M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb
tena_zovko
tena_zovko28 October 2017

M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb

PDF (12 MB)
42 str.
78broj poseta
Opis
Molekularna biologija, 4. poglavlje, organizacija i redoslijed stanicnih genoma
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 42

ovo je samo pregled

3 prikazano na 42 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 42 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 42 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 42 str.

preuzmi dokument
04-pogl.indd

Dio II

Protok geneti~kih informacija

4 Organizacija i redosljed stani~nih genoma

5 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA

6 Sinteza i dorada (sazrijevanje) RNA

7 Sinteza, dorada i regulacija proteina

Poglavlje 4 Organizacija i redosljedi stani~nih genoma

Slo`enost eukariotskih genoma 139

Kromosomi i kromatin 150

Redosljedi ~itavih genoma 158

KLJU^NI POKUS: Otkri}e introna 142

KLJU^NI POKUS: Humani genom 170

K AO GE NE TI^ KI MA TE RI JAL, DNA DA JE NAC RT ZA US MJE RA VA NJE svih sta ni~ nih ak tiv nos ti kao i za od re |i va nje pla na raz vo ja vi {es ta ni~ nih or ga ni za ma. Ra zu mi je va nje struk tu re i fun kci je ge na pre ma to me je od fun da men tal-

ne va` nos ti za ra zu mi je va nje mo le ku lar ne bio lo gi je sta ni ce. Raz voj me to da klo- ni ra nja ge na pred stav ljao je naj va` ni ji ko rak pre ma ovom ci lju jer je omo gu }io znan stve ni ci ma se ci ra nje slo ̀ e nih eu ka riot skih ge no ma kao i prou ~a va nje funk- ci je eu ka riot skih ge na. Kon ti nui ra no nap re do va nje teh no lo gi je re kom bi nan tne DNA do ve lo nas je sa da do uz bud lji vog tre nut ka od re |i va nja re dos li je da pa ro- va ba za ~i ta vih ge no ma {to omo gu }u je no vi pris tup de {if ri ra nju ge ne ti~ ke os no- ve po na {a nja sta ni ce.

Kao {to je iz lo ̀ e no u 3. pog lav lju, po ~et na prim je na teh no lo gi je re kom bi nant- ne DNA bi la je us mje re ne na izo la ci ju i ana li zu po je di nih ge na. Unu tar pos ljed- njih ne ko li ko go di na, glo bal ni ji pris tup sek ven ci ra nja ~i ta vih ge no ma do veo je do sek ven ci ra nja kom plet nih ge nom skih re dos li je da mno gih bak te ri ja, kvas ca, ne ko li ci ne bilj nih i `i vo tinj skih vr sta te ~ov je ka. Pot pu ni redosljedi sta ni~ nih ge- no ma dali su bo ga tu `et vu in for ma ci ja, me |u ko ji ma su i ot kri }a mno gih do sa- da ne poz na tih ge na. Od re zul ta ta pro je ka ta sek ven ci ra nja ge no ma o~e ku je se da }e ~i tav niz go di na sti mu li ra ti bu du }a is tra ̀ i va nja u mo le ku lar noj i sta ni~ noj bio lo gi ji te da }e ima ti zna ~a jan ut je caj na na {e ra zu mi je va nje i te ra pi ju bo les ti u ~ov je ka.

Slo ̀ e no st eu ka riot skih ge no ma Ge no mi ve }i ne eu ka rio ta ve }i su i slo ̀ e ni ji od pro ka riot skih (sli ka 4-1.). Ve li ~i na eu ka riot skih ge no ma ni je sa ma po se bi iz ne na |u ju }a, bu du }i da bi se i o~e ki va lo da se u slo ̀ e ni jim or ga niz mi ma na la zi vi {e ge na. Ipak, iz gle da da ve li ~i na ge no- ma ni je u raz mje ru sa ge ne ti~ kom slo ̀ e no{ }u. Prim je ri ce, ge no mi da` dev nja ka i lji lja na sad r ̀ avaju vi {e od de set pu ta ve }u ko li ~i nu DNA od ljud sko ga ge no ma, pa ipak, pos ve je jas no da ovi or ga niz mi ni su de set pu ta slo ̀ e ni ji od ljud skog.

Ovaj pri vid ni pa ra do ks tu ma ~i se ot kri }em da ge no mi ve }i ne eu ka riot skih sta- ni ca ne sad r ̀ avaju sa mo fun kcio nal ne ge ne ve} i ve li ke ko li ~i ne DNA sljedova ko ji ne ko di ra ju pro tei ne. Raz li ka u ve li ~i ni iz me |u ge no ma da` dev nja ka i ~ov je- ka dak le vi {e od ra ̀ a va raz li ku u ve }oj ko li ~i ni ne ko di ra ju }ih sljedova ne go li u ve }em bro ju ge na u da` dev nja ka. Pri sut no st ve li ke ko li ~i ne ne ko di ra ju }ih slje-

140 Poglavlje 4

Sli ka 4-1. Ve li ~i na ge no ma. Ras pon ve li ~i ne ge no ma rep re zen ta tiv- nih sku pi na or ga ni za ma pri ka zan je na lo ga ri tam skoj ska li.

105 106 107 108 109 1010 1011 1012

parova baza po haploidnom genomu

bakterije

gljive

kvasac

ljiljan

`aba da`devnjak

pile

~ovjek

Arabidopsis

E. coli

Haemophilus influenzae

vo}na mu{ica

biljke

kukci

vodozemci

ptice

sisavci

mikoplazma

dova je st op }e svoj stvo ge no ma slo ̀ e nih eu ka rio ta. Iz to ga sli je di da ti su }u pu ta ve }a du lji na ljud sko ga ge no ma u us po red bi s onim u E. co li nije uz ro- ko va na sa mo ve }im bro jem ljud skih ge na. Za ljud ski ge nom se pret pos ta- vlja da sad r ̀ ava 30.000 − 40.000 ge na, sa mo 10 pu ta vi {e ne go li onaj E. co li.

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 141

egzon 1

razdvojni slijed

primarni transkript RNA

mRNA

razdvojni slijed 5' 3'

5'

5'

3' 5'

3'

3'

egzon 2 egzon 3

intron 2intron 1

transkripcija

prekrajanje

kromosomska DNA

Sli ka 4-2. Struk tu ra eu ka riot skih ge na. Ve }i na eu ka riot skih ge na sad r ̀ ava seg men te ko di ra ju }ih sljedova (egzo- ni) ko ji su is pre ki da ni ne ko di ra ju }im slje dovima (in tro ni). In tro ni i egzoni za- jed no se pre pi su ju u du ga~ ki pri mar ni transkript RNA. Na kon to ga se pri li kom for mi ra nja zre le mR NA prek ra ja njem uk la nja ju in tro ni.

Pre ma to me, ve li ki dio slo ̀ e nos ti eu ka riot skih ge no ma re zul tat je ve li ke ko- li ~i ne ne ko li ko raz li ~i tih ti po va ne ko di ra ju }ih sljedova ko ji ~i ne ve }i nu DNA u sta ni ca ma vi {ih eu ka rio ta.

In tro ni i egzo ni Pre ma mo le ku lar noj ter mi no lo gi ji gen se mo ̀ e de fi ni ra ti kao dio DNA ko ji se ek spri mi ra u vi du fun kcio nal nog pro duk ta i to bi lo u ob li ku RNA (prim je- ri ce ribosomne i tran spor tne RNA) bi lo u ob li ku po li pep ti da. Ne ke od ne ko- di ra ju }ih DNA u eu ka rio ta ub ra ja ju se u du ge DNA slje do ve ko ji le ̀ e u pros to ri ma iz me |u ge na (raz dvoj ni sljedovi, en gl. spa cer). Me |u tim, unu tar ve }i ne eu ka riot skih ge na ta ko |er se na la ze ve li ke ko li ~i ne ne ko di ra ju }ih sljedova DNA. Tak vi ge ni ima ju po di je lje nu struk tu ru u ko ji ma su seg men ti ko di ra ju }ih sljedova (egzoni) raz dvo je ni s po mo }u ne ko di ra ju }ih sljedova (in tro ni) (sli ka 4-2). ^i tav gen se pre pi su je u du ga~ ku RNA mo le ku lu, a on- da se in tro ni uk la nja ju pro ce som prek ra ja nja (en gl. spli ci ng) ta ko da sa mo egzoni os ta ju uk lju ~e ni u mo le ku lu RNA. Ia ko in tro ni ne ma ju ni kak vu po- zna tu ulo gu, oni pred stav lja ju zna ~a jan dio DNA u ge no mi ma vi {ih eu ka rio- ta.

In tro ni su po pr vi put neo vis no ot kri ve ni 1977. go di ne u la bo ra to ri ji ma Phil li pa Shar pa i Ric har da Ro ber tsa pri li kom is tra ̀ i va nja rep li ka ci je ade no- vi ru sa u kul ti vi ra nim hu ma nim sta ni ca ma. Ade no vi rus pred stav lja ko ris tan mo del za prou ~a va nje gen ske ek spre si je za to {to ge nom ovog vi ru sa sad r- `ava sa mo oko 3,5 × 104 parova, ba za kao i za to {to se u za ra ̀ e nim sta ni ca- ma proiz vo de ve li ke ko li ~i ne mR NA ade no vi ru sa. Je dan od pris tu pa ko ri{ te- nih za ka rak te ri za ci ju ade no vi rus ne mR NA i{ao je pre ko od re |i va nja smje- {ta ja od go va ra ju }ih vi rus nih ge na pro mat ra njem RNA-DNA hib ri da elek- tron skim mik ros ko pom. Bu du }i da se RNA-DNA hib ri di mo gu raz li ko va ti od jed no lan ~a ne DNA, mo gu se od re di ti po lo ̀ a ji RNA-pri je pi sa na mo le ku- li DNA. Za ~u do, ovak vi ek spe ri men ti ot kri li su da se ade no vi rus ne mR NA ne hib ri di zi ra ju sa mo s jed nim pod ru~ jem vi rus ne DNA (sli ka 4-3). Um jes to to ga, po je di na mo le ku la mR NA hib ri di zi ra se s ne ko li ko od vo je nih pod ru- ~ja vi rus no ga ge no ma. Iz to ga sli je di da ade no vi rus na mR NA ne od go va ra nep re kid nom pri je pi su DNA ka lu pa; zap ra vo, mR NA se skla pa iz ne ko li ci- ne raz li ~i tih blo ko va sljedova ko ji pot je ~u iz raz li ~i tih di je lo va vi rus ne DNA. Kas ni je se po ka za lo da se to od vi ja uz po mo} prek ra ja nja RNA (en gl. RNA spli ci ng) {to ~e mu de talj no pri ka za ti u 6. pog lav lju.

Ub r zo na kon ot kri }a in tro na u ade no vi ru sa, pri mi je }e na je sli~ na po ja va u klo ni ra nim ge ni ma eu ka riot skih sta ni ca. Prim je ri ce, elek tron sko mik ro- skop ska ana li za RNA-DNA hib ri da i nak nad no sek ven ci ra nje klo ni ra nih ge- nom skih DNA i cDNA po ka za li su da je ko di ra ju }a re gi ja mi{ jeg b-globinsko- ga ge na (ko ji ko di ra b pod je di ni cu he mog lo bi na) pre ki nu ta dva ma in tro ni-

142 Poglavlje 4

Otkri}e introna

Spliced Segments at the 5' Terminus of Adenovirus 2 Late mRNA Susan M. Berget, Claire Moore, and Phillip A. Sharp Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Volume 74, 1977, pages 3171–3175

KLJU^NI POKUS

Elek tron sko mik ros kop ska sli ka i pra }e nje hek son ske mR NA ko ja se hib ri di zi ra la s ade no vi- rus nom DNA. Jed no lan ~a ne pet lje oz na ~e ne A, B i C od go va ra ju in tro ni ma.

hibrid

C

A

B 3'

Richard Roberts

Phillip Sharp

Kon tek st

Pri je ne go li se raz vi lo mo le ku lar no klo- ni ra nje ma lo se zna lo o sin te zi mR NA u eu ka riot skoj sta ni ci. Ipak, bi lo je jas no da je ovaj pro ces pu no slo ̀ e ni ji u eu ka rio ta ne go u bak te ri ja. Iz gle da lo je da sin te za eu ka riot skih mR NA tre ba osim tran skrip ci je ta ko |er i reak ci je do ra de ko je mo di fi ci ra ju struk tu ru pri mar nih tran skri pa ta. Ono {to je tu bi lo naj zna ~aj ni je je st da se ~i ni lo kao da se eu ka riot ske mR NA sin te ti zi ra ju u ob li ku du ga~ kih pri mar nih tran- skri pa ta u jez gri, a on da kida ju da se stvo re pu no kra }e mo le ku le mR NA ko je pre la ze u ci top laz mu.

Op }e ni to se smat ra lo da stup nje vi ovak ve do ra de uk lju ~u ju ukla nja nje sljedova s 5' i 3' kra je va pri mar noga tran skrip ta. Pre ma ovo me mo de lu, mR NA uk lop lje ne u du ga~ ke pri mar ne tran skrip te bi le bi ko di ra ne nep re ki nu- tim sljedovima DNA. Ova kav pog led na eu ka riot sku mR NA ra di kal no je pro- mi je ni lo ot kri }e prek ra ja nja do ~e ga su neo vis no do{ li Ber get, Moo re i Sha rp te Loui se Chow, Ric ha rd Ge li nas, Tom Bro ker i Ric ha rd Ro ber ts (An ama zi ng sequen ce ar ran ge me nt at the 5' en ds of ade no vi rus 2 mes sen ger RNA, Ce ll 12: 1-8, 1977).

Eksperimenti

Ob je is tra ̀ i va~ ke sku pi ne ko je su ot kri le prek ra ja nje ko ris ti le su ade no- vi rus 2 za is tra ̀ i va nje sin te ze mR NA u ljud skim sta ni ca ma. Naj ve }a pred- no st vi ru sa je st u to me da pred stav lja mo del ko ji je pu no jed nos tav ni ji od sta ni ce do ma }i na. Vi rus na DNA mo ̀ e se iz rav no izo li ra ti iz vi rus nih ~es ti ca, a mR NA mo le ku le ko je ko di ra ju vi rus ne struk tur ne pro tei ne pri sut ne su u ta ko ve li koj ko li ~i ni da se mo gu iz rav no pro ~is ti ti iz za ra ̀ e nih sta ni ca. Ber get,

Moo re i Sha rp us mje ri li su svoj po kus na mR NA ko ja se stva ra u ve li koj ko li- ~i ni, a ko di ra vi rus ni struk tur ni po li- pep tid poz nat pod ime nom hekson.

U svr hu kar ti ra nja hek son ske mR NA u vi rus nom ge no mu, pro~i- {}e na mR NA hib ri di zi ra na je s ade- no virus nom DNA, a hib rid ne su mo le ku le preg le da ne elek tron skom mik ros ko pi jom. Kao {to se i o~e ki va lo glav ni dio hek son ske mR NA stva rao je hib ri de s res trik cij skim frag men ti ma ade no vi rus ne DNA za ko je se pret- hod no saz na lo da sad r ̀ ava ju hek son- ski gen. Ipak, na op }e iz ne na |e nje, sljedovi na 5' kra ju hek son ske mR NA ni su se hib ri di zi ra li sa sljedovima DNA u bli zi ni onih ko ji ko di ra ju glav ni dio po ru ke, {to je upozori lo na to da 5' kraj mR NA mo le ku le pot je ~e od sljedova ko ji su smje{ te ni na ne kom dru gom mjes tu vi rus no ga ge no ma.

Ova mo gu} no st prov je re na je hi b ri di za ci jom hek son ske mR NA s res trik cij skim frag men tom ko ji se pro- te ̀ e uz vod no od hek son sko ga ge na. Hib ri di iz me |u mR NA i DNA ko ji su

se stva ra li u ovom po ku su po ka za li su slo ̀ e nu struk tu ru u ob li ku pet lji (vi di sli ku). Glav ni na mR NA stvo ri la je du ga~ ku hib rid nu re gi ju s pret- hod no iden ti fi ci ra nim hek son skim sljedovima DNA. Iz ne na |u ju }e je bi lo da se 5' kraj hek son ske mR NA hib ri di- zi rao s tri krat ke uz vod ne re gi je DNA ko je su bi le od vo je ne jed na od dru ge i od glav ni ne tran skrip ta ve li kim jed- no lan ~a nim pet lja ma DNA. Po ka za lo se da se sljedovi na 5' kra ju hek son ske

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 143

RNA-DNA hibrid

intron 3

intron 1

egzon 1

egzon 3

egzon 4

egzon 2

1

1 2 3

2 3 4

intron 2 3' kraj RNA

5' kraj RNA

jednolan~ana DNA

(A)

adenovirusna DNA

egzoni

heksonski gen

introni

(B)

Sli ka 4-3. Iden ti fi ka ci ja in tro na u ade no vi rus noj mR NA. Gen za ko di ra nje ade no vi rus no ga hek so na (glav- ni struk tur ni pro tein vi rus ne ~es ti ce) sas to ji se od ~e ti ri ju egzona ko ji su is pre ki da ni tri ma in tro ni ma. (B) Pri kaz elek tron sko mik ros kop ske fo tog ra fi je hi- po te ti~ ko ga hib ri da iz me |u hek son ske mR NA i di je la ade no vi rus ne DNA. Egzoni su pri ka za ni kao pod ru~ ja RNA-DNA hib ri da ko ja su raz dvo je- na jed no lan ~a nim pet lja ma DNA ko je od go va ra ju in tro ni ma.

ma ko ji se uk la nja ju prek ra ja njem (sli ka 4-4). In tron sko-egzon ska struk tu ra mno gih eu ka riot skih ge na pri li~ no je kom pli ci ra na, a ko li ~i na DNA u in tron- skim sljedovima ~es to je ve }a od one u egzoni ma. Slijed ljud sko ga ge no ma upu}u je na to da pros je ~an hu ma ni gen sad r ̀ ava ot pri li ke 9 egzona, da je

mR NA pre pi su ju iz tri ju od vo je nih re gi ja vi rus no ga ge no ma ko je su se prek ra ja njem po ve za le s glav nim di je- lom mR NA za vri je me do ra de du ga- ~kog pri mar nog tran skrip ta.

Ut je caj

Na kon ot kri }a prek ra ja nja ade no vi- rus ne mR NA, br zo su us li je di li sli~ ni po ku si sa sta ni~ nim mR NA ko ji su po ka za li da eu ka riot ski ge ni ima ju pret hod no pos ve nep red vi |e nu struk- tu ru. Nji ho vi ko di ra ju }i sljedovi ni su bi li kon ti nui ra ni ne go su ih pre ki da li

in tro ni ko ji su se od stra nji va li prek ra ja- njem pri mar noga pri je pi sa. Za in tro ne se da nas zna de da ~i ne ve li ki dio DNA eu ka riot skih ge no ma, a ulo ga in tro na u evo lu ci ji i re gu la ci ji gen ske ek spre- si je pred stav lja pod ru~ je ko je se i da lje ak tiv no prou ~a va. Ot kri }e prek ra ja nja ta ko |er je po tak lo ve li ko za ni ma nje za me ha ni zam ove neo ~e ki va ne reak ci je do ra de mR NA. Kao {to je pri ka za no u 6. pog lav lju, ove stu di je ni su sa mo ras vi jet li le no ve me ha niz me re gu la- ci je gen ske ek spre si je; one su ta ko |er ot kri le no ve ka ta li ti~ ke ak tiv nos ti

RNA i po das tr le va` ne po dat ke ko ji po du pi ru hi po te zu po ko joj je ra na evo lu ci ja bi la ba zi ra na na sa moum na- `a ju }im RNA mo le ku la ma. Ta ko se po ka za lo da je neo ~e ki va na struk tu ra ade no vi rus ne mR NA ima la go lem ut je caj na raz li ~i ta pod ru~ ja sta ni~ ne i mo le ku lar ne bio lo gi je.

144 Poglavlje 4

Sli ka 4-4. Mi{ ji b-globinski gen Ovaj gen sad r ̀ ava dva in tro na ko ji di je le ko di ra ju }u re gi ju na tri egzona. Egzon 1 ko di ra ami no ki se li ne 1 do 30, egzon 2 ko di ra ami no ki se li ne 31 do 104, a egzon 3 ko di ra ami no ki se li ne 105 do 146. Egzoni 1 i 3 ta ko |er sad r ̀ a va ju re gi- je koje se ne prevode (UTR) pr vi na na 5', a dru gi na 3' kra ju mR NA.

5'

3'

intron 2

egzon 1

DNA

mRNA

5' 3'

5'

3'

egzon 2 egzon 3

3' UTR5' UTR

intron 1

transkripcija

prekrajanje

translacija

egzon 1 egzon 2 egzon 3

protein 1 30 104 146

is pre ki dan s 8 in tro na i ras po re |en na oko 30.000 pa ro va ba za (30 ki lo ba za ili kb) ge nom ske DNA. Op }e ni to egzoni ~i ne sa mo oko 2 kb, pa pre ma to me vi {e od 90% pros je~ no ga hu ma no ga ge na ~i ne in tro ni.

In tro ni su pri sut ni u ve }i ni ge na slo ̀ e nih eu ka rio ta, ia ko ne pred stav lja ju uni ver zal nu po ja vu. Prim je ri ce, in tro ni ne dos ta ju u gotovo svim his ton skim ge ni ma, pa je pre ma to me jas no da in tro ni ni su pot reb ni za fun kcio ni ra nje ge na u eu ka riot skim sta ni ca ma. Ta ko |er tre ba do da ti da in tro ni ni su na |e ni ni u ve }i ni ge na jed nos tav nih eu ka rio ta kao {to kvas ci. Na sup rot to me, in- tro ni je su pri sut ni u ne kim ri jet kim ge ni ma pro ka rio ta. Pri sut no st ili od sut no- st in tro na pre ma to me ne pred stav lja ap so lut nu raz li ku iz me |u pro ka riot- skih i eu ka riot skih ge na ia ko su in tro ni da le ko ~e{ }i u vi {ih eu ka rio ta (bi lja- ka i `i vo ti nja) gdje na njih ot pa da zna tan dio cje lo kup ne ge nom ske DNA.

Ve }i na in tro na ne od re |u je sin te zu ne koga sta ni~ nog proiz vo da, ia ko pos to ji ma li broj in tro na ko ji ko di ra ju fun kcio nal ne RNA ili pro tei ne. Ipak, in tro ni ig ra ju va` nu ulo gu u kon tro li gen ske ekspresije. Prim je ri ce, pri sut no- st in tro na omo gu }u je da se egzoni ne ko ga ge na mo gu spa ja ti u raz li ~i te kom bi na ci je {to re zul ti ra sin te zom raz li ~i tih pro tei na na te me lju jed nog te is to ga ge na. Ovaj se pro ces na zi va al ter na tiv no prek ra ja nje (engl. al ter na ti- ve spli ci ng) (sli ka 4-5.), a bu du }i da se zbi va ~es to u ge ni ma slo ̀ e nih eu ka rio- ta, smat ra se va` nim za po ve }a nje re per toa ra fun kci ja 30.000 − 40.000 ge na ljud sko ga ge no ma.

Za in tro ne se ta ko |er mis li da su odig ra li va` nu ulo gu u evo lu ci ji olak {a- va ju }i re kom bi na ci ju iz me |u re gi ja za ko di ra nje pro tei na (egzona) raz li ~i tih ge na pro ce som ko ji je poz nat pod ime nom mi je {a nje egzona (en gl. exon shuf fli ng). Egzoni ~es to ko di ra ju fun kcio nal no raz li ~i te pro tein ske do me ne, pa bi re kom bi na ci ja me |u in tro ni ma raz li ~i tih ge na re zul ti ra la no vim ge ni- ma ko ji sad r ̀ avaju no ve kom bi na ci je sljedova za ko di ra nje pro tei na.

U skla du s ovom hi po te zom, prou ~a va nja pos ve }e na sek ven ci ra nju po ka- za la su da su ne ki ge ni egzon ske ki me re iz ve de ne od ne ko li ci ne ge na, a to pred stav lja di rek tni do kaz da no vi ge ni mo gu nas ta ti re kom bi na ci jom iz me- |u in tron skih sljedova.

O evo lu cij skom pod ri jet lu in tro na pos to je kon tro ver zna sta ja li{ ta. Pos to ji mo gu} no st da su in tro ni bi li pri sut ni ra no u evo lu ci ji, pri je od va ja nja pro ka- riot skih i eu ka riot skih sta ni ca. Pre ma ovoj hi po te zi, in tro ni su ig ra li va` nu ulo gu u po ~et nom skla pa nju sljedova za ko di ra nje pro tei na u drev nih pre- da ka da na{ njih sta ni ca. Na kon to ga, in tro ni su se pos tup no gu bi li iz ve }i ne ge na pro ka rio ta i jed nos tav ni jih eu ka rio ta (prim je ri ce kva sa ca) kao od go- vor na evo lu cij sku se lek ci ju ko ja je da va la pred no st br zoj rep li ka ci ji, pa je to do ve lo do »bo lje pro to~ nos ti« u ge no mi ma tih or ga ni za ma. Me |u tim, ka ko

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 145

5'kromosomska DNA

primarni RNA-prijepis

molekule mRNA

5' 3'

3'

transkripcija

translacija

protein 1

translacija translacija

egzon 1 egzon 2 egzon 3 egzon 4 egzon 5 egzon 6

5' 3' 1 2 3 4

1 2 4 5 1 3 5 66 1 3 4 5 6

5 6

alternativno prekrajanje

protein 2 protein 3

5

2

1

4 5

3

1

5

3

1

4

6 66

Sli ka 4-5. Al ter na tiv no prek ra ja nje Gen pri ka zan na sli ci sad r ̀ ava {e st egzona ko ji su raz dvo je ni s po mo }u pet in tro na. Al ter na tiv no iz re zi va nje omo- gu }u je ovim egzoni ma da se po ve ̀ u na raz li ~i te na ~i ne, pa se stva ra ju tri raz li ~i- te mR NA mo le ku le i tri raz li ~i ta pro tei- na iz jed noga pri mar noga transkripta..

br za dio ba ne pred stav lja pred no st u vi {ih or ga ni za ma, in tro ni su se zad r ̀ a- li u nji ho vim ge no mi ma. S dru ge stra ne, in tro ni su mo` da nas ta li kas ni je ti- je kom evo lu ci je kao re zul tat ug rad nje sljedova DNA u ge ne ko ji su se pret- hod no for mi ra li kao kon ti nui ra ni sljedovi za ko di ra nje pro tei na. Mi je {a nje ge na je on da vje ro jat no mo ra lo ig ra ti va` nu ulo gu u dalj njoj evo lu ci ji ge na u vi {ih eu ka rio ta ia ko ni je bi lo va` no za po ~et no skla pa nje ko di ra ju }ih slje- dova pri je evo lu cij skog od va ja nja pro ka riot skih i eu ka riot skih sta ni ca.

Po nav ljaju}i (repetitivni) sljedovi DNA In tro ni da ju svoj ve li ki pri nos ve li ~i ni ge no ma vi {ih eu ka rio ta. U lju di, pri- mje ri ce, in tro ni iz no se ot pri li ke 25% ukup ne ge nom ske DNA. Ipak, je dan jo{ ve }i dio slo ̀ e nih eu ka riot skih ge no ma sas to ji se od vi so ko po nov lje nih ne ko di ra ju }ih sljedova DNA. Ovi sljedovi, ko ji su po ne kad zas tup lje ni sto ti- na ma ti su }a ko pi ja po ge no mu, pr vi su pro na{ li Roy Brit ten i Da vid Koh ne za vri je me prou ~a va nja br zi ne rea so ci ja ci je de na tu ri ra nih frag me na ta sta- ni~ ne DNA (sli ka 4-6). De na tu ri ra ni lan ci DNA hib ri di zi ra ju se je dan s dru- gim (rea so ci ra ju) po nov no stva ra ju }i dvos tru ku uz voj ni cu (vi di sli ku 3.25). Bu du }i da je rea so ci ja ci ja DNA uz voj ni ce bi mo le ku lar na reak ci ja (dva raz- dvo je na lan ca mo ra ju se su da ri ti je dan s dru gim ne bi li se hib ri di zi ra li), br zi- na rea so ci ja ci je ovi si o kon cen tra ci ji la na ca DNA. Kad se pus ti lo de na tu ri ra- ne frag men te DNA E. co li da se me |u sob no hib ri di zi ra ju, sva DNA jed no li ko se rea so ci ra la kao {to bi se i o~e ki va lo da je u ge no mu sva ki sljed DNA pri su tan sa mo jed nom. Ipak, rea so ci ja ci ja frag me na ta DNA iz dvo je- nih iz sta ni ca si sa va ca po ka za la je pos ve dru ga ~i ju sli ku. Ot pri li ke 50% DNA frag me na ta rea so ci ra lo se br zi nom pred vi |e nom za sljedove ko ji su pri sut ni sa mo jed nom u ge no mu, a os ta tak se rea so ci rao pu no br ̀ e ne go {to bi se o~e ki va lo. Ovi re zul ta ti pro tu ma ~e ni su ti me da u ge no mu ne ki slje- dovi pos to je u vi {e ko pi ja pa se zbog to ga rea so ci ra ju pu no br ̀ e od sljedova ko ji su pri sut ni sa mo jed nom. Ovi su po ku si po seb no upu ti li na to da se prib li` no 50% DNA si sa va ca sas to ji od vi so ko re pe ti tiv nih sljedova, od ko jih su ne ki po nov lje ni ~ak 105 do 106 pu ta.

146 Poglavlje 4

fr ak

ci ja

p re

o st

al e

je d

n o la

n ~a

n e

D N

A

0,5

1,0

10–110–210–3 104103102101

C0t ( × s)

E. coli A DN

neponovljeni sljedovi u goveda

govedski ponovljeni sljedovi Sli ka 4-6. Iden ti fi ka ci ja re pe ti tiv nih sljedova po- mo }u rea so ci ja ci je DNA. Ki ne ti ka rea so ci ja ci je frag me na ta DNA E. co li i go ve da pri ka za na je kao fun kci ja C0t {to pred stav lja po ~et nu kon cen tra ci ju DNA pom no ̀ e nu s vre me nom in ku ba ci- je. DNA E. co li rea so ci ra se jed no li ko {to je u skla du s ~i nje ni com da je sva ki frag me nt DNA pri su tan sa sa mo jed nom ko pi jom u ge no mu od 4,7 × 106 pa ro va ba za. Za raz li ku od to ga frag men ti DNA go ve da po ka zu ju dva raz li ~i ta na ~i na rea so ci ja ci je. Oko 60% DNA fra- gme na ta (ne po nov lje ni sljedovi) rea so ci ra ju se spo ri je ne go DNA E. co li kao {to se i o~e ku je za sljedove ko ji su pri sut ni u jed noj ko pi ji u ve }em ge no mu go ve da (3 × 109 pa ro va ba za). Ipak, os ta lih 40% frag me na ta DNA go ve da (po nov lje ni sljedovi) rea so ci ra ju se br ̀ e od DNA E. co li {to upu}u je na to da pos to je vi {es tru ke ko pi je po je di nih sljedova.

Vrsta slijeda Broj kopija Dio genoma

Ponavljanje jednostavnih sljedovaa >1.000.000 š10% Retrotranspozoni LINE 850.000 21% SINE 1.500.000 13% Elementi sli~ni retrovirusu 450.000 8% DNA transpozoni 300.000 3%

a Koli~ina ponavljanja jednostavnih sljedova procijenjena je prema udjelu heterokromatina u ljudskom genomu.

Tablica 4-1. Repetitivni sljedovi u humanom genu

Dalj nje ana li ze, ko je su svoj vr hu nac do ̀ iv je le sek ven ci ra njem ~i ta vih ge- no ma, iden ti fi ci ra le su ne ko li ko vr sta ovak vih vi so ko po nov lje nih sljedova (tab li ca 4-1). Jed na od tih vr sti, ko ja spa da me |u re pe ti tiv ne sljedove naz va- ne ponav lja nja jed nos tav nih sljedova (en gl. sim ple-sequen ce re pea ts), sas to ji se od uzas top no po nov lje nih ni zo va ne ko li ko ti su }a ko pi ja krat kih sljedova du lji ne od 1 do 500 nuk leo ti da. Prim je ri ce, je dan tip po nav lja nja jed nos ta- vnih sljedova u vinske mu {i ce sas to ji se od uzas top nih po nav lja nja je di ni ce od se dam nuk leo ti da ACAAACT. Zbog nji ho va je din stve nog sas ta va, mno ge po nov lje ne jed nos tav ne DNA mo gu se iz dvo ji ti iz os tat ka ge nom ske DNA rav no te` nim cen tri fu gi ra njem u gra di jen ti ma gus to }e CsCl. Gus to }a DNA od re |e na je sas ta vom ba za, pa sljedovi bo ga ti AT ba za ma pos je du ju ma nju gus to }u ne go li sljedovi bo ga ti GC ba za ma. Zbog to ga, jed nos tav ni slijed bo- ga t AT ba za ma smje{ ta se u gra di jen ti ma CsCl u pod ru~ ju ma nje gus to }e od ve li ke ve }i ne ge nom ske DNA vinske mu {i ce (sli ka 4-7). Bu du }i da ovak vi po nov lje ni sljedovi ~i ne pru gu u ob li ku »sa te li ta« od vo je nih od glav ne pru- ge DNA, ~es to se o nji ma go vo ri kao o sa te lit nim DNA. Ovi sljedovi po na- vlja ju se na mi li ju ne pu ta u ge no mu pa ~i ne oko 10% DNA u ve }i ne vi {ih eu ka rio ta. Po nav lja nja jed nos tav nih sljedova ne pre pi su ju se i ne pred sta- vlja ju fun kcio nal nu ge ne ti~ ku in for ma ci ju. Ne ka ipak ig ra ju va` nu ulo gu u struk tu ri ra nju kro mo so ma, o ~e mu }emo ras prav lja ti u slje de }em od lom ku ovoga pog lav lja.

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 147

ko li~

in a

D N

A

1,705

gusto}a (g/cm3)

1,701 (glavna pruga)

1,687 (II + III)

1,672 (I)

(IV)

Sli ka 4-7. Sa te lit na DNA. Rav no te` nim cen tri fu gi ra njem DNA vinske mu {i ce u gra di jen tu gus to }e CsCl raz dva ja se sa te lit na DNA (oz na- ~e na bro je vi ma I × IV) s gus to }a ma od 1,672, 1,687 i 1,705 g/cm3, od glav ne pru ge ge nom ske DNA ~i ja je gus to }a 1,701 g/cm3.

retrotranspozon

retrotranspozon

transkripcija

reverzna transkripcija

kromosomska DNA

RNA

retrotranspozonska DNA

integracija u kromosomsku DNA

novo kromosomsko mjesto

Sli ka 4-8. Pok re ta nje ret rot ran spo zo na. Ret rot ran spo zon smje{ ten na jed nom mjes tu u kro mo som skoj DNA pre pi su je se u RNA, a za tim se pret va ra u DNA uz po mo} re ver zne tran skrip ta ze. Re- trot ran spo zon ska DNA mo ̀ e se ta da ug ra di ti u ne ko dru go kro mo som sko mjes to.

Os ta li po nov lje ni sljedovi DNA pri je su ra{ tr ka ni po ge no mu ne go li na- kup lje ni u ob li ku uzas top nih po nav lja nja. Ovi raz ba ca ni po nov lje ni ele men- ti naj vi {e pri do no se ve li ~i ni ge no ma ~i ne }i ot pri li ke 45% ljud ske ge nom ske DNA. Dvi je naj ~e{ }e vr ste tak vih sljedova zo vu se SINE (en gl. sho rt in ter- sper sed ele men ts) krat ki raz ba ca ni ele men ti i LINE (en gl. lo ng in ter sper sed ele- men ts) du gi raspr{eni ele men ti. SINE sad r ̀ avaju 100 – 300 pa ro va ba za. Oko 1,5 mi li jun ovak vih sljedova pro {i re no je po ge no mu, te ~i ne ot pri li ke 13% ukup ne ljud ske DNA. Ia ko se SINE pre pi su ju u RNA, ne ko di ra ju ni kak ve pro tei ne i ne poz na ta im je fun kci ja. Naj ve }i ljud ski LINE su du lji ne 6 – 8 kb ia ko su mno gi po nov lje ni sljedovi iz ve de ni iz LINE kra }i, s pros je~ nom ve li- ~i nom od oko 1 kb. U ge no mu pos to ji oko 850.000 LINE po nav lja nja {to ~i ni oko 21% ljud ske DNA. LINE se pre pi su ju i ba rem ne ki ko di ra ju pro tei ne, ali kao i za SINE ne poz na ta im je ulo ga u sta ni~ noj fi zio lo gi ji.

I SINE i LINE su prim je ri pok ret nih ele me na ta ko ji se mo gu po mi ca ti na raz li ~i ta mjes ta u ge nom skoj DNA. Kao {to se de talj no ras prav lja u 5. po- glav lju, i SINE i LINE su ret rot ran spo zo ni, pa se nji ho va tran spo zi ci ja od vi- ja pre ko re ver zne tran skrip ci je. RNA ko pi ja SINE ili LINE u sta ni ci se pret va- ra u DNA uz po mo} re ver zne tran skrip ta ze, pa se ug ra |u je na dru gom mjes tu u ge no mu. Raspr{eni re pe ti tiv ni sljedovi tre }e vr ste ta ko |er se po mi- ~u unu tar ge no ma uz po mo} re ver zne tran skrip ta ze, ja ko su na lik na ret ro- vi ru se, pa se sto ga i zo vu ret ro vi ru su-sli~ ni ele men ti (en gl. ret ro vi ru s-li ke ele men ts). Hu ma ni ret ro vi ru su-sli~ ni ele men ti imaju ras pon du lji ne od ot pri- li ke 2 − 10 kb. U ljud skom ge no mu pri sut no je oko 450.000 ret ro vi ru su-sli- ~nih ele me na ta {to iz no si oko 8% ljud ske DNA. Za raz li ku od to ga, ret ro vi- ru su--sli~ ni ele men ti ~et vr te vr ste (DNA tran spo zo ni) po mi ~u se kroz ge- nom ko pi ra njem i ug rad njom u ob li ku sljedova DNA ra di je ne go li pok re ta- njem uz po mo} re ver zne tran skrip ci je. U ljud skom ge no mu pri sut no je oko 300.000 ko pi ja DNA-tran spo zo na ve li ~i ne od 80 – 3.000 pa ro va baza, a ~i ne oko 3% ljud ske DNA.

Pre ma to me, bli zu po lo vi ne ljud sko ga ge no ma sas to ji se od raspr{enih re pe ti tiv nih ele me na ta ko ji su se rep li ci ra li i pu to va li kroz ge nom bi lo pre ko RNA- bi lo pre ko DNA-pos red ni ka, pa je ta ko re ver zna tran skrip ci ja bi la od- go vor na za ob li ko va nje pre ko 40% hu ma no ga ge no ma. Ne ki od ovih slje- dova mo gu re gu li ra ti gen sku ek spre si ju, ali ve }i na po nov lje nih sljedova, po sve mu su de }i, ne da je ni ka kav ko ris ni pri nos sta ni ci. Um jes to to ga, one su

148 Poglavlje 4

razdvojni slijed

embrijski

embrijski

fetalni i odrasli

pseudogeni

a-globinski lokus kromosom 16

z yz ya1 a2 a1

razdvojni slijed

odraslifetalnipseudogen pseudogen

b-globinski lokus kromosom 11

yb2 yb1 d be Gg Ag

Sli ka 4-9. Po ro di ce glo bin skih ge na ^la no vi ljud skih α- i β-globinskih gen skih po ro di ca gru pi ra ni su na kro mo so mi ma 16 i 11. Sva ka po ro di ca sad r ̀ i ge ne ko ji se spe ci fi~ no ek spri mi ra ju ili u tki vi ma em bri- ja, fe tu sa ili od ras lo ga organizma, kao i ne fun kcio nal ne ko pi je ge na (pseu do ge ni).

iz gle da, pred stav ni ci »se bi~ nih DNA ele me na ta« ko ji su se lek cio ni ra ni zbog vlas ti te spo sob nos ti da se um na ̀ a ju u ge no mu, a ne zbog ne ke se lek tiv ne pred nos ti va` ne za nji ho vog do ma }i na. U ne kim slu ~a je vi ma, pok ret ni su ele men ti, iz gle da, ig ra li va` ne evo lu cij ske ulo ge jer su po tak li preg rad nju ge na i pri do no si li stva ra nju gen eti~ke raz no li kos ti.

Dup li ka ci ja ge na i pseu do ge ni Slje de }i fak tor ko ji pri do no si ve li ~i ni eu ka riot skih ge no ma je st ~i nje ni ca da mno gi ge ni pos to je u vi {e ko pi ja od ko jih su ne ke ~es to ne fun kcio nal ne. Vi- {es tru ke ko pi je ne kih ge na ko ris te se za slu ~a je ve proiz vod nje RNA ili pro- tei na pot reb nih u ve li kim ko li ~i na ma po put ribosomnih RNA ili his to na. S dru ge stra ne, od re |e ni ~la no vi sku pi ne srod nih ge na (po ro di ce ge na) mo gu se pre pi si va ti u raz li ~i tim tki vi ma ili u raz li ~i tim sta di ji ma raz vo ja. Prim je ri- ce, a i b pod je di ni ce he mog lo bi na u hu ma nom su ge no mu ko di ra ne dvje ma po ro di ca ma ge na, a raz li ~i ti ~la no vi ovih po ro di ca ek spri mi ra ju se u em brio- nal nim, fe tal nim ili od ras lim tki vi ma (sli ka 4-9). ^la no vi mno gih gen skih po- ro di ca (prim je ri ce glo bin ski ge ni) sa kup lje ni su u jed nom pod ru~ ju DNA; ~la no vi os ta lih gen skih po ro di ca ras pr {e ni su u raz li ~i tim kro mo so mi ma.

Smat ra se da su po ro di ce ge na nas ta le dup li ka ci jom iz vor no ga prad je- dov sko ga ge na, a raz li ~i ti ~la no vi po ro di ce za tim su se od va ja li kao pos lje di- ca mu ta ci ja nas ta lih ti je kom evo lu ci je. Ovak va di ver gen ci ja mo ̀ e vo di ti evo lu ci ji srod nih pro tei na ko ji op ti mal no fun kcio ni ra ju u raz li ~i tim tki vi ma ili u raz li ~i tim fa za ma raz vo ja. Prim je ri ce, fe tal ni glo bi ni pos je du ju vi {i afi ni- tet za O2negoli glo bi ni od ras log − raz li ka ko ja omo gu }u je fe tu su da do bi je O2 iz maj ~in ske cir ku la ci je.

Ipak, kao {to bi se i mog lo o~e ki va ti, sve mu ta ci je ipak ne po ve }a va ju funk ci ju ge na. Ne ke ko pi je ge na um jes to to ga ima ju od r ̀ a ne mu ta ci je ko je re zul ti ra ju gu bit kom spo sob nos ti za proiz vod nju fun kcio nal no ga gen skog pro duk ta. Prim je ri ce, sva ka od ljud skih a i b-glo bin skih gen skih po ro di ca sad r ̀ ava dva ge na ko ji su bi li inak ti vi ra ni mu ta ci jom. Ovak ve ne fun kcio nal- ne ko pi je ge na (zva ne pseu do ge ni) pred stav lja ju evo lu cij ske re lik te ko ji po- ve }a va ju ve li ~i nu eu ka riot skih ge no ma, a ne da ju ni ka kav fun kcio nal ni ge- ne ti~ ki dop ri nos.

Dup li ka ci je ge na mo gu nas ta ti pre ko dva ju raz li ~i tih me ha ni za ma. Pr vi pred stav lja dup li ka ci ju di je la DNA ko ja mo ̀ e re zul ti ra ti pri je no som blo ka sljedova DNA na no vu lo ka ci ju u ge no mu. Za ovak ve dup li ka ci je DNA seg-

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 149

transkripcija

prekrajanje

reverzna transkripcija

integracija u novo

kromosomsko mjesto

3' 5'

intron 2

gen

mRNA

dora|eni pseudogen

5' 3'

intron 1egzon 1 egzon 2 egzon 3 Sli ka 4-10. For mi ra nje do ra |e no- ga pseu do ge na. Gen se pre pi {e i prek ro ji da bi se stvo ri la mR NA bez in tro na. Ta da se mR NA ko pi- ra s po mo }u re ver zne tran skrip ta ze, pa nas ta je cDNA bez in tro na. In teg ra ci ja u kro mo som sku DNA re zul ti ra for mi ra- njem do ra |e noga pseu do ge na.

me na ta du lji ne od 1 kb do vi {e od 50 kb proc je nju je se da iz no se oko 5% ljud sko ga ge no ma. Za raz li ku od to ga, ge ni se mo gu dup li ci ra ti ob rnutim pre pi si va njem mR NA, na kon ~e ga sli je di ug rad nja cDNA-ko pi je na ne ko no vo kro mo som sko mjes to (sli ka 4-10). Ovaj na ~in dup li ka ci je ge na, ana lo- gan tran spo zi ci ji po nov lje nih ele me na ta ko ji se pok re }u pre ko RNA-pos red- ni ka, re zul ti ra stva ra njem gen skih ko pi ja ko ji ma ne dos ta ju in tro ni, pa ne ma- ju ni nor mal ne kro mo som ske sljedove za regulacija pre pi si va nja ge na u mRNA. Kao re zul tat to ga, dup li ka ci ja ge na re ver znom tran skrip ci jom obi- ~no proiz vo di jed nu inak tiv nu ko pi ju ge na ko ja se zo ve do ra |e ni pseu do- gen. Proc je nju je se da u ljud skom ge no mu pos to ji ne ko li ko ti su }a ovak vih pseu do ge na.

Sas tav ge no ma vi {ih eu ka rio ta Bu du }i da se ras prav lja lo o ne ko liko vr sta ne ko di ra ju }ih DNA ko je pri do no- se ge nom skoj slo ̀ e nos ti u vi {ih eu ka rio ta, za nim lji vo bi bi lo da ti preg led sas ta va sta ni~ nih ge no ma. U bak te rij skih ge no ma, ve }i na DNA ko di ra pro te- i ne. Prim je ri ce, ge nom E. co li dug je oko 4,6 × 106 parova ba za i sad r ̀ ava oko 4.000 ge na, a bli zu 90% DNA ko ris ti se za ko di ra nje pro tei na. Ge nom kvas ca ko ji se sas to ji od 12 × 106 pa ro va ba za, ot pri li ke je 2,5 pu ta ve }i od ge no ma E. co li, ali je jo{ uvi jek dos ta kom pak tan. Sa mo 4% ge na Sac cha ro myces ce re vi- siae sad r ̀ ava in tro ne, a oni on da obi~ no ima ju sa mo je dan ma li in tron bli zu star ta ko di ra ju }ega slijeda. Ot pri li ke 70% kva{ ~e va ge no ma ko ris ti se za ko- di ra nje pro tei na, {to ukup no od re |u je oko 6.000 pro tei na.

Re la tiv no jed nos tav ni `i vo tinj ski ge no mi C. ele ga ns i vinske mu {i ce oko 10 pu ta su ve }i od kva{ ~e va ge no ma, ali sad r ̀ avaju sa mo 2−3 pu ta vi {e ge- na. Um jes to to ga, ovi jed nos tav ni `i vo tinj ski ge no mi imaju vi {e in tro na i vi- {e po nov lje nih sljedova ta ko da sljedovi za ko di ra nje pro tei na pred stav lja ju sa mo ot pri li ke 25% ge no ma C. ele ga ns i oko 13% ge no ma vinske mu {i ce. Genom bilj no ga mo de la Ara bi dop sis sad r ̀ ava sli ~an broj ge na, a ot pri li ke 26% ge no ma pred stav lja sljedove za ko di ra nje pro tei na.

Ge no mi vi {ih `i vo ti nja (kao i lju di) ot pri li ke su 20−30 pu ta ve }i od onih C. ele ga ns i vinske mu {i ce. Ipak, naj ve }e iz ne na |e nje na kon de {if ri ra nja sljeda hu ma no ga ge no ma bi lo je ot kri }e da ljud ski ge nom ima sa mo oko 30.000–40.000 ge na − to~ no dvos tru ki broj ge na od ono ga u ge no mi ma C. ele ga ns i vinske mu {i ce. Izgleda da sa mo 1–1,5% hu ma nog ge no ma sad r ̀ ava sljedo ve ko je ko di ra nju pro tei ne. Ot pri li ke 25% ge no ma sas to ji se od in tro- na, vi {e od 60% sas tav lje no je od raz li ~i tih ti po va re pe ti tiv ne i dup li ci ra ne DNA, dok os ta tak od go va ra pseu do ge ni ma, ne po nov lje nim sljedovima ko ji raz mi ~u ge ne i egzon skim sljedovima ko ji su pri sut ni na 5' i 3' kra ju mR NA,

150 Poglavlje 4

ali se ne pre vo de u pro tein. Po ve }a nje ge no ma vi {ih eu ka rio ta, pre ma to me, da le ko je vi {e pos lje di ca pri sut nos ti ve li kih ko li ~i na po nov lje nih sljedova i in tro na ne go po ve }a no ga bro ja ge na.

Kro mo so mi i kro ma tin Ne sa mo da su ge no mi ve }i ne eu ka rio ta da le ko slo ̀ e ni ji ne go li oni u pro ka- rio ta, ne go je ta ko |er DNA eu ka rot skih sta ni ca or ga ni zi ra na dru ga ~i je ne go- li ona pro ka riot skih. Ge nom pro ka rio ta sad r ̀ an je u jed nom kro mo so mu ko ji je obi~ no kru` na mo le ku la DNA. Za raz li ku od to ga, ge nom eu ka rio ta sas tav ljen je od vi {e kro mo so ma od ko jih sva ki sad r ̀ ava li near nu mo le ku lu DNA. Ia ko broj i ve li ~i na kro mo so ma zna ~aj no va ri ra me |u vr sta ma (tab li ca 4-2), os nov na im je struk tu ra jed na ka u svih eu ka rio ta. DNA eu ka riot skih sta ni ca ~vr sto je ve za na na ma le ba zi~ ne pro tei ne (his to ne) ko ji u sta ni~ noj jez gri pra vil no pa ki ra ju DNA. To je pop ri li~ na za da }a s ob zi rom na to da ukup na du lji na ras teg nu te DNA u ljud skoj sta ni ci iz no si sko ro 2 m, a mo ra se uk lo pi ti u jez gru ~i ji je prom jer sve ga 5 do 10 mm.

Kro ma tin Kom ple ks iz me |u eu ka riot ske DNA i pro tei na zo ve se kro ma tin, a ti pi~ no sad r ̀ ava dvos tru ko vi {e pro tei na ne go DNA. Glav ni pro tei ni kro ma ti na su his to ni, mali pro tei ni ko ji pro por cio nal no imaju pu no vi {e ba zi~ nih ami no- ki se li na (ar gi nin i li zin) ko je olak {a va ju ve za nje na ne ga tiv no na bi je nu mo le- ku lu DNA. Pos to ji pet ve li kih ti po va his to na ko ji se zo vu H1, H2A, H2B, H3 i H4, a vr lo su sli~ ni u raz li ~i tih eu ka riot skih vr sta (tab li ca 4-3). His to na ima neo bi~ no mno go u eu ka riot skoj sta ni ci; nji ho va za jed ni~ ka ukup na ma sa ot pri li ke je jed na ka ma si sta ni~ ne DNA. Osim to ga, kro ma tin ima prib li` no jed na ku ma su ve li kog bro ja raz li ~i tih ne his ton skih kro mo som skih pro tei na.

Veli~ina Broj Organizam genoma (Mb)a kromosomaa

Kvasac (Saccharomyces cerevisiae) 12 16 Sluzava plijesan (Dictyostelium) 70 7 Arabidopsis thaliana 125 5 Kukuruz 5.000 10 Crveni luk 15.000 8 Ljiljan 50.000 12 Nematoda (Caenorhabditis elegans) 97 6 Vinska mu{ica (Drosophila) 180 4 @aba (Xenopus laevis) 3.000 18 Slatkovodna riba dvodihalica 50.000 17 Pile 1.200 39 Mi{ 3.000 20 Krava 3.000 30 Pas 3.000 39 ^ovjek 3.000 23

a Veli~ina genoma i broj kromosoma odnose se na haploidne stanice. Mb = milijun parova baza.

Tablica 4-2. Broj kromosoma u eukariotskim stanicama

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 151

Molekularna Broj Postotak Histona te`ina aminokiselina lizina + arginina H1 22.500 244 30,8 H2A 13.960 129 20,2 H2B 13.774 125 22,4 H3 15.273 135 22,9 H4 11.236 102 24,5

a Podatci se odnose na kuni}je i govedsko meso.

Tablica 4-3. Glavni histonski proteini

~estica nukleosomske sr`i

200

400

600

800

intervali od 200 parova baza

(C)

(B)

(A)

p ar

o vi

b az

a

sm je

r p

u to

va n ja

p

50 nm

Sli ka 4-11. Or ga ni za ci ja kro ma ti na u nuk leo so mi ma. DNA se omo ta oko his to na u ~es ti ca- ma nuk leo som ske sr ̀ i i za pe ~a ti H1 his to nom. Ne his ton ski pro tei ni ve ̀ u se na nit DNA ko ja po ve zu je ~es ti ce s nuk leo som skom sr ̀ i. (B) Ge l-e lek- tro fo re za DNA frag me na ta do bi ve na dje lo mi~ nom raz grad njom kro ma ti na mik ro ko kal nom nuk lea zom. Vez na DNA iz me |u ~es ti ca nuk leo som ske sr ̀ i po ka zu je po seb nu os jet lji vo st, ta ko da og ra ni ~e na raz grad nja kro ma ti na da je frag men te ko ji od go va ra ju vi {es tru kim um no{ ci ma je di ni ce od 200 pa ro va ba za. (C) Elek tron sko mik ros kop ska sli- ka iz du ̀ e noga kro ma tin sko ga vlak na ko ja pri ka zu je nje gov zr na ti iz gled. (B, lju baz no{ }u Ro ge ra Kor nber ga, Uni ver- zi tet Stan fo rd; C, lju baz no{ }u Ade L. Oli ns i Do nal da E. Oli ns, Na cio nal ni la bo ra to rij Oak Rid ge.)

Ima vi {e od ti su }u raz li ~i tih ti po va ovih pro tei na ko ji su uk lju ~e ni u ci je li niz ak tiv nos ti uk lju ~iv {i rep li ka ci ju DNA i gen sku ek spre si ju.

Os nov nu struk tur nu je di ni cu kro ma ti na, nuk leo som, opi sao je, 1974. go- di ne, Ro ger Kor nbe rg (sli ka 4-11). Dva ti pa po ku sa do ve la su Kor nber ga do pred la ga nja nuk leo som skog mo de la. Pr vo, dje lo mi~ na raz grad nja kro ma ti- na s po mo }u mik ro ko kal ne nuk lea ze (en zim ko ji raz gra |u je DNA) proiz ve- la je frag men te DNA du ge oko 200 pa ro va ba za. Za raz li ku od to ga, sli~ na raz grad nja go le DNA (ko ja ni je bi la ve za na s pro tei ni ma) da la je jed no li~ ni raz maz slu ~aj no raz gra |e nih frag me na ta raz li ~i tih ve li ~i na. Ovi re zul ta ti da- li su nas lu ti ti da ve za nje pro tei na na DNA {ti ti od re |e na pod ru~ ja DNA od

152 Poglavlje 4

(A)

(B)

po dvije molekule H2A, H2B, H3 i H4

11 nm

DNA

H1

Sli ka 4-12. Struk tu ra kro ma to so ma.

^es ti ca nuk leo som ske sr ̀ i sas to ji se od 146 pa ro va ba za DNA omo ta nih 1,65 pu ta oko his ton skog ok ta me ra ko ji sad r ̀ ava po dvi je mo le ku le H2A, H2B, H3 i H4. Kro ma- to som sad r ̀ ava dva pu na ok re ta DNA (166 pa ro va ba za) ko je dr ̀ i na mjes tu jed na mo le ku la H1. (B) Mo del ~es ti ce nuk leo som ske sr ̀ i. DNA osi pri ka za ne su sme |om i tir kiz nom bo jom. His to ni su pri ka za ni pla vom (H3), ze le nom (H4), `u tom (H2A) i cr ve nom (H2B) bo jom (B, iz K. Lu ger i sur., 1997. Na tu re 389:251.)

30 nm

30-nm vlakno10-nm vlakno

~estica nukleosomske sr`i

DNA 10 nm

100 nm 100 nm

Sli ka 4-13. Kro ma tin ska vlak na.

Pa ki ra nje DNA u nuk leo so me da je kro ma tin sko vlak no prom je ra ot pri li ke 10 nm. Kro ma tin se da lje kon den zi ra sa vi ja njem u vlak no deb lji ne 30 nm ko je sad r ̀ a va oko {e st nuk leo so ma po na vo ju. (fo tog ra fi je lju baz no{ }u Ade L. Olins i Do nal da E. Olin- sa, Na cio nal ni la bo ra to rij Oak Rid ge.)

raz grad nje nuk lea zom ta ko da en zi mi mo gu na pas ti DNA sa mo na mjes ti- ma ko ja su uda lje na oko 200 pa ro va ba za. U skla du s ti me, elek tron ska mi- kros ko pi ja ot kri la je da kro ma tin ska vlakna ima ju zr nca ko ja su smje{ te na u raz ma ci ma od ot pri li ke 200 pa ro va ba za. Ta ko su ob je me to de, raz grad nja nuk lea zom i elek tron ska mik ros ko pi ja do ve le do pret pos tav ke da je kro ma- tin sas tav ljen od po nav lja ju }ih je di ni ca ve li ~i ne 200 pa ro va ba za pod ime- nom nuk leo so mi.

Sna` ni ja raz grad nja kro ma ti na mik ro ko kal nom nuk lea zom da va la je ~e sti ce (naz va ne ~es ti ce nuk leo som ske sr ̀ i) ko je od go va ra ju zr nci ma vid lji- vi ma pod elek tron skim mik ros ko pom. De talj nom ana li zom ovih ~es ti ca po- ka za lo se da one sad r ̀ avaju 146 pa ro va ba za DNA omo ta nih 1,65 pu ta oko his ton ske sr ̀ i ko ja se sas to ji od po dvi ju mo le ku la H2A, H2B, H3 i H4 his to- na (sli ka 4-12). Po jed na mo le ku la pe to ga his to na H1 ula zi u sva ku ~es ti cu his ton ske sr ̀ i ve ̀ u }i se na DNA. Ovo ~i ni kro ma tin sku pod je di ni cu poz na- tu kao kro ma to som ko ja se sas to ji od 166 pa ro va ba za DNA omo ta nih oko his ton ske sr ̀ i ko je za jed no dr ̀ i H1 (vez ni his ton).

Pa ki ra nje DNA s po mo }u his to na da je kro ma tin sko vlak no prom je ra od oko 10 nm, a ko je je sas tav lje no od kro ma to so ma od vo je nih vez nom (en gl. lin ker) DNA ko ja je du ga oko 80 pa ro va ba za (sli ka 4-13). Pod elek tron skim

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 153

1 mm

Sli ka 4-14. In ter faz ni kro ma tin. Elek tron skomik ros kop ska sli ka in ter- fazne jez gre. Euk ro ma tin je ras pros tra- njen po ~i ta voj jez gri. He te rok ro ma tin je oz na ~en vr ho vi ma strje li ca, a nuk le- o lus strje li com. (Lju baz no{ }u Ade. L. Oli ns i Do nal da E. Olin sa, Na cio nal ni la bo ra to rij Oak Rid ge).

Sli ka 4-15. Kon den za ci ja kro ma ti na za vri je me mi to ze. Pret ra` na elek tron sko mik ros kop ska sli ka me ta faz nog kro mo so ma. Do da no je um jet- no obo je nje (Biop ho to As so cia tes/Photo Re sear ches Inc.) 10 mm

mik ros ko pom ovo vlak no deb lji ne 10 nm ima iz gled zr na te og r li ce {to je i upozori lo na nuk leo som ski mo del. Pa ki ra nje DNA u ovak va kro ma tin ska vlak na deb lji ne 10 nm skra }u je nje go vu du lji nu za oko {e st pu ta. Kro ma tin se da lje mo ̀ e kon den zi ra ti na ma ta njem u vlak na deb lji ne 30 nm ~i ja struk- tu ra se tek mo ra ot kri ti. Iz gle da da u tom sta di ju kon den za ci je kro ma ti na va` nu ulo gu ig ra ju in te rak ci je iz me |u mo le ku la H1 his to na.

Stu panj kon den za ci je kro ma ti na mi je nja se ti je kom `i vot nog cik lu sa sta- ni ce. U in ter faz nim sta ni ca ma (sta ni ca ma ko je se ne di je le) ve }i na kro ma ti- na (naz va nog euk ro ma tin) re la tiv no je de kon den zi ra na i pro {i re na kroz ci- je lu jez gru (sli ka 4-14). Ti je kom ove fa ze sta ni~ no ga cik lu sa, ge ni se pre pi su- ju, a DNA se ud vos tru ~u je u sklo pu prip re me za dio bu sta ni ce. Ve }i na kro- ma ti na in ter faz ne jez gre pri sut na je, iz gle da, u ob li ku vla ka na deb lji ne 30 nm te je or ga ni zi ra na u ve li ke pet lje ko je sad r ̀ avaju oko 50 do 100 kb DNA. Ge ni ko ji se ak tiv no pre pi su ju de kon den zi ra ni ji su, {to ~i ni DNA pris tu pa ~- ni jom sus ta vu za tran skrip cij u. Pre ma to me struk tu ra kro ma ti na blis ko je ve za na za kon tro lu gen ske ek spre si je u eu ka rio ta o ~e mu }e mo ras prav lja ti u 6. pog lav lju.

Za raz li ku od euk ro ma ti na, ot pri li ke 10% in ter faz nog kro ma ti na (naz va- nog he te rok ro ma tin) na la zi se u po seb no kon den zi ra nom sta nju na lik na ono u ko jem se na la zi kro ma tin ti je kom mi to ze sta ni ce. He te rok ro ma tin je tran skrip cij ski neak ti van i sad r ̀ ava vi so ko po nov lje ne sljedove DNA po put onih ko je su pri sut ne u cen tro me ra ma i te lo me rama.

Ka ko sta ni ca ula zi u mi to zu, nje zi ni kro mo so mi pos ta ju vi so ko kon den zi- ra ni da bi se mog li pre no si ti u sta ni ce-k}e ri. Smat ra se da se pet lje kro ma tin-

154 Poglavlje 4

proteinski kostur

om~e DNA

Sli ka 4-16. Struk tu ra me ta faz nih kro mo so ma. Elek tron sko mik ros kop ska sli ka om ~i DNA ko je se hva ta ju na pro tein ski kos tur me- ta faz nih kro mo so ma iz ko jih su uklonje ni his to ni (Iz: J. R. Paul son i U. K. Lem mli, 1977. Ce ll 12:817.)

Sli ka 4-17. Ljud ski me ta faz ni kro mo so mi. Mik ros kop ska sli ka ljud skih kro mo so ma do bi ve nih iz me ta faz ne sta ni ce. (Leo na rd Les sin/Peter Ar no ld, Inc.)

skog vlak na deb lji ne 30 nm da lje pre sa vi ja ju ka ko bi ob li ko va le zgus nu te me ta faz ne kro mo so me mi to ti~ kih sta ni ca u ko ji ma se DNA kon den zi ra sko- ro 10.000 pu ta (sli ka 4-15). Ova ko zgus nu ti kro ma tin vi {e ne mo ̀ e pos lu ̀ i ti kao ka lup za sin te zu RNA, pa tran skrip ci ja pres ta je za vri je me mi to ze. Elek- tron sko mik ros kop ske sli ke upu}u ju na to da je DNA me ta faz nih kro mo so- ma or ga ni zi ra na u ve li ke om ~e ko je su pri~vr {}e ne za pro tein ski kos tur (sli- ka 4-16), ali tre nu ta~ no ne ra zu mi je mo ni de talj nu struk tu ru ovak vog vi so- ko kon den zi ra nog kro ma ti na, ni ti me ha ni zam kon den za ci je kro ma ti na.

Me ta faz ni kro mo so mi su to li ko vi so ko kon den zi ra ni da se nji ho va struk- tu ra mo ̀ e prou ~a va ti svjet los nom mik ros ko pi jom (sli ka 4-17). Ne ko li ko teh- ni ka bo je nja da ju ka rak te ris ti~ ne ob ras ce svi jet lih i tam nih pru ga ko je se iz- mje nju ju, a re zul tat su raz li ke u ve za nju obi~ nih ili fluo res cen tnih bo ja na sljedove DNA bo ga ti je AT ili GC ba za ma. Ove su pru ge spe ci fi~ ne za sva ki kro mo som i pred stav lja ju, iz gle da, od re |e ne kro mo som ske re gi je. Ge ni se mo gu lo ka li zi ra ti unu tar spe ci fi~ nih kro mo som skih pru ga in si tu hib ri di za ci- jom {to upu}u je na to da je pa ki ra nje DNA u kro mo so me ja ko ure dan i re- pro du ci bi lan pro ces.

Cen tro me re Cen tro mera je spe ci ja li zi ra na re gi ja kro mo so ma ko ja ig ra glav nu ulo gu u osi gu ra nju pra vil ne ras pod je le ud vos tru ~e nih kro mo so ma sta ni ca ma-k}e ri-

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 155

U prvoj fazi mitoze (profazi) kromosomi se kondenziraju i kre}u u sredi{te stanice.

U metafazi, visoko kondenzirani kromosomi sastoje se od dviju jednakih kopija (sestrinske kromatide) koje su povezane centromerom. Niti diobenoga vretena ve`u se na centromeru.

U anafazi, sestrinske kromatide odvajaju se i kre}u na suprotne polove stanice.

Za vrijeme zadnje faze mitoze (telofaza), jezgrina ovojnica ponovo se formira, a kromosomi se dekondenziraju.Stani~nom diobom

nastaju dvije stanice-k}eri.

interfaza

profaza

metafaza

anafaza

centromera

sestrinske kromatide

niti diobenoga vretena

centrosom

telofaza

dekondenzirani kromatin

Sli ka 4-18. Kro mo so mi za vri je me mi to ze. Bu du }i da se DNA rep li ci ra za vri je me in ter fa ze, sta ni ca sad r ̀ ava dvi je jed na- ke ud vos tru ~e ne ko pi je sva ko ga kro mo- so ma pri je ne go u|e u mi to zu.

Sli ka 4-19. Cen tro mera me ta faz no ga kro mo so ma. Cen tro mera je pod ru~ je na ko je mu su dvi je ses trin ske kro ma ti de spo je ne za vri je me me ta fa ze. Na cen tro mer nu DNA ve ̀ u se spe ci fi~ ni pro tei ni te tvo re ki ne to ho ru ko ja slu ̀ i kao mjes to ve za- nja ni ti dio be no ga vre te na.

kinetohora

niti diobenoga vretena

kromatida

ma ti je kom mi to ze (sli ka 4-18). Sta ni~ na se DNA rep li ci ra za vri je me in ter fa- ze {to re zul ti ra stva ra njem dvi ju ko pi ja sva kog kro mo so ma pri je po ~et ka mi to ze. Ka d sta ni ca u|e u mi to zu, kon den za ci jom kro ma ti na stva ra ju se me- ta faz ni kro mo so mi ko ji se sas to je od dvi ju iden ti~ nih ses trin skih kro ma ti da. Te ses trin ske kro ma ti de dr ̀ e se za jed no na cen tro me ri ko ja ima ob lik kon- strik ci je na kro mo so mu. Ka ko mi to za nap re du je, mik ro tu bu li mi to ti~ ko ga vre te na prih va }a ju se na cen tro me re, a za tim se dvi je ses trin ske kro ma ti de raz dvo je i kre }u na sup rot ne po lo ve vre te na. Na kra ju mi to ze jez gri ne mem- bra ne se po no vo for mi ra ju, kro mo so mi se de kon den zi ra ju, a kao re zul tat to ga stva ra ju se dvi je jez gre k}e ri od ko jih sva ka sad r ̀ ava po jed nu ko pi ju ro di telj skoga kro mo so ma.

Cen tro me re zap ra vo ima ju dvos tru ku ulo gu, pr vo kao mjes ta ud ru ̀ i va- nja ses trin skih kro ma ti da i dru go kao mjes ta na ko ja se prih va }a ju mik ro tu- bu li dio be no ga vre te na. Sas to je se od spe ci fi~ nih slje do va DNA na ko je se ve ̀ e od re |e ni broj cen tro me ri prid ru ̀ e nih pro tei na ko ji for mi ra ju spe ci ja li- zi ra nu struk tu ru ko ja se zo ve ki ne to ho ra (slika 4-19). Ve za nje mik ro tu bu la na ki ne to hor ne pro tei ne pos re du je ve za nju kro mo so ma na mi to ti~ ko vre te- no. Pro tei ni ve za ni na ki ne to ho re ta da dje lu ju kao »mo le ku lar ni mo to ri« ko- ji up rav lja ju kre ta njem kro mo so ma du` vlakna vre te na raz dva ja ju }i ta ko kro mo so me u jez gre k}e ri.

Cen tro mer ni sljedovi DNA pr vo su de fi ni ra ni u kvas ca gdje se nji ho va fun kci ja mo ̀ e prou ~a va ti pra }e njem seg re ga ci je plaz mi da u mi to zi (sli ka 4- 20). Plaz mi di ko ji sad r ̀ e fun kcio nal ne cen tro me re raz dva ja ju se na is ti na ~in

156 Poglavlje 4

I II

LEU2

ARS

transformacija kvasca

mitoza

plazmidi se nepravilno segregiraju

neke stanice-k}eri gube plazmid pa im je za rast potreban leucin

sve stanice-k}eri naslje|uju plazmid i mogu rasti u mediju bez leucina

plazmidi se pravilno segregiraju

LEU2

ARS

CEN

Sli ka 4-20. Cen tro mer ni te st u kvas cu. Oba pri ka za na plaz mi da sad r ̀ avaju se- lek tiv ni bi ljeg (LEU2) i slijed DNA ko ji slu ̀ e kvas cu kao iz vo ri rep li ka ci je (ARS, au to nom ni rep li ka cij ski slijed). Bu du }i da plaz mi du I ne dos ta je cen tro mera (CEN) ~es to se gu bi iz sta ni ce za vri je me mi to ze zbog nep ra vil ne seg re ga ci je. Za raz li ku od to ga, pri sut no st cen tro me re (CEN) u plaz mi du II osi gu ra va nje gov re do vi ti pri je nos u sta ni ce-k}e ri.

kao i kro mo so mi i jed no li ko se ras po re |u ju u sta ni ce-k}e ri na kon mi to ze. U od sut nos ti fun kcio nal ne cent ro me re ne raz dva ja ju se pra vil no, pa mno ge sta ni ce k}e ri ne nas li je de plaz mid nu DNA. Prou ~a va nja ovog ti pa omo gu }i- la su da se od re de sljedovi pot reb ni za fun kci ju cen tro me re. Ovak vi po ku si pr vo su po ka za li da su cen tro mer ni sljedovi dob ro poz na tog kvas ca Sac cha ro- myces ce re vi siae sad r ̀ a ni u ot pri li ke 125 pa ro va ba za ko ji se sas to je od tri ju ele me na ta: dva krat ka sljeda od 8 i 25 pa ro va ba za od vo je na me |u sob no sa 78 do 86 pa ro va ba za DNA ko ja je ja ko bo ga ta AT ba za ma (sli ka 4-21A).

Iz gle da da krat ki cen tro mer ni sljedovi de fi ni ra ni u S. ce re vi siae ipak ne od ra ̀ a va ju si tua ci ju u dru gih eu ka rio ta. Sli~ nim fun kcio nal nim pris tu pom, no vi je su stu di je de fi ni ra le cen tro me re cijepaju}ega kvas ca Schi zo sac cha ro- myces pom be. Ia ko su i S. ce re vi siae i S. pom be kvasci, iz gle da da su me |u sob no uda lje ni pod jed na ko kao {to je sva ki od njih uda ljen od ~ov je ka, pa su mno- ge zna ~aj ke nji ho ve sta ni~ ne bio lo gi je pri li~ no raz li ~i te. Ta ko ove dvi je vr ste kvas ca ~i ne kom ple men tar ne mo de le za jed nos tav no i la ga no prou ~a va nje eu ka riot ske sta ni ce. Cen tro me re S. pom be prote`u se na 40 do 100 kb DNA; oni su prib li` no ti su }u pu ta du ̀ i od onih S. ce re vi siae. Sas to je se od cen tral- ne sr ̀ i od 4 do 7 kb jed ne ko pi je DNA ko joj se na bo ko vi ma na la ze po nov lje- ni sljedovi (sli ka 4-21B). Ne sa mo cen tral na sr` ne go ta ko |er i bo~ ni po no-

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 157

(A) S. cerevisiae

(B) S. pombe

B K L B

transpozoni

AATAT satelit

AAGAG satelit

neponovljena DNA

K KL LCCB BB

65 kb

(C) Drosophila melanogaster

420 kb

125 bp

CDE I CDE II CDE III

Pu T C A C Pu T G T G T x T x T G y y T T C C G A A y y y y y A A A

78–86 bp >90% A/T

Sli ka 4-21. Cen tro me re S. ce re vi- siae, S. pom be i vinske mu {i ce. (A) Cen tro mer ni sljedovi S. ce re vi siae (CEN) sas to je se od dva ju krat kih kon- zer vi ra nih sljedova (CDE I i CDE III) ko ji su raz dvo je ni s po mo }u sljedova DNA bo ga tih AT-ba za ma du lji ne od 78 do 86 pa ro va ba za (CDE II). Pri ka za ni sljedovi su kon sen zus sljedovi iz ve de ni ana li zom cen tro mer nih sljedova po je di- nih kva{ ~e vih kro mo so ma. Pu = A ili G; x = A ili T; y = bi lo ko ja ba za. (B) Pri ka- zan je us troj cen tro mer nih sljedo va kro- mo so ma II S. pom be. Cen tro mera se sas- to ji od cen tral ne sr ̀ i (CC – en gl. cen tral co re) je din stve nog sljeda DNA, na ~i jem se bo ku na la ze po nov lje ni slje do vi tri ju re pe ti tiv nih ele me na ta (B, K i L). (C) Cen tro mera vinske mu {i ce sas to ji se od dvi ju sa te lit nih sljedova , tran spo ni ra ju- }ih ele me na ta i ne po nov lje ne DNA.

vlje ni sljedovi pot reb ni su za fun kci ju cen tro me re, pa iz gle da da su cen tro- me re S. pom be daleko slo ̀ e ni je ne goone S. ce re vi siae.

Prou~avanjem kro mo so ma vinske mu {i ce nap rav lje na je pr va ka rak te ri- za ci ja cen tro me ra u vi {ih eu ka rio ta (sli ka 4-21 C). Cen tro me re vinske mu {i- ce pro te ̀ u se na pre ko 420 kb od ko jih se ve }i na (vi {e od 85%) sas to ji od dva ju vi so ko po nov lje nih sa te lit nih DNA sa sli je dom AATAT i AAGAG. Os ta- tak cen tro me ra sas to ji se od ras pr {e nih tran spo ni ra ju }ih ele me na ta, ko ji se ta ko |er na la ze i na dru gim mjes ti ma ge no ma vinske mu {i ce, kao do da tak ne po nov lje noj re gi ji DNA bo ga toj AT ba za ma. De le ci ja sa te lit nih sljedova i tran spo ni ra ju }ih ele me na ta, kao i ne po nov lje ne DNA, sma nji la je ak tiv no st cen tro me ra u fun kcio nal nim is pi ti va nji ma. Pre ma to me, ob je vr ste sljedova i po nov lje ne i ne po nov lje ne iz gle da da pri do no se stva ra nju ki ne to ho re i fun kci ji cen tro me ra. Cen tro me re biljke Ara bi dop si s tako|er se iz gle da pro te- `u pre ko 500 do 1.000 kb i sas to je se ve li kim di je lom od vi so ko po nov lje nih slje do va.

Cen tro me re si sa va ca ka rak te ri zi ra ne su pro {i re nim re gi ja ma he te rok ro- ma ti na ko ji se sas to ji od vi so ko po nov lje nih sa te lit nih sljedova DNA. U lju- di i os ta lih pri ma ta glav ni cen to me rni slijed je st a-satelitna DNA. Nje zi ni os nov ni slijed sad r ̀ ava 171 par ba za ko ji se uzas top no po nav lja ju u re gi ja- ma i po mi li jun pa ro va ba za. a-satelitna DNA ve za na je na pro tei ne prid ru- `e ne cen tro me ri, a ne dav no su po ku si po ka za li da je a-satelitni niz ljud- skoga X kro mo so ma do vo ljan da pos lu ̀ i kao fun kcio nal na cen tro mera. Ipak, opi sa ni su i ab nor mal ni ljud ski kro mo so mi s fun kcio nal nom cen tro me- rom ko ji ma ne dos ta je a-satelitna DNA, pa os ta je i da lje ne jas no {to je zap ra- vo pot reb no za fun kci ju cen tro me re u vi {ih eu ka rio ta.

Te lo me re Sljedovi na kra je vi ma eu ka riot skih kro mo so ma, naz va ni telomere, ig ra ju zna ~aj nu ulo gu u rep li ka ci ji i od r ̀ a nju kro mo so ma. Te lo me re su ra no pre- poz na ne kao po seb ne struk tu re jer su u eu ka riot skim sta ni ca ma na kon lom- lje nja kro mo so mi vr lo nes ta bil ne, pa se pret pos ta vi lo da su ne ki spe ci fi ~ni sljedovi pot reb ni na nor mal nim kra je vi ma kro mo so ma. Ovo je za tim po ka-

158 Poglavlje 4

3'

Sli ka 4-22. Struk tu ra te lo me ra. Te lo mer na DNA iz bo ~i se i vra }a sa ma na se be pa se ta ko stvo ri kru` na struk tu ra na ko ju se ve ̀ e od re |e ni broj pro tei na ko ji ~u va- ju kra je ve kro mo so ma.

Telomerni ponovljeni Organizam slijed

Kvasci Saccharomyces G1–3T cerevisiae Schizosaccharomycespombe G2–5TTAC Protozoa Tetrahymena GGGGTT Dictyostelium G1–8A Biljka Arabidopsis AGGGTTT Sisavac ^ovjek AGGGTT

Tablica 4-4. Telomerna DNA

za no po ku si ma u ko ji ma su te lo me re pra ̀ i vo ti nje Tet ra hyme na do da ne kra je- vi ma li near nih mo le ku la DNA plaz mi da kvas ca. Te lo mer ne DNA omo gu }i le su ovim plaz mi di ma da se rep li ci ra ju u kvas cu kao li near ne mo le ku le na lik na kro mo so me, pa je to bio iz ra van do kaz da su te lo me re pot reb ne za rep li- ka ci ju li near nih mo le ku la DNA.

Te lo mer ni sljedovi DNA raz li ~i tih eu ka rio ta sli~ ni su i sad r ̀ a va ju po nov- lje ne jed nos tav ne sljedove DNA s na ku pi na ma G os ta ta ka u jed nom lan cu (tab li ca 4-4). Prim je ri ce, slijed te lo mer nih po nav lja nja u ~ov je ka i os ta lih si sa- va ca je AGGGTT, a te lo mer no po nav lja nje u pra ̀ i vo ti nji Tet ra hyme na je GGGGTT. Ovi su sljedovi po nov lje ni sto ti na ma ili ti su }a ma pu ta, pa za u zi- ma ju ne ko li ko ki lo ba za i zav r {a va ju s jed nim jed no lan ~a nim re pom. Po nov- lje ni sljedovi te lo mer ne DNA ~i ne om ~e na kra je vi ma kro mo so ma te ujed no ve ̀ u od re |e ni broj pro tei na ko ji ~u va ju kro mo som ske kra je ve od raz grad- nje ili me |u sob nog spa ja nja (sli ka 4-22).

Te lo me re ig ra ju glav nu ulo gu u rep li ka ci ji kra je va li near ne DNA mo le ku- le (vi di pog lav lje 5). DNA-po li me ra za mo ̀ e pro du ̀ i ti ras tu }i DNA la nac, ali ne mo ̀ e za po ~e ti sin te zu no vo ga lan ca na kra ju li near ne DNA mo le ku le. Pre ma to me, kra je vi li near nih kro mo so ma ne mo gu se rep li ci ra ti nor mal- nom ak ci jom DNA-po li me ra ze. Taj prob lem ri je {en je evo lu ci jom po seb nog me ha niz ma ko ji uk lju ~u je ak tiv no st re ver zne tran skrip ta ze za rep li ka ci ju te lo mer nih sljedova DNA. Od r ̀ a nje te lo me ra je, iz gle da, va ̀ an fak tor u od- re |i va nju tra ja nja `i vo ta i rep ro duk tiv ne spo sob nos ti sta ni ce, pa prou ~a va- nje te lo me ra i te lo me ra ze obe }a va no ve uvi de u pro ce se sta re nja i nas tan ka ra ka.

Sljedovi ~i ta vih ge no ma Ne ka od na juz bud lji vi jih no vih ot kri }a u mo le ku lar noj bio lo gi ji pred stav lja- ju re zul ta te ana li ze kom plet nog nuk leo tid nog sljeda hu ma noga ge no ma i ge no ma ne ko li ci ne mo del nih or ga ni za ma me |u ko ji ma su E. co li, Sac cha ro- myces ce re vi siae, Cae nor hab di tis ele ga ns, Dro sop hi la me la no gas ter, Ara bi dop sis tha- lia na i mi{ (tab li ca 4-5). Re zul ta ti sek ven ci ra nja ~i ta vih ge no ma od ve li su nas da lje od ka rak te ri za ci je po je di nih ge na sve do glo bal nog pog le da na or ga ni-

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 159

Tablica 4-5. Sekvencirani genomi (sa`etak)

Veli~ina Broj Sljedovi koji Organizam genoma (Mb)a gena kodiraju proteine

Bakterije Mycoplasma genitalium 0,58 470 88% H. influenzae 1,8 1.743 89% E. coli 4,6 4.288 88% Kvasci S. cerevisiae 12 6.000 70% S. pombe 12 4.800 60% Beskralje`njaci C. elegans 97 19.000 25% Drosophila 180 13.600 13% Biljke Arabidopsis thaliana 125 26.000 25% Ri`a 440 30.000 –50.000 ≈ 10% Sisavci ^ovjek 3.200 30.000–40.000 1–1.5%

aMb = milijuni parova baza

za ci ju i gen ski sad r ̀ aj ~i ta vih ge no ma. Ova kav pris tup po ten ci jal no vo di do iden ti fi ka ci je svih ge na ne kog or ga niz ma ko ji ta da pos ta ju pris tu pa~ ni is tra- `i va nju nji ho ve struk tu re i fun kci je. Pri to mu je za nim lji vo da se, ka ko u~i- mo ob ja{ nja va ti go le mu ko li ~i nu po da ta ka ko ju je ge ne ri ra lo sek ven ci ra nje ~i ta vih ge no ma, po jav lju ju no vi iza zo vi i no vo pod ru~ je naz va no bioin for- ma ti kom koje le ̀ i na gra ni ci iz me |u bio lo gi je i kom pju ter ske zna nos ti, a us mje re no je na raz voj ra ~u nal nih me to da pot reb nih za ana li zu i iz dva ja nje ko ris nih bio lo{ kih po da ta ka iz sljedova mi li jar di ba za ko je tvo re ge nom ve li- ~i ne hu ma nog. Ia ko je jo{ pu no to ga pot reb no nau ~i ti, ge nom ski re dos li je di ko ji su ve} dos tup ni opskr bi li su znan stve ni ke s je din stve nom ba zom po da- ta ka ko ja se sas to ji od sljedova nuk leo tid a ~i ta vog kom ple ta ge na. Bu du }i da mno gi od tih ge na ni su pri je bi li pre poz nani, od re |i va nje nji ho ve fun kci- je stvo rit }e os no vu za mno ga bu du }a is tra ̀ i va nja u sta ni~ noj bio lo gi ji.

Pro ka riot ski ge no mi Sa da poz na je mo pot pu ni ge nom ski re dos li jed vi {e od {ez de set raz li ~i tih bak te ri ja, a jo{ vi {e tak vih re dos li je da je up ra vo u pro ce su od re |i va nja. Pr vi pot pu ni slijed sta ni~ no ga ge no ma ob ja vi la je, 1995. go di ne, sku pi na is tra ̀ i- va ~a pod vod stvom Crai ga Ven te ra, a ra di lo se o bak te ri ji Hae mop hi lus in- fluen zae koja je ~es ti sta nov nik di{ no ga sus ta va. Ge nom H. in fluen zae sad r- `ava oko 1,8 × 106 pa ro va ba za (1,8 me ga ba za ili Mb) {to je ma lo ma nje od po lo vi ne ve li ~i ne ge no ma E. co li. Pot pu ni nuk leo tid ni slijed poka zao je da je ge nom H. influenzae kru`na mo le ku la ko ja sad r ̀ ava 1.830,137 pa ro va ba za DNA. Slijed je ta da ana li zi ra n na ge ne ko ji ko di ra ju rR NA, tR NA i pro tei ne. Po ten ci jal na pod ru~ ja za ko di ra nje pro tei na iden ti fi ci ra na su kom pju ter- skom ana li zom sljedova DNA ka ko bi se ot kri li ot vo re ni ok vi ri ~i ta nja (engl. ope n-rea di ng fra mes), du gi ni zo vi nuk leo tid a i ko ji mo gu ko di ra ti po li- pep ti de jer ne sad r ̀ a va ju ni je dan od stop ko do na (UAA, UAG i UGA). Bu- du }i da se ovi ko do ni ko ji zaus tav lja ju pre vo |e nje po li pep tid nog lan ca na- sum ce po jav lju ju jed nom na sva ki 21 ko don (3 stop ko do na od ukup no 64

160 Poglavlje 4

Sli ka 4-23. Ge nom Hae mop hi lus in fluen zae. Predvi|ene re gi je ko je ko di ra ju pro- te i ne oz na ~e ne su obo je nim cr ta ma. Bro je vi oz na ~u ju pa ro ve ba za u DNA. (Iz Fleis chma nn et al., 1995. Scien ce 269: 496.)

1.800.000 100 000

.000

400.000

500.000

0.000

900.0001.000.000

1.200

1.300.000

1.400.000

1.500.00

1

ko do na), ot vo re ni ok vi ri ~i ta nja ko ji se pro te ̀ u na vi {e od sto ti nu ko do na obi~ no pred stav lja ju fun kcio nal ne ge ne.

Ovak vom ana li zom u ge no mu H. in fluen zae ot kri ve no je {e st ko pi ja ge na za rR NA, 54 raz li ~i tih tR NA ge na i 1.743 po ten ci jal nih re gi ja za ko di ra nje pro tei na (sli ka 4-23). Na te me lju nji ho ve po du dar nos ti s poz na tim pro tein- skim sljedovi ma, vi {e od ti su }u ovih re gi ja po ve za no je od re |e nom bio lo- {kom ulo gom (kao prim je ri ce en zimi cik lu sa li mun ske ki se li ne), ali os ta li pred stav lja ju ge ne ne poz na te fun kci je. Pret pos tav lje ni ko di ra ju }i sljedovi ima ju pros je~ nu ve li ~i nu od oko 900 pa ro va ba za, pa pok ri va ju oko 1,6 Mb DNA {to ~i ni bli zu 90% ge no ma H. in fluen zae.

Kom plet an slijed ge no ma Mycop las ma ge ni ta lium po seb no je za nim lji v jer su mi kop laz me naj ma nje da na{ nje bak te ri je i od svih poz na tih sta ni ca sad r- `avaju naj ma nje ge no me. Ge nom M. ge ni ta lium du lji ne je sa mo 580 kb (0,58 Mb) te vje ro jat no pred stav lja mi ni mal ni kom plet ge na pot re ban za odr ̀ a- nje or ga niz ma ko ji se sam raz mno ̀ a va. Ana li za sljeda DNA M. ge ni ta liumpokazala je da on sad r ̀ i sa mo 470 sljedova za ko di ra nje pro tei na, a to ~i ni ot pri li ke 88% ge nom ske DNA. Mno gi od tih sljedova iden ti fi ci ra ni su kao ge ni ko ji ko di ra ju pro tei ne uk lju ~e ne u rep li ka ci ju DNA, tran skrip ci ju, trans- la ci ju, mem bran ski tran spo rt i ener get ski me ta bo li zam. Ipak, M. ge ni ta lium sad r`a va mno go ma nje ge na za en zi me me ta bo liz ma od H. in fluen zae {to pred stav lja od raz nje zi na og ra ni ~e ni jeg me ta bo liz ma. Prim je ri ce, mno gi ge- ni za ko je se zna da ko di ra ju kom po nen te bio sin te ti~ kih pu te va ne dos ta ju u ge no mu M. ge ni ta lium, a to je u skla du s nje zi nom pot re bom da uzi ma ami- no ki se li ne i pre kur so re nuk leo ti da iz do ma }i na. Za nim lji vo je da ge nom mi- kop laz me ta ko |er sad r ̀ ava ot pri li ke 150 ge na, ~i ja je fun kci ja tre nut no ne- poz na ta. Ta ko ~ak i u naj jed nos tav ni joj sta ni ci tek preos ta je da se od re di bio lo{ ka fun kci ja mno gih ge na.

Ge nom ski re dos li jed ar he bak te ri je Met ha no coc cus ja nas chii, ob jav ljen 1996. go di ne, omo gu }io je zna ~a jan uvid u evo lu cij ske od no se iz me |u ar he-

Organizacija i redosljedi stani~nih genoma 161

bak te ri ja, eu bak te ri ja i eu ka rio ta. Ge nom M. ja nnas chii ve li ~i ne je 1,7 Mb i pred vi |a se da sad r ̀ ava 1.738 sljedova za ko di ra nje pro tei na − sli~ ne je ve li- ~i ne kao i ge nom H. in fluen zae. Ipak, sa mo oko tre }i ne sljedova za ko di ra nje pro tei na ko je su ot kri ve ne u M. ja nas chii srod ne su poz na tim ge ni ma eu bak- te ri ja ili eu ka rio ta {to upu}u je na po seb no st gen skoga sas ta va ar he bak te ri ja. Ge ni za ko di ra nje pro tei na M. ja nas chii uk lju ~e ni u proiz vod nju ener gi je i bio sin te zu sta ni~ nih sas to ja ka srod ni su oni ma u eu bak te ri ja {to na me }e pret pos tav ku da su se os nov ni me ta bo li~ ki pro ce si raz vi li u zajed ni~ kom pret ku ar he bak te ri ja i eu bak te ri ja. Zna ~aj no je da su ge ni za ko di ra nje pro- tei na pot reb nih za ud vos tru ~i va nje, pre pi si va nje i pre vo |e nje DNA u bli- `em srod stvu s ge ni ma u eu ka rio ta ne go li s oni ma u eu bak te ri ja. Ge nom sko sek ven ci ra nje ove ar he bak te ri je, dak le, po ka zu je da ar he bak te ri je i eu ka rio- ti di je le za jed ni~ ku evo lu cij sku li ni ju i u bli ̀ em su srod stvu ne go {to je bi lo ko ji od njih s eu bak te ri ja ma (vi di sli ku 1-8).

Ia ko su re la tiv na jed nos tav no st i la ko }a ge ne ti ke E. co li od nje nap ra vi li omi lje ni or ga ni zam mo le ku lar nih bio lo ga, ge nom E. co li od 4,6 Mb ni je bio pot pu no sek ven ci ran sve do 1997. go di ne. Ana li za sljeda nukleotida E. co li ot kri la je ukup no 4.288 ge na, a sljedovi za ko di ra nje pro tei na ~i ne 88% nje zi- na ge no ma. Od 4.288 ge na ot kri ve nih sek ven ci ra njem, 1.835 ge na bi lo je ve} pret hod no iden ti fi ci ra no, a fun kci ja do dat nih 821 mog la se iz vu }i iz us po- red bi sa sljedovima ge na ka rak te ri zi ra nih u dru gim or ga niz mi ma. Ipak, funk ci ja 1.632 ge na E. co li (oko 40% ge no ma) ni je se mog la od re di ti. Ta ko nam ge nom sko sek ven ci ra nje po ka zu je da se jo{ mno go to ga mo ra nau ~i ti o sta ni~ noj bio lo gi ji pro ka rio ta, pa ~ak i u jed noga ta ko iscr pno is tra ̀ i va nog or ga niz ma po put E. co li.

Kva{ ~ev ge nom Kao {to je ve} na po me nu to, naj jed nos tav ni ji eu ka riot ski ge nom (1,2 × 107 pa ro va ba za DNA) pro na |en je u kvas ca Sac cha ro myes ce re vi siae. [to vi {e, kvas ci ras tu br zo i mo gu se podvr gnu ti jed nos tav nim ge ne ti~ kim ma ni pu la- ci ja ma. Zbog to ga kvas ci na vi {e na ~i na pred stav lja ju mo del eu ka riot skih sta ni ca ko ji se mo ̀ e pu no lak {e prou ~a va ti ne go li sta ni ce si sa va ca i os ta lih vi {ih eu ka rio ta. U skla du s ti me, pot pu no sek ven ci ra nje jed noga cijeloga kva{ ~e voga kro mo so ma, 1992. go di ne, (sli ka 4-24) te za tim od re |i va nje sli- jeda cijeloga kva{ ~e va ge no ma 1996. go di ne, pred stav lja lo je naj va` ni je ko- ra ke u ra zu mi je va nju mo le ku lar ne bio lo gi je eu ka riot skih sta ni ca.

Ge nom S. ce re vi siae sad r ̀ ava oko 6.000 ge na, me |u ko ji ma se, ka ko se pred vi |a, na la zi 5.885 sljedova za ko di ra nje pro tei na, 140 ge na za ribosom- nu RNA, 275 ge na za tran spor tnu RNA i 40 gena ko ji ko di ra ju ma le jez gri ne RNA (snR NA) uk lju ~e nih u do ra du RNA (vi di 6. pog lav lje). Pre ma to me, kvas ci ima ju ve li ku gus to }u sljedova ko ji ko di ra ju pro tei ne {to je sli~ no bak- te rij skim ge no mi ma, a ti sljedovi ~i ne oko 70% ukup ne kva{ ~e ve DNA. U skla du s ti me, sa mo 4% kva{ ~e vih ge na sad r ̀ avaju in tro ne. [to vi {e, ge ni S. ce re vi siae ko ji sad r ̀ avaju in tro ne obi~ no ima ju sa mo je dan ma li in tron bli zu po ~et ka ge na.

Kom pju ter skom ana li zom, te me lje nom na sli~ nos ti ma sa sljedovima po- zna tih ge na, pred vi |e ne su u S. ce re vi siae fun kci je za oko 3.000 sljedova za ko di ra nje pro tei na. Te me lje no na ana li zi ovih ge na, iz gle da da oko 11% pro- tei na kvas ca dje lu ju u me ta bo liz mu, 3% u proiz vod nji i poh ra ni me ta bo li- ~ke ener gi je, 3% u rep li ka ci ji DNA, pop rav ku i re kom bi na ci ji, 7% u pre pi si- va nju, 6% u pre vo |e nju, a 14% u sor ti ra nju pro tei na i tran spor tu. Ipak, funk ci je mno gih od ovih ge na opi su ju se sa mo op }im ter mi ni ma (kao {to je tran skrip cij ski fak tor), pa tek tre ba od re di ti nji ho vu to~ nu ulo gu u sta ni ci. [to vi {e, bu du }i da po lo vi na pro tei na ko di ra nih kva{ ~e vim ge no mom ni je bi la ni u kak voj ve zi s pret hod no opi sa nim ge ni ma, preos ta je da se fun kci ja

komentari (0)

nema postavljenih komentara

budi prvi koji ce napisati!

ovo je samo pregled

3 prikazano na 42 str.

preuzmi dokument