda bir bak te ri ja s re kom bi nant- nim plaz mi dom. Ve li ~i na plaz mid nih vek to ra obi~ no je iz me |u 2 i 4 kb DNA, {to je zna ~aj no ma nje od ve li ~i ne DNA l vek to ra (30 do 45 kb) i sto ga olak {a va ana li zu ug ra |e no ga frag men ta DNA.

Osnove molekularne biologije 111

Da bi se od re |e ni frag me nt DNA klo ni rao u plaz mid ni vek tor on se naj- pri je mo ra ug ra di ti u od go va ra ju }e res trik cij sko mjes to na tom vek to ru, a za tim se ta ko nas ta lom re kom bi ni ra nom mo le ku lom tran sfor mi ra bak te ri ja E. co li. Za tim se oda bi ru ko lo ni je ko je su re zis ten tne na an ti bio tik, jer one sad r ̀ avaju plaz mid nu DNA. Bak te ri je u ko ji ma se na la ze plaz mi di mo gu }e je sad um no ̀ i ti u `e lje nim ko li ~i na ma i iz njih izo li ra ti DNA. Ma le kru` ne mo le ku le plaz mid ne DNA, ko jih ~es to ima vi {e sto ti na u sva koj sta ni ci, mo- gu }e je raz dvo ji ti od kro mo som ske DNA bak te ri ja. Re zul tat je pro ~i{ }e na plaz mid na DNA ko ja je prik lad na za dalj nju ana li zu ug ra |e no ga frag men- ta DNA.

Broj ne ana li ze ge nom ske DNA zah ti je va ju klo ni ra nje frag me na ta DNA ve }ih no {to ih mo gu prih va ti ti l vek to ri. Za tu se nam je nu ko ris te pet glav- nih ti po va vek to ra (ta bl. 3-3). Koz mid ni vek to ri mo gu prih va ti ti umet ke ve- li ~i ne oko 45 kb. Ovi vek to ri sad r ̀ avaju DNA bak te rio fa ga l ko ja omo gu }u- je u~in ko vi tu ug rad nju klo ni ra ne DNA u ~es ti ce fa ga. Koz mid ni vek to ri sad r ̀ avaju i is ho di{ te rep li ka ci je i ge ne za re zis ten ci ju na an ti bio ti ke svoj- stve ne plaz mi di ma, pa se mo gu rep li ci ra ti kao plaz mi di u bak te rij skim sta- ni ca ma. Dru ga dva ti pa vek to ra iz ve de na su pak iz bak te rio fa ga P1 i mo gu prih va ti ti frag men te DNA ve li ~i ne od 70 do 100 kb. Sad r ̀ avaju sljedove nukleotida ko je omo gu }u ju in vit ro ug rad nju re kom bi nan tne DNA u ~es ti- ce P1 fa ga, a u bak te ri ji E. co li se mo gu neo vis no rep li ci ra ti po put plaz mi da. Ta koz va niP1 um jet ni kro mo so mi (PAC – en gl. P1 ar ti fi cial chro mo so me) ta ko- |er sad r ̀ avaju sljedove bak te rio fa ga P1, ali se u bak te ri ju E. co li uno se iz- rav no kao plaz mi di, a prih va }a ju frag men te DNA ve li ~i ne od 130 do 150 kb. Bak te rij ski um jet ni kro mo so mi (BAC – en gl. bac te rial ar ti fi cial chro mo so- me) su vek to ri iz ve de ni iz pri rod nog plaz mi da ko ji na la zi mo u E. co li (na zi- va mo ga F fak tor). Is ho di{ te rep li ka ci je i os ta li re dos li je di F fak to ra omo gu- }u ju da se BAC rep li ci ra kao sta bil ni plaz mid ~ak i uz umet ke od 120 do 300 kb. Jo{ ve }e frag men te DNA (250 – 400 kb) mo gu }e je klo ni ra ti u vek to ru ko ji na zi va mo kva{~ev um jet ni kro mo som (YAC – en gl. yea st ar ti fi cial chro- mo so me). Ti vek to ri sad r ̀ avaju is ho di{ te rep li ka ci je kvas ca i ne ke dru ge ele- men te (cen tro me re i te lo me re, vi di 4. pog lav lje) ko ji im omo gu }u ju da se rep li ci ra ju u sta ni ca ma kvas ca kao li near ne mo le ku le sli~ ne kro mo so mi ma.

Sekvenciranje DNA Mo le ku lar no klo ni ra nje omo gu }u je izo la ci ju po je di na~ nih frag me na ta DNA u ko li ~i na ma ko je su prik lad ne za de talj nu ka rak te ri za ci ju i od re |i va- nje sli je da nuk leo ti da. Od re |i va nje sli je da nuk leo ti da broj nih ge na ot kri lo je struk tu re nji ho vih pro tein skih pro du ka ta, a raz jas ni lo je i svoj stva slje- dova DNA ko ji re gu li ra ju nji ho vu ek spre si ju. [to vi {e, sli jed nuk leo ti da u ko di ra ju }im re gi ja ma no vih ge na ~es to je sro dan sli je du nuk leo ti da u ne- kim ve} ot pri je poz na tim ge ni ma pa je fun kci ju no voot kri ve nih ge na ~es to mo gu }e pre poz na ti na os no vi sli~ nos ti u sljedovima nukleotida.

Suv re me ne me to de sek ven ci ra nja DNA su br ze i to~ ne pa je da nas od re- |i va nje sli je da nuk leo ti da DNA od ne ko li ko ki lo ba za raz mjer no jed nos ta-

Tablica 3-3. Vektori za kloniranje velikih fragmenata DNA

Vektor Veli~ina fragmenta (kb) Stanica doma}in Kozmidi 30–45 E. coli Bakteriofag P1 70–100 E. coli P1 umjetni kromosomi (PAC) 130–150 E. coli Bakterijski umjetni kromosomi (BAC) 120–300 E. coli Kva{~ev umjetni kromosom (YAC) 250–400 kvasac

112 Poglavlje 3

A A

ddG ddA ddC ddT

C C C

G CA T

putovanje fragmenata

elektroforeza

autoradiografija

sinteza DNA u prisutnosti dideoksinukleotida koji zaustavljaju sintezu

2', 3' dideoksinukleotid

2'3'

5'

3' 5'

5' 3'

slijed nukleotida u komplementarnom lancu

T

T T T T

TA A CC GGC T GAA A CC GGC T GA A A CC GGC T A A A CC GGCA T

C GGC T A AC GGC T CGT

GT AC GGC T

G G G

O

H

H

H

H

O

PPP

C baza

T

G

A

C

A

A

G

C

G

radioaktivna po~etnica

Slika 3-21. Sekvenciranje DNA Sangerovom metodom. Dideoksinukleotidi kojima nedostaje OH skupina i na 3' i na 2' polo`aju de- oksiriboze koriste se za prekidanja sin- teze DNA na specifi~nim bazama. Te se molekule normalno ugra|uju u rastu}e lance DNA. Budu}i da im nedostaje 3' OH skupina, na njih nije mogu}e po- vezati sljede}i nukleotid pa na tom mjestu prestaje daljnja sin teza DNA. Sinteza DNA zapo~inje ra dio aktivno obilje`enom po~etnicom. Provode se ~etiri neovisne reakcije od kojih svaka osim ~etiri normalna de oksinukleotida sadr`ava i manju ko li ~i nu jednog od dideoksinukleotida. Sva ka od ~etiriju reakcija rezultirat }e serijom moleku- la DNA koje zapo~inju radioaktivno obilje`enom po~etnicom, a zavr{avaju dideoksinukleotidom ugra |enim na mjesto odre|ene nor malne baze. Pro- dukti reakcija tada se razdvoje elektro- forezom i analiziraju autoradiografijom kako bi se odredio slijed nukleotida.

van za da tak. Sto ga je neus po re di vo jed nos tav ni je klo ni ra ti i sek ven ci ra ti DNA ne go {to je od re di ti sli jed ami no ki se li na u pro tei nu {to ga taj gen ko di- ra. Bu du }i da sli jed nuk leo ti da u ge nu mo ̀ e mo iz rav no pre ves ti u sli jed ami no ki se li na u pro tei nu, naj lak {i na ~in od re |i va nja pri mar ne struk tu re pro tei na je sek ven ci ra nje klo ni ra no ga ge na ili cDNA.

Naj ~e{ }a me to da za sek ven ci ra nje DNA zas ni va se na preu ra nje nom pres tan ku sin te ze DNA zbog ug rad nje di deok si nuk leo ti da (ko ji ne ma ju 3' OH sku pi nu na deok si ri bo zi) ko ji pre ki da ju sin te zu DNA lan ca DNA-po li- me ra zom (sli ka 3-21). Sin te za DNA za po ~i nje po ~et ni com ko ja je na jed nom kra ju obi lje ̀ e na ra dioi zo to pom. Pro vo de se ~e ti ri neo vis ne reak ci je od ko jih sva ka osim nor mal nih nuk leo ti da sad r ̀ ava i po je dan od di deok si nuk leo ti- da (A, C, G ili T). Ug rad nja di deok si nuk leo ti da zaus tav lja sin te zu DNA jer je 3' OH sku pi na nu` na za ve za nje slje de }eg nuk leo ti da. Na taj na ~in nas ta- je se ri ja obi lje ̀ e nih mo le ku la DNA ko je sve zav r {a va ju ba zom ko ja od go va- ra di deok si nuk leo ti du ko ri{ te nom u toj reak ci ji. Ti se frag men ti DNA za tim raz dva ja ju pre ma ve li ~i ni ge l-e lek tro fo re zom i de tek ti ra ju iz la ga njem ge la fil mu os jet lji vom na X-zra ke (au to ra diog ra fi ja). Ve li ~i na sva kog frag men ta od re |e na je po lo ̀ a jem na ko ji se ug ra dio di deok si nuk leo tid, sto ga sli jed nuk leo ti da u DNA od go va ra re dos li je du frag me na ta ko ji pro ~i ta mo s ge la.

Osnove molekularne biologije 113

fotomultiplikator

A A

ddG ddA ddC ddT

C C C

putovanje fragmenata

laserska zraka fluorescencija ra~unalo

spojiti produkte

elektroforeza

reakcija sekvenciranja koristi po~etnice obilje`ene razli~itim fluorescentnim biljezima za svaki dideoksinukleotid

jednolan~ana DNA koju treba sekvencirati 3' 5' T T T T

CA

G G G

A AC C CT T T TG G G

CA

A AC C CT T T TG G G

CA

A AC C CT T T TG G

CA

A AC C CT T T TG G G

Slika 3-22. Automatizirano sekvenciranje DNA. Provode se ~etiri odvojene reakcije se- kven ciranja od kojih svaka sadr`i po ~et- nicu obilje`enu specifi~nim flu ores- centnim biljegom i jedan od di de oksi- nukleotida koji }e prekinuti sintezu lanca DNA. Reakcijski produkti se tada mije{aju i analiziraju gel-elektrofore- zom. Kako lanci DNA putuju kroz gel, nailaze na lasersku zraku koja pobu|uje fluorescentni biljeg. Emitiranu fluores- centnu svjetlost detektira fotomulti- plikator povezan s ra~unalom koje pri- kuplja i analizira podatke.

Sek ven ci ra nje DNA ~es to se iz vo di i po mo }u au to ma ti zi ra nih sus ta va ko ji ko ris te fluo res cen tno obi lje ̀ e ne po ~et ni ce u reak ci ji ug rad nje di de oksi- nuk leo ti da (sli ka 3-22). No vo sin te ti zi ra ni lan ci DNA iz la ze iz ge la za elek tro- fo re zu i pro la ze kroz la ser sku zra ku ko ja po bu |u je fluo res cen tni bi ljeg. Emi ti ra nu svjet lo st od~i ta va fo to mul tip li ka tor, a ra ~u na lo pri kup lja i ana li zi- ra po dat ke. Tak va au to ma ti za ci ja ja ko je ub r za la sek ven ci ra nje {to je bi lo pot reb no za od re |i va nje sli je da nuk leo ti da cje lo kup no ga ge no ma ~ov je ka, kao i ge no ma broj nih bak te ri ja, glji vi ca, vr sta po put Ara bi dop sis tha lia na, Caeno rhabditis ele ga ns, Dro sop hi la me la no gas ter, te mi {a.

Ekspresija klo ni ra nih ge na Osim od re |i va nja sli je da nuk leo ti da po je di no ga ge na, te sto ga i sli je da ami- no ki se li na u nje go vom pro tein skom pro duk tu, mo le ku lar no klo ni ra nje je omo gu }i lo prip ra vu ve li kih ko li ~i na pro tei na za struk tur na i fun kcio nal na is pi ti va nja. Ve }i na pro tei na pri sut na je u vr lo ma lim ko li ~i na ma u eu ka riot- skim sta ni ca ma, sto ga je kon ven cio nal nim bio ke mij skim me to da ma ne mo- gu }e prip ra vi ti ve }e ko li ~i ne tih pro tei na. Me |u tim, kad jed nom ima mo klo ni ra ni gen, taj prob lem mo ̀ e mo ri je {i ti ko ris te }i po seb no di zaj ni ra ne vek to re ko ji omo gu }u ju sna` nu ek spre si ju klo ni ra no ga ge na u bak te rij- skim ili eu ka riot skim sta ni ca ma.

komentari (1)

ovo je samo pregled

3 prikazano na 48 str.

preuzmi dokument