M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb
tena_zovko
tena_zovko28 October 2017

M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb

PDF (15 MB)
50 str.
70broj poseta
Opis
Molekularna biologija, 6. poglavlje, sinteza i obrada RNA
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 50

ovo je samo pregled

3 prikazano na 50 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 50 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 50 str.

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 prikazano na 50 str.

preuzmi dokument
06-pogl.indd

Poglavlje 6 Sinteza i dorada RNA

Transkripcija u prokariota 231

Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori 239

Regulacija transkripcije u eukariota 244

Dorada i promet RNA 261

KLJU^NI POKUS: Izolacija eukariotskoga transkripcijskoga faktora 251

KLJU^NI POKUS: Otkri}e snRNP 268

U 4. I 5. POG LAV LJU RAZ MAT RA NA JE OR GA NI ZA CI JA i od r ̀ a va nje ge nom ske DNA, ko ja bi se mog la pro mat ra ti kao skup ge ne ti~ kih in struk ci ja {to uprav lja ju svim sta ni~ nim ak tiv nos ti ma. In struk ci je se pre no se na RNA ko ja po tom up rav lja pro ce som sin te ze pro tei na. Va` no je na po me nu ti da po na- {a nje sta ni ce ni je od re |e no is klju ~i vo nas li je |e nim ge ni ma ne go i koji je od tih ge na iz ra ̀ e n u ne ko od re |e no vri je me. Re gu la ci ja gen ske ek spre si je omo gu }u- je sta ni ca ma pri la god bu na prom je ne nji ho va oko li {a, a od go vor na je i za spe ci- fi ~ne ak tiv nos ti brojnih di fe ren ci ra nih sta ni~ nih vr sta ko je izgra|uju vi {e bilj ke i `i vo ti nje. Mi {i} ne i jet re ne sta ni ce, prim je ri ce, sad r ̀ avaju is te ge ne; fun kci je tih sta ni ca ni su od re |e ne raz li ka ma u nji ho vim ge no mi ma, ne go re gu li ra nim na ~i- nom ekspresije ge na ko ji up rav lja ju raz vo jem i di fe ren ci ja ci jom.

Pr vi ko rak u ek spre si ji ge na, tran skrip ci ja DNA u RNA, pri mar na je ra zi na na ko joj se re gu li ra gen ska ek spre si ja i u pro ka riot skim i u eu ka riot skim sta ni ca ma. Mo le ku le RNA u eu ka riot skim sta ni ca ma nak nad no se mi je nja ju na raz li ~i te na- ~i ne − prim je ri ce, in tro ni se uk la nja ju prek ra ja njem − ~i me se pri mar ni prijepis pre vo di u svoj fun kcio nal ni ob lik. Raz li ~i te vr ste RNA ima ju raz li ~i te ulo ge u sta ni ca ma. Glas ni~ ke RNA (mR NA) slu ̀ e kao ka lu pi za sin te zu pro tei na; ribo- somne RNA (rR NA) i tran spor tne RNA (tR NA) dje lat ne su u pro ce su tran sla ci je mR NA. Dru ge ma le mo le ku le RNA slu ̀ e re gu la ci ji ge na, prek ra ja nju mR NA do- ra |i va nju tR NA te razvr sta va nju pro tei na u eu ka rio ta. U ovom po glav lju ra- zmat ra mo tran skrip ci ju i do ra du (engl. processing) RNA. Kraj nji ko rak u ek spre- si ji ge na, pre vo |e nje glas ni~ ke RNA u pro tein, raz mat ra mo u 7. pog lav lju.

Tran skrip ci ja u pro ka rio ta Kao u ve }i ni pod ru~ ja mo le ku lar ne bio lo gi je, stu di je na E. co li osi gu ra le su mo- del za kas ni ja is tra ̀ i va nja tran skrip ci je u eu ka riot skim sta ni ca ma. Ka ko je re ~e- no u 3. pog lav lju, mR NA je pr vot no ot kri ve na u E. co li. Ta ko |er, E. co li je pr vi or ga ni zam iz ko je ga je izo li ra na i prou ~a va na RNA-po li me ra za. Os nov ni me ha- niz mi s po mo }u ko jih je tran skrip ci ja re gu li ra na ras vi jet lje ni su na sli ~an na ~in pio nir skim po ku si ma na E. co li. U tim je po ku si ma po ka za no da re gu li ra na gen- ska ek spre si ja omo gu }u je sta ni ci da od go vo ri na prom je ne u oko li ni, prim je ri ce na ne dos ta tak hra nji vog sas toj ka. Ra zu mi je va nje tran skrip ci je u E. co li omo gu }i-

232 Poglavlje 6

Sli ka 6-1. RNA-po li me ra za iz E. co li. En zim se sas to ji iz 6 pod je di ni ca: dvi je α, jed ne β, jed ne β’, jed ne ω i jed ne σ. Pod je di ni ca σ re la tiv no je sla bo ve za na i mo ̀ e di so ci ra ti od os ta lih pet pod je di ni- ca ko je ~i ne sr` po li me ra ze.

bβ'

a a

s

w

+1–10

mjesto zapo~injanja transkripcije

–35

AA ACG TT ATTT A TT TGC AA TAAA T

Sli ka 6-2. Promotorski slje do vi E. co li. Zna~ajku E. co li pro mo to ra pred stav lja ju dva ni za slje do va smje{ te nih 10 i 35 pa ro va baza uz vod no od po ~et nog mjes ta za tran skrip ci ju (+1). Usug la {e ni slje do vi po ka zu- ju da su u skla du s naj ~e{ }e na |e nim ba za ma u raz li ~i tim pro mo to ri ma.

lo je prou ~a va nje mno go slo ̀ e ni jih me ha ni za ma ko ji re gu li ra ju tran skrip ci- ju u eu ka riot skim sta ni ca ma.

RNA-po li me ra za i tran skrip ci ja Enzim od go vo ran za sin te zu RNA je st RNA-po li me ra za ko ja ka ta li zi ra po li- me ri za ci ju ri bo nuk leo zi d-5'-tri fos fa ta (NTP) us mje re nu ka lu pom DNA. Sin- te za je RNA sli~ na sin te zi DNA; sli~ no DNA-po li me ra zi, RNA-po li me ra za ka ta li zi ra ra st lanca RNA uvi jek u smje ru 5' pre ma 3'. Me|utim, za raz li ku od DNA-po li me ra ze, RNA-po li me ra za ne tre ba prip rem lje nu kli cu za za po- ~i nja nje (ini ci ja ci ju) sin te ze RNA. Um jes to to ga, tran skrip ci ja za po ~i nje de no vo na spe ci fi~ nim mjes ti ma na po ~et ku ge na. Pro ces za po ~i nja nja po se bi- ce je va ̀ an jer je to zna ~aj na ra zi na na ko joj se re gu li ra tran skrip ci ja.

RNA-po li me ra za, sli~ no kao i DNA-po li me ra za, slo ̀ en je en zim ko ji se sas to ji od vi {e po li pep tid nih la na ca. Bak te rij ski en zim sas tav ljen je iz pet raz li ~i tih pod je di ni ca, naz va nih a, b, b', w i s (sli ka 6-1.). s pod je di ni ca je re- la tiv no sla bo ve za na i mo ̀ e se raz dvo ji ti od os ta lih pet pod je di ni ca, da ju }i sr` en zi ma na ~i nje nu od dvi je a, jed ne b, jed ne b' i jed ne w pod je di ni ce. Sr` po li me ra ze pot pu no je spo sob na ka ta li zi ra ti po li me ri za ci ju NTP u RNA, {to upu }u je na to da s pod je di ni ca ni je pot reb na za os nov nu ka ta li ti- ~ku ak tiv no st en zi ma. Me |u tim, sr` en zi ma ne mo ̀ e se spe ci fi~ no ve za ti na slje do ve DNA, {to je po ka za telj nor mal ne ini ci ja ci je tran skrip ci je, sto ga je s pod je di ni ca pot reb na za ut vr |i va nje is prav nih mjes ta za za po ~i nja nje tran skrip ci je. Iz bor je tih mjes ta kri ti~ ni dio tran skrip ci je, jer sin te za fun k- cio nal ne RNA mo ra za po ~e ti na po ~et ku ge na.

Slijed DNA na ko ji se ve ̀ e RNA-po li me ra za ka ko bi za po ~e la tran skrip ci- ju ge na na zi va se pro mo tor. Slje do vi DNA uk lju ~e ni u pro mo tor sku fun kci- ju naj pri je su ut vr |e ni us po red bom nuk leo tid nih slje do va ni za raz li ~i tih ge na izo li ra nih iz E. co li. Us po red be su po ka za le da pod ru~ ja uz vod no od mjes ta za po ~i nja nja tran skrip ci je sad r ̀ avaju dvi je sku pi ne slje do va ko je su sli ~ne u mno gim ge ni ma. Sva ki od tih za jed ni~ kih slje do va sas to ji se od {e st nuk leo ti da i smje{ ten je oko 10 i 35 baz nih pa ro va uz vod no od po ~et- nog tran skrip cij skog mjes ta (sli ka 6-2). Oni se na zi va ju −10 i −35 di je lo vi, oz na ~u ju }i nji ho vu po zi ci ju u od no su na po ~et no tran skrip cij sko mjes to ko je je de fi ni ra no kao +1. Slje do vi na −10 i −35 po zi ci ji u raz li ~i tim pro mo- to ri ma ni su jed na ki, ali su svi do volj no sli~ ni da se pos ta vi usug la {e ni sli jed − naj ~e {}e na |e ne ba ze na sva koj po zi ci ji.

Ne ko li ko vr sta ek spe ri men tal nih do ka za pot vr |u ju fun kcio nal nu va- `nost −10 i −35 pro mo tor skih di je lo va. Pr vo, ge ni s pro mo to ri ma ko ji se raz- li ku ju od usug la {e nih slje do va prepisuju se ma nje u~in ko vi to od ge na ~i ji se pro mo to ri mno go bo lje po du da ra ju s usug la {e nim slje do vi ma. Dru go, mu ta ci je uve de ne bi lo u −10 bi lo u −35 usug la {e ne slje do ve ima ju ja ke u~in- ke na pro mo tor sku fun kci ju. Tre }e, mjes ta na ko ji ma se RNA-po li me ra za ve ̀ e na pro mo to re iz rav no su ut vr |e na po ku si ma otis ka sto pa la (engl. foot- print), ko ji se uo bi ~a je no ko ris te za ut vr |i va nje mjes ta na ko ji ma se pro tei ni

Sinteza i dorada RNA 233

Sli ka 6-3. DNA oti sak sto pa la. Uzo rak ko ji sad r ̀ ava frag men te DNA ra dioak tiv no oz na ~e ne na jed nom kra- ju po di je ljen je u dva di je la, a jed na po lo vina uzor ka in ku bi ra na je s pro tei- ni ma ko ji se ve ̀ u na spe ci fi~ ne slje do ve unu tar frag men ta DNA. Oba se uzor ka po tom raz gra |u ju DNa zom pod tak vim uv je ti ma da DNa za uvo di pros je~ no je- dan rez po mo le ku li. Dio DNA ve zan na pro tein za{ ti }en je od raz grad nje DNa zom. Kom plek si DNA-pro tein se de na tu ri ra ju, a ve li ~i na ra dioak tiv no- oz na ~e nih frag me na ta nas ta lih dje lo va- njem DNa ze ana li zi ra na je elek tro fo re- zom. Frag men ti DNA nas ta li ki da njem DNa zom unu tar pod ru~ ja za{ ti }e nog ve za njem pro tei na na DNA ne dos ta ju u uzor ku DNA ko ji je in ku bi ran s pro- tei nom.

radioaktivno ozna~ivanje

protein

inkubacija s proteinom

razgradnja DNazom

elektroforeza autoradiografija

podru~je DNA za{ti}eno

vezanjem proteina

razgradnja DNazom

protein vezan na specifi~ni slijed DNA

inkubacija bez proteina

fragment DNA

razdioba uzorka

denaturacija

ve ̀ u na DNA (sli ka 6-3). U po ku si ma te vr ste, ulo mak DNA ra dioak tiv no je oz na ~en na jed nom kra ju. Oz na ~e na DNA in ku bi ra se s pro tei ni ma ko ji se is pi tu ju (prim je ri ce RNA-po li me ra za) i nak nad no djelomi~no raz gra |u je DNa zom. Na ~e lo je me to de da su pod ru~ ja DNA na ko ja se ve zao pro tein za{ ti }e na od raz grad nje DNa zom. Sto ga se ta pod ru~ ja mo gu ut vr di ti us po- red bom raz grad nih pro du ka ta DNA na ko ju su se ve za li pro tei ni, s iden ti- ~nim pa ra lel nim uzor kom DNA ko ja ni je bi la in ku bi ra na s pro tei ni ma. Va ri- ja ci je ove os nov ne me to de, ko ja ko ris ti ke mij ske rea gen se za mo di fi ka ci ju i raz grad nju DNA na od re |e nim nuk leo ti di ma, mo gu se ko ris ti ti za ut vr |i- va nje spe ci fi~ nih ba za na DNA ko je su u kon tak tu s pro tei nom. Ana li za otis ka sto pa la po ka za la je da se RNA-po li me ra za op }e ni to ve ̀ e na pro mo to-

234 Poglavlje 6

– 10

–35

promotor specifi~no vezanje s podjedinice na –35 i –10 promotorske sljedove

polimeraza nespecifi~no vezana na DNA

–10 +1

– –

razmotavanje DNA oko inicijacijskoga mjesta

otvoreni promotorski kompleks

inicijacija transkripcije

+1

otpu{tanje s podjedinice

1+

produljenje lanca RNA+1

+1+1

Sli ka 6-4. Tran skrip ci ja po li me ra zom iz E. co li. U po ~et ku se po li me ra za ve ̀ e nes pe ci fi- ~no na DNA i kre }e po mo le ku li sve dok se σ pod je di ni ca ne ve ̀ e na −35 i −10 pro mo tor ske ele men te, stva ra ju }i zat vo- re ni pro mo tor ski kom ple ks. Po li me ra za po tom raz ma ta DNA oko ini ci ja cij skog mjes ta, a tran skrip ci ja za po ~i nje po li me- ri za ci jom slo bod nih NTP. σ pod je di ni ca po tom di so ci ra od sr ̀ i po li me ra ze, ko ja se kre }e du` DNA i pro du lju je ras tu }i la nac RNA.

re u pod ru~ ju od oko 60 pa ro va baza ko ji se pro te ̀ u od − 40 do + 20 (od 40 nuk leo ti da uz vod no do 20 nuk leo ti da niz vod no od po ~et noga tran skrip cij- skoga mjes ta). Pod je di ni ca σ spe ci fi~ no se ve ̀ e na slje do ve u oba −35 i −10 pro mo tor ska pod ru~ ja, pot krjep lju ju }i va` no st tih slje do va u pro mo tor skoj fun kci ji. Do dat no, ne ki E. co li pro mo to ri ima ju tre }i sli jed smje{ ten uz vod- no od –35 pod ru~ ja ko ji slu`i kao specifi~no vezno mjesto za a-podjedinicu RNA-po li me ra ze.

Sinteza i dorada RNA 235

Sli ka 6-5. Struk tu ra bak te rij ske RNA-po li me ra ze. α pod je di ni ce po li me ra ze obo je ne su tam no ze le no i svi jet lo ze le no, β pla vo, β' ru ̀ i ~as to i ω `u to. (Lju baz no{ }u Set ha Dar sta, Sveu ~i li{ te Roc ke fel ler)

U od sut nos ti σ pod je di ni ce, RNA-po li me ra za ve ̀ e se nes pe ci fi~ no i s ni- skim afi ni te tom na DNA. Ulo ga σ pod je di ni ce sas to ji se u usmjerava nju po- li me ra ze k pro mo to ri ma spe ci fi~ nim ve zi va njem na oba sli je da, –35 i −10, do vo de }i do za po ~i nja nja tran skrip ci je na po ~et ci ma ge na (sli ka 6-4). Po ~e- tno ve zi va nje iz me |u po li me ra ze i pro mo to ra naz va no je zat vo re nim pro- mo tor skim kom plek som bu du }i da DNA ni je od mo ta na. Po li me ra za po tom od mo ta va 14 ba za DNA, od −12 do +2, stva ra ju }i ot vo re ni pro mo tor ski kom ple ks u ko je mu jed no lan ~a na DNA slu ̀ i kao ka lup za tran skrip ci ju. Tran skrip ci ja za po ~i nje po ve zi va njem dva ju slo bod nih NTP. Na kon ugra- dnje pr vih de set nuk leo ti da, s pod je di ni ca os lo ba |a se s po li me ra ze ko ja ostav lja pro mo tor i kre }e se du` ka lu pa DNA da bi nas ta vi la pro du lje nje (elon ga ci ju) ras tu }e ga lan ca RNA.

Tijekom pro du lje nja, po li me ra za os ta je zdru ̀ e na s ka lu pom nas tav lja ju- }i sin te zu mR NA. Ka ko se ona kre }e du` ka lu pa DNA, po li me ra za od mo ta- va ka lup is pred se be, a smo ta va ga iza se be, od r ̀ a va ju }i od mo ta no pod ru- ~je od oko 15 pa ro va baza u di je lu ko ji se pre pi su je. Vi so ko-raz lu ~u ju }a struk tur na ana li za bak te rij ske RNA-po li me ra ze uka zu je da b i b' podje- dinice tvo re struk tu ru sli~ nu ra ko vim {ti palj ka ma ko ja ~vr sto dr ̀ i DNA ka- lup (sli ka 6-5). Unu tar nji `li jeb iz me |u b i b' pod je di ni ca mo ̀ e primiti 20 pa ro va baza DNA i sad r ̀ ava ak tiv no mjes to po li me ra ze.

Sin te za RNA nas tav lja se sve dok po li me ra za ne nai |e na ter mi na cij ski znak, na tom se mjes tu zaus tav lja tran skrip ci ja, RNA se os lo ba |a s po li me- ra ze, a en zim di so ci ra s DNA ka lu pa. Naj jed nos tav ni ji i naj ~e{ }i ter mi na cij- ski sig nal u E. co li sas to ji se od si met ri~ no ob r nu tog po nav lja nja sli je da bo- ga tog GC ba za ma iza ko je ga sli je di ~e ti ri ili vi {e A ba za (sli ka 6-6). Tran skri- pci ja GC-bo ga tog ob r nu to-si met ri~ nog po nav lja nja do vo di do stva ra nja seg men ta RNA ko ji mo ̀ e tvo ri ti sta bil ne struk tu re peteljka-om~a kom ple- men tar nim spa ri va njem ba za. Nas ta nak tak vih struk tu ra u RNA, ko je su sa me se bi kom ple men tar ne, ras ki da aso ci ja ci ju RNA s DNA-ka lu pom i zaus tav lja tran skrip ci ju. S ob zi rom na to da su vo di ko vi mos to vi iz me |u A i U sla bi ji ne go iz me |u G i C, pri sut no st A ba za niz vod no od ob r nu to-po- nav lja ju }e ga sli je da pro mi ~e di so ci ja ci ju RNA s DNA-ka lu pa. Dru ge vr ste ter mi na cij skih sig na la, i u pro ka riot skim i u eu ka riot skim sta ni ca ma, pri je ovi se o ve zi va nju pro tei na ko ji zaus tav lja ju tran skrip ci ju na spe ci fi~ nim slje do vi ma DNA, ne go o nas tan ku struk tu re peteljka-om~a u RNA.

236 Poglavlje 6

U U U U

A

T

A

T

DNA

RNA

G C

G C

C

G C

GC

GC

GC

GC

GC

U

U A A

5'

5'

5'

3'

3'

5' A

T

A

TG

C

G

CG

C

G

C G

C G

C G

GG

C

G

C

G

CG

C

C

G

C G

C G

C

C

G

C G

C A

T A

TG

C

G

C

G

C

G

C

A

TA

T

G

C

A

T

G

C

G

C

A

T

A

T

A

T

A

T

G

C

G

C

AT

G C C

G

C

G C

C

A U GGC G C U U U U

OH 3'5'

A

T

A

T

DNA

3'

3'

5' A

T

A

TG

C

G

CG

C

G

C G

C G

C G

C

G

C

G

CG

C

G

C G

C G

CG

C G

C A

TA

TG

C

G

CG

C

G

C A

TA

T

G

C

A

T

G

C

G

C

A

T

A

T

A

T

A

T

G

C

G

C

stvaranje peteljka-om~a

disocijacija RNA s kalupa DNA

Sli ka 6-6. Ter mi na ci ja tran skrip ci je. Ter mi na ci ja tran skrip ci je sig na li zi ra na je ob r nu tim po nav lja nji ma bo ga tim GC iza ko jih sli je de ~e ti ri A os tat ka. Ob r nu- ta po nav lja nja stva ra ju sta bil ne pe telj- ka-om ~a struk tu re u RNA, uz ro ku ju }i di so ci ja ci ju RNA s ka lu pa DNA.

CH2OH

H OHO

HO

OH

OH

O

CH2OH

H

OH

OH

OH O

CH2OH

H

OH

OH

OH

+

O

HO

CH2OH

H

OH

OH

OH O

b-galaktozidaza

galaktoza

glukoza

laktoza

Sli ka 6-7. Me ta bo li zam lak to ze. β-galaktozidaza ka ta li zi ra hid ro li zu la- kto ze na glu ko zu i ga lak to zu.

Rep re so ri i ne ga tiv na kon tro la tran skrip ci je Pe de se tih go di na pro{ lo ga sto lje }a Fra nçois Ja cob i Ja cques Mo nod iz ve li su pio nir ska is tra ̀ i va nja re gu la ci je ge na u E. co li. Ovi is tra ̀ i va ~i za jed no sa svo jim su rad ni ci ma ana li zi ra li su ek spre si ju en zi ma dje lat nih u me ta bo li- zmu lak to ze ~i ji se raz grad ni pro duk ti, glu ko za i ga lak to za, mo gu ko ris ti ti kao iz vor ug lji ka i ener gi je (sli ka 6-7). En zim ko ji ka ta li zi ra raz grad nju la- kto ze (b-galaktozidaza), kao i os ta li en zi mi dje lat ni u me ta bo liz mu lak to ze, ek spri mi ra ni su sa mo ako je lak to za na ras po la ga nju bak te ri ja ma. Ina ~e, sta- ni ca je spo sob na ra cio nal no gos po da ri ti ne ula ̀ u }i ener gi ju u sin te zu RNA i pro tei na ko ji joj ni su pot reb ni. Ta ko lak to za in du ci ra sin te zu en zi ma ko ji sud je lu ju u nje zi nom vlas ti tom me ta bo liz mu. Osim b-galaktozidaze, za me- ta bo li zam lak to ze pot reb ni su pro duk ti dva ju dru gih ge na ko ji su us ko po- ve za ni: per mea za, ko ja tran spor ti ra lak to zu u sta ni cu i tran sa ce ti la za, ~i ja je za da }a inak ti vi ra ti tok si~ ne tio ga lak to zi de ko ji se sku pa s lak to zom trans- por ti ra ju u sta ni cu s po mo }u per mea ze. Na os no vi ~is to ge ne ti~ kih po ku sa, Ja cob i Mo nod de du ci ra li su me ha ni zam ko jim je re gu li ra na ek spre si ja ovih ge na, pos tav lja ju }i mo del fun da men ta lan za ra zu mi je va nje re gu la ci je trans- krip ci je.

Prvi korak u ana li zi bi la je izo la ci ja mu tan ti s de fek tnom re gu la ci jom ge- na va` nih za me ta bo li zam lak to ze. Izo li ra ne su dvi je vr ste mu tan ti: kon sti- tu tiv ne mu tan te ko je ek spri mi ra ju sva tri ge na i u od sut nos ti lak to ze i nein- du ci bil ne mu tan te ko je ne ek spri mi ra ju ove ge ne ni u pri sut nos ti lak to ze. Ge ne ti~ kim ma pi ra njem ovih mu tan ti lo ka li zi ra na su dva od vo je na mjes ta, naz va na o i i, a o je smje{ te n ne pos red no uz vod no od struk tur no ga ge na za b-galaktozidazu. Gen ske prom je ne (mu ta ci je) ko je po ga |a ju o do vo de do kon sti tu tiv ne ek spre si je, a mu ta ci je ve za ne uz i ili do kon sti tu tiv ne ili do nein du ci bil ne ek spre si je.

Fun kci je ovih re gu la tor nih ge na is pi ta ne su po ku si ma s dva bak te rij ska so ja, ko ji me |u sob nim spajanjem da ju dip loid ne sta ni ce {to sad r ̀ avaju ge- ne obaju ro di te lja (sli ka 6-8). Ana li za ek spre si je ge na u tak vim dip loid nim

Sinteza i dorada RNA 237

roditeljske bakterije

inducibilne konstitutivne

Oboje, 2

inducibilne 2 konstitutivno

inducibilne konstitutivne

diploidi

i + o+ z1

i+ o+ z1

io+ z 2 i + o+ z1 i + oc z 2

io z2

i+ o+ z1

i+ oc z2

Sli ka 6-8. Re gu la ci ja b-galaktozi- daze u dip loid nim E. co li. Spariva njem dvaju bak te rij skih ro dova nas ta ju dip loid ne sta ni ce ko je sad r- `avaju ge ne oba ju ro di te lja. U tim prim- je ri ma pret pos tav lje no je da se ge ni ko ji ko di ra ju b-galaktozidazu (z ge ni) mo gu raz li ko va ti na os no vi struk tur nih gen- skih mu ta ci ja, oz na ~e nih z1 i z2. U i−/i+ dip loi du (li je vo), oba su struk tur na ge na in du ci bil na; sto ga, i+ je do mi nan tna nas- pram i− i ut je ~e na ek spre si ju z ge na na oba kro mo so ma. Sup rot no to me, u oc/o+ dip loi du (des no), z gen ve zan na oc kon- sti tu tiv no je ek spri mi ran, dok je z gen ve zan na o+ in du ci bi lan. Ta ko, o ut je ~e na ek spre si ju sa mo sus jed noga z ge na na is tom kro mo so mu.

bak te ri ja ma da la je kri ti~ ki uvid i de fi ni ra la ko ji je alel re gu la tor nih ge na do mi nan tan, a ko ji re ce si van. Prim je ri ce, ako se bak te ri je s nor mal nim i ge- nom (i+) spare s bak te ri ja ma no si te lji ma mu ta ci je u i ge nu koja ima za po- slje di cu kon sti tu tiv nu ek spre si ju (i− mu ta ci ja) nas ta le dip loid ne bak te ri je po ka zu ju nor mal nu in du ci bil no st. Sto ga je nor mal ni i+ gen do mi nan tan nad mu ti ra nim i−. Na sup rot to mu, spariva nje nor mal nih bak te ri ja s bak te ri- ja ma no si te lji ma oc mu ta ci je (kon sti tu tiv na ek spre si ja) da je dip loi de s kon- sti tu tiv nom ek spre si jom, {to upu }u je na to da je oc do mi nan tan nad o+. Do- dat ni po ku si u ko ji ma su mu ti ra ni o i i kom bi ni ra ni s raz li ~i tim mu ta ci ja ma u struk tur nim ge ni ma po ka za li su da o ut je ~e na ek spre si ju sa mo onih ge- na s kojima je fi zi~ ki po ve za n, dok i ut je ~e na ek spre si ju ge na na ob je ma kro mo som skim ko pi ja ma u dip loid nim bak te ri ja ma. Ta ko su u oc/o+ sta ni ci sa mo oni struk tur ni ge ni koji su po ve za ni s oc kon sti tu tiv no ek spri mi ra ni. Na sup rot to mu, u i+/ i− sta ni ci, struk tur ni ge ni na oba kro mo so ma nor mal- no su re gu li ra ni. Ti su re zul ta ti do ve li do zak lju~ ka da o pred stav lja pod ru- ~je DNA ko je kon tro li ra tran skrip ci ju sus jed nih ge na, a i gen ko di ra re gu la- tor ni fak tor (pro tein) ko ji mo ̀ e di fun di ra ti kroz ci je lu sta ni cu i kon tro li ra ti ge ne na oba kro mo so ma.

Mo del gen ske re gu la ci je pos tav ljen na te me lju ovih po ku sa ilus tri ra sli- ka 6-9. Ge ni za b-galaktozidazu, per mea zu i tran sa ce ti la zu ek spri mi ra ni su kao jed na je di ni ca naz va na ope ron. Tran skrip ci ja ope ro na kon tro li ra na je ge nom o (ope ra tor) smje{ te nim u neposrednom sus jed stvu mjes ta po~etka tran skrip ci je. Gen i ko di ra pro tein ko ji ve zi va njem na ope ra tor kon tro li ra tran skrip ci ju. S ob zi rom na to da su i− mu tan te (koje do vo de do kon sti tu tiv- ne ek spre si je) re ce siv ne, zak lju ~e no je da te mu tan te ne mo gu stva ra ti funk- cio nal ni gen ski pro du kt. Taj re zul tat po ka zu je da je nor mal ni pro du kt i ge- na rep re sor koji spr je ~a va tran skrip ci ju ve za njem na o. Pri sut no st lak to ze iza zi va in duk ci ju ope ro na jer se lak to za ve ̀ e na rep re sor, spr je ~a va ju }i ta- ko nje go vo ve zi va nje na ope ra tor sku DNA. U nein du ci bil nih i mu tan ti (ko- je su do mi nan tne nad i+), rep re sor se ne mo`e vezati na lak to zu, pa se ni ope ron ne mo ̀ e in du ci ra ti.

Mo del dos tat no od go va ra re zul ta ti ma ge ne ti~ kih po ku sa iz ko jih je po- stav ljen. U i− sta ni ca ma, rep re sor se ne stva ra, ta ko da je lac ope ron kon sti tu- tiv no ek spri mi ran. Dip loid ne i+/ i− sta ni ce nor mal no su in du ci bil ne, s ob zi- rom na to da je fun kcio nal ni rep re sor ko di ran i+ alelom. Ko na~ no, u oc mu- tan ti ne pos to ji fun kcio nal ni ope ra tor te sto ga rep re sor ne mo ̀ e bi ti ve zan. Suk lad no to me, oc mu tan te su do mi nan tne, ali ut je ~u na ek spre si ju sa mo onih struk tur nih ge na ko ji su s nji ma fi zi~ ki po ve za ni.

238 Poglavlje 6

i y 5'

3'

3'

5'

z a

P

o

represor

laktoza

sprije~ena transkripcija

lac mRNA

i y 5'

3'

3'

5'

z a

neaktivni represor

P

Pol

o

Pol

Sli ka 6-9. Ne ga tiv na kon tro la lac ope ro na. i gen ko di ra rep re sor ko ji se, u od sut no- sti lak to ze (vrh), ve ̀ e na ope ra tor (o) i in- ter fe ri ra s ve zi va njem RNA-po li me ra ze na pro mo tor, blo ki ra ju }i tran skrip ci ju tri struk tur na ge na (z, b-galaktozidaze; y, per mea ze; a, tran sa ce ti la ze). Lak to za in du ci ra ek spre si ju ope ro na ve zi va- njem na rep re sor (dno slike) {to spr je- ~a va rep re sor da se ve ̀ e na ope ra tor. P – pro mo tor; Po l – po li me ra za.

Mno gi po ku si pot vr di li su ovaj te melj ni mo del, uk lju ~u ju }i i pokuse izo- la ci je lac rep re so ra i ana li ze nje go va ve za nja na ope ra tor sku DNA, koje je proveo Walter Gilbert {ez de se tih go di na pro{ lo ga sto lje }a. Mo le ku lar nom ana li zom de fi ni ra na je ope ra tor ska DNA kao dva de se tak pa ro va baza smje{ te nih ne ko li ko ba za is pred ini ci ja cij sko ga mjes ta tran skrip ci je. Ana li- zom otis ka sto pa la iden ti fi ci ra no je to pod ru~ je kao mjes to na ko je se ve ̀ e rep re sor spr je ~a va ju }i tran skrip ci ju ti me {to onemogu}ava s ve za njem RNA-po li me ra ze na pro mo tor. Kao {to je pred vi |e no, lak to za se ve ̀ e na rep re sor koji se tada vi{e ne mo`e vezati na operatorsku DNA. Tako|er, kao {to je predvi|eno, oc mutacije mjenjaju slijed nukleotida u operatoru i tako onemogu}uju vezanje represora {to rezultira konstitutivnom ekspresijom gena.

Sre di{ nji je prin cip re gu la ci je ge na, pro tu ma ~en na prim je ru lak to za ope- ro na, da je kon tro la tran skrip ci je pos re do va na in te rak ci jom re gu la tor nih pro tei na sa spe ci fi~ nim slje do vi ma DNA. Ovaj op }i na ~in re gu la ci je {i ro ko je prim je njiv i kod pro ka riot skih i kod eu ka riot skih sta ni ca. Re gu la tor ni slje- do vi po put ope ra to ra na zi va ju se cis-dje lu ju }i kon trol niele men ti, s ob zi- rom na to da ut je ~u na ek spre si ju sa mo onih ge na ko ji su ve za ni na is tu mo le ku lu DNA. S dru ge stra ne, pro tei ni po put rep re so ra, na zi va ju se tra ns- dje lu ju }i faktori, jer mo gu ut je ca ti na ek spre si ju ge na smje{ te nih na dru- gim kro mo so mi ma u sta ni ci. Lac ope ron je prim jer ne ga tiv ne kon tro le, jer ve za nje rep re so ra spr je ~a va tran skrip ci ju. Me |u tim, to ni je uvi jek slu ~aj; mno gi tra ns-djeluju}i faktori pri je su ak ti va to ri ne go in hi bi to ri tran skrip- cije.

Po zi tiv na kon tro la tran skrip ci je Naj bo lje is tra ̀ en prim jer po zi tiv ne kon tro le u E. co li je st ut je caj glu ko ze na ek spre si ju ge na ko ji ko di ra ju en zi me dje lat ne u raz grad nji (ka ta bo liz mu) dru gih {e }e ra (uk lju ~u ju }i lak to zu), koji pred stav lja ju al ter na tiv ni iz vor uglji ka i ener gi je. Prio ri tet no se ko ris ti glu ko za, ta ko da dok je glu ko za na ras po la ga nju, en zi mi dje lat ni u ka ta bo liz mu al ter na tiv nih iz vo ra ener gi je ni su ek spri mi ra ni. Prim je ri ce, ako E. co li ras te u me di ju ko ji sad r ̀ ava i glu ko- zu i lak to zu, lac ope ron se ne in du ci ra, a bak te ri je ko ris te sa mo glu ko zu. Ta- ko glu ko za gu {i lac operon ~ak i u pri sut nos ti nor mal nog in duk to ra (lak to- ze).

Da nas je poz na to da je rep re si ja glu ko zom (op }e ni to naz va no rep re si ja ka ta bo li tom) pos re do va na po zi tiv nim kon trol nim sus ta vom, ko ji je po ve-

Sinteza i dorada RNA 239

niska razina glukoze

P iP

adenil-ciklaza

cAMP +

cAMP

CAP

z

P

o

Pol

cAMP

CAP

Sli ka 6-10. Po zi tiv na kon tro la lac ope ro na glu ko zom. Nis ka ra zi na glu ko ze ak ti vi ra ade ni lil-cik la zu ko ja pre vo di ATP u cik li~ ki AMP (cA MP). Cik li~ ki AMP ve ̀ e se po tom na ka ta bo li~ ki ak ti va tor ski pro tein (CAP) ~i me sti mu li ra nje go vo ve za nje na re gu la tor ne slje do ve mno gih ope ro na po ve za nih s me- ta bo liz mom al ter na tiv nih {e }e ra, kao {to je lak to za. CAP stu pa u in te rak ci ju s α pod- je di ni com RNA-po li me ra ze olak {a va ju }i ta ko ve za nje po li me ra ze za pro mo tor.

zan s ra zi nom cik li~ kog AMP (cA MP) (sli ka 6-10). En zim ade ni l-cik la za, ko ji pre vo di ATP u cA MP, u bak te ri ja ma je re gu li ran ta ko da pad ra zi ne glu ko ze iza zi va po ra st cA MP. cA MP se po tom ve ̀ e na pro tein ko ji re gu li ra tran skrip- ci ju, naz van ka ta bo li~ ki ak ti va tor ski pro tein (CAP). Ve zi va nje cA MP sti mu li- ra ve zi va nje CAP na cilj ni sli jed DNA u lac operonu smje{ ten oko 60 ba za uz vod no od po ~et nog mjes ta tran skrip ci je. CAP za tim stu pa u in te rak ci ju s α pod je di ni com RNA-po li me ra ze, pro mi ~u }i ve zi va nje po li me ra ze na pro- mo tor i ak ti vi ra ju }i tran skrip ci ju.

Eu ka riot ske RNA-po li me ra ze i tran skrip cij ski fak to ri Ia ko se tran skrip ci ja u svim sta ni ca ma od vi ja po is tom te melj nom me ha ni- zmu, u eu ka riot skim je sta ni ca ma taj pro ces znat no slo ̀ e ni ji ne go u bak te ri- ja ma. Dvi je su iz ra zi te raz li ke iz me |u pro ka riot skog i eu ka riot sko ga sus ta- va. Pr vo, dok se u bak te ri ja ma svi ge ni pre pi su ju po mo }u jed ne RNA-po li me ra ze, eu ka riot ske sta ni ce ima ju ne ko li ko raz li ~i tih RNA-po li me- ra za ko je pre pi su ju od re |e ne sku pi ne ge na. Dru go, eu ka riot ske RNA-po li- me ra ze ne ve ̀ u se iz rav no na pro mo tor ske slje do ve ne go tre ba ju in te rak ci- ju s ni zom do dat nih pro tei na da bi spe ci fi~ no za po ~e le tran skrip ci ju. Pretposta vlja se da to po ve }a va slo ̀ e no st eu ka riot ske tran skrip ci je, olak{ava so fis ti ci ra nu re gu la ci ju gen ske ek spre si je pot reb ne za us mje ra va- nje ak tiv nos ti ve li ko ga bro ja raz li ~i tih sta ni ca u vi {es ta ni~ nom or ga niz mu.

Eu ka riot ske RNA-po li me ra ze Eu ka riot ske sta ni ce ima ju tri raz li ~i te RNA-po li me ra ze, smje{ te ne u je-

zgri, ko je pre pi su ju raz li ~i te sku pi ne ge na (tab li ca 6-1). Ge ni ko ji ko di ra ju pro tei ne pre pi su ju se s po mo }u RNA-po li me ra ze II da ju }i mR NA, a ribo- somne (rR NA) i tran spor tne RNA (tR NA) pre pi su ju se RNA-po li me ra za ma I i III. RNA-po li me ra za I spe ci fi~ no je od re |e na za tran skrip ci ju tri ju naj ve- }ih vr sta rR NA oz na ~e nih kao 28S, 18S i 5,8S, u skla du s br zi nom nji ho ve se di men ta ci je. RNA-po li me ra za III pre pi su je ge ne za tR NA i za naj ma nju ribosomnu RNA (5S rR NA). Ne ke od ma lih RNA dje lat nih u prek ra ja nju RNA i pri je no su pro tei na (snR NA i scR NA) ta ko |er se pre pi su ju s po mo }u RNA-po li me ra ze III, dok su os ta li tran skrip ti nas ta li dje lo va njem po li me ra- ze II. Uz to, po seb ne RNA-po li me ra ze (sli~ ne bak te rij skim RNA-po li me ra za- ma) na la ze se u klo rop las ti ma i mi to hon dri ji ma, gdje spe ci fi~ no pre pi su ju DNA tih or ga ne la.

Sve su tri jez gri ne RNA-po li me ra ze slo ̀ e ni en zi mi ko ji se sas to je od 12 do 17 raz li ~i tih pod je di ni ca. Prem da pre poz na ju raz li ~i te pro mo to re i pre pi- su ju raz li ~i te sku pi ne ge na, po ne kim su svoj stvi ma me |u sob no sli~ ne pa ~ak i s bak te rij skom RNA-po li me ra zom. Po se bi ce, sve tri RNA-po li me ra ze sad r ̀ avaju de vet kon zer vi ra nih pod je di ni ca, od ko jih su pet sli~ ne a, b, b' i w pod je di ni ca ma bak te rij ske RNA-po li me ra ze. Ne dav no kris ta log raf sko od- re |i va nje struk tu re kva{ ~e ve RNA-po li me ra ze II po nov no je po ka za lo ka-

Vrsta RNA- sintetizirane RNA polimeraza nuklearni geni mRNA II tRNA III rRNA 5,8S, 18S, 28S I 5S III snRNA i scRNA II i IIIa

mitohondrijski geni mitohondrijskab

kloroplastni geni kloroplastnab

a Neke male nuklearne (sn) i male citoplazmat- ske (sc) RNA prepisuju se polimerazom II, a druge polimerazom III. b Mitohondrijske i kloroplastne RNA-polimer- aze sli~ne su bakterijskim enzimima.

Tablica 6-1. Skupine gena prepisanih eukariotskim RNA- polimerazama

240 Poglavlje 6

Sli ka 6-11. Struk tu ra kva{ ~e ve RNA-po li me ra- ze II. Pod je di ni ce su pri ka za ne u raz li ~i tim bo ja ma. (Od P. D. Kra mer i sur., 2001. Scien ce 292: 1863.)

ko je ar hi tek tu ra ove eu ka riot ske RNA-po li me ra ze vr lo sli~ na bak te rij skom en zi mu (sli ka 6-11), su ge ri ra ju }i da sve RNA-po li me ra ze ra be te melj ni kon- zer vi ra ni me ha ni zam za tran skrip ci ju DNA.

Transkripcijski fak to ri i za po ~i nja nje tran skrip ci je s po mo }u RNA-po li me ra ze II U `a ri{ tu ve }i ne stu di ja tran skrip ci je na la zi se RNA-po li me ra za II s ob zi- rom na to da je od go vor na za sin te zu mR NA ge na ko ji ko di ra ju pro tei ne. Ra ni po ku {a ji prou ~a va nja tog en zi ma po ka za li su da je nje go va ak tiv no st raz li ~i ta od pro ka riot ske RNA-po li me ra ze. To~ no pre pi si va nje bak te rij skih ge na, {to se mo ̀ e sav r {e no iz ves ti in vit ro jed nos tav nim do dat kom pro ~i {}e- ne RNA-po li me ra ze mo le ku li DNA ko ja sad r ̀ ava pro mo tor, ni je mo gu }e u eu ka riot skom sus ta vu. Os no va ove raz li ke utvr|e na je 1979. go di ne ka da je Ro be rt Roe der sa su rad ni ci ma ot krio da je RNA-po li me ra za spo sob na za po- ~e ti tran skrip ci ju sa mo ako su u reak ci ji pri sut ni do dat ni pro tei ni. Ta ko se ~i ni ka ko su za tran skrip ci ju u eu ka riot skom sus ta vu pot reb ni raz li ~i ti ini ci- ja cij ski fak to ri, ko ji (za raz li ku od bak te rij skih s fak to ra) ni su zdru ̀ e ni s po- li me ra zom.

Bio ke mij skim frak cio ni ra njem jez gri nog ek strak ta iden ti fi ci ra ni su spe ci- fi~ ni pro tei ni (naz va ni tran skrip cij ski fak to ri) ko ji su pot reb ni RNA-po li- me ra zi za za po ~i nja nje tran skrip ci je. Iden ti fi ka ci ja i ka rak te ri za ci ja ovih fak to ra pred stav lja naj ve }i dio nas to ja nja za ra zu mi je va njem tran skrip ci je u eu ka riot skim sta ni ca ma. Ut vr |e ne su dvi je os nov ne sku pi ne tran skrip cij- skih fak to ra. Op }i tran skrip cij ski fak to ri dje lat ni su u tran skrip ci ji svih pro mo to ra po li me ra ze II i ~i ne dio baz ne tran skrip cij ske ma {i ne ri je. Tran- skrip cij ski fak to ri spe ci fi~ ni za ge ne (raz mat ra ni da lje u ovom pog lav lju) ve ̀ u se na slje do ve DNA ko ji kon tro li ra ju ek spre si ju in di vi dual nih ge na pa su ta ko od go vor ni za gen sku ek spre si ju. Pro ci je nje no je ka ko oko 5% ge na ljud sko ga ge no ma ko di ra tran skrip cij ske fak to re, nag la {u ju }i zna ~e nje ovih pro tei na.

Za za po ~i nja nje tran skrip ci je RNA-po li me ra zom II u us pos tav lje nom (re- kon sti tui ra nom) in vit ro sus ta vu (sli ka 6-12) pot reb no je pet op }ih tran skrip- cij skih fak to ra. Pro mo to ri mno gih ge na ko ji se pre pi su ju RNA-po li me ra- zom II uk lju ~u ju sli jed sli ~an TATAA 25 do 30 nuk leo ti da uz vod no od po ~et-

Sinteza i dorada RNA 241

vezanje polimeraze i TFIIF

vezanje TFIIB

vezanje TFIID

polimeraza

TAF

TAF

TAF

TAF

TAF

TAF

TAF

TAF

TAF

TBP

TBP

B

TBP

F

TATAA

B

RNA

polimerazaTBP F

E

H

TAF

TAF

TAF

B

+1

CTD

vezanje TFIIE i TFIIH

Sli ka 6-12. Stva ra nje tran skrip cij sko ga kom plek sa po li me ra ze II. Mno gi pro mo to ri po li me ra ze II ima ju TA TA-slog (usug la {e ni sli jed TATAA) 25 do 30 nuk leo ti da uz vod- no od po ~et no ga mjes ta za tran skrip ci ju. Taj sli jed pre poz na je tran skrip cij ski fak tor TFIID ko ji se sas to ji od TA TA-vez no ga pro tei na (TBP) i fak to ra zdru ̀ e nih s TBP (TAF). TFIIB se po tom ve ̀ e na TBP, na kon ~e ga sli je di ve za nje po li me ra ze u aso ci ja ci ji s TFIIF. Na kra- ju se TFIIE i TFIIH prid ru ̀ u ju kom plek su.

no ga tran skrip cij skog mjes ta. Taj sli jed (naz- van TA TA-slog) na li ku je –10 sli je du u bak te rij- skim pro mo to ri ma, a re zul ta ti uvo |e nja mu ta- ci ja u TA TA-slog u po zo ri li su na nje go vu ulo gu u za po ~i nja nju tran skrip ci je. Pr vi je ko rak u nas tan ku tran skrip cij sko ga kom plek sa ve za- nje op }e ga tran skrip cij skog fak to ra naz va nog TFIID na TA TA-slog (TF oz na ~u je tran skrip cij- ski fak tor; II oz na ~u je po li me ra zu II). TFIID je i sam slo ̀ en od vi {e pod je di ni ca, kao {to su TBP, pro tein ko ji se specifi~no ve ̀ e na TA TA- slog i oko 10 po li pep ti da naz va nih fak to ri zdru ̀ e ni s TBP (TA F). Na kon ve zi va nja TFIID sli je di prid ru ̀ i va nje dru gog op }eg tran skrip- cij skog fak to ra (TFIIB) ko ji se ve ̀ e na TBP kao i na slje do ve DNA pri sut ne uz vod no od TA- TA-slo ga u ne kim pro mo to ri ma (sli ka 6-13). TFIIB slu ̀ i kao mo st za RNA-po li me ra zu II ko- ja se ve ̀ e na kom ple ks TBP-TFIIB zdru ̀ en s tre }im fak to rom, TFIIF.

Sli je de }i prid ru ̀ i va nje RNA-po li me ra ze II na pro mo tor, za ini ci ja ci ju tran skrip ci je pot reb- no je ve za nje dva ju do dat nih fak to ra (TFIIE i TFIIH). TFIIH se sas to ji iz vi {e pod je di ni ca, a ima dvi je va` ne ulo ge. Pr vo, dvi je su pod je di- ni ce TFIIH he li ka ze ko je od mo ta va ju DNA oko ini ci ja cij skog mjes ta. (Te pod je di ni ce TFIH je su XPB i XPD pro tei ni, pot reb ni za pop ra vak iz re zi va njem nuk leo ti da, ko ji je opisan u 5. po- glav lju) Dru ga je pod je di ni ca TFIIH protein- kinaza ko ja fos fo ri li ra po nav lja ne slje do ve pri- sut ne u pod ru~ ju C-kra ja naj ve }e pod je di ni ce RNA-po li me ra ze II. C-terminalni dio po li me- ra ze II (ili CTD) sas to ji se iz uzas top nih po na- vlja nja (27 po nav lja nja u kvas ca, a 52 u ~ov je- ka) od 7 ami no ki se li na s usug la {e nim sli je dom Tyr-Se r-Pro-Thr-Se r-Pro-Ser. Fos fo ri la ci ja ovih ami noki se li na os lo ba |a po li me ra zu iz nje zi na zdru ̀ e nja s prei ni ci ja cij skim kom ple ksom i vo- di do prid ru ̀ i va nja dru gih pro tei na ko ji do- pu{ ta ju po li me ra zi da za po~ ne trans krip ci ju te da lje sin te ti zi ra ras tu }i la nac mRNA.

242 Poglavlje 6

+1 –43

Sli ka 6-13. Mo del kom plek sa TBP-TFIIB ve za no ga na DNA. DNA je pri ka za na kao {ta pi}asta struk- tura koja se sa sto ji se od ̀ u to ga i ze le no- ga lan ca s po ~et nim mjes tom za tran- skrip ci ju oz na ~e nim +1. TBP se sas to ji od dvaju po nav lja nja obo je na svi jet lo- pla vo i tam nop la vo. TFIIB po nav lja nja obo je na su na ran ~as to i gri miz no. Va`- no je za mi je ti ti da ve za nje TBP sa vi ja DNA za oko 110°. ( Od D. B. Ni ko lov i sur., 1995. Na tu re 377: 119.)

Uz TA TA-slog pro mo to ri mno gih ge na ko ji se pre pi su ju RNA-po li me ra- zom II ima ju jo{ je dan va ̀ an ele me nt (ini ci ja tor, ili Inr sli jed) ko ji se pro te ̀ e unu tar po ~et no ga mjes ta za tran skrip ci ju. [to vi {e, ne ki pro mo to ri RNA-po- li me ra ze II sas to je se sa mo od Inr ele men ta, bez TA TA-slo ga. Mno gi pro mo- to ri ko ji ne sadr`ava ju TA TA-slog, a sadr`ava ju Inr ele me nt, ta ko |er ima ju jo{ je dan niz vod ni pro mo tor ski ele me nt (DPE) smje{ ten oko 30 pa ro va baz a niz vod no od po ~et no ga mjes ta za tran skrip ci ju ko ji koo pe ra tiv no funk cio ni ra s Inr sli je dom. Ini ci ja ci ja tih pro mo to ra zah tije va TFIID (i TBP), prem da TBP o~i to ne pre poz na je tak ve pro mo to re iz rav nim ve zi va njem na TA TA-slog. Um jes to to ga ~i ni se da se pod je di ni ce TFIID (TAF) ve ̀ u na Inr i DPE. Ve za nje TAF na ove ele men te prid ru ̀ u je TBP, TFIIB i po li me ra zu II pro mo to ru, na kon ~e ga se zdru ̀ u ju os ta li tran skrip cij ski fak to ri ka ko je ve} opi sa no. TBP ta ko ig ra sre di{ nju ulo gu u ini ci ja ci ji tran skrip ci je po li me ra- zom II, ~ak i ako pro mo to ri ne pos je du ju TA TA-slog.

Prem da ov dje opi sa no sek ven cij sko prid ru ̀ i va nje pet op }ih tran skrip cij- skih fak to ra i RNA-po li me ra ze II pred stav lja mi ni mal ni sus tav pot re ban za tran skrip ci ju in vit ro, u sta ni ci su pot reb ni do dat ni fak to ri. Oni obuh va }a ju pos red ni~ ki pro tein ski kom ple ks ko ji omo gu }u je da po li me ra za od go vo ri na tran skrip cij ske fak to re spe ci fi~ ne za ge ne ko ji re gu li ra ju gen sku ek spre si- ju. Naj ma nje je je dan dio RNA-po li me ra ze II u kvas ca i u sta ni ca ma si sa va- ca pri su tan u ob li ku ve li kog kom plek sa (naz van RNA-po li me ra za II ho loen- zim) u ko jem je po li me ra za zdru ̀ e na s pos red ni~ kim pro tei ni ma, kao i sa sku pi nom op }ih tran skrip cij skih fak to ra uk lju ~u ju }i TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Pos red ni~ ki su pro tei ni zdru ̀ e ni s do me nom na C-kra ju (CTD) po li- me ra ze II, a os lo ba |a ju se s po li me ra ze pra te }i zdru ̀ i va nje prei ni ci ja cij sko- ga kom plek sa i fos fo ri li ra nje po li me raz ne do me ne na C-kra ju (sli ka 6-14). Fos fo ri li ra na CTD po tom ve ̀ e os ta le pro tei ne ko ji pro mi ~u elon ga ci ju trans- krip cije i dje lu ju u pro ce su do ra de mR NA, {to }e mo pri ka za ti da lje u ovom pog lav lju.

Sinteza i dorada RNA 243

elongacijski i doradbeni faktori

polimeraza

polimeraza TBP

TBP

CTD

F

F

E

E

H

H

TAF

TAF

TAF

TAF

B

B

fosforiliranje CTD

inicijacija transkripcije

CTD

RNA

posrednik

posrednik

P

P P

P

rDNA

45S pre-rRNA

rRNAs

transkripcija

–150 +1

promotor 18S 5,8S 28S

18S 5,8S 28S

dorada

Sli ka 6-15. Ge ni za ri bo som nu RNA. Ri bo som na se DNA prepisuje da ju }i ve li ke mo le ku le RNA (45S pre-r R NA ko je se nak nad no ki da ju na 28S, 18S i 5,8S rR NA.

Sli ka 6-14. RNA-po li me ra za II/ posredni~ki kom ple ks. RNA-po li me ra za II zdru ̀ e na je s po- sred ni~ kim pro tei ni ma, kao i s op }im tran skrip cij skim fak to ri ma na pro mo- to ru. Pos red ni~ ki se kom ple ks ve`e na ne fos fo ri li ra ni CTD po li me ra ze II, a o slo ba |a se na kon fos fo ri li ra nja CTD kad je za po ~e ta tran skrip ci ja. Fos fo ri li- ra ni CTD po tom ve ̀ e elon ga cij ske i do- rad be ne fak to re ko ji olak {a va ju sin te zu i do ra du mR NA.

Tran skrip ci ja po li me ra zom I i III Ka ko je ra ni je raz mat ra no, raz li ~i te RNA-po li me ra ze od go vor ne su za trans- krip ci ju ge na ko ji ko di ra ju ribosomne i tran spor tne RNA u eu ka riot skim sta ni ca ma. Me |u tim, sve tri RNA-po li me ra ze tre ba ju do dat ne tran skrip cij- ske fak to re zdru ̀ e ne s od go va ra ju }im pro mo tor skim slje do vi ma. Na da lje, prem da tri raz li ~i te po li me ra ze u eu ka riot skim sta ni ca ma pre poz na ju raz li- ~i te vr ste pro mo to ra, ~i ni se da je tran skrip cij ski fak tor ko ji se ve ̀ e na TATA- slog (TBP) pot re ban za ini ci ja ci ju tran skrip ci je bi lo ko jim od tri en zi ma.

RNA-po li me ra za I posve}ena je is klju ~i vo tran skrip ci ji ge na za ribo- somne RNA, pri sut nih u uzas top nim po nav lja nji ma. Tran skrip ci jom tih ge- na nas ta je ve li ka 45S pre-r R NA ko ja do ra dom da je 28S, 18S i 5,8S rR NA (sli- ka 6-15). Pro mo tor ge na za ribosomne RNA obuh va }a oko 150 pa ro va baza ne pos red no uz vod no od ini ci ja cij sko ga mjes ta tran skrip ci je. Te pro mo tor-

244 Poglavlje 6

polimeraza I

+1

UBF

SL1

TBP

promotor rDNA

Sli ka 6-16. Ini ci ja ci ja tran skrip ci je rDNA. Dva tran skrip cij ska fak to ra, UBF i SL1, koo pe ra tiv no se ve ̀ u na pro mo tor rDNA i prid ru ̀ u ju RNA-po li me ra zu I stva ra ju }i ta ko ini ci ja cij ski kom ple ks. Jed na pod je di ni ca SL1 je TBP, prote in ko ji se ve`e na TATA-slog.

ske slje do ve pre poz na ju dva tran skrip cij ska fak to ra, UBF (fak tor ko ji se ve- `e uz vod no, en gl. up stream bin di ng fac tor) i SL1 (fak tor se lek ci je 1, en gl. se lec- ti vi ty fac tor 1), ko ji se koo pe ra tiv no ve ̀ u na pro mo tor a po tom im se prid ru- `u je po li me ra za I te time nas taje ini ci ja cij ski kom ple ks (sli ka 6-16). SL1 tran skrip cij ski fak tor sas to ji se od ~e ti ri pod je di ni ce, a jed na od njih je TBP. Ulo ga TBP iz rav no je po ka za na na la zom da su kvas ci no si te lji mu ta ci je u TBP de fek tni ne sa mo u tran skrip ci ji ge na po li me ra zom II, ne go i u trans- krip ci ji ge na po li me ra zama I i III. Ta ko je TBP za jed ni~ ki tran skrip cij ski fak- tor pot re ban za sve tri vr ste eu ka riot skih RNA-po li me ra za. S ob zi rom na to da ge ni ko ji ko di ra ju ribosomne RNA ne ma ju TA TA-slog, TBP se ne ve ̀ e na spe ci fi~ ni pro mo tor ski sli jed. Um jes to to ga, zdru ̀ e nje TBP s ge ni ma za ri- bosomne RNA pos re do va no je ve za njem dru gih pro tei na iz SL1 kom ple- ksa na pro mo tor {to je sli~ no zdru ̀ i va nju TBP s Inr slje do vi ma ge na ko je pre pi su je po li me ra za II, a ko ji ne ma ju TA TA-slog.

Ge ni za tR NA, 5S rR NA i ne ke ma le mo le ku le RNA dje lat ne u pre kra ja- nju RNA i pri je no su pro tei na pre pi su ju se po li me ra zom III. Ti se ge ni pre pi- su ju od tri raz li ~i te sku pi ne pro mo to ra, od ko jih su dva smje{ te na unu tar, a ne uz vod no od slje da ko ji se pre pi su je (sli ka 6-17). Naj vi {e prou ~a va ni ge ni od svih ko ji se pre pi su ju po li me ra zom III je su ge ni za 5S rR NA `a be ro da Xe no pus. TFIIIA (pr vi pro ~i{ }e ni tran skrip cij ski fak tor) ini ci ra zdru ̀ i va nje tran skrip cij sko ga kom plek sa ve za njem na spe ci fi~ ne slje do ve DNA u 5S rRNA pro mo to ru. To je ve za nje pra }e no sek ven cij skim ve za njem TFIIIC, TFIIIB i po li me ra ze. Pro mo to ri ge na za tR NA raz li ku ju se od 5S rRNA pro- mo to ra ti me {to ne pos je du ju sli jed DNA ko ji pre poz na je TFIIIA. Um jes to to ga TFIIIC se iz rav no ve ̀ e na pro mo to re ge na za tRNA, {to uzrokuje pridru`ivanje TFIIIB i polimeraze i nastanak transkripcijsko ga kom ple ksa. Pro mo to ri tre }e sku pi ne ge na pre pi si va nih po li me ra zom III, uk lju ~u ju }i i ge ne za ma le jez gri ne RNA dje lat ne u prek ra ja nju RNA, smje{ te ni su uz- vod no od po ~et no ga tran skrip cij skog mjes ta. Ti pro mo to ri ima ju TATA-slog (sli~ no pro mo to ri ma za po li me ra zu II) kao i vez na mjes ta za dru ge fak to re naz va ne SNAP. SNAP i TFIIIB ve ̀ u se koo pe ra tiv no na pro mo to re, s tim da se TFIIIB iz rav no ve ̀ e na TA TA-slog. Ve za nje je pos re do va no pro tei nom ko ji se ve ̀ e na TA TA-slog, TBP, pod je di ni com TFIIIB. Kao i u slu ~a ju pro mo- to ra za ostale ge ne pre pi si va ne po li me ra zom III, TFIIIB po tom prid ru ̀ u je po li me ra zu u tran skrip cij ski kom ple ks.

Re gu la ci ja tran skrip ci je u eu ka rio ta

Prem da je kon tro la ek spre si je ge na pu no slo ̀ e ni ja u eu ka rio ti ma ne go u bak te ri ja ma, vri je de is ti te melj ni prin ci pi. Ek spre si ja eu ka riot skih ge na pri- mar no je kon tro li ra na na ra zi ni ini ci ja ci je tran skrip ci je, a u mno gim slu ~a je- vi ma i ti je kom elon ga ci je. Kao i kod bak te ri ja, tran skrip ci ja u eu ka riot skim sta ni ca ma kon tro li ra na je pro tei ni ma ko ji se spe ci fi~ no ve ̀ u za re gu la tor ne slje do ve i mo du li ra ju ak tiv no st RNA-po li me ra ze. Me |u tim, va` na raz li ka

Sinteza i dorada RNA 245

polimeraza III

TFIIIBtRNA

TFIIIC

TBP

+1

polimeraza III

TFIIIB 5S rRNA

TFIIIC

+1 promotor

TFIIIA

TBP

promotor

polimeraza III

TFIIIBU6 snRNA

TBP

promotor

TATA

+1

SNAP

Sli ka 6-17. Tran skrip ci ja ge na po li- me ra zom III. Ge ni koje prepisuje po li me ra za III e ks pri mi ra ju se s po mo }u dvi je vr ste pro mo to ra. Pro mo to ri ge na za 5S rR NA i tR NA na la ze se niz vod no od mjes ta ini ci ja ci je tran skrip ci je. Tran skrip ci ja ge na za 5S rR NA je ini ci ra na ve za- njem TFIIIA na kon ~e ga sli je di ve za nje TFIIIC, TFIIIB i po li me ra ze. Pro mo to ri za tR NA ne sadr ̀ avaju vez no mjes to za TFIIIA, a on ni je ni pot re ban za nji ho- vu tran skrip ci ju. Um jes to to ga, TFIIIC ini ci ra tran skrip ci ju tR NA ge na ve za- njem na pro mo tor ski sli jed, a po tom se zdru ̀ u ju TFIIIB i po li me ra za. Pro mo tor ge na za U6 snR NA je uz vod no od po ~et- nog mjes ta za tran skrip ci ju i sad r ̀ a va TA TA-slog ko ji pre poz na je TBP, ko ja ve ̀ e TATA-slog pod je di ni ca tran skrip- cij sko ga fak to ra TFIIIB u koo pe ra ci ji s dru gim fak to rom naz va nim SNAP.

iz me |u re gu la ci je tran skrip ci je u pro ka riot skim i eu ka riot skim sta ni ca ma, re zul tat je pa ki ra nja eu ka riot ske DNA u kro ma tin ko ji og ra ni ~a va ras po lo ̀ i- vo st DNA kao ka lu pa za tran skrip ci ju. Sto ga, mo di fi ka ci ja kro ma tin ske struk tu re ig ra klju~ nu ulo gu u kon tro li tran skrip ci je u eu ka riot skim sta ni ca- ma.

cis-Djeluju}i re gu la tor ni slje do vi: pro mo to ri i po ja ~i va ~i Ka ko je up ra vo ob raz lo ̀ e no, tran skrip ci ja je u bak te ri ja ma re gu li ra na ve za- njem pro tei na na cis-djeluju}e slje do ve (prim je ri ce lac ope ra tor) ko ji kon tro- li ra ju tran skrip ci ju sus jed nih ge na. Sli~ ni cis-djeluju}i slje do vi re gu li ra ju eks pre si ju eu ka riot skih ge na. Ti su slje do vi iden ti fi ci ra ni u sta ni ca ma si sa- va ca prim je nom tes ta pri je no sa ge na za ispitivanje vje ro jat nih re gu la tor nih pod ru~ ja klo ni ra nih ge na (sli ka 6-18). Eu ka riot ski re gu la tor ni slje do vi obi- ~no su ve za ni na re por ter ski gen ko ji ko di ra en zim jed nos ta van za de tek ci- ju. Ek spre si ja re por ter skog ge na na kon pri je no sa u kul ti vi ra ne sta ni ce omo- gu }u je os jet lji vo is pi ti va nje spo sob nos ti klo ni ra nih re gu la tor nih slje do va da up rav lja ju tran skrip ci jom. Bio lo{ ki ak tiv na re gu la tor na pod ru~ ja mo gu se ta ko ut vr di ti, a in vi vo mu ta ge ne za prim je nju je se za ut vr |i va nje ulo ge spe ci fi~ nih slje do va unu tar od re |e nog pod ru~ ja.

Ge ni ko ji se pre pi su ju RNA-po li me ra zom II ima ju sr ̀ ne pro mo tor ske ele men te, za jed no s TA TA-slo gom i Inr sli je dom ko ji slu ̀ e kao vez na mjes ta

246 Poglavlje 6

ekspresija reporterskoga gena

reporterski gen

regulatorni slijed

transfekcija stanica primatelja

plazmidna DNA

Sli ka 6-18. Iden ti fi ci ra nje eu ka riot skih re gu la tor nih slje do va. Re gu la tor ni sli jed klo ni ra noga eu ka riot sko ga ge na spo jen je s re por ter skim ge nom. Re por ter ski gen ko di ra en zim ~i ju je ak tiv no st la ko de tek ti ra ti. Nas ta li plaz mid po- tom se uvo di u kul tu ru sta ni ca pri ma te lja tran sfek ci jom. Ak tiv ni re gu la tor ni sli jed up rav lja tran skrip ci jom re por ter sko ga ge na, a nje go va se ek spre si ja de tek ti ra u trans- fici ra nim sta ni ca ma.

Sli ka 6-19. Eu ka riot ski pro mo tor. Pro mo tor ge na za ti mi di n-ki na zu vi ru sa Her pes sim plex sadr`i tri sljed na ele men ta uz vod no od TA TA-slo ga ko ji su pot reb ni za u~in ko vi tu tran skrip ci ju: CCAA T-slog i dva GC-slo ga (usug la {e ni sli jed GGGCGG).

+1

mRNA

–100 –75 –50 –25

GGGCGG GGGCGG TATAACCAAT

za op }e tran skrip cij ske fak to re. Dru gi cis-djeluju}i slje do vi slu ̀ e kao vez na mjes ta za {i ro ku le pe zu re gu la tor nih fak to ra ko ji kon tro li ra ju ek spre si ju in- di vi dual nih ge na. Ci s-dje lu ju }i re gu la tor ni slje do vi su ~es to, ali ne uvi jek, smje{ te ni uz vod no od TA TA-slo ga. Prim je ri ce, dva re gu la tor na sli je da, na- |e na u mno gim eu ka riot skim ge ni ma, iden ti fi ci ra na su is tra ̀ i va njem pro- mo to ra ge na ko ji ko di ra ti mi di n-ki na zu u vi ru su Her pes sim plex (slika 6-19). Oba sli je da smje{ te na su unu tar 100 pa ro va baz a uz vod no od TA TA- -slo ga: usug la {e ni su nji ho vi slje do vi CCAAT i GGGCGG (naz van GC-slog). Spe ci fi~ ni pro tei ni ko ji se ve ̀ u na te slje do ve i sti mu li ra ju tran skrip ci ju ta- ko |er su iden ti fi ci ra ni.

Na sup rot re la tiv no jed nos tav noj or ga ni za ci ji CCAAT i GC-slo go va u pro- mo to ru ge na za ti mi di n-ki na zu kod her pes-vi ru sa, mno ge ge ne u sta ni ca- ma si sa va ca kon tro li ra ju re gu la tor ni slje do vi smje{ te ni vr lo da le ko (po ne- kad vi {e od 10 ki lo ba za) od po ~et no ga tran skrip cij skog mjes ta. Ti slje do vi, na zva ni po ja ~i va ~i (en gl. en han cer), pr vot no su iden ti fi ci ra ni ti je kom is tra ̀ i- va nja pro mo to ra jed no ga dru gog vi ru sa, SV40 (sli ka 6-20). Za u~in ko vi tu trans krip ci ju kon tro li ra nu tim pro mo to rom, osim TA TA-slo ga pot reb ni su i {e st GC-slo go va te dva po nav lja nja od 72 pa ra baza smje{ te na da lje uz vod- no. Ut vr |e no je da ti slje do vi sti mu li ra ju tran skrip ci ju od dru gih pro mo to- ra kao i od SV40 te da, iz ne na |u ju }e, nji ho va ak tiv no st ne ovi si ni o uda lje- nosti ni ti o ori jen ta ci ji u od no su na mjestro zapo~injanja tran skrip cij e mje- sto (sli ka 6-21). Oni mo gu sti mu li ra ti tran skrip ci ju bez ob zi ra na to je su li smje{ te ni uz vod no ili niz vod no od pro mo to ra, ili u ori jen ta ci ji nap ri jed ili na zad.

Spo sob no st po ja ~i va ~a da dje lu ju i kad su vr lo uda lje ni od ini ci ja cij skog mjes ta za tran skrip ci ju su ge ri rala je u pr vi mah da oni fun kcio ni ra ju po dru gom prin ci pu od pro mo to ra. Me |u tim, ta je pret pos tav ka od ba ~e na: po ja ~i va ~i, sli~ no pro mo to ri ma, fun kcio ni ra ju ve za njem tran skrip cij skih fak to ra ko ji po tom mo gu re gu li ra ti RNA-po li me ra zu. To je mo gu }e s ob zi- rom na pos to ja nje om ~i DNA {to omo gu }u je tran skrip cij skim fak to ri ma ve- za nim na uda lje ne po ja ~i va ~e da stu pa ju u in te rak ci ju s pro tei ni ma zdru ̀ e- nim s RNA-po li me ra zom na pro mo to ru (sli ka 6-22). Ta ko tran skrip cij ski fak to ri ve za ni na uda lje ne po ja ~i va ~e dje lu ju na is ti na ~in kao i oni ve za ni na sus jed ne pro mo to re, {to zna ~i da ne ma fun da men tal ne raz li ke iz me |u dje lo va nja po ja ~i va ~a i cis-djeluju}ih re gu la tor nih slje do va u sus jed stvu po-

Sinteza i dorada RNA 247

+1

mRNA

ponavljanja od po 72 pb

poja~iva~ promotor

GC slog

TATAA

Sli ka 6-20. SV40 po ja ~i va~. SV40 pro mo tor za ra nu ek spre si ju ge na sad r ̀ ava TA TA-slog i {e st GC-slo go va aran ̀ i ra nih u tri ni za po nav lja ju }ih slje do va. Osim to ga, za u~in ko vi tu tran- skrip ci ju, pot re ban je uz vod ni po ja ~i va~ ko ji se sa sto ji od dva po nav lja nja od po 72 pa ra ba za (pb).

osnovna transkripcija

stimulirana transkripcija

stimulirana transkripcija

stimulirana transkripcija

stimulirana transkripcija

genP

genE

(A)

(B)

gen

(C)

gen

(D)

gen

(E)

E

E

E

Sli ka 6-21. Dje lo va nje po ja ~i va ~a. Bez po ja ~i va ~a gen se prepisuje na nis koj os nov noj ra zi ni (A). Do dat kom po ja ~i va ~a E, prim je ri ce, SV40 72 pb po- nav lja nja, sti mu li ra tran skrip ci ju. Po ja ~i- va~ je ak ti van ne sa mo kad je smje {ten ne pos red no uz vod no od pro mo to ra (B), ne go i kad je uba ~en ne ko li ko ki lo- ba za uz vod no ili niz vod no od star tno ga trans krip cij sko ga mjes ta (C i D). Osim to ga, po ja ~i va~ je ak ti van u ob je ori jen- ta ci je, nap ri jed i na zad (E).

~et nog mjes ta za tran skrip ci ju. Za nim lji vo je da su po ja ~i va ~i pr vo iden ti fi- ci ra ni u sta ni ca ma si sa va ca, a po tom na |e ni i u bak te ri ja ma − neo bi ~an slu- ~aj da is tra ̀ i va nja eu ka rio ta slu ̀ e kao mo del za jed nos tav ni je pro ka riot ske sus ta ve.

Ve za nje spe ci fi~ nih tran skrip cij skih re gu la tor nih pro tei na na po ja ~i va ~e od go vor no je za kon tro lu ek spre si je gena ti je kom raz vo ja i di fe ren ci ja ci je, kao i za od go vor sta ni ca na hor mo ne i fak to re ras ta. Je dan od naj bo lje is tra- `e nih po ja ~i va ~a si sa va ca kon tro li ra tran skrip ci ju ge na za imu nog lo bu lin u B lim fo ci ti ma. Po ku si ma pri je no sa ge na ut vr |e no je da je imu nog lo bu lin ski po ja ~i va~ ak ti van sa mo u lim fo ci ti ma, a ne i u dru gim vr sta ma sta ni ca. Ta ko je ovaj re gu la tor ni sli jed dje lo mi~ no od go vo ran za spe ci fi~ nu tkiv nu eks-

248 Poglavlje 6

om~a DNA

inicijacijski kompleks

Sli ka 6-22. Stva ra nje om ~e DNA. Tran skrip cij ski fak to ri ve za ni na uda lje- ne po ja ~i va ~e u sta nju su stu pa ti u in- ter ak ci ju s kom plek som RNA-po li me ra- za/posrednik ili op }im tran skrip cij skim fak to ri ma na pro mo to ru. Raz log to mu su om ~e {to ih mo ̀ e stva ra ti DNA. Ne ma te melj ne raz li ke iz me |u dje lo va- nja trans krip cij skih fa kto ra ve za nih na DNA ne pos red no uz vod no od pro mo to- ra i uda lje nog po ja ~i va ~a.

200 parova baza

E mE1 mE5 mE2 mE3 mE4 OCTmBp

Sli ka 6-23. Imu nog lo bu lin ski po ja ~i va~. Po ja ~i va~ imu nog lo bu lin sko ga te{ kog lan ca pre mo{ }uje oko 200 ba za i sad r ̀ ava de- vet fun kcio nal nih sljed nih ele me na ta (E, E1-5, π, mB i OCT), ko ji za jed no sti mu li ra ju tran skrip ci ju u B lim fo ci ti ma.

pre si ju imu nog lo bu lin skih ge na u od go va ra ju }i di fe ren ci ra nim vr sta ma sta nica.

Va ̀ an je as pe kt po ja ~i va ~a to {to oni sad r ̀ avaju vi {e fun kcio nal nih ele- me na ta ko ji ve ̀ u raz li ~i te re gu la tor ne pro tei ne. Ka da dje lu ju za jed no, ti pro tei ni re gu li ra ju ek spre si ju ge na. Po ja ~i va~ te{ ko ga lan ca imu nog lo bu li- na, prim je ri ce, obuh va }a oko 200 baz nih pa ro va i sad r ̀ ava naj ma nje de vet raz li ~i tih ele me na ta ko ji slu ̀ e kao vez na mjes ta za pro tei ne (sli ka 6-23). Mu- ta ci ja bi lo ko jeg od slje do va sma nju je, ali ne uni{ ta va po ja ~i va~ ku ak tiv- nost, upu }u ju }i na to da su fun kci je in di vi dual nih pro tei na ko ji se ve ̀ u na po ja ~i va~ barem di je lomi~no su vi{ ne. Mno gi od po je di na~ nih slje do va imu- nog lo bu lin skog po ja ~i va ~a sa mi po se bi sti mu li ra ju tran skrip ci ju u ne lim- foid nim sta ni ca ma. Sto ga og ra ni ~e na ak tiv no st ci je log po ja ~i va ~a u B lim fo- ci ti ma ni je re zul tat spe ci fi~ ne tkiv ne fun kci je sva ke od nje go vih kom po ne n- ti. Umje sto to ga, spe ci fi~ na tkiv na ek spre si ja pos lje di ca je kom bi na ci je in di- vi dual nih sljed nih ele me na ta ko ji upot pu nju ju ci je li po ja ~i va~. Ti ele men ti obu hva }a ju ne ke cis-djeluju}e re gu la tor ne slje do ve ko ji ve ̀ u tran skrip cij- ske ak ti va to re, spe ci fi~ no ek spri mi ra ne u B lim fo ci ti ma, kao i dru ge re gu la- tor ne slje do ve ko ji ve ̀ u rep re so re u ne lim foid nim sta ni ca ma. Pre ma to me, imu nog lo bu lin ski po ja ~i va~ ima ne ga tiv ne re gu la tor ne ele men te ko ji in hi bi- ra ju tran skrip ci ju u neod go va ra ju }oj vr sti sta ni ca, ali i po zi tiv ne re gu la tor- ne ele men te ko ji ak ti vi ra ju tran skrip ci ju u B lim fo ci ti ma. Ukup na ak tiv no st po ja ~i va ~a ve }a je od zbro ja po je di na~ nih ak tiv nos ti, od ra ̀ a va ju }i kom bi ni- ra no dje lo va nje pro tei na zdru ̀ e nih sa sva kim in di vi dual nim sli je dom.

Prem da stva ra nje om ~i u mo le ku li DNA omo gu }u je po ja ~i va ~i ma da dje- lu ju sa znat ne uda lje nos ti od pro mo to ra, ak tiv no st bi lo ko jeg po ja ~i va ~a

Sinteza i dorada RNA 249

fragment DNA

protein

slobodna DNA

kompleks DNA-protein

protein vezan na DNA

elektroforeza autoradiografija

inkubacija bez proteina

inkubacija s proteinom

dioba uzorka

Sli ka 6-24. Te st po ma ka u elek tro- fo reti~koj pok ret lji vos ti. Uzo rak ko ji sad r ̀ ava ra dioak tiv no oz- na ~e ni frag me nt DNA po di je li se u dva di je la te se jed na po lo vi ca in ku bi ra s pro- tei nom ko ji se ve ̀ e na spe ci fi~ ni sli jed DNA. Uzor ci se po tom ana li zi ra ju elek- tro fo re zom u ne de na tu ri ra ju }em ge lu (pro tein os ta je ve zan na DNA). Ve za nje pro tei na ut vr |u je se us po red bom us po- re ne mig ra ci je kom plek sa DNA-pro tein u od no su na slo bod nu DNA. Sa mo je dio DNA u uzor ku ve zan na pro tein pa se mo gu de tek ti ra ti i kom ple ks DNA- pro tein i slo bod na DNA u uzor ku in ku- bi ra nom s pro tei nom.

spe ci fi~ na je za pro mo tor od re |e no ga ci lja no ga ge na. Ta se spe ci fi~ no st od r- `a va s po mo }u izo la to ra ko ji di je le kro mo so me u neo vis na pod ru~ ja i spr je- ~a va ju po ja ~i va ~e da dje lu ju na pro mo to re smje{ te ne u susjednom pod ru- ~ju. Izo la to ri ta ko |er spr je ~a va ju {i re nje kro ma tin ske struk tu re jed ne do me- ne na sus jed stvo, ~ime od r ̀ a va ju neo vis no re gu li ra na pod ru~ ja ge no ma.

Tran skrip cij ski re gu la tor ni pro tei ni Izo li ra nje ve li ko ga bro ja raz li ~i tih tran skrip cij skih re gu la tor nih pro tei na ute me lje no je na nji ho vom spe ci fi~ nom ve za nju na pro mo tor ske ili po ja ~i- va ~ke slje do ve. Ve zi va nje pro tei na na slje do ve DNA ana li zi ra no je na dva na~ina. Pr vi na~in, oti sak sto pa la opi san je pri je u sve zi s ve zi va njem RNA- -po li me ra ze na pro ka riot ske pro mo to re (vi di sli ku 6-3). Dru gi je na~in test po ma ka u elek tro fo reti~koj pok ret lji vos ti, u ko jem se ra dioak tiv no oz na ~e- ni frag me nt DNA in ku bi ra s pro tei ni ma, a po tom podvr gne elek tro fo reti- ~kom raz dva ja nju na ne de na tu ri ra ju }em ge lu (sli ka 6-24). Ve za nje pro tei na de tek ti ra se kao sma nje nje elek tro fo reti~ke pok ret lji vos ti frag men ta DNA, s ob zi rom na to da je nje go vo kre ta nje kroz gel us po re no ve za nim pro tei- nom. Kom bi ni ra na prim je na otis ka sto pa la i po ma ka u elek tro fo reti~koj pok ret lji vos ti omo gu }i la je us po red bu vez nih mjes ta za pro tei ne s re gu la- tor nim ele men ti ma po ja ~i va ~a i pro mo to ra te po ka za la da su ti slje do vi op- }e ni to mjes ta pre poz na va nja spe ci fi~ nih pro tei na ko ji se ve ̀ u na DNA.

Ro be rt Tjian i su rad ni ci pr vi su iden ti fi ci ra li je dan od pro to ti po va eu ka- riot sko ga tran skrip cij skog fak to ra is tra ̀ u ju }i tran skrip ci ju SV40 DNA. Ut vr- |e no je da taj fak tor (naz van Sp1, od en gl. spe ci fi ci ty pro tein 1) sti mu li ra tran skrip ci ju od SV40 pro mo to ra, ali ne od ne ko li ko dru gih pro mo to ra u bez sta ni~ nim ek strak ti ma (en gl. ce ll-free extrac ts). Ta ko |er je ut vr |e no da sti mu la ci ja tran skrip ci je Sp1 ovi si o pri sut nos ti GC-slo go va u SV40 pro mo- to ru: ako su ti slje do vi uk lo nje ni spri je ~e na je sti mu la ci ja s pomo}u Sp1. [to vi {e, po ku si ma otis ka sto pa la ut vr |e no je da se Sp1 spe ci fi~ no ve ̀ e na GC-slo go ve. Uzev {i sve u ob zir, re zul ta ti upu }u ju na to da GC-slog pred- stav lja spe ci fi ~no vez no mjes to za ak ti va tor tran skrip ci je Sp1. Sli~ ni po ku si po ka za li su da mno gi dru gi tran skrip cij ski re gu la tor ni slje do vi, za jed no s

250 Poglavlje 6

GC-slog DNA kolona

pro~i{}eni Sp1

drugi proteini prolaze kroz kolonu

GC-slog DNA

kuglica agaroze

Sp1

smjesa stani~nih proteina

pufer s visokom koncentracijom soli

Sp1 vezan na kolonu

Sli ka 6-25. Pro ~i{ }a va nje Sp1 s po mo }u DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je. Dvo lan ~a ni oli go nuk leo tid ko ji sad r- `ava po nav lja ne GC-slo go ve ve ̀ e se na aga roz ne kug li ce smje{ te ne u ko- lo nu. Smje sa sta ni~ nih pro tei na, ko ja sad r ̀ ava Sp1, na ne se se na ko lo nu; s ob zi rom na spe ci fi~ no ve za nje Sp1 na GC-slog oli go nuk leo ti da, Sp1 zad r ̀ a va se na ko lo ni dok dru gi pro tei ni pro la ze kroz nju. Is pi ra nje ko lo ne pu fe rom s vi so kom kon cen tra ci jom so li iza zi va di- so ci ja ci ju Sp1 od GC-slo ga DNA, da ju }i pro ~i{ }e ni Sp1.

CCAA T-slo gom i raz li ~i tim dru gim ele men ti ma imu nog lo bu lin skog po ja ~i- va ~a, ta ko |er pred stav lja ju mjes ta pre poz na va nja za pro tei ne ko ji se ve ̀ u na spe ci fi~ ne slje do ve DNA.

Spe ci fi~ no ve za nje Sp1 na GC-slog ne pred stav lja sa mo dje lo va nje Sp1 kao tran skrip cij sko ga fak to ra, ne go i op }i pris tup pro ~i{ }a va nju tran skri- pcij skih fak to ra. Izo la ci ja tih pro tei na pr vot no je bi la go lem iza zov s ob zi- rom na to da su pri sut ni u vr lo ma lim ko li ~i na ma (prim je ri ce sve ga 0,001% ukup nih sta ni~ nih pro tei na) ko je je te{ ko pro ~is ti ti kon ven cio nal nim bio ke- mij skim teh ni ka ma. Prob lem je ot klo njen pro ~i{ }a va njem Sp1 DNA-a fi ni- tet nom kro ma tog ra fi jom (sli ka 6-25). Mno gob roj ne ko pi je oli go nuk leo ti da,

Transkripcijski faktor Usugla{eno vezno mjesto Specifi~ni protein 1 (Sp1) GGGCGG CCAAT/Protein koji se ve`e na poja~iva~ (C/EBP) CCAAT Aktivatorski protein 1 (AP1) TGACTCA Protein koji se ve`e na oktamere ATGCAAAT (OCT-1 i OCT-2) Proteini koji se ve`u na E-slog (E12, E47, E2-2) CANNTGa

a N ozna~ava bilo koji nukleotid.

Tablica 6-2. Primjeri transkripcijskih faktora i njihovih veznih mjesta za DNA

Sinteza i dorada RNA 251

Izolacija eukariotskoga transkripcijskoga faktora

Affinity purification of Sequence-Specific DNA-Binding Proteins

James T. Kadonaga and Robert Tjian University of California, Berkeley Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1986, Volume 83, pages 5889–5893

KLJU^NI POKUS

Robert Tjian

205,0

116,0

97,4

66,0

45,0

29,0

1 2 3

Pro ~i{ }a va nje Sp1. Gel-elek tro fo re za pro tei na po ~et no pri sut nih u gru bom nuk lear nom ek strak tu (ko lo na 1) i pro tei na do bi ve nih na kon jed no ga (ko lo na 2) ili dva cik lu sa DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je (ko lo na 3). Ve li- ~i na pro tei na mar ke ra (u ki lo dal to ni ma) oz na ~e na je na li je voj stra ni ge la, a Sp1 po li pep ti da strje li ca ma.

Kon tek st

S is tra ̀ i va nji ma lac ope ro na Ja co ba i Mo no da pos ta lo je jas no da je tran- skrip ci ja re gu li ra na pro tei ni ma ko ji se ve ̀ u na spe ci fi~ ne slje do ve DNA. Je dan od pro to tip nih sus ta va za stu di- ra nje gen ske ek spre si je u eu ka riot skim sta ni ca ma je st maj mun ski vi rus SV 40, u ko jem je iden ti fi ci ra no ne ko li ko re gu la tor nih slje do va DNA jo{ ra nih 80-ih go di na pro{ loga sto lje }a. Wil liam Dynan i Ro be rt Tjian po ka za li su 1983. da je je dan od tih sljed- nih ele me na ta (GC- -slog) spe ci fi~ no vez no mjes to za pro tein ko ji se mo ̀ e de tek ti ra ti u nuk lear nom ek strak tu hu ma nih sta ni ca. Pro- tein (naz van Sp1 za spe ci fi~ ni pro tein 1) ne ve ̀ e se sa mo za GC-slog, on ta ko |er sti mu li ra tran skrip ci ju in vit ro, po ka zu ju }i da je tran skrip cij ski ak ti- va tor.

Da bi se mo gao prou ~a va ti me ha ni- zam dje lo va nja Sp1, bi lo je pot reb no ima ti tran skrip cij ski fak tor u ~is tom ob li ku i even- tual no klo ni ra ti Sp1 gen. Izo la ci ja ~is tog Sp1 bi la je nu` na, ali

is to dob no je to bio zas tra {u ju }i teh- ni~ ki iza zov.

Sp1 i dru gi tran skrip cij ski fak to ri pred stav lja ju sa mo oko 0,001% ukup- nih sta ni~ nih pro tei na, ta ko da se oni ne mo gu pro ~is ti ti kon ven cio nal- nim bio ke mij skim teh ni ka ma. Ja mes Ka do na ga i Ro be rt Tjian ri je {i li su taj pro blem raz vit kom me to de DNA-a fi- ni tet ne kro ma tog ra fi je, me to de ko jom su pro ~i{ }e ni Sp1 i mno gi dru gi eu ka- riot ski tran skrip cij ski fak to ri, ot va ra ju }i

ta ko vra ta za mo le ku lar nu ana li zu re gu la ci je tran- skrip ci je u eu ka riot skim sta ni ca ma.

Eksperiment

Me to da DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je Ka do na ge i Tjia na ko ris ti la je spe ci- fi~ no vi so ko-a fi ni tet no ve za nje Sp1 na GC-slog, GGGCGG. Sin te ti~ ki oli- gonuk leo ti di ko ji sad r ̀ a- va ju mno gob roj ne ko pi je tog sli je da ve za ni su na ~vr ste kug li ce, a gru bi nuk- lear ni ek stra kt pro la zio je kroz ko lo nu ko ja je sad r ̀ a- va la kug li ce na ko ji ma je ve zan GC-slog. Kug li ce su po tom op ra ne da bi se is pra li pro tei ni ko ji se ni su spe ci fi~ no ve za li na oli go- nuk leo ti de. Ko na~ no su kug li ce op ra ne u pu fe ru s vi so kom kon cen tra ci jom

so li (0,5 M KCl) {to ras ki da ve zu Sp1 i DNA, os lo ba |a- ju }i ta ko Sp1 s ko lo ne.

Gel-elek tro fo re za po ka- za la je da je gru bi nuk lear ni

ek stra kt do dan na po ~et ku na ko lo nu slo ̀ e na mje {a vi na pro tei na (vi di sli ku). Sup rot no to me, oko 90% pro tei na po nov no do bi ve nih na kon dva ju cik- lu sa DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je pred stav lja ju dva po li pep ti da, ko ji su iden ti fi ci ra ni kao Sp1 na os no vi ve za- nja na DNA i dje lo va nja na tran skrip- ci ju u invit ro tes to vi ma. Ta ko je Sp1 us pje{ no pro ~i{ }en DNA-a fi ni tet nom kro ma tog ra fi jom.

Ut je caj

U ~lan ku iz 1986. go di ne, Ka do na ga i Tjian tvr di li su ka ko se teh ni ka DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je »mo`e op }e ni to pri mi je ni ti u pro ~i{ }a va nju dru gih pro tei na ko ji se spe ci fi~ no ve ̀ u slje do ve DNA.« Pret pos tav ka je pot vr- |e na pro ~i{ }a va njem broj nih eu ka riot- skih tran skrip cij skih fak to ra up ra vo tom me to dom. Ge ni ko ji ko di ra ju dru ge tran skrip cij ske fak to re izo li ra ni su al ter na tiv nim pos tup kom (neo vis no raz vi je nim 1988. go di ne u la bo ra to ri ju Phil li pa Shar pa i Ste ve na McKnig hta) u ko jem se cDNA ek spre sij ska knji- `ni ca pro si ja va s oli go nuk leo tid nom son dom da bi se de tek ti ra li pro tei ni ko ji se spe ci fi~ no ve ̀ u na od re |e ne slje do ve. Mo gu} no st izo la ci je pro tei na ko ji se spe ci fi~ no ve ̀ u na od re |e ne slje do ve DNA ovim me to da ma do ve lo je do de talj ne ka rak te ri za ci je struk tu re i fun kci je ve li kog bro ja tran skrip cij skih re gu la tor nih pro tei na, osi gu ra va ju }i te melj za na {e da na{ nje ra zu mi je va- nje gen ske ek spre si je u eu ka riot skim sta ni ca ma.

252 Poglavlje 6

TATAAdomena koja se ve`e na DNA

aktivacijska domena

posrednik

Sli ka 6-26. Struk tu ra tran s krip cij skih ak ti va to ra. Tran skrip cij ski ak ti va to ri sas to je se od dvi ju neo vis nih do me na. Do me na ko ja se ve ̀ e na DNA pre poz na je spe ci fi~ ni sli jed DNA, a ak ti va cij ska do me na stu- pa u in te rak ci ju s dru gim ~im be ni ci ma tran skrip cij sko ga sus ta va.

ko ji od go va ra ju sli je du GC-slo ga, ve za ne su na ~vr sti no sa~, a sta ni~ ni ek s- trakt pro la zi kroz oli go nuk leo tid nu ko lo nu. Po{ to je Sp1 ve zan na GC-slog ja kim afi ni te tom, spe ci fi~ no je zad r ̀ an na ko lo ni, dok os ta li pro tei ni ni su. Pro ~i {}e ni Sp1 mo gao se ta ko po nov no do bi ti i is ko ris ti ti za daljnja istra`ivanja poput od re |i va nja nje go va ami no ki se lin skog sli je da i klo ni- ranja Sp1 gena.

Me to da DNA-a fi ni tet ne kro ma tog ra fi je, pr vot no op ti mi ra na za pro ~i{ }a- va nje Sp1, us pje{ no je ko ri{ te na za izo la ci ju ve li kog bro ja pro tei na ko ji se ve ̀ u na spe ci fi~ ne slje do ve DNA iz eu ka riot skih sta ni ca. Ge ni ko ji ko di ra ju dru ge tran skrip cij ske fak to re izo li ra ni su pret ra ̀ i va njem cDNA ek spre sij- skih knji` ni ca na re kom bi nan tni pro tein ko ji se ve ̀ e na spe ci fi~ ne slje do ve. Klo ni ra nje i sek ven ci ra nje cDNA za tran skrip cij ske fak to re omo gu }i lo je broj ne in for ma ci je o struk tu ri i fun kci ji ovih va` nih re gu la tor nih pro tei na.

Struk tu ra i fun kci ja tran skrip cij skih ak ti va to ra S ob zi rom na to da tran skrip cij ski fak to ri ima ju sre di{ nju ulo gu u re gu la ci ji ek spre si je ge na, u ra zu mi je va nje me ha ni za ma nji ho va dje lo va nja ulo`eni su znatni istra`iva~ki napori. Naj vi {e su is tra ̀ e ni tran skrip cij ski ak ti va to- ri, ko ji se, sli~ no Sp1, ve ̀ u na re gu la tor ne slje do ve DNA i sti mu li ra ju tran s- krip ci ju. Op }e ni to, ti se fak to ri sas to je od dvi ju do me na: jed na se do me na spe ci fi~ no ve ̀ e na DNA, a dru ga sti mu li ra tran skrip ci ju stu pa njem u in te r- ak ci ju s dru gim pro tei ni ma, uk lju ~u ju }i kom po nen te tran skrip cij skog sus ta- va (sli ka 6-26). Tran skrip cij ski su fak to ri mo du lar ni pro tei ni, u smis lu da se DNA ve zu ju }a i ak ti vi ra ju }a do me na raz li ~i tih fak to ra mo ̀ e me |u sob no zam je nji va ti s po mo }u teh ni ka re kom bi nan tne DNA. Tak vim ma ni pu la ci ja- ma nas ta ju hib rid ni tran skrip cij ski fak to ri ko ji ak ti vi ra ju tran skrip ci ju ve za- njem na pro mo tor ske ili po ja ~i va~ ke slje do ve ka ko je od re |e no nji ho vom vez nom do me nom. Iz to ga proiz la zi da je os nov na fun kci ja do me ne za ve- za nje na DNA sid re nje tran skrip cij sko ga fak to ra na prik lad no mjes to na DNA; ak ti va cij ska do me na po tom neo vis no sti mu li ra tran skrip ci ju in te rak- ci jom pro tei n-pro tein.

Mno gi raz li ~i ti tran skrip cij ski fak to ri iden ti fi ci ra ni su u eu ka riot skim sta- ni ca ma i, ka ko se o~e ki va lo, po ka za li su svu kom plek sno st tkiv no-spe ci fi- ~ne i in du ci bil ne gen ske ek spre si je u slo ̀ e nim vi {es ta ni~ nim or ga niz mi ma. Mo le ku lar na je ka rak te ri za ci ja pak ras vi jet li la sli~ no st do me na za ve za nje na DNA u mno gih takvih pro tei na (sli ka 6-27). Do me ne cin ko va pr sta sa dr-

Sinteza i dorada RNA 253

(A) cinkovi prsti (B) uzvojnica-okret-uzvojnica

(C) leucinski zatvara~

(D) Uzvojnica- -om~a-uzvojnica

domena leucinskoga zatvara~a

uzvojnica koja ve`e DNA

om~a

uzvojnica koja ve`e DNA

2

3

1

uzvojnica

postrani~ni lanac leucina

a

b-nabrana plo~acinkov ion

Sli ka 6-27. Po ro di ca do me na ko je se ve ̀ u na DNA. (A) Do me na cin ko va pr sta sas to ji se od ne ko li ko om ~i u ko ji ma jed na α uz voj- ni ca i β-nab ra na plo ~a koor di na tiv no ve ̀ u cin kov ion. (B) Uz voj ni ca-ok re t- uz voj ni ca do me ne sas to je se iz triju (ili u ne kim slu ~a je vi ma ~e ti riju) uz vo ji tih pod ru~ ja. Jed na uz voj ni ca (uz voj ni ca 3) os tva ru je ve }i nu kon ta ka ta s DNA, dok uz voj ni ce 1 i 2 le ̀ e na vr hu i sta bi li zi ra- ju in te rak ci ju. (C) Do me ne pro tei na s leu cin skim zat va ra ~em ko je se ve ̀ u na DNA nas ta ju iz dvaju uda lje nih po li pep- tid nih lan aca. In te rak ci je iz me |u hid ro- fob nih pos tra ni~ nih la na ca leu cin skih os ta ta ka ko ji su iz lo ̀ e ni na jed noj stra ni uz vo ji tog pod ru~ ja (leu cin ski zat va ra~) od go vor ne su za di me ri za ci ju. Od mah na kon pod ru~ ja leu cin sko ga zat va ra ~a sli je di uz voj ni ca ko ja ve ̀ e DNA, a bo- ga ta je ba zi~ nim ami no ki se li na ma. (D) Uz voj ni ca-om~a-uz voj ni ca do me ne sli~- ne su leu cin skom zat va ra ~u, osim {to se sva ka di me ri za cij ska do me na tih pro tei- na sa sto ji od dvaju uz vo ji tih pod ru~ ja raz dvo je nih om ~om.

`e po nav lja nja cis tein skih i his ti din skih os ta ta ka ko ji ve ̀ u cin ko ve io ne i smo ta ni su u om ~e (»pr sti«) {to se ve ̀ u na DNA. Pr vot no su te do me ne iden ti fi ci ra ne u tran skrip cij skom fak to ru po li me ra ze III, TFIIIA, ali su pri- sut ne i u tran skrip cij skim fak to ri ma ko ji re gu li ra ju pro mo to re po li me ra ze II, kao i Sph1. Dru gi prim je ri tran skrip cij skih fak to ra {to sad r ̀ avaju do me- nu cin ko va pr sta je su re cep to ri za ste roid ne hor mo ne, re gu la to ri tran skrip- ci je ge na u od go vo ru na ste roid ne hor mo ne, kao {to su es tro gen i tes tos te- ron.

Uz voj ni ca-ok re t-uz voj ni ca (engl. he lix-tu r n-he lix) mo tiv pr vi je put pre- poz nat kod pro ka riot skih pro tei na ko ji se ve ̀ u na DNA, kao {to je E. co li pro tein ak ti va tor ka ta bo liz ma (CAP). U tih pro tei na jed na uz voj ni ca os tva- ru je ve }i nu do di ra s DNA, dok dru ga uz voj ni ca pre mo{ }u je kom ple ks da bi sta bi li zi ra la in te rak ci ju. U eu ka riot skim sta ni ca ma pro tei ni uz voj ni ca- okre t-uz voj ni ca uk lju ~u ju ho meo do men ske pro tei ne ko ji su va` ni u re gu la- ci ji eks pre si je ge na ti je kom em brio nal no ga raz vo ja. Ge ni ko ji ko di ra ju te pro tei ne naj pri je su ot kri ve ni u raz voj nim mu tan ta ma vinske mu{ice. Ne ke od naj ra ni je pre poz na nih mu tan ti vinske mu {i ce (naz va ne, 1984. go di ne, ho meot skim mu tan ta ma) do vo de do raz vo ja mu {i ca kod ko jih je je dan dio ti je la tran sfor mi ran u dru gi. Prim je ri ce, u ho meot skoj mu tan ti naz va noj An- ten na pe dia, no ge, a ne an te ne, ras tu iz gla ve mu {i ce (sli ka 6-28). Pio nir skim ra dom Eda Lewi sa u ~et r de se tim go di na ma pro{ lo ga sto lje }a, nap rav lje na je ge ne ti~ ka ana li za te mu {i ce i po ka za lo se da ima de vet ho meot skih ge na,

254 Poglavlje 6

(B)(A)Sli ka 6-28. Mu ta ci ja An ten na pe dia. An ten na pe dia mu tan tne mu {i ce ima ju no ge ko je ras tu iz nji ho vih gla va na mjes tu an te ne. (A) Gla va nor mal ne mu- {i ce. (B) Gla va An ten na pe dia mu tan te. (Lju baz no { }u F. Ru do lfa Tur nera, In dia- na Uni ver si ty).

interakcija s posrednikom i op}im transkripcijskim

faktorima

modificiranje kromatinske

strukture

domena koja se ve`e na DNA

aktivacijska domena

Sli ka 6-29. Dje lo va nje tran skrip cij skih ak ti va to ra Eu ka riot ski ak ti va to ri sti mu li ra ju tran- skrip ci ju na dva na ~i na. Oni stu pa ju u in te rak ci ju s pos red ni~ kim pro tei ni ma i op }im tran skrip cij skim fak to ri ma olak- {a va ju }i zdru ̀ i va nje tran skrip cij sko ga kom plek sa. Osim to ga, oni mo gu stu- pi ti i u in te rak ci ju s koak ti va to ri ma ko ji olak {a va ju tran skrip ci ju mo di fi ci ra ju }i kro ma tin sku struk tu ru.

a sva ki je od njih od go vo ran za iden ti tet od re |e no ga di je la ti je la. Mo le ku- lar no klo ni ra nje i ana li za tih ge na po ka za li su da oni sad r ̀ a va ju kon zer vi ra- ne slje do ve od 180 pa ro va baza (naz va ne ho meos lo go vi ma) ko ji ko di ra ju do me ne tran skrip cij skih fak to ra {to se ve ̀ u na DNA (ho meo do me ne). Mno go ho meo do men skih pro tei na na |e no je u glji va ma, bilj ka ma i `i vo ti- nja ma, kao i kod ~ov je ka. Ge ni s ho meos lo go vi ma u kra lje` nja ka vr lo su sli~ ni, struk tur no i fun kcio nal no, tak vim ge ni ma vinske mu {i ce, {to go vo ri o evo lu cij ski vr lo o~u va nim ulo ga ma tih tran skrip cij skih fak to ra u `i vo tinj- skom raz vo ju.

Druge dvi je po ro di ce pro tei na ko ji se ve ̀ u na DNA, pro tei ni s leu cin- skim zat va ra ~em i uz voj ni ca-om ~a-uz voj ni ca pro tei ni, ima ju vez ne do me- ne nas ta le di me ri za ci jom dva ju po li pep tid nih la na ca. Leu cin ski zat va ra~ sad r ̀ ava ~e ti ri ili pet leu cin skih os ta ta ka raz mak nu tih u in ter va li ma od po se dam ami no ki se li na, ~i me su nji ho vi hid ro fob ni pos tra ni~ ni lan ci izlo ̀ e ni na jed noj stra ni uz voj ni ce. Taj dio uz voj ni ce slu ̀ i kao di me ri za cij ska do me- na za dvi je pro tein ske pod je di ni ce ko je se dr ̀ e za jed no hid ro fob nim in ter- ak ci ja ma pos tra ni~ nih la na ca leu ci na. Od mah na kon do me ne s leu cin skim zat va ra ~em na la zi se do me na bo ga ta po zi tiv no na bi je nim ami no ki se li na ma (li zin i ar gi nin) ko ja se ve ̀ e na DNA. Pro tei ni uz voj ni ca-om ~a-uz voj ni ca sli~ ne su struk tu re, osim {to je sva ka nji ho va di me ri za cij ska do me na iz gra- |e na od dvi ju uz voj ni ca raz dvo je nih om ~om. Va` no je svoj stvo tran skrip- cij skih fak to ra ti pa leu cin skih zat va ra ~a ili uz voj ni ca-om ~a-uz voj ni ca {to raz li ~i ti ~la no vi ovih po ro di ca mo gu di me ri zi ra ti me |u sob no. Ta ko kom bi- na ci ja raz li ~i tih pro tein skih pod je di ni ca mo ̀ e stva ra ti ve li ki broj fak to ra ko ji se raz li ku ju, ka ko u pre poz na va nju sli je da DNA na ko ji se ve ̀ u, ta ko i u sti mu la ci ji tran skrip ci je. Pro tei ni s leu cin skim zat va ra ~em i pro tei ni uz voj- ni ca-om ~a-uz voj ni ca va` ni su u re gu la ci ji spe ci fi~ ne tkiv ne i in du ci bil ne gen ske ek spre si je, a nas ta nak dime ra iz me |u raz li ~i tih ~la no va tih po ro di- ca va ̀ an je as pe kt kon tro le nji ho ve fun kci je.

Aktiviraju}a do me na ni je ta ko dob ro ka rak te ri zi ra na kao vez na do me na. Ne ke, naz va ne ki se lim ak ti vi ra ju }im do me na ma, bo ga te su ne ga tiv no na bi- je nim os tat ci ma (as par tat i glu ta mat), dru ge su pak bo ga te pro li ni ma i glu ta- mi ni ma. Ak ti vi ra ju }e do me ne eu ka riot skih tran skrip cij skih fak to ra sti mu li- ra ju tran skrip ci ju na dva raz li ~i ta na ~i na (sli ka 6-29). Pre ma pr vom me ha- niz mu, one rea gi ra ju s pos red ni~ kim pro tei ni ma i op }im tran skrip cij skim fak to ri ma, kao {to su TFIIB ili TFIID, da bi prid ru ̀ i li RNA-po li me ra zu i olak {a li zdru ̀ i va nje tran skrip cij sko ga kom plek sa na pro mo to ru, sli~ no tran skrip cij skim ak ti va to ri ma u bak te ri ja ma (vi di sli ku 6-10). Na da lje, eu ka- riot ski tran skrip cij ski fak to ri stu pa ju u in te rak ci ju s mno gim koak ti va to ri-

Sinteza i dorada RNA 255

Represor se natje~e s aktivatorom za vezanje na DNA.

Represor se ve`e na DNA i sprje~ava transkripciju interakcijom protein-protein.

aktivator

represor

(A)

(B)

TATAA

TATAA

domena koja ve`e DNA

posrednik

represorska domena

Sli ka 6-30. Dje lo va nje eu ka riot skih rep re so ra. (A) Ne ki rep re so ri spr je ~a va ju ve za nje ak ti va to ra na re gu la tor ne slje do ve. (B) Dru gi rep re so ri pos je du ju rep re sij ske do me ne ko je in hi bi ra ju tran skrip ci ju svo- jom in te rak ci jom ili s pos red ni~ kim pro tei ni ma ili s op }im tran skrip cij skim fak to ri- ma, ili, pak, s ko rep re so ri ma ko ji mo di fi ci ra ju kro ma tin sku struk tu ru.

ma ko ji sti mu li ra ju tran skrip ci ju mo di fi ci ra njem struk tu re kro ma ti na, ka ko }e bi ti pri ka za no da lje u ovom pog lav lju.

Eu ka riot ski rep re so ri Ekspresija ge na u eu ka riot skim sta ni ca ma re gu li ra na je, ka ko rep re so ri ma, ta ko i tran skrip cij skim ak ti va to ri ma. Sli~ no pro ka riot skim rep re so ri ma, eu- ka riot ski se rep re so ri ve ̀ u na spe ci fi ~an sli jed DNA i in hi bi ra ju tran skrip ci- ju. U ne kim slu ~a je vi ma eu ka riot ski rep re so ri jed nos tav no in ter fe ri ra ju s ve za njem dru gih tran skrip cij skih fak to ra na DNA (sli ka 6-30). Prim je ri ce, ve za nje rep re so ra u bli zi ni po ~et no ga mjes ta za tran skrip ci ju mo ̀ e spri je ~i- ti in te rak ci ju RNA-po li me ra ze ili op }ih tran skrip cij skih fak to ra s pro mo to- rom, {to je sli~ no dje lo va nju rep re so ra u bak te ri ja ma. Dru gi se rep re so ri nat je ~u s ak ti va to ri ma za ve za nje na spe ci fi ~an re gu la tor ni sli jed. Ta ko ne ki rep re so ri sad r ̀ avaju is tu do me nu za ve za nje na DNA kao i ak ti va to ri, ali ne ma ju nji ho vu ak ti va cij sku do me nu. Pos lje di ca je to ga da nji ho vo ve za nje na pro mo tor ili po ja ~i va~ spr je ~a va ve za nje ak ti va to ra na to mjes to ~i me je in hi bi ra na tran skrip ci ja.

komentari (0)

nema postavljenih komentara

budi prvi koji ce napisati!

ovo je samo pregled

3 prikazano na 50 str.

preuzmi dokument