M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb
tena_zovko
tena_zovko28 October 2017

M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb

PDF (4 MB)
52 str.
1broj preuzimanja
72broj poseta
Opis
Molekularna biologija, 5. poglavlje, genomska DNA
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 52

ovo je samo pregled

3 prikazano na 52 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 52 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 52 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 52 str.

preuzmi dokument
05-pogl.indd

Poglavlje 5 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA

Replikacija DNA 179

Popravak DNA 192

Rekombinacija izme|u homolognih sljedova DNA 204

Preslagivanje DNA 211

KLJU^NI POKUS:Preslagivanje imunoglobulinskih gena 218

MOLEKULARNA MEDICINA: Karcinom debeloga crijeva i popravak DNA 203

O S NOV NI BIO LO[ KI PRO CES RAZ MNO @A VA NJA zah ti je va vjer ni pri je nos ge ne- ti~ ke in for ma ci je s ro di te lja na po tom stvo. Zbog to ga je to~ na rep li ka ci- ja ge nom ske DNA klju~ na za `i vot svih sta ni ca i or ga ni za ma. Sva ki pu-

ta kad se sta ni ca di je li, nje zin cje lo kup ni ge nom mo ra bi ti ud vos tru ~en, pri ~e mu je za ko pi ra nje ve li kih mo le ku la DNA ko je iz gra |u ju pro ka riot ske i eu ka- riot ske kro mo so me pot reb na pri sut no st ci je log ni za en zi ma. Uz to, sta ni ce su raz vi le me ha niz me za pop rav lja nje pog rje {a ka ko je se po ne kad do ga |a ju za vri- je me um na ̀ a nja DNA te za pop ra vak o{ te }e nja ko ja nas ta ju kao re zul tat dje lo- va nja ~im be ni ka oko li {a kao {to je zra ~e nje. Nep ra vil nos ti u ovim pro ce si ma re- zul ti ra ju ne mo gu} no{ }u to~ ne rep li ka ci je i od r ̀ a va nja ge nom ske DNA – po- grje{ kom ko ja mo ̀ e ima ti ka tas tro fal ne pos lje di ce kao {to je raz voj kar ci no ma.

Una to~ va` nos ti pre ciz ne rep li ka ci je i od r ̀ a va nja DNA, sta ni~ ni ge no mi su ipak pod lo` ni prom je na ma. Da bi se vr ste evo lu cij ski raz vi ja le, pot reb na je pri- sut no st mu ta ci ja i pres la gi va nja ge na ka ko bi se od r ̀ a la ge ne ti~ ka va ri ja bil no st iz me |u je din ki. Re kom bi na ci ja ho mo log nih kro mo so ma za vri je me me jo ze ig ra va` nu ulo gu u ovom pro ce su omo gu }u ju }i ro di telj skim ge ni ma da pres la gi va- njem (rea ran ̀ ma nom) stva ra ju no ve kom bi na ci je u bu du }im ge ne ra ci ja ma. Smat ra se da pres la gi va nje slje do va DNA unu tar ge no ma stva ra njem no vih kom bi na ci ja ge ne ti~ kih in for ma ci ja ta ko |er pri do no si evo lu cij skom nap ret ku. Uz to su ne ki ob li ci pres la gi va nja DNA prog ra mi ra ni za re gu la ci ju ek spre si je ge- na ti je kom di fe ren ci ja ci je i raz vo ja in di vi dual nih sta ni ca i or ga ni za ma. Ka rak te- ris ti ~an prim jer to ga pro ce sa kod lju di pred stav lja pres la gi va nje imu nog lo bu lin- skih ge na ti je kom raz vo ja imu no lo{ kog sus ta va. Sto ga je za raz voj po je di na~ nih or ga ni za ma kao i za evo lu ci ju vr sta pot reb na sup til na ravnote`a iz me |u od r ̀ a- va nja i va ri ja bil nos ti nas ljed nih in for ma ci ja.

Rep li ka ci ja DNA Kao {to je na ve de no u tre }em pog lav lju, rep li ka ci ja DNA je se mi kon zer va ti van pro ces u ko jem sva ki ro di telj ski la nac slu ̀ i kao ka lup za sin te zu no vih, kom ple- men tar nih la na ca k}e ri. Glav ni en zim uk lju ~en u ovaj pro ces je DNA-po li me ra- za ko ja ka ta li zi ra spa ja nje deok si ri bo nuk leo zi d-5'-tri fos fa ta (dNTP) ras tu }eg lan- ca DNA. Ipak, rep li ka ci ja DNA znat no je kom plek sni ja i zah ti je va vi {e od jed ne en zim ske reak ci je. U cje lo ku pan pro ces uk lju ~e ni su broj ni dru gi pro tei ni, a nu- `na je i pri sut no st ko ri gi ra ju }ih me ha ni za ma ka ko bi se osi gu ra lo da to~ no st

180 Poglavlje 5

Sli ka 5-1. Izo la ci ja mu ta na ta s ne dos tat kom DNA-po li me ra ze I. Kul tu ra sta ni ca E. co li tretirana je ke mij- skim mu ta ge nom, na kon ~e ga su uz go- jem na po lu~vr stom me di ju izo li ra ne po je di na~ ne bak te rij ske ko lo ni je. Ne ko- li ko ti su }a ko lo ni ja na sa |e no je za tim na za seb ne kul tu re i pret ra ̀ e no ka ko bi se iden ti fi ci ra li mu tan ti s ne dos tat kom po li me ra ze I.

kultura stanice E. coli

tretiranje mutagenom

rast na polu~vrstom mediju u Petrijevoj posudi

pra}enje aktivnosti DNA polimeraze I kako bi se identificirao mutant s nedostatkom enzima

kulture pojedina~nih kolonija

kolonije nastale iz jedne bakterije tretirane mutagenim ~imbenikom

rep li ka ci je bu de kom pa ti bil na s ma lom u~es ta lo{ }u pog rje {a ka {to je pot re- bno za nor mal no od vi ja nje sta ni~ ne rep ro duk ci je. Do dat ni pro tei ni, kao i spe ci fi~ ni slje do vi DNA, pot reb ni su i za ini ci ja ci ju rep li ka ci je i ko pi ra nje kra je va eu ka riot skih kro mo so ma.

DNA-po li me ra ze DNA-po li me ra zu pr vi je ot krio Ar htur Kor nbe rg, 1956. go di ne u li za ti ma bak te ri je E. co li. Spo sob no st ovog en zi ma da to~ no ko pi ra DNA-ka lup pru- `i la je bio ke mij sku pod lo gu za mo del rep li ka ci je mo le ku le DNA ko ji su prvot no pred lo ̀ i li Wat son i Cri ck, ta ko da nje zi na izo la ci ja pred stav lja jed- no od te melj nih ot kri }a mo le ku lar ne bio lo gi je. Iro ni~ no, pr va iden ti fi ci ra na DNA-po li me ra za (da nas je zo ve mo DNA-po li me ra za I) ni je glav ni en zim od go vo ran za rep li ka ci ju DNA E. co li. Um jes to to ga da nas zna mo da i pro- ka riot ske i eu ka riot ske sta ni ce sad r ̀ avaju ne ko li ko DNA-po li me ra za ko je ima ju raz li ~i te ulo ge u rep li ka ci ji i pop rav ku DNA.

Vi {es tru ko st DNA-po li me ra za pr vi je put ot kri ve na izo la ci jom mu tan t- nog so ja E. co li s ne dos tat kom DNA-po li me ra ze I (sli ka 5-1). Kul tu re E. co li tre ti ra ne su ke mij skom tva ri (mu ta ge nom) ko ja in du ci ra ve li ku u~es ta lo st mu ta ci ja, na kon ~e ga su izo li ra ne i is pi ta ne po je di na~ ne bak te rij ske ko lo ni- je ka ko bi se iden ti fi ci rao mu ti ra ni soj s ne dos tat kom po li me ra ze I. Ana li za ne ko li ko ti su }a ko lo ni ja do ve la je do izo la ci je `e lje nog mu tan ta ko je mu je go to vo u pot pu nos ti ne dos ta ja la ak tiv no st po li me ra ze I. Za ~u do, mu ti ra na bak te ri ja ras la je nor mal no iz ~e ga je proi zi {ao zak lju ~ak da DNA-po li me ra- za I ni je nu` na za rep li ka ci ju DNA. S dru ge stra ne, mu ti ra ne bak te ri je bi le su iz nim no os jet lji ve na ~im be ni ke ko ji o{ te }u ju DNA (prim je ri ce UV-zra ~e- nje) upu }u ju }i na to da je po li me ra za I uk lju ~e na pog la vi to u pop ra vak DNA o{ te }e nja, a ne u rep li ka ci ju DNA per se.

Zak lju ~ak da po li me ra za I ni je pot reb na za rep li ka ci ju im pli ci rao je da E. co li mora sad r ̀ avati dru ge DNA-po li me ra ze te su nak nad ni ek spe ri men ti do ve li do iden ti fi ka ci je dva ju en zi ma, da nas poz na tih kao DNA-po li me ra- za II i III. Po ten ci jal na ulo ga ovih en zi ma is pi ta na je izo la ci jom od go va ra ju- }ih mu ta na ta. Po ka za lo se da so je vi E. co li s mu ta ci jom po li me ra ze II ras tu nor mal no, a ulo ga ovo ga en zi ma u po seb nom ob li ku pop rav ka DNA sklo- nom pog rje{ ka ma (pri ka za nom u od jelj ku Pop ra vak DNA) tek je ne dav no ut vr |e na. Na sup rot to mu, tem pe ra tur no os jet lji vi mu tan ti s ne dos tat kom po li me ra ze III ni su bi li u mo gu} nos ti rep li ci ra ti svo ju DNA pri vi so koj tem- pe ra tu ri, a dalj nje su stu di je pot vr di le da je po li me ra za III glav ni rep li ka cij- ski en zim E. co li.

Da nas je poz na to da je za rep li ka ci ju DNA E. co li uz po li me ra zu III po- treb na i pri sut no st po li me ra ze I. U pr vot no opi sa nom mu tan tu za DNA-po li- me ra zu I, taj en zim ni je bio pot pu no ne dos ta tan, a dalj nji ek spe ri men ti po- ka za li su da pri sut na ak tiv no st DNA-po li me ra ze I u tom so ju ig ra klju ~nu ulo gu u rep li ka ci ji. Rep li ka ci ja DNA E. co li pre ma to me uk lju ~u je dvi je raz li- ~i te DNA-po li me ra ze ~i je su spe ci fi~ ne ulo ge prikazane u dalj njem tek stu.

Eu ka riot ske sta ni ce sad r ̀ avaju pet ti pi~ nih DNA-po li me ra za:a, b, g, d i e. Po li me ra za g na la zi se u mi to hon dri ji ma i od go vor na je za rep li ka ci ju mi- to hon drij ske DNA. Preos ta la ~e ti ri en zi ma smje{ te na su u jez gri i sto ga je bi lo op rav da no vje ro va ti da su uk lju ~e ni u rep li ka ci ju jez gri ne DNA. Po li- me ra ze a, b i e na jak tiv ni je su u sta ni ca ma ko je se di je le, {to su ge ri ra nji ho- vu ulo gu za vri je me rep li ka ci je. Na sup rot to mu, po li me ra za a i b pod jed na- ko su ak tiv ne i u sta ni ca ma ko je se di je le i u oni ma ko je se ne di je le, {to je u skla du s nji ho vom fun kci jom u pop rav ku o{ te }e nja DNA.

Dva ti pa ek spe ri me na ta pru ̀ i la su dalj nje do ka ze ko ji upu }u ju na ulo ge po li me ra za a, b i e u pro ce su rep li ka ci je DNA. Pr vo, rep li ka ci ja DNA ne kih

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 181

lanac kalupa

lanac po~etnice

lanac kalupa

lanac po~etnice

P iP

AT

A T

OH

HO

sm je

r ra

st a

la n ca

sm je

r ra

st a

la n ca

5'

5'

3'

3'

3'

A T

G C

G C

P

P

P

P

HO

PPP

P

P

P

P

T

P

C

P

A

P

P

T

P

AT

A T

OH 5'

5'

3'

A T

GC

G C

P

P

P

P

P

HO

P

P

P

P

T

P

C

P

A

P

P

T

P

Sli ka 5-2. En zim ska reak ci ja ka ta li zi ra na DNA-po li me ra zom I. Sve poz na te DNA-po li me ra ze do da ju deok si ri bo nuk leo ti d-5'- tri fos fat na 3' hid rok sil nu sku pi nu ras tu }ega lan ca DNA (la nac po ~et ni ce).

`i vo tinj skih vi ru sa po put SV40 mo ̀ e se prou ~a va ti u bez sta ni~ nim (en gl. ce ll-free) ek strak ti ma. Prou ~a va nje rep li ka ci je in vit ro omo gu }i lo je iz rav nu iden ti fi ka ci ju od go vor nih en zi ma, a ana li za tak vih bez sta ni~ nih sus ta va po- ka za la je da su po li me ra ze a i d nu` ne za rep li ka ci ju DNA vi ru sa SV40. Dru- go, po li me ra ze a, d i e na |e ne su u kvas ci ma kao i u sta ni ca ma si sa va ca {to je omo gu }i lo iz rav no ispitivanje nji ho vih bio lo{ kih ulo ga na mo de lu kva sa- ca (vi di 3. pog lav lje). Stu di je ge ne ti ke kva sa ca po ka zu ju da su mu tan ti kva- sa ca s ne dos tat kom bi lo ko jeg od tri na ve de na en zi ma nes po sob ni za pro li- fe ra ci ju im pli ci ra ju }i kri ti~ nu ulo gu po li me ra ze ε kao i po li me ra ze a i d u rep li ka ci ji DNA. Ipak, dalj nje su stu di je po ka za le da esen ci jal na fun kci ja po li me ra ze e u kvas ci ma ne zah ti je va nje zi no en zim sko dje lo va nje u svoj- stvu DNA-po li me ra ze. Sto ga, ulo ga po li me ra ze e u rep li ka ci ji DNA os ta je ne jas na ia ko je mo gu }e da fun kcio ni ra sli~ no kao i po li me ra za d ko ja mo ̀ e ka ta li zi ra ti rep li ka ci ju DNA u od sut nos ti po li me ra ze e, ka ko u bez sta ni- ~nim sus ta vi ma ta ko i u in tak tnim kvas ci ma.

Sve poz na te DNA-po li me ra ze di je le dva os nov na svoj stva ko ja su od pre sud ne va` nos ti za rep li ka ci ju DNA (sli ka 5-2). Pr vo, sve po li me ra ze sin- te ti zi ra ju DNA sa mo u 5' → 3' smje ru do da ju }i dNTP na 3' hid rok sil nu sku- pi nu ras tu }eg lan ca. Dru go, DNA-po li me ra ze mo gu do da ti no ve dNTP sa- mo na pret hod no for mi ra ni la nac po ~et ni ce ko ji je vo di ko vim ve za ma spo- jen s ka lu pom – one ni su u mo gu} nos ti za po ~e ti sin te zu DNA de no vo ka ta li- zi ra ju }i po li me ri za ci ju slo bod nih dNTP. Po to me se DNA-po li me ra ze raz li- ku ju od RNA-po li me ra za ko je mo gu za po ~e ti sin te zu no vog lan ca RNA u od sut nos ti po ~et ni ce. Kao {to je opi sa no da lje u ovom pog lav lju, na ve de ne

182 Poglavlje 5

lanac k}eri

roditeljski lanac

replikacijske ra{lje

(B)(A)

100 mm

replikacijske ra{lje

Sli ka 5-3. Rep li ka ci ja DNA E. co li. (A) Au to ra diog ra fi ja s pri ka zom bak te ri- ja ko je su uz ga ja ne u [3H] ti mi di nu kroz dvi je ge ne ra ci je ka ko bi se obi lje ̀ i la DNA, ko ja je za tim izo li ra na i vi zua li zi- ra na ek spo zi ci jom fo tog raf skog fil ma. (B) Ovaj she mat ski pri kaz ilus tri ra dvi je rep li ka cij ske ra{ lje pri ka za ne pod (A). (Iz J. Cairns, 1963., Co ld Spri ng Har bor Symp.Quant. Biol. 28: 43.)

ka rak te ris ti ke DNA-po li me ra za ~i ne se klju~ ni ma za od r ̀ a va nje vi so ke vjer- nos ti rep li ka ci je DNA pot reb ne za um no ̀ a va nje sta ni ca.

Rep li ka cij ske ra{ lje Mo le ku le DNA u pro ce su rep li ka ci je pr vi je ana li zi rao Jo hn Cair ns u ek spe- ri men ti ma u ko ji ma je E. co li uz ga ja na u pri sut nos ti ra dioak tiv nog ti mi di na {to omo gu }uje nak nad nu vi zua li za ci ju no vo rep li ci ra ne DNA s po mo }u au- to ra diog ra fi je (sli ka 5-3). U ne kim slu ~a je vi ma mo gu }e je opa zi ti kom plet- ne kru` ne mo le ku le u pro ce su rep li ka ci je. Ove mo le ku le DNA sad r ̀ avaju dvi je rep li ka cij ske ra{ lje ko je pred stav lja ju pod ru~ ja sin te ze DNA. U sva- kim ra{ lja ma ro di telj ski lan ci mo le ku le DNA su raz dvo je ni i sin te ti zi ra ju se dva no va lan ca k}e ri.

Pro ces sin te ze no vih la na ca DNA kom ple men tar nih lan ci ma ro di telj ske mo le ku le DNA pred stav lja zna ~a jan prob lem za ra zu mi je va nje bio ke mij- skih pro ce sa uk lju ~e nih u rep li ka ci ju DNA. Bu du }i da lan ci dvo lan ~a ne DNA uz voj ni ce te ku u sup rot nim (an ti pa ra lel nim) smje ro vi ma, kon ti nui ra- na sin te za dva ju no vih la na ca u rep li ka cij skim ra{ lja ma zah ti je va la bi da je- dan la nac bu de sin te ti zi ran u 5' → 3' smje ru, dok se dru gi sin te ti zi ra u su- prot nom (3' → 5') smje ru. No, DNA-po li me ra za ka ta li zi ra po li me ri za ci ju dNTP sa mo u 5' → 3' smje ru. Ka ko se on da vr {i sin te za dru gog DNA lan ca?

Ova enig ma ri je {e na je ek spe ri men ti ma ko ji su po ka za li da se sa mo je- dan la nac mo le ku le DNA sin te ti zi ra kon ti nui ra no u smje ru sveu kup ne re- pli ka ci je DNA dok se dru gi for mi ra iz krat kih dis kon ti nui ra nih frag me na ta DNA (1 – 3 kb) ko ji se sin te ti zi ra ju unat rag u od no su na smjer kre ta nja re pli- ka cij skih ra{ lji (sli ka 5-4). Ovi ma li frag men ti no vo sin te ti zi ra ne DNA (pre- ma nji ho vom ot kri va ~u, naz va ni Oka za ki je vi frag men ti) spa ja ju se dje lo va- njem DNA-li ga ze stva ra ju }i cje lo vi ti no vi la nac DNA. Kon ti nui ra no sin te ti- zi ra ni la nac na zi va se vo de }i la nac jer nje go vo pro du lje nje u smje ru kre ta- nja rep li ka cij skih ra{ lji iz la ̀ e ka lup ko ji se ko ris ti za sin te zu Oka za ki je vih frag me na ta dru go ga no vog lan ca ko ji na zi va mo zaos ta ju }i ili tro mi la nac.

Ot kri }e dis kon ti nui ra ne sin te ze tro mo ga lan ca ob jas ni lo je me ha ni zam pro du lje nja oba lan ca DNA u rep li ka cij skim ra{ lja ma, no is tov re me no je i

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 183

zaostaju}i lanac

vode}i lanac

roditeljski lanci

sinteza Okazakijeva fragmenta

spajanje Okazakijeva fragmenta s tromim lancem

sinteza novoga Okazakijeva fragmenta

Okazakijev fragment

sveukupni smjer replikacije

3' 3'5' 3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3' 5' 3'

5' 3' 3'

3'

5' 5'

5'

5'

5'

3' 5'

5'

3' 5'

5' 3'

3' 5

replikacijske ra{lje

3' 3'

5'

lanac DNA kalupa

5'

inicijacija sinteze RNA

sinteza RNA- -po~etnice

ekstenzija RNA po~etnice DNA-polimerazom

primaza

T

A

A

T

G

A

G

C

G

A

G

T

G

C

T

C

T

A

A

T

G

A

G

C

G

A

G

T

G

C

T

C

C

3'

3'

5'

5

DNA polimeraza

DNA

RNA

T

A

A

T

G

A

G

C

A

G

T

G

C

T

C

U

U

C

C

3'

3'

5'

T

A

A

A

A

A

T

G

A

G

C

A

G

T

G

T

C

U

U

T

C

C

C

5'P P P P P P 5'P P P

Sli ka 5-5. Ini ci ja ci ja Oka za ki je va frag men ta RNA-po ~et ni ca ma. Krat ki frag men ti RNA slu ̀ e kao po ~et ni- ce ko je se mo gu pro du lji ti dje lo va njem DNA-po li me ra ze.

Sli ka 5-4. Sin te za vo de }ega i tro moga lan ca DNA. Vo de }i la nac sin te ti zi ra se kon ti nui ra no u smje ru kre ta nja rep li ka cij skih ra{ lji. Zaos ta ju }i la nac sin te ti zi ra se u krat kim ulom ci ma (Oka za ki je vi frag men ti), una- trag u od no su na sveu kup ni smjer rep li- ka ci je. Oka za ki je vi frag men ti se na kon to ga spa ja ju dje lo va njem DNA-li ga ze.

pos ta vi lo pi ta nje ka ko DNA-po li me ra za ko ja zah ti je va po ~et ni cu i ne mo ̀ e za po ~e ti sin te zu de no vo, za po ~i nje sin te zu Oka za ki je vih frag me na ta? Od- go vor je da krat ki frag men ti RNA slu ̀ e kao po ~et ni ce za rep li ka ci ju DNA (sli ka 5-5).

Za raz li ku od sin te ze DNA, sin te za RNA mo ̀ e za po ~e ti de no vo, a en zim naz van pri ma za sin te ti zi ra krat ke frag men te RNA (prim je ri ce du ga~ ke 3 – 10 nuk leo ti da) kom ple men tar ne ka lu pu tro mo ga lan ca u rep li ka cij skim ra- {lja ma. Oka za ki je vi se frag men ti za tim sin te ti zi ra ju pro du lje njem ovih RNA-po ~et ni ca dje lo va njem DNA-po li me ra ze. Ot kri }e RNA-DNA spo je va u no vo sin te ti zi ra nim Oka za ki je vim frag men ti ma pru ̀ i lo je klju~ ni do kaz za ulo gu RNA-po ~et ni ca u rep li ka ci ji DNA.

184 Poglavlje 5

RNA-po~etnica

polimeraza I uklanjanje RNA 5'

popunjavanje pukotine s DNA

3' egzonukleazom

pukotina izme|u Okazakijevih fragmenata

5'

5'

3'

3'

3'

3'

5'

DNA-ligaza spajanje fragmenata DNA

TA

T

A

T

T

A

G

C

A

T

G

C

A

TG

C G

C

A

TG

C G

C

G

C

A

T

G

C

U

A

G

C

G

CG

C

G

C

A T

A T

A

5'

3'

3'

5'

TA

T

A

T

T

A

G

C

A

T

G

C

A

TG

C G

C

A

TG

C G

C

G

C

A

T

G

C

T

A

G

CG

C

G

C

A T

A T

A

5'

3'

3'

5'

TA

T

A

T

T

A

G

C

A

T

G

C

G

C

G

C

A

TG

C G

C

A

TG

C G

C

G

C

A

T

G

C

T

A

G

CG

C

G

C

A T

A T

A

5'

Sli ka 5-6. Uk la nja nje RNA po ~et ni ca i spa ja nje Oka za ki je vih frag me na ta. Zah va lju ju }i svo joj 5'→3' eg zo nuk lea- znoj ak tiv nos ti, DNA-po li me ra za I uk- la nja RNA-po ~et ni ce i po pu nja va pu ko- ti ne iz me |u Oka za ki je vih frag me na ta s DNA. Nas ta li frag men ti DNA mo gu se za tim spo ji ti DNA-li ga zom.

Da bi se for mi rao kon ti nui ra ni zaos ta ju }i (tro mi) la nac DNA, RNA-po ~et- ni ce mo ra ju se na kra ju uk lo ni ti iz Oka za ki je vih frag me na ta i za mi je ni ti s slje do vi ma DNA. Kod E. co li RNA po ~et ni ce se uk la nja ju kom bi ni ra nim dje- lo va njem RNa zeH, en zi ma ko ji deg ra di ra RNA la nac RNA-DNA hib ri da, i po li me ra ze I. Ovo je as pe kt rep li ka ci je DNA u E. co li u ko jem DNA-po li me- ra za I ig ra klju~ nu ulo gu. Uz nje zi nu DNA-po li me raz nu ak tiv no st, po li me- ra za I dje lu je kao eg zo nuk lea za ko ja mo ̀ e hid ro li zi ra ti DNA (ili RNA) ili u 3' → 5' ili u 5' → 3' smje ru. 5' → 3' eg zo nuk leaz na ak tiv no st po li me ra ze I ukla nja ri bo nuk leo ti de s 5' kra ja Oka za ki je vih frag me na ta te se oni zam je- nju ju deok si ri bo nuk leo ti di ma ka ko bi se stvo ri li frag men ti u pot pu nos ti gra |e ni od slje do va DNA (sli ka 5-6). U euka riot skim sta ni ca ma um jes to po- li me ra ze I po ~et ni ce uk la nja dru ga eg zo nuk lea za, a pu ko ti ne iz me |u Oka- za ki je vih frag me na ta po pu nja va ju se dje lo va njem po li me ra ze δ. Kao i kod pro ka rio ta ovi frag men ti DNA spa ja ju se za tim dje lo va njem DNA-li ga ze.

Raz li ~i te DNA-po li me ra ze ig ra ju za seb ne ulo ge u rep li ka cij skim ra{ lja- ma (sli ka 5-7). U pro ka riot skim sta ni ca ma, glav na rep li ka cij ska po li me ra za je po li me ra za III ko ja obav lja sin te zu i vo de }eg lan ca DNA i Oka za ki je vih frag me na ta pro du lje njem RNA-po ~et ni ca. Po li me ra za I za tim uk la nja RNA- -po ~et ni ce i is pu nja va pu ko ti ne iz me |u Oka za ki je vih frag me na ta. U eu ka riot skim sta ni ca ma, po li me ra za a pro na |e na je u kom plek su s pri ma- zom te se ~i ni da za jed no s njom sud je lu je u sin te zi krat kih RNA-DNA frag- me na ta ti je kom sin te ze tro mo ga lan ca. Po li me ra za d mo ̀ e za tim oba vi ti sin te zu i vo de }ega i tro moga lan ca pro du lji va njem DNA-po ~et ni ca pr vo- tno sin te ti zi ra nih dje lo va njem kom plek sa po li me ra za a-primaza. Uz to, po- li me ra za d mo ̀ e na kon uk la nja nja po ~et ni ca zau ze ti mjes to po li me ra ze I E. co li u po pu nja va nju pu ko ti na iz me |u Oka za ki je vih frag me na ta. Prem da ulo ga po li me ra ze e ni je jo{ u pot pu nos ti shva }e na, nje zi no je dje lo va nje, ~i ni se, sli~ no dje lo va nju po li me ra ze d.

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 185

E. coli sisavci

sinteza vode}ega lanca pol III pol d/e

pol d/e

sinteza tromoga lanca

primaza pol a/primaza

pol III

Sli ka 5-7. Ulo ge DNA-po li me ra za u E. co lii sta ni ca ma si sa va ca. Vo de }i la nac sin te ti zi ra se u E. co li djelovanjem po li me ra ze III (pol III) i dje lo va njem po li me ra za d i e (pol d/e) u sta ni ca ma si sa va ca. U E. co li sin te za tro moga lan ca ini ci ra se pri ma zom, a RNA-po ~et ni ce pro du lju ju se dje lo va- njem po li me ra ze III. U sta ni ca ma si sa- va ca ini ci ja ci ja sin te ze tro moga lan ca od vi ja se s po mo }u kom plek sa pri ma ze i po li me ra ze a (pol a). Krat ki hib rid ni frag men ti (sas to je se od RNA i DNA) sin te ti zi ra ni ovim kom plek som pro du- lju ju se za tim po li me ra zom d i e.

RFC

RFC

RFC

PCNA

(A)

polimeraza

(B)

Sli ka 5-8. Po mo} ni pro tei ni po li me ra ze. (A) Pro tei ni za stav lja nje ste zalj ke (RFC u sta ni ca ma si sa va ca) ve ̀ u se za DNA na mjes tu spa ja nja po ~et ni ce i ka lu pa. Pro tei ni kli ̀ u }e ste zalj ke (PCNA u sta ni ca ma si sa va ca) ve ̀ u se uz RFC na kon ~e ga se DNA-po li me ra za ve ̀ e za PCNA. (B) Mo del PCNA ve za nog za DNA. (B, iz T. S. Kris hna, X. P. Ko ng, S. Ga ry, P. M. Bur ge rs i J. Ku riyan, 1994. Ce ll 79: 1233.)

Uz po li me ra ze i pri ma ze, u rep li ka cij skim je ra{ lja ma ak ti van ~i tav niz dru gih pro tei na. Ti do dat ni pro tei ni iden ti fi ci ra ni su pod jed na ko ana li zom mu ta na ta E. co li de fek tnih za rep li ka ci ju DNA kao i pro ~i{ }a va njem pro tei- na iz si sa va ca, pot reb nih za in vit ro rep li ka ci ju SV40 DNA. Jed na sku pi na tih pro tei na pot reb nih za rep li ka ci ju ve ̀ e se za DNA-po li me ra ze po ja ~a va- ju }i nji ho vu ak tiv no st i zad r ̀ a va ju }i ih ve za ni ma uz DNA-ka lup ka ko bi nas ta vi le sin te zu no vo ga lan ca DNA. Po li me ra za III E. co li i eu ka riot ske po li- me ra ze d i e zdru ̀ e ne su s dvi je vr ste po mo} nih pro tei na (pro tei ni ma kli ̀ u-

186 Poglavlje 5

vode}i lanac

tromi lanac

proteini koji se ve`u za jednolan~anu DNA

helikaza

smjer kretanja replikacijskih ra{lji

(A)

(B)

topoizomeraza

odmotavanje roditeljske DNA

uvijanje lanca DNA ispred replikacijskih ra{lji

privremeni prekid slu`i kao os kako bi se omogu}ila slobodna rotacija lanca DNA

Sli ka 5-10. Dje lo va nje to poi zo me- ra za za vri je me rep li ka ci je DNA. (A) Dok se dva lan ca roditeljske DNA od mo ta va ju, DNA is pred rep li ka cij skih ra{ lji pri si lje na je na ro ta ci ju u sup rot- nom smje ru uz ro ku ju }i me |u sob no uvi ja nje kru` nih mo le ku la. (B) Ovaj prob lem ri je {en je dje lo va njem to poi zo me ra za ko je ka ta li zi ra ju re ver- zi bil no ki da nje i spa ja nje la na ca DNA. Priv re me ni pre ki di nas ta li dje lo va njem ovih en zi ma slu ̀ e kao osi ko je omo gu- }u ju da se dva la na ca DNA slo bod no ro ti ra ju je dan oko dru go ga.

Sli ka 5-9. Dje lo va nje he li ka ze i pro tei na ko ji ve ̀ e jed no lan ~a nu DNA. He li ka ze od mo ta va ju dva lan ca ro di- telj ske DNA is pred rep li ka cij skih ra {lji. Od mo ta ni lan ci DNA sta bi li zi ra ju se pro tei ni ma ko ji ve ̀ u jed no lan ~a nu DNA ka ko bi mog li slu ̀ i ti kao ka lu pi za sin te zu no ve DNA.

}e ste zalj ke, en gl. sli di ng-cla mp pro tei ns, i pro tei ni ma za stav lja nje ste zalj ke, en gl. cla mp-loa di ng pro tei ns) ko ji po sta- vlja ju po li me ra zu na po ~et ni cu i od r ̀ a va ju nje zi nu sta bil- nu po ve za no st s ka lu pom (sli ka 5-8). Pro tei ni za stav lja nje ste zalj ke (u E. co li nazvani g-kompleks, a u eu ka rio ti ma rep li ka cij ski fak tor C, RFC) spe ci fi~ no pre poz na ju i ve ̀ u DNA na mjes tu spa ja nja po ~et ni ce i ka lu pa. Pro tei ni kli ̀ u- }e ste zalj ke (b pro tein E. co li i jez greni an ti gen pro li fe ri ra ju- }ih sta nica, PCNA, en gl. pro li fe ra ti ng ce ll nuc lear an ti gen) ve- `u se na pro tein za stav lja nje ste zalj ke i stva ra ju prsten oko DNA-ka lu pa. Pro tei ni kli ̀ u }e ste zalj ke smje{ ta ju za- tim DNA-po li me ra zu na DNA na mjes to spa ja nja po ~et ni- ce i ka lu pa. Pr sten stvo ren pro tei ni ma kli`u}e ste zalj ke od- r ̀ a va zdru ̀ e no st po li me ra ze s nje zi nim ka lu pom ti je kom pro ce sa rep li ka ci je i ta ko omo gu }uje neo me ta nu ug rad nju vi {e ti su }a nuk leo ti da u no vo sin te ti zi ra ni la nac DNA.

Dru gi pro tei ni raz mo ta va ju DNA-ka lup i sta bi li zi ra ju jed no lan ~a na pod ru~ ja (sli ka 5-9). He li ka ze su en zi mi ko ji ka ta li zi ra ju raz mo ta va nje ro di telj ske DNA is pred rep li ka- cij skih ra{ lji {to je po ve za no s hid ro li zom ATP. Pro tei ni ko-

ji ve ̀ u jed no lan ~a nu DNA (en gl. sin gle stran ded DNA-bin di ng pro tei ns, pri- mje ri ce eu ka riot ski rep li ka cij ski fak tor A, RFA) na kon to ga sta bi li zi ra ju raz mo- ta ni DNA-ka lup od r ̀ a va ju }i ga u is pru ̀ e nom jed no lan ~a nom sta nju ka ko bi se mo gao ko pi ra ti dje lo va njem po li me ra ze.

Dok se lan ci ro di telj ske DNA raz ma ta ju, DNA is pred rep li ka cij skih ra{ lji pri si lje na je na ro ta ci ju. Ne kon tro li ra na ro ta ci ja do ve la bi do to ga da se kru- `ne mo le ku le DNA (po put SV40 DNA i kro mo so ma E. co li) omo ta ju sa me oko se be {to bi na kra ju blo ki ra lo pro ces rep li ka ci je (sli ka 5-10). Ovaj pro- blem ri je {en je dje lo va njem to poi zo me ra za, en zi ma ko ji ka ta li zi ra ju re ver zi- bil no ki da nje i po nov no spa ja nje la na ca DNA. Pos to je dvi je vr ste ovih en zi- ma: to poi zo me ra ze ti pa I ki da ju sa mo je dan la nac DNA, dok to poi zo me ra- ze ti pa II is tov re me no ki daju oba lan ca. Pre ki di nas ta li dje lo va njem to poi zo- me ra za slu ̀ e kao osi ko je omo gu }u ju da se dva la na ca DNA ka lu pa slo bod- no ro ti ra ju je dan oko dru go ga ta ko da se rep li ka ci ja mo ̀ e nas ta vi ti bez uvi- ja nja DNA is pred rep li ka cij skih ra{ lji (sli ka 5-10). Prem da su eu ka riot ski

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 187

vode}i lanac

zaostaju}i lanac

smjer kretanja replikacijskih ra{lji

helikaza

topoizomeraza

primaza

RNA-po~etnica

polimeraza I

Okazakijev fragment

ligaza

dimer polimeraze III

proteini koji se ve`u na jednolan~anu DNA

RNA-po~etnica

protein za stavljanje stezaljke

kli`u}a stezaljka

Sli ka 5-11. Mo del rep li ka cij skih ra{lji E. co li. He li ka za, pri ma za i dvi je mo le ku le DNA-po li me ra ze III pro vo de koor di- ni ra nu sin te zu vo de }eg i zaos ta ju }eg lan ca DNA. Ka lup tro moga lan ca je uvi- jen ta ko da se po li me ra za od go vor na za sin te zu tro moga la n ca kre }e u is tom smje ru kao i sveu kup no kre ta nje rep li ka- cij skih ra{ lji. To poi zo me ra za dje lu je kao os ok re ta nja is pred rep li ka cij skih ra{ lji, a DNA-po li me ra za I i li ga za uk la nja ju RNA-po ~et ni ce i spa ja ju Oka za ki je ve frag men te iza rep li ka cij skih ra{ lji.

kro mo so mi gra |e ni od li near nih, a ne kru` nih mo le ku la DNA, nji ho va re- pli ka ci ja ta ko |er zah ti je va dje lo va nje to poi zo me ra za jer bi se u sup rot nom kom plet ni kro mo so mi mo ra li kon ti nui ra no ro ti ra ti za vri je me sin te ze DNA.

To poi zo me ra za ti pa II pot reb na je ne sa mo za raz mo ta va nje DNA ve} i za raz mo ta va nje no vo rep li ci ra nih kru` nih DNA mo le ku la ko je su pos ta le me |u sob no is prep le te ne. ^i ni se da je to poi zo me ra za ti pa II u eu ka riot- skim sta ni ca ma ta ko |er uk lju ~e na u kon den za ci ju mi to ti~ kih kro mo so ma. Is pi ti va nja mu ta na ta kva sa ca, kao i ek spe ri men ti na vinskoj mu {i ci te sta ni- ca ma si sa va ca, po ka za li su da je to poi zo me ra za II pot reb na za raz dva ja nje kro mati da k}e ri u mi to zi su ge ri ra ju }i nje zi nu ulo gu u raz mo ta va nju no vo- rep li ci ra nih pet lji DNA eu ka riot skih kro mo so ma.

En zi mi uk lju ~e ni u rep li ka ci ju DNA dje lu ju na koor di ni ran na ~in sin te ti- zi ra ju }i is tov re me no vo de }i i zaos ta ju }i la nac DNA u rep li ka cij skim ra {lja- ma (sli ka 5-11). Ovaj za da tak pos ti ̀ e se stva ra njem di me ra rep li ka tiv nih DNA-po li me ra za (po li me ra za III kod E. co li ili po li me ra ze d/e kod eu ka rio- ta) od ko jih sva ka sad r ̀ ava i od go va ra ju }e pra te }e pro tei ne. Jed na mo le ku- la po li me ra ze ta da sin te ti zi ra vo de }i la nac dok dru ga dje lu je u sin te zi tro- mo ga lan ca. Smat ra se da zaos ta ju }i la nac stva ra pet lju u rep li ka cij skim ra- {lja ma ta ko da se pod je di ni ca po li me ra ze uk lju ~e na u sin te zu tro mo ga lan- ca kre }e u is tom sveu kup nom smje ru kao dru ga pod je di ni ca ko ja sin te tizi- ra vo de }i la nac.

188 Poglavlje 5

polimeraza izrezuje krivo spareni G s pomo}u 3' 5' egzonukleaze

5'

ugradnja G umjesto A

3'

3'

5'

sinteza se nastavlja ugradnjom odgovaraju}e baze (A)

A

T

G

C

A

T T AG

5'

3'

3'

5'

A

T

G

C

A

T AT G

5'

3'

3'

5'

A

T

G

C

A

T AT G

5'

3'

3'

5'

A

T

G

C T T AG

G

Sli ka 5-12. Ko rek tiv na ak tiv no st DNA-po li me ra ze. G je ug ra |en um jes to A kao re zul tat kri vog spa ri va nja s T na lan cu ka lu pa. Zbog to ga {to je kri vo spa ren G na 3' kra ju no vo sin te ti zi ra no ga lan ca ni je ve- zan vo di ko vom ve zom s lan cem ka lu pa. Ovo pog rje{ no spa ri va nje na 3' kra ju ras tu }eg lan ca pre poz nano je i iz re za- no 3'→5' eg zo nuk leaz nom ak tiv no{ }u DNA-po li me ra ze ko ja, da bi nas ta vi la sin te zu, zah tije va po ~et ni cu spo je nu vo di ko vim ve za ma s lan cem ka lu pa. Na- kon iz re zi va nja kri vo spa re nog G, sin te- za DNA mo ̀ e se nas ta vi ti ug rad njom od go va ra ju }ega nuk leo ti da (A).

Vjer no st rep li ka ci je Pre ciz no st um na ̀ a nja DNA kri ti~ na je za sta ni~ no raz mno ̀ a va nje, a proc je- na mu ta cij skih sto pa za raz li ~i te ge ne poka zu je da u~es ta lo st pog rje {a ka ti- je kom rep li ka ci je od go va ra sa mo jed noj pog rje{ no ug ra |e no j ba zi na sva- kih 109 do 1010 ug ra |e nih nuk leo ti da. Ova u~es ta lo st pog rje {a ka znat no je ma nja od one ko ja bi se mog la pred vid je ti sa mo na os no vi kom ple men tar- nos ti spa ri va nja ba za. Kon kret no, raz li ka u slo bod noj ener gi ji ko ja prois tje- ~e iz prom je na u spa ri va nju vo di ko vim ve za ma iz me |u ko rek tno i ne ko- rekt no spa re nih ba za je tek to li ka da fa vo ri zi ra stva ra nje kom ple men tar no ga baz nog pa ra za sve ga ti su }u pu ta. Zbog to ga bi iz bor ba za re gu li ran sa mo spa ri va njem vo di ko vim ve za ma na te me lju kom ple men tar nos ti re zul ti rao u~es ta lo{ }u pogrje {a ka ko ja od go va ra ug rad nji ot pri li ke jed ne pog rje{ ne ba ze na sva kih 103 nuk leo ti da. Mno go ve }i stu panj vjer nos ti rep li ka ci je ko ji se u s tva ri pos ti ̀ e prois tje ~e ug lav nom iz ak tiv nos ti DNA-po li me ra ze.

Je dan od me ha ni za ma ko jim DNA-po li me ra za po ve }a va vjer no st rep li- ka ci je je st taj da po ma ̀ e u iz bo ru od go va ra ju }e ba ze za ug rad nju u no vo- sin te ti zi ra ni la nac. Po li me ra za ne ka ta li zi ra ug rad nju bi lo ko jeg nuk leo ti da ko ji je vo di ko vim ve za ma po ve zan s lan cem ka lu pa. Um jes to to ga, ona ak- tiv no dis kri mi ni ra ug rad nju pog rje{ ne ba ze pri la go |uju }i se kon for ma ci ji kom ple men tar no ga pa ra ba za. Ne dav na is pi ti va nja struk tu re ne ko li ko DNA-po li me ra za upu}u ju na to da ve za nje ko rek tno spa re nih dNTP in du- ci ra kon for ma cij ske prom je ne u DNA-po li me ra zi ko je do vo de do ug rad nje nuk leo ti da u DNA. Iz gle da da spo sob no st DNA-po li me ra ze da fa vo ri zi ra ug rad nju pra vil no spa re nih nuk leo ti da po ve }a va pre ciz no st rep li ka ci je za oko ti su }u pu ta sma nju ju }i ti me o~e ki va nu u~es ta lo st pog rje {a ka sa 10–3 na oko 10–6.

Dru gi glav ni me ha ni zam od go vo ran za pre ciz no st DNA rep li ka ci je je ko rek tiv na (en gl. proof rea di ng) aktivnost DNA-po li me ra ze. Kao {to je ve} spo me nu to, po li me ra za I iz E. co li pos je du je 3'→5' kao i 5'→3' eg zo nuk lea- znu ak tiv no st. 5'→3' eg zo nuk lea za dje lu je u smje ru DNA sin te ze i po ma ̀ e u u kla nja nju RNA-po ~et ni ca iz Oka za ki je vih frag me na ta. 3'→5' eg zo nu kle- a za dje lu je u sup rot nom smje ru od smje ra sin te ze DNA i sud je lu je u pro- vje ra va nju to~ nos ti no vo sin te ti zi ra no ga lan ca (sli ka 5-12). Svi no voug ra |e- ni nuk leo ti di pod li je ̀ u ovak vom prov je ra va nju jer DNA-po li me ra za ni je u sta nju za po ~e ti sin te zu de no vo, ve} sa mo pro du ljuje ve} pos to je }e po ~et ni- ce ko je su vo di ko vim ve za ma povezane s ka lu pom. Ka da do |e do ug rad- nje pog rje{ ne ba ze vr lo je vje ro jat no da se ona ne }e is ko ris ti ti za nas ta vak sin te ze, ve} }e se uk lo ni ti 3'→5' eg zo nuk leaz nom ak tiv no{ }u DNA-po li me- ra ze. 3'→5' eg zo nuk leaz na ak tiv no st DNA-po li me ra ze I srod na je s 3'→5' eg zo nuk leaz nom ak tiv no{ }u po li me ra ze III iz E. co li i eu ka riot skih po li me- ra za d i e ko je se lek tiv no uk la nja ju nep ra vil no spa re ne ba ze ug ra |e ne na kraj ras tu }eg lan ca DNA i ti me po ve }a va ju vjer no st rep li ka ci je za oko sto do ti su }u pu ta.

Va` no st ko rek tiv nog od~i ta va nja no vo sin te ti zi ra nog lan ca mog la bi ob ja- sni ti za{ to DNA-po li me ra ze zah ti je va ju pri sut no st po ~et ni ca i ka ta li zi ra ju sin te zu la na ca DNA sa mo u 5'→3' smje ru. Ka d se DNA sin te ti zi ra u 5'→3' smje ru ener gi ja pot reb na za po li me ri za ci ju prois tje ~e iz hid ro li ze 5' tri fos- fat ne sku pi ne slo bod nog dNTP do ko je do la zi kad se is ti do da je na 3' hi dro- k sil nu sku pi nu ras tu }e ga lan ca (vi di sli ku 5-2). Na sup rot to mu, ka d bi se DNA pro du lji va la u 3'→5' smje ru, ener gi ja po li me ri za ci je mo ra la bi pot je ca- ti iz hid ro li ze 5' tri fos fat ne sku pi ne ter mi nal nih nuk leo ti da ve} u gra |e nih u DNA. To bi one mo gu }i lo ko rek tiv no od~i ta va nje zbog to ga {to bi pri tak voj sin te zi uk la nja nje nep ra vil no spa re noga ter mi nal nog nuk leo ti da is tov re me- no uk lo ni lo 5' tri fos fat nu sku pi nu pot reb nu kao iz vor ener gi je za dalj nje

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 189

ori

vezanje inicijacijskog proteina

inicijator

formiranje dviju replikacijskih ra{lji

odmotavanje DNA djelovanja helikaze i proteina koji se ve`u za jednolan~anu DNA

sinteza RNA- -po~etnice

proteini koji se ve`u za jednolan~anu DNA

RNA-po~etnica

helikazaori

ori ori

Sli ka 5-13. Is ho di{ te rep li ka ci je E. co li.

Rep li ka ci ja za po ~i nje u je din stve nom is- ho di{ tu na kro mo so mu E. co li ozna ~e- nom s ori (en gl. ori gin). Pr vi ko rak je ve- za nje ini ci ja cij skog pro tei na za ori sli jed u mo le ku li DNA {to do vo di do dje lo mi- ~nog od mo ta va nja ka lup ne DNA. Od- mo ta va nje DNA se nas tav lja dje lo va- njem he li ka ze i pro tei na ko ji ve ̀ u jed no- lan ~a nu DNA, a pri ma za sin te ti zi ra RNA-po ~et ni ce. Dvi je rep li ka cij ske ra- {lje stvo re ne u is ho di{ tu kre }u se za tim u sup rot nim smje ro vi ma uz du` kru` ne mo le ku le DNA.

pro du lje nje lan ca. Pre ma to me, ia ko spo sob no st DNA-po li me ra ze da pro- du lju je po ~et ni ce sa mo u 5'→3' smje ru ~i ni rep li ka ci ju na iz gled kom pli ci- ranom, ona je nu`na da bi osi gu ra la pre ciz no um na ̀ a nje ge ne ti~ kog ma te- ri ja la.

Uz spo sob no st da raz li ku je ug rad nju pog rje{ no spa re ne ba ze, ko rek ti- vna aktivnost DNA-po li me ra ze do volj na je da sma nji u~es ta lo st pog rje {a ka pri rep li ka ci ji na ot pri li ke jed nu pog rje{ no spa re nu ba zu na sva kih 109 ug ra- |e nih nuk leo ti da. Ka ko bi se uk lo ni le pog re{ no spa re ne ba ze ug ra |e ne u no vo sin te ti zi ra nu DNA, dje lu ju do dat ni me ha niz mi (pri ka za ni u od jelj ku Pop ra vak DNA), osi gu ra va ju }i ti me jo{ ve }u vjer no st um na ̀ a nja ge ne ti~ ke in for ma ci je.

Is ho di{ te i ini ci ja ci ja rep li ka ci je Um na ̀ a nje pro ka riot skih i eu ka riot skih DNA za po ~i nje na je din stve nom mjes tu zva nom is ho di{ te rep li ka ci je ko je slu ̀ i kao spe ci fi~ no vez no mje- sto za pro tei ne ko ji ini ci ra ju pro ces rep li ka ci je. Pr vo is ho di{ te rep li ka ci je opi sa no je u E. co li. Pr vo je ot kri ve no da um na ̀ a nje uvi jek za po ~i nje na je- din stve nom mjes tu bak te rij skog kro mo so ma, a de talj ni je su ana li ze po ka za- le da je is ho di{ te rep li ka ci je gra |e no od 245 pa ro va ba za ~i ji di je lo vi slu ̀ e kao vez na mjes ta za pro tei ne pot reb ne za ini ci ja ci ju rep li ka ci je DNA (sli ka 5-13). Klju~ ni ko rak pred stav lja ve za nje ini ci ja cij skog pro tei na za spe ci fi~ ni sli jed nuk leo ti da unu tar is ho di{ ta ~i me za po ~i nje raz ma ta nje dvos tru ke uz- voj ni ce. Osim to ga, ini ci ja cij ski pro tein reg ru ti ra i dru ge pro tei ne uk lju ~e- ne u sin te zu DNA. Na kon to ga he li ka za i pro tei ni ko ji ve ̀ u jed no lan ~a nu DNA dje lu ju u dalj njem raz mo ta va nju DNA-ka lu pa, a pri ma za za po ~i nje sin te zu vo de }eg lan ca. For mi ra ju se dvi je rep li ka cij ske ra{ lje u ko ji ma sin te- za te ~e u sup rot nim smje ro vi ma uz du` kru` noga kro mo so ma E. co li.

Prou ~a va nje is ho di{ ta rep li ka ci je ne ko li ko animalnih vi ru sa kao {to je SV40 pos lu ̀ i lo je kao mo del za is tra ̀ i va nje ini ci ja ci je DNA sin te ze u eu ka- rio ta. Ovaj vi rus pos je du je jed no is ho di{ te rep li ka ci je (gra |e no od 64 pa ro- va ba za) ko je fun kcio ni ra i u in fi ci ra nim sta ni ca ma i u bez sta ni~ nim sus ta vi- ma. Rep li ka ci ju za po ~i nje T an ti gen – pro tein ko di ran vi rus nim ge no mom – ko ji se ve ̀ e za is ho di{ te rep li ka ci je i is to dob no dje lu je kao he li ka za. Za sta bi li za ci ju raz mo ta no ga ka lu pa pot reb na je pri sut no st pro tei na ko ji se ve- `e za jed no lan ~a nu DNA, a za tim kom ple ks DNA-po li me ra za α i pri ma ze za po ~i nje sin te zu DNA.

Prem da su jed nos tru ka is ho di{ ta do volj na za rep li ka ci ju bak te rij skih i vi rus nih ge no ma, za rep li ka ci ju mno go ve }ih ge no ma eu ka riot skih sta ni ca unu tar prih vat lji vog vre men skog pe rio da pot reb na je pri sut no st vi {es tru- kih is ho di{ ta rep li ka ci je. Ta ko se prim je ri ce sveu kup ni ge nom E. co li (4 × 106 pa ro va ba za) rep li ci ra iz jed nos tru kog is ho di{ ta za ot pri li ke 30 mi nu ta. Ka d bi se ge nom si sa va ca (3 × 109 pa ro va ba za) rep li ci rao is tom br zi nom iz jed-

190 Poglavlje 5

inicijacija replikacije

ori oriori

novosintetizirana DNA ( )

pomicanje replikacijskih ra{lji u suprotnim smjerovima

Sli ka 5-14. Is ho di{ ta rep li ka ci je u eu ka riot skim kro mo so mi ma. Rep li ka ci ja za po ~i nje u vi {es tru kim is ho- di{ ti ma (ori) od ko jih sva ko stva ra dvije rep li ka cij ske ra{ lje.

nog is ho di{ ta za rep li ka ci ju DNA bi lo bi pot reb no oko 3 tjed na (30.000 mi- nu ta). Ta ko |er je poz na to da je br zi na rep li ka ci je DNA u sta ni ca ma si sa va- ca u stva ri oko de set pu ta ma nja ne go u E. co li, vje ro jat no ra di pa ki ra nja eu ka riot ske DNA u kro ma tin. Una to~ to mu, ge no mi sta ni ca si sa va ca ug lav- nom se rep li ci ra ju unu tar ne ko li ko sa ti, {to zah ti je va ko ri{ te nje vi {e ti su }a is ho di{ ta rep li ka ci je.

Pri sut no st vi {es tru kih is ho di{ ta rep li ka ci je u eu ka riot skim sta ni ca ma prvi je put po ka za na iz la ga njem kul tu re sta ni ca si sa va ca ra dioak tiv nom ti- mi di nu unu tar raz li ~i tih vre men skih in ter va la {to je pra }e no au to ra diog ra- fi jom ka ko bi se de tek ti ra la no vo sin te ti zi ra na DNA. Re zul ta ti tak vih is pi ti- va nja po ka za li su da sin te za DNA za po ~i nje na vi {e mjes ta iz ko jih se za tim nas tav lja u oba smje ra uz du` kro mo so ma (sli ka 5-14). Is ho di{ ta rep li ka ci je u sta ni ca ma si sa va ca me |u sob no su uda lje na za ot pri li ke 50 do 300 kb – pre- ma to me hu ma ni ge nom ima oko 30.000 is ho di{ ta rep li ka ci je. Ge no mi jed- nos tav ni jih eu ka rio ta ta ko |er pos je du ju vi {es tru ka is ho di{ ta; ta ko prim je ri- ce rep li ka ci ja u kvas ci ma za po ~i nje u is ho di{ ti ma me |u sob no uda lje nim oko 40 kb.

Is ho di{ ta rep li ka ci je eu ka riot skih kro mo so ma pr vi put su prou ~a va na u kvas cu S. ce re vi siae u ko jem su iden ti fi ci ra ni kao sljedovi ko ji po du pi ru re- pli ka ci ju plaz mi da u tran sfor mi ra nim sta ni ca ma (sli ka 5-15). To je ujed no bio fun kcio nal ni te st za ove sljedove i do sa da je izo li ra no ne ko li ko tak vih ele me na ta (naz va ni au to nom no rep li ci ra ju }i sljedovi ili ARS). Nji ho va ulo- ga kao is ho di{ ta rep li ka ci je pot vr |e na je iz rav nom bio ke mij skom ana li zom, ne sa mo u plaz mi di ma ve} i u kro mo som skoj DNA kva sa ca.

Fun kcio nal ni ARS ele men ti obuh va }a ju oko 100 pa ro va ba za, uk lju ~u ju- }i slijed du g 11 pa ro va ba za ko ji je pri sut an u mno gim raz li ~i tim ARS ele- men ti ma (sli ka 5-16). Ovaj sre di{ nji slijed nu` an je za fun kci ju ARS ele me- na ta te pred stav lja vez no mjes to za pro tein ski kom ple ks (naz van kom ple- ks is ho di{ ta rep li ka ci je ili ORC; engl. ori gin rep li ca tion com plex) ko ji je pot re- ban za ini ci ja ci ju rep li ka ci je DNA u is ho di{ ti ma S. ce re vi siae. ^i ni se da ORC kom ple ks reg ru ti ra dru ge pro tei ne pre ma is ho di{ tu (uk lju ~u ju }i DNA-he li- ka zu), {to do vo di do ini ci ja ci je rep li ka ci je. Me ha ni zam za po ~i nja nja rep li ka- ci je DNA u S. ce re vi siae pre ma to me je iz gle da sli ~an ono me u pro ka riot- skim i eu ka riot skim vi ru si ma – ini ci ja cij ski pro tein se spe ci fi~ no ve ̀ e za sli- jed nuk leo ti da u is ho di{ tu rep li ka ci je.

Dalj nja is pi ti va nja po ka za la su da je ulo ga ORC pro tei na kao ini ci ja to ra rep li ka ci je kon zer vi ra na u svim eu ka rio ti ma od kva sa ca do si sa va ca. Ipak, is ho di{ ta rep li ka ci je dru gih eu ka rio ta znat no su ma nje de fi ni ra na od ARS ele me na ta S. ce re vi siae. Is ho di{ ta rep li ka ci je u ge no mu S. pom be na la ze se

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 191

LEU2 LEU2 ARS

plazmid IIplazmid I

transformirane stanice kvasca transformirane stanice kvasca

dobivene su samo rijetke transformirane stanice kvasca u kojima je plazmid integriran u kromosomsku DNA

dobiveno mnogo transformiranih stanica jer se plazmid mo`e replicirati bez integriranja u kromosom

transformirane kolonije kvasca

uzgoj u mediju bez leucina uzgoj u mediju bez leucina

Sli ka 5-15. Identifikacija is ho di{ ta rep li ka ci je u kvas cu. Oba plaz mi da, plaz mid I i plaz mid II sad r ̀ avaju se lek tiv ni bi ljeg, gen (LEU2) ko ji omo gu }uje tran sfor mi ra nim sta ni- ca ma ra st u me di ju bez leu ci na. Ipak, sa mo plaz mid II sad r ̀ ava is ho di{ te rep- li ka ci je (ARS). Tran sfor ma ci ja sta ni ca kvas ca s plaz mi dom I da je sa mo ri jet ke tran sfor man te u ko ji ma je plaz mid in teg- ri ran u kro mo som sku DNA. Plaz mid II je, me |u tim, spo so ban rep li ci ra ti se bez in teg ra ci je u kro mo somom kvas ca (au to- nom na rep li ka ci ja) ta ko da nje gov unos u sta ni ce kvas ca re zul ti ra znat no ve }im bro jem tran sfor mi ra nih sta ni ca.

unu tar sli je da nuk leo ti da du gog 1 kb. Ona ne ma ju jas no de fi ni ra nih ORC vez nih mjes ta kao {to su ARS ele men ti S. ce re vi siae, ali sad r ̀ avaju po nav lja- ju }e slje do ve bo ga te AT ba za ma ko ji vje ro jat no slu ̀ e kao vez no mjes to za ORC kom ple ks. Ot kri ve no je da is ho di{ te rep li ka ci je vinske mu {i ce obuh va- }a pre ko 2 kb du gi sli jed nuk leo ti da te da sad r ̀ ava ne ko li ko ORC vez nih mjes ta ~i ji sljedovi jo{ ni su poz na ti. Kod si sa va ca je lo ka li zi ra no ne ko li ko is- ho di{ ta u pod ru~ ji ma ge no ma ko ja obuh va }a ju ne ko li ko ki lo ba za. U dru- gim slu ~a je vi ma, rep li ka ci ja mo ̀ e za po ~e ti u vi {es tru kim is ho di{ ti ma s ve li- kom »i ni ci ja cij skom zo no m« ko ja obuh va }a 10 – 50 kb. Sto ga se ~i ni da slje- dovi ko ji de fi ni ra ju is ho di{ te rep li ka ci je znat no va ri ra ju unu tar eu ka rio ta ia ko je ulo ga ORC pro tei na kao ini ci ja to ra rep li ka ci je vr lo kon zer vi ra na.

Te lo me re i te lo me ra ze: um na ̀ a nje kra je va kro mo so ma Bu du }i da DNA-po li me ra ze pro du lju ju po ~et ni ce sa mo u 5' → 3' smje ru,

one ne mo gu ko pi ra ti kraj nje 5' di je lo ve li near nih mo le ku la DNA. Zbog to- ga su za rep li ka ci ju kraj njih slje do va li near nih eu ka riot skih kro mo so ma

192 Poglavlje 5

B3 B2 B1 ACS

(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)

DNA

ORC

Sli ka 5-16. ARS ele me nt kvas ca. Ele me nt sad r ̀ ava 11 pa ro va ba za dug ARS kon sen zus sli jed (ACS – en gl. ARS con- sen sus sequen ce) ko ji pred stav lja spe ci fi~ no vez no mjes to ORC kom plek sa (kom ple ks is ho di{ ta rep li ka ci je). Tri do dat na ele men ta (B1, B2 i B3) po je di na~ no ni su esen ci jal ni, ali za jed no p ri dono se fun kci ji ARS ele men ta.

pot reb ni po seb ni me ha niz mi. Ter mi nal ni di je lo vi kro mo so ma (te lo me re) sas to je se od uzas top nih po nav lja nja jed nos tav nih slje do va DNA (vi di 4. pog lav lje). Te lo me re se od r ̀ a va ju dje lo va njem po seb nog en zi ma, naz va- nog te lo me ra za, ko ji je spo so ban rep li ci ra ti kraj nje slje do ve DNA u od sut- nos ti DNA-ka lu pa.

Te lo me ra za je re ver zna tran skrip ta za, tip DNA-po li me ra ze ko ji sin te ti zi- ra DNA na os no vi RNA-ka lu pa, a pr vi je put ot kri ve na u ret ro vi ru si ma (vi- di 3. pog lav lje). Va` no je na po me nu ti da je te lo me ra za en zim ski kom ple ks ko ji sad r ̀ ava svoj vlas ti ti RNA-ka lup kom ple men ta ran s po nav lja ju }im te- lo mer nim slje do vi ma kro mo so ma. Ko ri{ te nje RNA-ka lu pa omo gu }u je te lo- me ra zi da stvo ri vi {es tru ke ko pi je po nav lja ju }ih slje do va te lo me ra od r ̀ a va- ju }i ih na taj na ~in i u od sut nos ti kon ven cio nal noga DNA-ka lu pa.

Me ha ni zam te lo me raz ne ak tiv nos ti ob jas ni li su 1985. go di ne Ca rol Grei- der i Eli za be th Blac kbu rn prou ~a va ju }i pro to zou Tet ra hyme na (sli ka 5-17). Te lo me ra za Tet ra hyme na nala zi se u kom plek su sa 159 nuk leo ti da du gom RNA ko ja sad r ̀ ava sli jed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je sli jed kom ple men ta- ran s te lo mer nim po nav lja njem Tet ra hyme na (5'-TTGGGG-3') i slu ̀ i kao ka- lup za sin te zu te lo mer ne DNA. Ko ri{ te nje ove RNA kao ka lu pa omo gu }uje te lo me ra zi da pro du lji 3' kraj kro mo som ske DNA za jed nu po nav lja ju }u je- di ni cu vi {e od ori gi nal ne du lji ne. Kom ple men tar ni se la nac ta da mo ̀ e sin- te ti zi ra ti dje lo va njem kom plek sa po li me ra ze α i pri ma ze ko ri{ te njem kon- ven cio nal ne RNA po ~et ni ce. Uk la nja nje RNA po ~et ni ce os tav lja jed no lan- ~a ni 3' kraj kro mo som ske DNA ko ji mo ̀ e stva ra ti pet lje na kra ju eu ka riot- skih kro mo so ma (vi di sli ku 4-22).

Te lo me ra ze su ot kri ve ne u raz li ~i tim eu ka rio ti ma, a ge ni ko ji ko di ra ju te- lo me raz ne RNA klo ni ra ni su iz Tet ra hyme na, kva sa ca, mi {a i ~ov je ka. Te lo me- raz na RNA uvi jek sad r ̀ ava slje do ve kom ple men tar ne s po nav lja ju }im sli je- dom te lo me re or ga niz ma iz ko jega je izo li ra na (vi di tab li cu 4-4). Ulo ga te lo- me ra ze u od r ̀ a va nju kra je va eu ka riot skih kro mo so ma do ka za na je i uno {e- njem mu ti ra nih ge na za te lo me raz nu RNA u kvas ce {to je re zul ti ra lo od go- va ra ju }im prom je na ma po nav lja ju }ih slje do va na kra je vi ma kro mo so ma.

Pop ra vak DNA DNA, kao i sva ka dru ga mo le ku la, mo ̀ e bi ti iz lo ̀ e na raz li ~i tim ke mij skim reak ci ja ma. Bu du }i da DNA slu ̀ i kao je din stve na, traj na ko pi ja sta ni~ no ga ge no ma, prom je ne nje zi ne struk tu re ima ju znat no ve }e pos lje di ce ne go prom je ne dru gih sta ni~ nih kom po nen ti, po put RNA, ili pro tei na. Mu ta ci je

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 193

vezanje za telomeraznu RNA

novosintetizirani tromi lanci

telomerna DNA s jednolan~anim 3' krajem

telomeraza djeluje kao reverzna-transkriptaza

produljavanje tromoga lanca primazom i polimerazom

3' kraj vode}ega lanca produljen za jednu ponavljaju}u jedinicu

uklanjanje RNA-po~etnice

5' 3'

5'3'

G

C

G

C C

G

C

T

A

T

A C

G G GG T T G

5' 3'

5'3'

G

C

G

C C

T

A

T

A C

G G GG T T G G GG T T G

5' 3'

5'3'

G

C

G

C

GG

C

T

A

T

A C

T T

CC CA A CC C

G G GG T T G G GG T T G

5' 3'

5'3'

G

C

G

C C

T

A

T

A CCC CA A

G GG T T G G GG T T G

telomerazatelomerazna RNA

5' 3'

5' 3' 5'3' C

G

C C

T

A

T

A C CC CCA A CA A

G G GG T T G

telomerna DNA produljena za jednu ponavljaju}u jedinicu

Sli ka 5-17. Djelovanje te lo me ra ze. Te lo mer na DNA jed nos tav ni je po nav- lja ju }i sli jed s jed no lan ~a nim 3' kra jem na no vo sin te ti zi ra nom vo de }em lan cu. Te lo me ra za, kao dio en zim skog kom- plek sa, sad r ̀ ava svo ju vlas ti tu mo le ku- lu RNA kom ple men tar nu te lo mer noj DNA. Jed no lan ~a ni 3' kraj te lo mer ne DNA ve ̀ e se za RNA te lo me ra ze ko ja za tim slu ̀ i kao ka lup za pro du lje nje vo de }ega lan ca za jed nu po nav lja ju }u je di ni cu. Zaos ta ju }i la nac te lo mer ne DNA mo ̀ e se na kon to ga sin te ti zi ra ti s po mo }u kon ven cio nal ne RNA-po ~et ni- ce dje lo va njem DNA-po li me ra ze.

mo gu proi za}i iz ug rad nje pog rje{ ne ba ze za vri je me um na ̀ a nja DNA. Uz to, u mo le ku li DNA do ga |a ju se raz li ~i te ke mij ske prom je ne, bi lo spon ta no (sli ka 5-18) bi lo kao pos lje di ca iz lo ̀ e nos ti ke mi ka li ja ma ili zra ~e nju (sli ka 5- 19). Tak va o{ te }e nja DNA mo gu blo ki ra ti rep li ka ci ju ili tran skrip ci ju, a mo-

194 Poglavlje 5

adenin

dGMP AP mjesto

hipoksantin

(A) deaminacija

(B) depurinacija

N

N N

C

C

N

HC C

H2N

citozin

N

CH

C

CO

N

CH

CH

NH2

N

N N

C

C

HC

HN

C

CH

N

N N

C

C

O

C

HN

C

CH

O

OH

NH2

uracil

N

CH

C

CO

HN

CH

O

O

H

O

H

H

HH

O

H

O

H

H

HH

CH2CH2P P

Sli ka 5-18. Spon ta no o{ te }e nje DNA. Dvi je su glav ne vr ste spon ta nih o{ te- }e nja DNA: (A) dea mi na ci ja ade ni na, ci to zi na i gva ni na i (B) de pu ri na ci ja (gu bi tak pu rin skog mjes ta) ko ja nas ta- je zbog ki da nja ve ze iz me |u pu rin ske ba ze i deok si ri bo ze, os tav lja ju }i apu rin- sko (AP) mjes to u DNA. dGMP = deo- ksig va no zi n-mo no fos fat.

gu i re zul ti ra ti vi so kom u~es ta lo{ }u mu ta ci ja ~i je su pos lje di ce nep rih vat lji- ve s gle di{ ta sta ni~ ne rep ro duk ci je. Da bi od r ̀ a le in teg ri tet svo je ga ge no ma sta ni ce su mo ra le raz vi ti me ha niz me za pop ra vak o{ te }e nja DNA. Me ha ni- zmi pop rav ka DNA mo gu se po di je li ti u dvi je op }e sku pi ne: (1) iz rav ni obrat ke mij ske reak ci je od go vor ne za o{ te }e nje DNA i (2) uk la nja nje o{ te }e- nih ba za na kon ~e ga sli je di nji ho va zam je na s no vo sin te ti zi ra nom DNA. U slu ~a je vi ma ka d za ta je oba me ha niz ma pop rav ka DNA, evo lu ci ja je raz vi la do dat ne me ha niz me ko ji sta ni ci po ma ̀ u da se no si s o{ te }e nji ma.

Iz rav ni ob rat o{ te }e nja DNA Ve }i na o{ te }e nja DNA pop rav lja se uk la nja njem o{ te }e ne ba ze na kon ~e ga sli je di po nov na sin te za uk lo nje nog pod ru~ ja. Ne ka se o{ te }e nja ipak mo gu pop ra vi ti iz rav nim ob ra tom o{ te }e nja {to mo ̀ e bi ti znat no u~in ko vi ti ji na- ~in bor be sa spe ci fi~ nim ti po vi ma o{ te }e nja DNA ko ji se u~es ta lo do ga |aju. Sa mo ne ko li ko ti po va o{ te }e nja DNA pop rav lja se na ovaj na ~in – pi ri mi- din ski di me ri nas ta li kao re zul tat iz la ga nja ul tra lju bi ~as tom (UV) svjet lu i

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 195

susjedni timin u DNA

gvanin O6-metilgvanin

timinski dimer

ciklobutanski prsten

(A) izlaganje UV-svjetlu

(B) alkiliranje

(C) reakcija s karcinogenom

N

N

N N

C

1

2 3

4

56

1

2

3 4

5 7

8

9

6

N C

CC

C

C

C

HN

C

H

H

O

O

H2N

OH

HN

OH

OH

O

CH3

CH3

CH CH

O

O

N

N N

C

C

C

N

CH2N

O

gvanin

adicija ve}e kemijske skupine

N

N N

C

CH

C

C

HN

CH2N

O

N

N N

C

C

C

HN

C

P

NC

N C

CC

H

H

O

O

CH3

O

P

NC

N C

CC

H

O

O

CH3

O

P

NC

N C

CC

H

H

O

O

CH3

O

P

CH

H

Sli ka 5-19. Prim je ri o{ te }e nja DNA in du ci ra nih zra ~e njem i ke mij skim ~im be ni ci ma. (A) UV-svjetlo inducira nas ta ja nje pi- ri mi din skih di me ra u ko ji ma su dva sus jed na pi ri mi di na (prim je ri ce ti mi na) spo je na struk tu rom cik lo bu tan skog pr- ste na. (B) Al ki li ra nje je adi ci ja me til ne ili etil ne sku pi ne na raz li ~i te po lo ̀ a je DNA ba za. U ovom prim je ru al ki li ra nje O6 po- lo ̀ a ja gva ni na re zul ti ra stva ra njem O6 me til gva ni na. (C) Mno gi kar ci no ge ni (prim je ri ce ben za pi ren) rea gi ra ju s ba za- ma u DNA {to re zul ti ra adi ci jom ve li kih ke mij skih sku pi na na mo le ku lu DNA.

al ki li ra ni gva nin ski os tat ci, mo di fi ci ra ni do dat kom me til ne ili etil ne sku pi- ne na O6 po zi ci ju pu rin skog pr ste na.

UV-svjet lo je dan je od zna ~aj ni jih iz vo ra o{ te }e nja DNA, a ta ko |er je naj- vi {e prou ~e ni tip o{ te }e nja u smis lu me ha ni za ma pop rav ka. Na nje go vu va` no st upu }u je ~i nje ni ca da iz la ga nje Sun ~e vu UV-zra ~e nju pred stav lja uz rok go to vo svih kar ci no ma ko ̀ e u lju di. Glav ni tip o{ te }e nja in du ci ran UV-svjet lom jest for mi ra nje pi ri mi din skih di me ra u ko jem su sus jed ni pi ri- mi di ni na is tom lan cu DNA spo je ni cik lo bu tan skim pr ste nom nas ta lim za si- }e njem dvos tru ke ve ze iz me |u pe to ga i {es to ga ato ma ug lji ka (vi di sli ku 5-19A). Stva ra nje ovak vih di me ra na ru {a va struk tu ru DNA i blo ki ra trans- krip ci ju ili rep li ka ci ju niz vod no od mjes ta o{ te }e nja pa je nji hov po pra vak us ko po ve zan sa spo sob no{ }u sta ni ca da pre ̀ i ve UV-zra ~e nje. Je dan od me-

196 Poglavlje 5

svjetlo

fotoreaktivacijski enzim

timinski dimer

O6-metilgvanin O6-metilgvanin- metiltransferaza

HC

O

C

C

C

C

N

N N

N

H

HO

H

H

HH

CH3

O

H2N

CH2HS

cistein

gvanin

+

O

C

C

C

C

N

N HN

N

H

HO

H

H

HH

O

H2N

CH2 CH2 S

CH2

HC

P

P

metilcistein

H3C

Sli ka 5-20. Iz rav ni pop ra vak ti min skih di me ra. UV-svjet lom in du ci ra ni ti min ski di me ri mo gu se pop ra vi ti fo to reak ti va ci jom, pri ~e mu ener gi ja vid lji ve svjet los ti slu ̀ i za ki da nje ve za ko je tvo re cik lo bu- tan ski pr sten.

Sli ka 5-21. Pop ra vak O6-metilgvanina. O6-metilgvanin-metiltransferaza pre no si me til nu sku pi nu s O6-metilgvanina na cis tein ski os ta tak u ak tiv nom mjes tu en zi ma.

ha ni za ma za pop rav lja nje UV in du ci ra nih pi ri mi din skih di me ra je st iz rav- ni ob rat di me ri za cij ske reak ci je. Pro ces se na zi va fo to reak ti va ci ja jer se za ki da nje struk tu re cik lo bu tan skog pr ste na ko ris ti ener gi ja vid lji ve svjet lo sti (sli ka 5-20). Fo to reak ti va ci jom se iz vor ne pi ri mi din ske ba ze vra }a ju u nor- mal no sta nje i one os ta ju u mo le ku li DNA. Ka ko je Sun ~e vo UV-zra ~e nje glav ni iz vor o{ te }e nja mo le ku le DNA u raz li ~i tim ti po vi ma sta ni ca, lo gi~ no je o~e ki va ti da je pop ra vak pi ri mi din skih di me ra fo to reak ti va ci jom za jed- ni~ ko raz li ~i tim pro ka riot skim i eu ka riot skim sta ni ca ma, uk lju ~u ju }i E. co li, kvas ce i ne ke vr ste bi lja ka i `i vo ti nja. Za nim lji vo je, ipak, da fo to reak ti va ci- ja ni je uni ver zal na; mno ge vr ste (uk lju ~u ju }i ~ov je ka) ne ma ju ovaj me ha ni- zam pop rav ka DNA.

Dru gi ob lik di rek tnog pop rav ka od no si se na o{ te }e nja proi za{ la iz reak ci- je iz me |u al ki li ra ju }ih ~im be ni ka i DNA. Al ki li ra ju }i ~im be ni ci su reak tiv ne kom po nen te ko je mo gu pre ni je ti me til nu ili etil nu sku pi nu na ba zu DNA i ti me je ke mij ski mo di fi ci ra ti (vi di sli ku 5-19B). Oso bi to va ̀ an tip o{ te }e nja je me ti la ci ja O6 po zi ci je gva ni na sto ga {to nas ta li pro du kt, O6-metilgvanin, stva ra kom ple men tar ne baz ne pa ro ve s ti mi nom um jes to s ci to zi nom. Ova le zi ja mo ̀ e bi ti pop rav lje na dje lo va njem en zi ma naz va nog O6-metilgvanin- metiltransferaza, ko ji pre no si me til nu sku pi nu s O6-metilgvanina na cis tein- ski os ta tak u svom ak tiv nom mjes tu (sli ka 5-21). Ti me je uk lo nje na po ten ci- jal na mu ta ge na ke mij ska mo di fi ka ci ja i res tau ri ran iz vor ni gva nin. En zi mi ko ji ka ta li zi ra ju ovu di rek tnu reak ci ju pop rav ka zas tup lje ni su u znat nom bro ju pro ka riot skih i eu ka riot skih or ga ni za ma, uk lju ~u ju }i i ~ov je ka.

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 197

DNA sadr`ava U stvoren deaminacijom C

DNA-glikozilaza

AP mjesto

G

G

AP-endonukleaza

deoksiriboza-fosfodiesteraza

G

G

DNA-polimeraza

ligaza

G

C

U

Sli ka 5-22. Pop ra vak iz re zi va njem ba za. U ovom je prim je ru ura cil (U) stvo ren dea mi na ci jom ci to zi na (C) i zbog to ga se na la zi na sup rot gva ni nu (G) u kom ple men tar nom lan cu DNA. Ve za iz me |u ura ci la i deok- si ri bo ze pre ki nu ta je dje lo va njem DNA-gli ko zi la ze os tav lja ju }i u DNA {e }er bez pri- dru ̀ e ne ba ze (AP mjes to). Ovo mjes to pre poz na je AP-en do nuk lea za ko ja ki da la nac DNA. Preos ta la deok si ri bo za uk la nja se dje lo va njem deok si ri bo za-fos fo dies te ra ze. Nas ta la pu ko ti na po pu nja va se na kon to ga DNA-po li me ra zom i li ga zom {to do vo di do ug rad nje od go va ra ju }e ba ze (C) na sup rot G.

Pop ra vak iz re zi va njem (ek sci zij ski pop ra vak) Prem da je iz rav ni pop ra vak u~in ko vit na ~in no {e nja s od re |e nim ti po vi ma o{ te }e nja DNA, pop ra vak iz re zi va njem je op }e ni ti ji na ~in pop rav ka {i ro ke sku pi ne ke mij skih prom je na mo le ku le DNA. Pre ma to me, raz li ~i ti ti po vi pop rav ka iz re zi va njem pred stav lja ju naj va` ni je me ha niz me pop rav ka DNA ka ko u pro ka riot skim ta ko i u eu ka riot skim sta ni ca ma. U pop rav ku iz re zi va njem, o{ te }e na DNA bi va pre poz nana i uk lo nje na bi lo u ob li ku slo- bod nih ba za ili nuk leo ti da. Nas ta la pu ko ti na se za tim po pu nja va sin te zom no vog lan ca DNA ko ri{ te njem neo{ te }e noga kom ple men tar nog lan ca kao ka lu pa. Tri ti pa pop rav ka iz re zi va njem – iz re zi va nje ba za, iz re zi va nje nu- kleo ti da i pop ra vak kri vo spa re nih ba za (en gl. mis mat ch re pair) – omo gu }u- ju sta ni ca ma da se bo re sa {i ro kim spek trom raz li ~i tih o{ te }e nja DNA.

Pop ra vak mo le ku le DNA ko ja sad r ̀ ava ura cil pred stav lja do bar prim jer pop rav ka iz re zi va njem ba za, u ko jem jed na o{ te }e na ba za bi va pre poz na- na i uk lo nje na iz mo le ku le DNA (sli ka 5-22). Ura cil se mo ̀ e po ja vi ti u DNA na dva na ~i na: (1) Ura cil (kao dU TP – deok siu ri di n-tri fos fat) pov re me no se ug ra |u je na mjes tu ti mi na za vri je me sin te ze DNA; i (2) ura cil se mo ̀ e po- ja vi ti u DNA dea mi na ci jom ci to zi na (vi di sli ku 5-18A). Dru gi me ha ni zam ima mno go ve }i bio lo{ ki zna ~aj bu du }i da mi je nja nor mal ni ob ra zac kom- ple men tar nog spa ri va nja ba za i ti me pred stav lja mu ta ge ni do ga |aj. Iz re zi- va nje ura ci la ka ta li zi ra no je dje lo va njem DNA-gli ko zi la ze, en zi ma ko ji ki- da ve zu iz me |u ba ze (ura ci la) i deok si ri bo ze u okos ni ci DNA. Ova reak ci ja stva ra slo bod ni ura cil i api ri mi din sko mjes to – {e }er bez prid ru ̀ e ne ba ze. DNA-gli ko zi la ze ta ko |er pre poz na ju i uk la nja ju dru ge nep ra vil ne ba ze uklju ~u ju }i hi pok san tin stvo ren dea mi na ci jom ade ni na, pi ri mi din ske di me- re, al ki li ra ne pu ri ne (osim O6-alkil gva ni na) i ba ze o{ te }e ne ok si da ci jom ili io ni zi ra ju }im zra ~e njem.

Re zul tat ak tiv nos ti DNA-gli ko zi la ze je st for mi ra nje api ri mi din skog ili apu rin skog mjes ta (uo bi ~a je no zva nim AP mjes tom) u DNA. Sli~ na AP mjes ta nas ta ju kao re zul tat spon ta no ga gu bit ka pu rin skih ba za (vi di sli ku 5-18B), {to se do ga |a sa zna ~aj nom u~es ta lo{ }u u nor mal nim sta ni~ nim u vje ti ma. Proc je nju je se da na taj na ~in sva ka sta ni ca u ljud skom ti je lu dnev no gu bi ne ko li ko ti su }a pu rin skih ba za. Ta se mjes ta pop rav lja ju dje lo- va njem AP-en do nuk lea ze ko ja ki da la nac DNA uz AP mjes to (vi di sli ku 5- 22). Preos ta li se deok si ri boz ni os ta tak za tim uk lo ni, a nas ta la pu ko ti na od jed ne ba ze po pu nja va se dje lo va njem DNA-po li me ra ze i li ga ze.

Dok DNA-gli ko zi la ze pre poz na ju sa mo spe ci fi~ ne ob li ke o{ te }e nih ba za, dru gi sus ta vi pop rav ka iz re zi va njem pre poz na ju {i ro ku sku pi nu o{ te }e nih ba za ko je na ru {a va ju struk tu ru DNA mo le ku le, uk lju ~u ju }i pi ri mi din ske di me re in du ci ra ne UV zra ~e njem i ve li ke sku pi ne do da ne ba za ma DNA kao re zul tat in te rak ci je raz li ~i tih kan ce ro ge na s DNA (vi di sli ku 5-19C). Ovaj {i ro ko ras pros tra nje ni ob lik pop rav ka DNA poz nat je kao pop ra vak iz re zi va njem nuk leo ti da jer se o{ te }e ne ba ze (prim je ri ce di me ri ti mi na) ukla nja ju kao dio oli go nuk leo ti da u ko jem je do{ lo o{ te }e nja (sli ka 5-23).

198 Poglavlje 5

prepoznavanje o{te}enja

kidanje nukleazom

helikaza izrezani oligonukleotid

DNA-polimeraza

ligaza

T T

T T

T T

T T

Sli ka 5-23. Pop ra vak ti min skih di me ra iz re zi va njem nuk leo ti da. O{ te }e na DNA pre poz nana je i po kida- na na oba kra ja ti min skog di me ra dje lo- va njem 3'→5'-nukleaze. Od mo ta va nje DNA-he li ka zom re zul ti ra izrezivanjem oli go nuk leo ti da ko ji sad r ̀ ava o{ te }e ne ba ze. Nas ta la pu ko ti na po pu nja va se dje lo va njem DNA-po li me ra ze i zat va ra li ga zom.

Kod E. co li pop ra vak iz re zi va njem nuk leo ti da ka ta li zi ran je dje lo va njem pro du ka ta triju ge na (uv rA, B i C) ko ji su ot kri ve ni zah va lju ju }i ~i nje ni ci da mu ta ci je ovih lo ku sa re zul ti ra ju ek strem nom os jet lji vo{ }u na UV-svjet lo. Pro tein UvrA pre poz na je o{ te }e nu DNA i reg ru ti ra UvrB i UvrC k mje stu le zi je. UvrB i UvrC za tim ki da ju la nac na 3' i 5' stra ni o{ te }e nog mjes ta od va- ja ju }i oli go nuk leo tid gra |en od 12 ili 13 ba za. UvrABC kom ple ks se ~es to na zi va eksci nuk lea za, ime nom ko je od ra ̀ a va nje go vu spo sob no st da iz ra- vno iz re zu je (en gl. exci se) od re |e ni oli go nuk leo tid. Na kon to ga je po treb na ak tiv no st he li ka ze ka ko bi se iz dvo lan ~a ne mo le ku le DNA uk lo nio oli go- nuk leo tid u ko jem se na la zi o{ te }e nje, a nas ta la pu ko ti na po pu nja va se dje- lo va njem DNA-po li me ra ze i li ga ze.

Sus tav pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da ta ko |er je in ten ziv no prou ~a- van u eu ka riot skim or ga niz mi ma, uk lju ~u ju }i kvas ce, glo dav ce i ~ov je ka. U kvas ci ma, kao i u E. co li, ot kri ve no je ne ko li ko ge na uk lju ~e nih u pop ra vak DNA (naz va nih RAD ge ni – en gl. ra dia tion sen si ti vi ty) izo la ci jom mu ta na ta s po ve }a nom os jet lji vo{ }u na UV-svjet lo. U ~ov je ka su ge ni pop rav ka DNA ot kri ve ni ug lav nom prou ~a va njem oso ba ko je pa te od nas ljed nih bo les ti

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 199

T

T

prepoznavanje o{te}enja

XPC

XPC hHR23B

hHR23B

helikaza

TFIIH (XPB and XPD)

XPG

XPA

XPF/ERCC 1

DNA-polimeraza

ligaza

TT

T

XPA

ERCCI

XPF

kidanje i izrezivanje oligonukleotida

Sli ka 5-24. Pop ra vak iz re zi va njem nuk leo ti da u sta ni ca ma si sa va ca. XPC/hHR23B kom ple ks pre poz na je DNA o{ te }e nje (prim je ri ce ti min ski di mer). Na kon to ga se tran skrip cij ski fak tor TFIIH, ko ji sad r ̀ ava XPB i XPD he li ka ze kao i XPG, us mje ruje k mjes tu o{ te }e ne DNA. Na kon od mo ta va nja DNA dje lo va njem XPB i XPD, XPA pot vr |u je pri sut no st o{ te }e nja i mo bi li zi ra XPF/ERCC1 kom ple ks. XPF/ERCC1 i XPG-en do nuk lea ze ki da ju DNA i uk la nja nju o{ te }e ni oli go nuk leo tid. Nas ta la pu ko ti na po pu nja va se dje lo va njem DNA-po li me ra ze i zat va ra li ga zom.

uz ro ko va nih ne mo gu} no{ }u pop rav ka o{ te }e nja DNA. Na jin ten ziv ni je prou ~a va na od ovih bo les ti je Xe ro der ma pig men to sum (XP), ri je dak ge ne ti- ~ki po re me }aj ko ji po ga |a ot pri li ke jed nu od 25.000 oso ba. Po je din ci s ovom bo le{ }u ek strem no su os jet lji vi na UV-zra ~e nje i raz vi ja ju mul tip le kar ci no me ko ̀ e na pod ru~ ji ma ti je la iz lo ̀ e ni ma Sun ~e vu svjet lu. Ja mes Clea ver je 1968. go di ne do {ao do klju~ nog ot kri }a da kul ti vi ra ne sta ni ce izo- li ra ne iz bo les ni ka ko ji pa te od Xero der ma pig men to sum ne mo gu pro vo di ti pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da. Ovo opa ̀ a nje ne sa mo da je pru ̀ i lo prvu ve zu iz me |u pop rav ka DNA i kar ci no ma, ve} je ta ko |er pred lo ̀ i lo ko ri{ te nje XP sta ni ca kao ek spe ri men tal nih sus ta va za iden ti fi ka ci ju ljud- skih ge na uk lju ~e nih u pop ra vak DNA. Ljud ski ge ni uk lju ~e ni u pop ra vak DNA ot kri ve ni su osim to ga i prou ~a va njem dru ge dvi je bo les ti lju di ko je nas ta ju kao pos lje di ca de fe ka ta u pop rav ku DNA (Coc kayneov sin drom i tri ho tio dis tro fi ja), te prou ~a va njem sta ni~ nih li ni ja os jet lji vih na UV-zra ~e- nje. Vra ta ek spe ri men tal ne ana li ze pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da u sus ta vi ma si sa va ca ot vo ri lo je klo ni ra nje ge na za du ̀ e nih za pop ra vak o{ te- }e nja DNA. To me su pri do ni je li ek spe ri men ti pri je no sa ge na pro ve de ni u sta ni ca ma si sa va ca s de fek ti ma u pop rav ku DNA, a ko ji se zas ni va ju na spo- sob nos ti ale la div ljeg ti pa da os jet lji vo st mu ti ra nih sta ni ca na UV-zra ~e nje vra te na nor mal nu ra zi nu.

Mo le ku lar nim klo ni ra njem ot kri ve no je se dam raz li ~i tih ge na pop rav ka (oz na ~e nih XPA do XPG) ko ji su mu ti ra ni kod oso ba obo lje lih od Xe ro der ma pig men to sum, a ot kri ve ni su i ge ni mu ti ra ni u oso ba ko je pa te od Coc kayneo- va sin dro ma i tri ho tio dis tro fi je, te ge ni u sta ni~ nim li ni ja ma os jet lji vim na UV-zra ~e nje. Pro tei ni ko di ra ni ovim ge ni ma pop rav ka o{ te }e nja DNA u si- sa va ca us ko su srod ni pro tein skim pro duk ti ma RAD ge na kva sa ca, {to uka- zu je na vi so ku kon zer vi ra no st me ha niz ma pop rav ka iz re zi va njem nu kleo ti- da u eu ka riot skim or ga niz mi ma. Ka da su klo ni ra ni ge ni pop rav ka u kva sa- ca i si sa va ca bi lo je mo gu }e do bi ti i pro tei ne ko je oni ko di ra ju u ~is tom ob li- ku te raz vi ti in vit ro sus ta ve za is pi ti va nje nji ho ve ulo ge u me ha niz mi ma pop rav ka (sli ka 5-24). Po ~et ni ko rak pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da u sta ni ca ma si sa va ca uk lju ~u je pre poz na va nje kri vo spa re nih ba za s po mo }u kom plek sa gra |e nog od XPC pro tei na i pro tei na pod ime nom hHR23B, ho- mo log nog kva{ ~e vom Ra d23 pro tei nu. Na kon to ga sli je di us mje ri va nje XPB, XPD i XPG pro tei na ka mjes tu o{ te }e nja DNA. XPB i XPD pro tei ni su kom po nen te tran skrip cij skog fak to ra TFIIH, ko ji se sas to ji od vi {e pod je di- ni ca, a pot re ban je za ini ci ja ci ju tran skrip ci je eu ka riot skih ge na (vi di 6. po- glav lje) – oni dje lu ju kao he li ka ze, od ma ta ju }i ot pri li ke 30 pa ro va ba za DNA oko mjes ta o{ te }e nja. XPA pro tein za tim pot vr |u je o{ te }e nje i us mje- ruje he te ro di mer XPF i ER CC1 pro tein (pro tein pop rav ka iden ti fi ci ran u sta ni~ nim li ni ja ma glodavaca os jet lji vim na UV-zra ~e nje) ka mjes tu o{ te }e- nja. XPF/ERCC1 i XPG su en do nuk lea ze ko je ki da ju DNA u 5'→3' smje ru od o{ te }e nog mjes ta. Tim se ki da njem iz re zu je oli go nuk leo tid du lji ne od ot pri li ke 30 ba za. Nas ta la pu ko ti na po pu nja va se dje lo va njem DNA-po li me- ra ze d ili e (uz su rad nju RFC i PCNA) i li ga ze.

Dok XPC/hHR23B kom ple ks mo ̀ e pre poz na ti o{ te }e nja DNA bi lo gdje u ge no mu, al ter na tiv ni ob lik pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da, zvan po-

200 Poglavlje 5

T

CSB

RNA-polimeraza zaustavljena

na mjestu o{te}enja

T T

izrezivanje oligonukleotida

sinteza DNA ligacija

T

TT

XPA

XPF

T

CSATFIIH (XPB i XPD)

XPG

XPA

XPF/ERCCI

CSB

Sli ka 5-25. Pop ra vak po ve zan s tran skrip ci jom u sta ni ca ma si sa va ca. RNA-po li me ra za zaus tav lje na je na mjes tu le zi je u DNA lan cu ko ji se pre pi su je. Zaus tav lje nu RNA-po li me ra zu pre poz na ju pro tei ni po ve za ni s tran skrip cij skim pop rav kom, CSA i CSB, ko ji us mje ru ju TF II i XPG k mjes tu o{ te }e nja DNA. Po pra- vak se da lje od vi ja uo bi ~a je nim me ha niz mom pop rav ka iz re zi va njem nuk leo ti da (vi di sli ku 5-24).

pra vak ud ru ̀ en s tran skrip ci jom, spe ci fi ~an je za pop ra vak o{ te }e nja unu- tar ge na ko ji se pre pi su ju. Ve za iz me |u tran skrip ci je i pop rav ka ge na pr vi pu ta je do ka za na ek spe ri men ti ma ko ji su po ka za li da se la nac DNA ko ji se pre pi su je pop rav lja znat no br ̀ e od lan ca ko ji se ne pre pi su je, ka ko u E. co li ta ko i u sta ni ca ma si sa va ca. Budu}i da o{ te }e nje DNA blo ki ra tran skrip ci ju, sta ni ca fa vo ri zi ra pop ra vak za vri je me tran skrip ci je jer joj omo gu }u je da pog la vi to pop ra vi o{ te }e nja onih ge na ko ji su ek spri mi ra ni. Kod E. co li meha ni zam po ve za nos ti tran skrip ci je i pop rav ka uk lju ~u je pre poz na va nje RNA-po li me ra ze za ko ~e ne pri o{ te }e nju lan ca DNA ko ji se pre pi su je. Za ko- ~e nu RNA- po li me ra zu pre poz na je pro tein, naz van fak tor po ve zan s trans- krip cij skim pop rav kom, ko ji uk la nja RNA-po li me ra zu i us mje ruje UvrABC ek sci nuk lea zu pre ma mjes tu o{ te }e nja.

U sta ni ca ma si sa va ca, pop ra vak ud ru ̀ en s tran skrip ci jom uk lju ~u je pre- poz na va nje za ko ~e ne RNA-po li me ra ze dje lo va njem CSA i CSB pro tei na ko ji su ko di ra ni ge ni ma od go vor nim za Coc kayneov sin drom (sli ka 5-25). Za raz li ku od bo les ni ka ko ji pa te od Xero der ma pig men to sum, bo les ni ci s Coc- kayneo vim sin dro mom po ka zu ju spe ci fi ~an de fe kt pop rav ka po ve za nog s tran skrip ci jom {to je u skla du s ulo gom CSA i CSB pro tei na kao fak to ra po- ve za nih s tran skrip cij skim pop rav kom. CSA i CSB dje lu ju ana log no XPC/ ERCC1 kom plek su us mje ru ju }i XPB, XPD i XPG k mjes tu o{ te }e nja. Na kon to ga sli je di mo bi li zi ra nje XPA pro tei na i XPF/ERCC1 kom plek sa te iz re zi va- nje o{ te }e nog oli go nuk leo ti da. Pop ra vak ud ru ̀ en s tran skrip ci jom se, pre- ma to me, nas tav lja sli~ no uo bi ~a je nom pop rav ku iz re zi va njem nu kleo ti da s izu zet kom po ~et nog pre poz na va nja za ko ~e ne RNA po li me ra ze dje lo va- njem CSA i CSB pro tei na, a ne iz rav nim pre poz na va njem o{ te }e nja DNA s po mo }u XPC/hHR23B kom plek sa.

Tre }i me ha ni zam pop rav ka iz re zi va njem pre poz na je kri vo spa re ne ba ze ug ra |e ne za vri je me rep li ka ci je DNA. Mno ge od tih kri vo spa re nih ba za u kla nja ju se ko rek tiv nom ak tiv no{ }u DNA-po li me ra ze. Preos ta le kri vo spa- re ne ba ze ob je kt su kas ni jeg ko rek tiv nog me ha niz ma zva nog pop ra vak kri- vo spa re nih ba za (engl. mis mat ch re pair system) ko ji prov je ra va no vo rep li ci ra- nu DNA. Me ha niz mi ovog pop rav ka spo sob ni su ot kri ti i spe ci fi~ no iz re za ti kri vo spa re nu ba zu iz no vo sin te ti zi ra no ga lan ca DNA omo gu }iv {i ti me po- pra vak pog rje{ ke i po nov no us pos tav lja nje iz vor no ga sli je da nuk leo ti da.

Kod E. co li, spo sob no st sus ta va pop rav ka kri vo spa re nih ba za da raz li ku- je ro di telj ski od no vo sin te ti zi ra no ga lan ca DNA zas ni va se na ~i nje ni ci da je DNA ove bak te ri je mo di fi ci ra na me ti la ci jom ade nin skih os ta ta ka unu tar sli je da GATC ~i me se ade nin pret va ra u 6-metiladenozin (sli ka 5-26). Ka ko se me ti la ci ja od vi ja na kon rep li ka ci je, no vo sin te ti zi ra ni lan ci DNA ni su me- ti li ra ni i mo gu se spe ci fi~ no pre poz na ti en zi mi ma pop rav ka pog rje{ no spa- re nih ba za. Pop ra vak pog rje{ no spa re nih ba za za po ~i nje dje lo va njem pro- tei na MutS ko ji pre poz na je kri vo spa re ne ba ze te tvo ri kom ple ks s dva dru- ga pro tei na zva na MutL i MutH. MutH-en do nuk lea za za tim ki da ne me ti li- ra ni la nac DNA unu tar GATC sli je da. MutL i MutS dje lu ju na kon to ga za- jed no s eg zo nuk lea zom i he li ka zom isi je ca ju }i DNA iz me |u pre ki da lan ca i kri vo spa re nih ba za, a nas ta la pu ko ti na po pu nja va se dje lo va njem DNA- po li me ra ze i li ga ze.

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 201

CH3 CH3 stari lanac

novi lanac

MutS, MutL, MutH pogrje{no sparena baza

CH3 CH3

MutS, MutL, helikaza, egzonukleaza

DNA-polimeraza ligaza

CH3 CH3

CH3 CH3

H L S

L S

Sli ka 5-26. Pop ra vak pog rje{ no spa re nih ba za u E. co li. Sus tav pop rav ka pog rje{ no spa re nih ba za ot kri va i uk la nja pog rje{ no spa re ne ba ze u no vo rep li ci ra noj DNA ko ja se raz li ku je od ro di telj skog lan ca jer jo{ ni je me ti li ra- na. MutS se ve ̀ e za pog rje{ no spa re nu ba zu na kon ~e ga se ve ̀ e i MutL. Ve za nje MutL ak ti vi ra MutH ko ji kida ne mo di fi ci ra ni la nac na sup rot mjes tu me ti la ci je. MutS i MutL za jed no s he li ka zom i eg zo nuk lea zom na kon to ga iz re zu ju dio ne mo di fi ci- ra nog lan ca ko ji sad r ̀ ava pog rje{ no spa re nu ba zu. Pu ko ti na se po pu nja va dje lo va- njem DNA-po li me ra ze i zat va ra li ga zom.

Eu ka rio ti ima ju sli ~an sus tav pop rav ka kri vo spa re nih ba za prem da se me ha ni zam ko jim eu ka riot ske sta ni ce pre poz na ju no vo rep li ci ra nu DNA raz li ku je od onog ko ri{ te nog u E. co li. ^i ni se da u sta ni ca ma si sa va ca spe ci- fi~ no st pog rje{ no spa re ne ba ze u no vo sin te ti zi ra nom lan cu ni je od re |e na me ti la ci jom DNA. Um jes to to ga, pri sut no st jed no lan ~a nog lo ma (u ovom slu ~a ju u no vo sin te ti zi ra nom lan cu DNA) ili pak po ve zi va nje eu ka riot skih ho mo lo ga pro tei na MutS i MutL s rep li ka cij skim sustavom mog li bi od re di- ti ko ji je la nac pot reb no pop ra vi ti. Ho mo lo zi MutS i MutL pro tei na ve ̀ u se za tim za kri vo spa re nu ba zu i up rav lja ju isi je ca njem DNA iz me |u lo ma lan- ca i kri vo spa re nih ba za, kao i u slu ~a ju E co li. Va` no st ovog me ha niz ma pop rav ka dra ma ti~ no je ilus tri ra na ~i nje ni com da su mu ta ci je ljud skih ho- mo lo ga mutS i mutL ge na od go vor ne za uo bi ~a je ni tip nas ljed nog kar ci no- ma de be loga cri je va (nas ljed ni ne po li poz ni ko lo rek tal ni kar ci nom ili HNPCC). HNPCC pred stav lja jed no od na juo bi ~a je ni jih nas ljed nih obo lje- nja s u~es ta lo{ }u od jed ne na 200 oso ba, a od go vo ran je za 15% svih ko lo- rek tal nih kar ci no ma u SA D-u. Po ve za no st iz me |u HNPCC i po re me }a ja u pop rav ku kri vo spa re nih ba za ot kri ve na je 1993. go di ne ka d su dvi je sku pi- ne znan stve ni ka klo ni ra le ljud ski ho mo log mutS ge na i pro na{ le da je mu ta- ci ja u ovom ge nu od go vor na za ot pri li ke po lo vi nu HNPCC slu ~a je va. Na- knad na is pi ti va nja po ka za la su da je ve }i na preos ta lih slu ~a je va HNPCC re zul tat mu ta ci je jed nog od tri ljud ska ho mo lo ga mutL ge na. ^i ni se da de- fek ti ovih gena re zul ti ra ju vi so kom u~es ta lo{ }u mu ta ci ja dru gih sta ni~ nih ge na s od go va ra ju }om vi so kom vje ro jat no{ }u da }e ne ke od njih na kra ju do ves ti do raz vo ja kar ci no ma.

Pop ra vak sklon pog rje{ ka ma Me ha niz mi iz rav nog ob ra ta o{ te }e nja DNA i pop rav ka iz re zi va njem po- prav lja ju o{ te }e nje DNA pri je rep li ka ci je ta ko da se DNA mo ̀ e sin te ti zi ra ti ko ri{ te njem neo{ te }e nog lan ca DNA kao ka lu pa. U slu ~a ju da ovi me ha ni- zmi za ka ̀ u, sta ni ca ipak ima al ter na tiv ne me ha niz me za pop ra vak o{ te }e- nja DNA u rep li ka cij skim ra{ lja ma. Pi ri mi din ski di me ri i mno gi dru gi ti po- vi le zi ja ne mo gu se ko pi ra ti nor mal nom ak tiv no{ }u DNA-po li me ra za pa je rep li ka ci ja na mjes ti ma tih o{ te }e nja blo ki ra na. No, sta ni ce ta ko |er pos je- du ju ne ko li ko spe ci ja li zi ra nih DNA-po li me ra za ko je su u sta nju iz vr {i ti re- pli ka ci ju i pre ko mjes ta s o{ te }e njem DNA. Rep li ka ci ja o{ te }e ne DNA dje lo- va njem tak vih spe ci ja li zi ra nih po li me ra za mo ̀ e do ves ti do u~es ta log ug ra |i va nja neod go va ra ju }ih ba za pa se ovaj ob lik bor be s o{ te }e nji ma DNA na zi va pop ra vak sklon pog rje{ ka ma (engl. er ror– pro ne re pair).

Pr va DNA-po li me ra za sklo na pog rje{ ka ma ot kri ve na je 1999. go di ne u E. co li. Ovaj en zim, naz van po li me ra za V, in du ci ran je u od go vo ru na eks- ten ziv no UV-zra ~e nje. Po li me ra za V mo ̀ e sin te ti zi ra ti no vi la nac mo le ku le DNA pre ko mjes ta s ti min skim di me ri ma (sli ka 5-27). Dru ge dvi je DNA-po- li me ra ze u E. co li, po li me ra za II i IV, na sli ~an su na ~in in du ci ra ne o{ te }e- njem DNA i dje lu ju u me ha niz mu pop rav ka sklo nom pog rje{ ka ma. Eu ka-

202 Poglavlje 5

DNA-polimeraza sklona pogrje{kama usmjerena ka mjestu lezije

normalna replikacija

sinteza DNA preko mjesta o{te}enja djelovanjem DNA polimeraze sklone pogrje{kama

T T

T T

T T

nastavljanje normalne replikacije

popravak lezije izrezivanjem

T T

T

Sli ka 5-27. Pop ra vak sklon pog re{ ka ma Nor mal na rep li ka ci ja blo ki ra na je ti min- skim di me rom, ali DNA-po li me ra za sklo na pog re{ ka ma, kao {to je prim je- ri ce po li me ra za V (pol V), pre poz na je i nas tav lja sin te zu DNA i pre ko o{ te }e- nog mjes ta. Rep li ka ci ja se ta da mo ̀ e nas ta vi ti re gu lar nom rep li ka cij skom DNA-po li me ra zom, a ti min ski di mer se na kra ju uk la nja pop rav kom ek sci zi jom nuk leo ti da. Sin te za DNA po mo }u po li- me ra ze sklo ne pog re{ ka ma do vo di do u~es ta le ug rad nje pog re{ nih ba za.

riot ske sta ni ce ta ko |er sad r ̀ avaju vi {e DNA-po li me ra za sklo nih pog rje{ ka- ma. Do sa da je ot kri ve no de vet tak vih en zi ma u sta ni ca ma ~ov je ka.

Sve DNA-po li me ra ze sklo ne pog rje{ ka ma is ka zu ju ma lu vjer no st iz vor- nom ka lu pu kad ko pi ra ju neo{ te }e nu DNA, sa sto pa ma pog rje {a ka od 100 do 10.000 pu ta ve }im no {to su sto pe pog rje {a ka nor mal nih rep li ka cij skih DNA-po li me ra za (prim je ri ce po li me ra ze III u E. co li ili po li me ra ze d i ε u eu ka rio ta). Uz to, po li me ra ze sklo ne pog rje{ ka ma ne ma ju 3'→5' ko rek tiv nu ak tiv no st svoj stve nu nor mal nim rep li ka cij skim DNA-po li me ra za ma (vi di sli ku 5-12).

Va` no je ipak da su po li me ra ze sklo ne pog rje{ ka ma spe ci ja li zi ra ne za ugrad nju od go va ra ju }ih ba za smje{ te nih na sup rot spe ci fi~ nim le zi ja ma u o{ te }e noj DNA i sto ga su u mo gu} nos ti to~ no sin te ti zi ra ti no vi la nac ko ri ste- }i ne ke ob li ke o{ te }e noga lan ca kao ka lu pa. Ta ko prim je ri ce po li me ra za V u E. co li spe ci fi~ no pre poz na je ti min ske di me re i ko rek tno ug ra |u je AA na na- sup rot nom mjes tu no vo sin te ti zi ra no ga la na ca. Dak le, ovi en zi mi spo sob ni su spe ci fi~ no ug ra di ti od go va ra ju }u ba zu smje{ te nu na sup rot ne kim ob li ci- ma o{ te }e nja DNA, prem da su sklo ne pog rje{ ka ma u ug ra |i va nju ba za smje{ te nih na sup rot dru gih ob li ka o{ te }e ne DNA ili u sin te zi DNA ko ri{ te- njem nor mal noga neo{ te }e nog ka lu pa.

Re kom bi na cij ski pop ra vak Jo{ jedan na ~in pop rav ka DNA, re kom bi na cij ski pop ra vak, zas ni va se na zam je ni o{ te }e ne DNA re kom bi na ci jom s neo{ te }e nom mo le ku lom. Ovaj me ha ni zam se u~es ta lo ko ris ti za pop ra vak o{ te }e nja na ko ja se nai la zi za vri je me rep li ka ci je DNA ka da pri sut no st ti min skih di me ra ili dru gih le zi ja, ko je ne mo gu bi ti ko pi ra ne dje lo va njem nor mal ne rep li kacijske DNA-po li- me ra ze, blo ki ra nap re do va nje rep li ka cij skih ra{ lji. Re kom bi na cij ski pop ra- vak ovi si o ~i nje ni ci da je je dan la nac ro di telj ske DNA os tao neo{ te }en, i da je rep li ka ci jom dao nor mal nu ses trin sku mo le ku lu, ko ja sa da mo ̀ e bi ti is ko- ri{ te na za pop ra vak o{ te }e no ga lan ca.

Prem da mo le ku lar ni me ha niz mi re kom bi na cij sko ga pop rav ka ni su u pot pu nos ti poz na ti i mo gu va ri ra ti me |u raz li ~i tim ti po vi ma sta ni ca op }i ilus tra tiv ni mo del pri ka zan je na sli ci 5-28. U ovom prim je ru nor mal na re- pli ka ci ja blo ki ra na je pri sut no{ }u ti min skog di me ra u jed nom lan cu mo le- ku le DNA. Ipak, niz vod no od mjes ta o{ te }e nja rep li ka ci ja mo ̀ e opet bi ti za po ~e ta sin te zom Oka za ki je va frag men ta i mo ̀ e se nas ta vi ti uz du` o{ te }e- nog lan ca ka lu pa. Re zul tat to ga je ses trin ski la nac ko ji sad r ̀ ava pu ko ti nu na sup rot mjes tu o{ te }e nja ro di telj sko ga lan ca. Neo{ te }e ni ro di telj ski la nac, ko ji je rep li ka ci jom dao nor mal ni ses trin ski la nac, mo ̀ e za tim bi ti upot ri je- bljen za po pu nja va nje pu ko ti ne na sup rot mjes tu o{ te }e nja s po mo }u re- kom bi na ci je ho mo log nih slje do va DNA (vi di dalj nji tek st). Bu du }i da je ta- ko nas ta la pu ko ti na u pret hod no in tak tnom ro di telj skom lan cu smje{ te na na sup rot neo {te }e nom lan cu ona mo ̀ e bi ti po pu nje na dje lo va njem DNA- po li me ra ze. Ia ko dru ga ro di telj ska mo le ku la i da lje sad r ̀ ava iz vor no o{ te }e- nje (ti min ski di mer), ono sa da le ̀ i na sup rot nor mal nom lan cu i mo ̀ e se kas ni je pop ra vi ti pop rav kom iz re zi va njem.

Re kom bi na cij ski pop ra vak ta ko |er pru ̀ a glav ni me ha ni zam za po pra- vlja nje dvo lan ~a nih lo mo va ko ji se mo gu po ja vi ti u mo le ku li DNA kao po- slje di ca io ni zi ra ju }eg zra ~e nja (prim je ri ce X zra ke) ili dje lo va nja ne kih ke- mij skih ~im be ni ka (sli ka 5-29). Ka ko ovaj tip o{ te }e nja po ga |a oba lan ca DNA oso bi to je nez go dan za pop ra vak. Re kom bi na ci ja s ho mo log nim sli je- dom DNA u neo{ te }e nom kro mo so mu osi gu ra va meha ni zam za pop rav lja- nje ovak vih o{ te }e nja i res tau ri ra nje nor mal nog sli je da DNA. Al ter na tiv no, dvo lan ~a ni lo mo vi mo gu se pop ra vi ti jed nos tav no spa ja njem pre ki nu tih kra je va zah va }e ne mo le ku le DNA, no to bi re zul ti ra lo vi so kom u~es ta lo sti

Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 203

Karcinom debelog crijeva i popravak DNA

MOLEKULARNA MEDIC INA

pog rje {a ka ko je nas ta ju zbog de le ci je ba za oko mjes ta o{ te }e nja. Tre ba na- po me nu ti da ge ni od go vor ni za nas ljed ni kar ci nom doj ke (BR CA1 i BRCA2) ko di ra ju pro tei ne ko ji su uk lju ~e ni u pop ra vak dvo lan ~a nih lo mo va po sre- do va njem ho mo log ne re kom bi na ci je, {to su ge ri ra da de fek ti ovog ti pa pop- rav ka DNA mo gu ima ti za pos lje di cu nas ta nak jed nog od na ju ~es ta li jih kar ci no ma u `e na.

Bo le st

Kar ci no mi ko lo na i rek tu ma (ko lono- rektal ni kar ci no mi) ne ki su od naj ~e- {}ih kar ci no ma u za pad nom svi je tu. Na njih ot pa da oko 140.000 sveu kup- nih kar ci no ma ko ji su go di{ nje za bi lje- `e ni u SA D-u (ot pri li ke oko 10% in ci- den ci je kar ci no ma). Ve }i na kar ci no ma ko lo na (kao i dru gih vr sta kar ci no ma) ni su nas ljed ne bo les ti {to zna ~i da se ne pre no se iz rav no s ro di te lja na po tom stvo. No ipak, opi sa na su dva nas ljed na ob li ka kar ci no ma. U oba slu ~a ja nas lje |i va nje ge na za pre dis po- zi ci ju po ja ve kar ci no ma re zul ti ra vr lo ve li kom vje ro jat no{ }u raz vo ja bo les ti. Je dan od ob li ka nas ljed nog kar ci no ma de be loga cri je va (fa mi li jar na ade no ma- toz na po li po za) iz nim no je ri je dak i ~i ni ma nje od 1% slu ~a je va kar ci no ma de be lo ga cri je va. Dru gi nas ljed ni ob lik kar ci no ma de be lo ga cri je va (nas ljed ni ne po li poz ni ko lo rek tal ni kar ci nom ili HNPCC, en gl. he re di ta ry non po lypo sis co lo rec tal can cer) znat no je u~es ta li ji i ~i ni do 15% svih slu ~a je va kar ci no ma de be lo ga cri je va. HNPCC je jed na od na ju ~es ta li jih nas ljed nih bo les ti i po ga |a prib li` no jed nu od sva kih 200 oso ba. Prem da su kar ci no mi de be lo ga cri je va naj ~e{ }a ma ni fes ta ci ja ovog obo- lje nja, po go |e ne oso be ta ko |er pa te od po ve }a ne in ci den ci je dru gih ti po va kar- ci no ma, uk lju ~u ju }i kar ci nom jaj ni ka i en do met ri ja.

Mo le ku lar na i sta ni~ na os no va

Po put dru gih kar ci no ma, ko lo rek tal ni se kar ci nom raz vi ja zbog mu ta ci je ge na ko ji re gu li ra ju sta ni~ nu pro li fe ra ci ju {to do vo di do ne kon tro li ra no ga ras ta sta ni ca kar ci no ma. U ve }i ni slu ~a je va te mu ta ci je nas ta ju spo ra di~ no u so mat-

skim sta ni ca ma. Za raz li ku od to ga, kod nas ljed nih kar ci no ma mu ta ci je u sta ni ca ma ger mi na tiv ne li ni je (spol nim sta ni ca ma) pre dis po ni ra ju oso bu za raz- voj bo les ti.

Zna ~a jan nap re dak u is tra ̀ i va nju ove vr ste kar ci no ma do go dio se 1993. go di ne ka da je ot kri ve no da gen od go- vo ran za oko 50% HNPCC slu ~a je va ko di ra en zim uk lju ~en u pop ra vak kri vo spa re nih ba za – ovaj gen u ~ov je ka ho mo log je MutS ge na u E. co li. Nak nad na is tra ̀ i va nja po ka za la su da su jo{ tri ge na, od go vor na za ve }i nu preos ta lih slu ~a je va HNPCC, ho mo lo zi MutL ge na te su ta ko |er uk lju ~e ni u pop ra vak kri vo spa re nih ba za. Mu ta- ci je u ovim ge ni ma re zul ti ra ju vi so kom u~es ta lo{ }u mu ta ci ja dru gih sta ni~ nih ge na. Ve li ka je vje ro jat no st da }e ne ke od tih mu ta ci ja na kra ju do ves ti do raz vo ja kar ci no ma u slu ~a ju da po go de ge ne ko ji re gu li ra ju pro li fe ra ci ju sta- ni ca.

Pre ven ci ja i lije~enje

Kao i kod dru gih nas ljed nih bo les ti, ot kri }e ge na od go vor nih za HNPCC omo gu }u je da se ge ne ti~ kim tes ti ra- njem iden ti fi ci ra ju oso be iz lo ̀ e ne ri zi ku za raz voj ovog ob li ka nas ljed nog kar ci no ma. Na da lje, pre na tal na ge ne- ti~ ka di jag no za mo ̀ e bi ti veo ma va` na no sio ci ma HNPCC mu ta ci ja u pla ni ra- nju obi te lji. Po ten ci jal ne po god nos ti ot kri va nja ovih mu ta ci ja ni su og ra ni- ~e ne sa mo na pre ven ci ju pre no {e nja mu ti ra no ga ge na na slje de }u ge ne ra- ci ju – nji ho vo ot kri }e mo ̀ e ta ko |er pri do ni je ti pre ven ci ji raz vo ja bo les ti kod no sio ca mu ta ci ja.

Klju~ na zna ~aj ka kar ci no ma de be- lo ga cri je va je st nje gov pos tup ni raz voj

u raz dob lju od ne ko li ko go di na. Ra no di jag nos ti ci ra nje obo lje nja znat no po- ve }a va {an se pre ̀ iv lje nja bo les ni ka. Po ~et ni sta dij kar ci no ma de be lo ga cri je va pred stav lja ra st ma lih be nig nih po li pa ko ji s vre me nom pos ta ju ma lig ni i na pa da ju okol no ve ziv no tki vo. Pri je ma lig ne tran sfor ma ci je po li pe je mo gu }e la ko uk lo ni ti ki rur {kim pu tem {to je vr lo efi kas no u pre ven ci ji raz vo ja tu mo ra. Po li pi i ra ni sta di ji kar ci no ma de be lo ga cri je va mo gu se ot kri ti is pi ti va- njem de be lo ga cri je va s tan kom os vi jet- lje nom son dom (ko lo nos ko pom), ta ko da u~es ta le ko lo nos ko pi je bo les ni ka s HNPCC mo gu omo gu }i ti uk la nja nje po li pa pri je raz vo ja kar ci no ma. Osim to ga, ot kri ve no je ne ko li ko li je ko va po ten ci jal nih in hi bi to ra raz vo ja kar- ci no ma de be loga cri je va ko ji mo gu do ni je ti znat nu ko ri st bo les ni ci ma s HNPCC. Pra vo dob na prim je na pre- ven tiv nih mje ra, u smis lu ot kri va nja mu ta ci ja od go vor nih za HNPCC, mo ̀ e znat no pri do ni je ti sma nje nju bro ja obo- lje lih od ove zlo }ud ne bo les ti.

Po lip de be lo ga cri je va vi zua li zi ran ko lo no- skopi jom. (David M. Martin, M.D./SPL/Photo Researches, Inc..)

komentari (0)

nema postavljenih komentara

budi prvi koji ce napisati!

ovo je samo pregled

3 prikazano na 52 str.

preuzmi dokument