M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb
tena_zovko
tena_zovko29 October 2017

M.Cooper, R.Hausman - Stanica - Molekularni pristup, 3. izdanje, Ostalo' predlog Biologia Molecolare. University of Zagreb

PDF (9 MB)
40 strane
37broj poseta
Opis
Molekularna biologija, poglavlje 14, stanicni ciklus
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 strane / 40

ovo je samo pregled

3 shown on 40 pages

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 shown on 40 pages

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 shown on 40 pages

preuzmi dokument

ovo je samo pregled

3 shown on 40 pages

preuzmi dokument
14-pogl.indd

Poglavlje14Stani~ni ciklus

Eukariotski stani~ni ciklus 591

Regulatori napredovanja kroz stani~ni ciklus 599

Doga|aji u M-fazi 608

Mejoza i oplodnja 615

Mati~ne stanice i odr`avanje zreloga tkiva 621

KLJU^NI POKUS: Otkri}e MPF-A 600

KLJU^NI POKUS: Kultura zametnih mati~nih stanica 622

S A MO REP RO DUK CI JA JE BIT NA I JE DIN STVE NA OSO BI NA STA NI CE, a ti me i svih `i vih or ga ni za ma. Sve se sta ni ce raz mno ̀ a va ju ta ko da se po di je le na dvi je, pa od sva ke ro di telj ske sta ni ce nas ta ju dvi je sta ni ce-k}e ri po zav r {et ku sva ko-

ga cik lu sa sta ni~ ne dio be. No vo nas ta le sta ni ce-k}e ri da lje sa me ras tu i di je le se, te omo gu }u ju nas ta ja nje mno{ tva sta ni ca, a sve proiz la ze od jed ne ro di telj ske sta ni ce. Naj jed nos tav ni ji je prim jer bak te ri ja, ko ja na prin ci pu sta ni~ no ga ras ta i dio be stva ra ko lo ni ju sas tav lje nu od mi li ju na sta ni ca po tom stva ti je kom sa mo jed ne no }i, ako je na hra nji voj pod lo zi. Mno go slo ̀ e ni ji prim jer do ga |a se kod op lo |e ne jaj ne sta ni ce ko ja po nav lja njem cik lu sa sta ni~ no ga ras ta i dio be do vo- di do stva ra nja vi {e od 1013 sta ni ca ko je ~i ne ljud sko ti je lo.

Dio ba sva ke sta ni ce mo ra bi ti pom no re gu li ra na i koor di ni ra na sa sta ni~ nim ras tom i rep li ka ci jom DNA da bi se osi gu ra lo nas ta ja nje sta ni ca po to ma ka, ko je sad r ̀ a va ju neo{ te }e ne ge no me. Kod eu ka riot ske sta ni ce, ti jek sta ni~ no ga cik lu- sa kon tro li ra niz pro tei n-ki na za ko je su sas tav ni dio sta ni ce od kva sa ca do si sa- va ca. Kod vi {ih eu ka rio ta, sta ni~ ni cik lus re gu li ra ju fak to ri ras ta od go vor ni za sta ni ~nu pro li fe ra ci ju ta ko da dio ba po je di ne sta ni ce bu de u skla du s pot re ba- ma or ga niz ma u cje li ni. Me |u tim, pog rje{ ke u re gu la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa vr lo su ~es te i uz rok su ab nor mal noj pro li fe ra ci ji u sta ni ce ra ka pa su stu di je o sta ni- ~nom cik lu su i ra ku pos ta le me |u sob no us ko po ve za ne, sli~ no kao pri prou ~a va- nju od no sa nas tan ka tu mo ra i sta ni~ nih sig nal nih pu te va ko je smo ob jas ni li u 13. pog lav lju.

Sta ni~ ni cik lus eu ka riot ske sta ni ce Dio be ni cik lus ve }i ne sta ni ca sas to ji se od ~e ti ri ju me |u sob no po ve za nih pro ce- sa: sta ni~ no ga ras ta, rep li ka ci je DNA, ras pod je le udvostru~enih kro mo so ma sta- ni ca ma-k}e ri ma i pod je le sta ni ca. Kod bak te ri ja, sta ni~ ni ra st i rep li ka ci ja DNA od vi ja ju se ti je kom ve }eg di je la sta ni~ no ga cik lu sa, a dup li ci ra ni kro mo so mi ra- spo re |u ju se u sta ni ce-k}e ri povezani sa sta ni~ nom mem bra nom. Me |u tim, kod eu ka rio ta, sta ni~ ni je cik lus slo ̀ e ni ji i sas to ji se od ~e ti ri ju za seb nih fa za. Prem da je sta ni~ ni ra st obi~ no nep re ki dan pro ces, DNA se sin te ti zi ra ti je kom sa mo jed ne fa ze sta ni~ no ga cik lu sa, a rep li ci ra ni se kro mo so mi ta da smje{ ta ju u jez gre sta ni- ca-k}e ri se ri jom slo ̀ e nih pro ce sa ko ji pret ho de dio bi sta ni ce. Nap re do va nje

592 Poglavlje 14

G2

G1

S me|ufaza

M

Slika 14-1. Faze stani~noga ciklusa. Diobeni ciklus kod ve}ine eukariotskih stanica mo`e se podijeliti u 4 zasebne faze: M, G1, S i G2-faza. Nakon M-faze (mitoza) slijedi citokineza. Tijekom S- fa ze doga|a se replikacija DNA. Stanica raste tijekom interfaze koja uklju~uje G1, S i G2-fazu. Trajanje faza stani~noga ci klusa koji smo ovdje prikazali je ti- pi ~no za stanice sisavaca koje se brzo dijele.

kroz fa ze sta ni~ no ga cik lu sa kon tro li ra ju re gu la tor ni me ha niz mi ko ji koor di- ni ra ju raz li ~i te do ga |a je u sta ni~ nom cik lu su, ali ta ko |er po ve zu ju sta ni~ ni cik lus s iz van sta ni~ nim sig na li ma ko ji kon tro li ra ju sta ni~ nu pro li fe ra ci ju.

Fa ze sta ni~ noga cik lu sa

Ti pi ~an eu ka riot ski sta ni~ ni cik lus ko ji se od vi ja prib li` no sva ka 24 sa ta mo- `e mo pra ti ti na kul tu ri ljud skih sta ni ca. Kao {to se mo ̀ e vid je ti pod mik ro- sko pom, sta ni~ ni cik lus ~i ne dva os nov na di je la: mi to za i in ter fa za. Mi to za (dio ba sta ni~ ne jez gre) je naj dra ma ti~ ni je raz dob lje sta ni~ no ga cik lu sa u ko- jem se zbi va od va ja nje kro mo so ma sta ni ca-k}e ri i obi~ no zav r {a va dio bom sta ni ce (ci to ki ne za). Me |u tim, mi to za i ci to ki ne za tra ju sa mo oko je dan sat, a preos ta lo vri je me, oko 95% sta ni~ no ga cik lu sa zau zi ma in ter fa za – raz- dob lje iz me |u dvi ju mi to za. Ti je kom in ter fa ze kro mo so mi su dekondenzi- rani i ras po re |eni po ci je loj jez gri, ta ko da ona mor fo lo{ ki iz gle da jed no li- ~no. Na mo le ku lar noj ra zi ni in ter fa za je raz dob lje u ko jem se od vi ja ju i sta ni~ ni ra st i rep li ka ci ja DNA ka ko bi se sta ni ca prip re mi la za dio bu.

Ti je kom ci je le in ter fa ze sta ni ca pos tup no i pra vil no ras te te ud vos tru ~u- je svo ju ve li ~i nu, a DNA se sin te ti zi ra sa mo u jed nom di je lu in ter fa ze. [to vi- {e, sin te za DNA di je li cik lus eu ka riot ske sta ni ce u ~e ti ri za seb ne fa ze (sli ka 14-1). M-fa za cik lu sa od go va ra mi to zi, na kon ko je u pra vi lu sli je di ci to ki ne- za. Za tim sli je di G1-fa za, ko ja pred stav lja in ter val iz me |u mi to ze i po ~et ka re pli ka ci je DNA. Ti je kom G1-faze sta ni ca je me ta bo li~ ki ak tiv na i nep res ta- no ras te, ali bez rep li ka ci je DNA. Na fa zu G1 nadovezuje se S-fa za (sinteza) u ko joj se od vi ja rep li ka ci ja DNA. Dov r {e njem sin te ze DNA za po ~i nje G2- fa za u ko joj se nas tav lja sta ni~ ni ra st i sin te za pro tei na pot reb nih za prip re- mu mi to ze.

Tra ja nje fa za sta ni~ no ga cik lu sa znat no se raz li ku je u raz li ~i tih vr sta sta- ni ca. Za ti pi~ nu ljud sku sta ni cu ko ja se raz mno ̀ a va u vre men skom cik lu su

od 24 sa ta, G1-faza tra je oko 11 sa ti, S-fa za oko 8 sa ti, G2-faza oko 4 sa ta i M-fa za oko 1 sat. Ne ke dru ge vr- ste sta ni ca di je le se mno go br ̀ e. Na prim jer, sta ni ce pupaju}eg kvas ca pro la ze kroz sve ~e ti ri fa ze sta ni~- no ga cik lu sa za oko 90 mi nu ta. ^ak i kra }e tra ja nje sta ni~ no ga cik lu sa (30 mi nu ta i ma nje), ko je se do ga- |a od mah po op lod nji jaj ne sta ni ce, uo ~e no je kod ra nih em brio nal nih sta ni ca (sli ka 14-2). No u ovom slu ~a ju sta ni~ ni ra st izos ta je, a sta ni~ ni cik lus po ~et- nih em brio nal nih sta ni ca o~i tu je se u vr lo br zoj raz- dio bi ci top laz me jaj ne sta ni ce u ma nje no vo nas ta le sta ni ce. Fa ze G1 i G2 izos ta ju, a rep li ka ci ja DNA se do- ga |a vr lo br zo te se na taj na ~in vr lo krat ka S-fa za iz- mje nju je s M-fa zom.

Za raz li ku od br ze pro li fe ra ci je em brio nal nih sta ni- ca, ne ke sta ni ce `i vo ti nja u od ras loj do bi sas vim pre- sta ju s dio bom (npr. `iv ~a ne sta ni ce), a ne ke dru ge sta ni ce di je le se sa mo pov re me no, kad se za to uka ̀ e pot re ba, ka ko bi se na dom jes ti le one sta ni ce ko je su iz gub lje ne zbog oz lje de ili sta ni~ ne smr ti. U ovaj tip sta ni ca ub ra ja mo ko` ne fib rob las te, kao i sta ni ce ne- kih unut ra{ njih or ga na, kao {to je jet ra. Da lje u tek- stu ob jas nit }e mo da ove sta ni ce iz la ze iz G1-faze i ula ze u fa zu mi ro va nja naz va nu G0, u ko joj os ta ju me ta bo li~ ki ak tiv ne, ali ne ma pro li fe ra ci je sve dok ih na to ne po tak nu od go va ra ju }i iz van sta ni~ ni sig na li.

Stani~ni ciklus 593

S S S

M M M

Slika 14-2. Stani~ni ciklus embrio- nalne stanice. Kod stani~noga ciklusa ranog embrija citoplazma jaja vrlo se brzo dijeli u manje stanice. Tijekom ovih ciklusa stanice ne rastu, G1 i G2-faza nedostaju te se stani~ni ciklus sastoji od kratkih S- faza koje se izmjenjuju s M-fazama.

Slika 14-3. Identifikacija stanice u S-fazi inkorporacijom radioaktivnoga timidina. Stanice se izla`u djelovanju radioaktivnoga ti- midina i analiziraju autoradiografijom. Obilje`e- ne stanice ozna~ene su strjelicama. (iz D. W. Stacey et al.,1991.Mol.Cell Biol.11:4053.)

Ana li za sta ni~ no ga cik lu sa zah ti je va iden ti fi ka ci ju sta ni ca u raz li ~i tim fa- za ma ko je smo pri je ob jas ni li. Prem da se sta ni ce za vri je me mi to ze mo gu ras poz na ti pod mik ros ko pom, za ras poz na va nje os ta lih fa za sta ni~ no ga ci- klu sa slu ̀ i mo se bio ke mij skim pa ra met ri ma. Sta ni ce u S-fa zi mo gu se la ko ras poz na ti s ra dioak tiv no obi lje ̀ e nim ti mi di nom ko ji se ko ris ti samo za sin- te zu DNA (sli ka 14-3). Na prim jer, kul tu ru ljud skih sta ni ca ko je se br zo raz- mno ̀ a va ju, iz lo ̀ i se dje lo va nju ra dioak tiv no ga ti mi di na krat ko vri je me (npr. 15 mi nu ta) i na kon au to ra diog raf ske ana li ze na la zi mo tre }i nu sta ni ca ra dioak tiv no oz na ~e nih, {to od go va ra frak ci ji sta ni ca u S-fa zi.

Va ri jan te ovak vih po ku sa mo gu se pri mi je ni ti i kod od re |i va nja du lji ne tra ja nja raz li ~i tih sta di ja sta ni~ no ga cik lu sa. Ta ko npr., uz mi mo u raz mat ra- nje po kus u ko me su sta ni ce iz lo ̀ e ne dje lo va nju ra dioak tiv no ga ti mi di na u tra ja nju od 15 mi nu ta, na kon ~e ga se is te sta ni ce na da lje razli~ito dugo kul- ti vi ra ju pri je au to ra diog ra fi je. Ra dioak tiv no oz na ~e ne in ter faz ne sta ni ce ko je su bi le u S-fa zi ti je kom iz la ga nja dje lo va nju ra dioak tiv no ga ti mi di na bit }e vidljive ne ko li ko slje de }ih sa ti dok bu du nap re do va le kroz os ta tak S- fa ze i G2-fazu. S dru ge stra ne, ra dioak tiv no oz na ~e ne mi to ti~ ke sta ni ce vid- jet }e se tek na kon 4 sa ta od oz na ~i va nja. Ovo raz dob lje od 4 sa ta od go va ra tra ja nju G2-faze – to je mi ni mal no vri je me pot reb no sta ni ci da ve ̀ e ra dioak- tiv ni ti mi din pri kra ju S-fa ze i u|e u mi to zu.

Sta ni ce u raz li ~i tim sta di ji ma sta ni~ no ga cik lu sa mo gu se ras poz na ti s po- mo }u nji ho va sad r ̀ a ja DNA (sli ka 14-4). Na prim jer, `i vo tinj ske su sta ni ce

594 Poglavlje 14

2n koli~ina sadr`aja DNA po stanici

4n

b ro

j st

an ic

a

G1

G2 M +

S

Slika 14-4. Odre|ivanje stani~no- ga DNA sadr`aja. Populacija stanica ozna~uje se fluore- scentnom bojom koja se ve`e na DNA. Stanice zatim prolaze kroz proto~ni citometar, koji mjeri jakost fluorescencije svake stanice. Podatci su prikazani u odnosu broja stanica prema jakosti fluorescencije, a ona je proporcional na sadr`aju DNA. Na grafikonu smo dobili krivulju sa dva vrha koji odgo varaju stanicama sa sadr`ajem DNA 2n, ili 4n, ovisno o tome da li su u G1 ili G2/M- fazama stani~noga ciklusa. Stanice u S- -fazi imaju sadr`aj DNA izme|u 2n i 4n i na grafikonu su raspodijeljene izme|u dva vrha krivulje.

u G1-fazi dip loid ne (sad r ̀ a va ju dvi je ko pi je sva kog kro mo so ma) pa se sad r- `aj nji ho ve DNA oz na ~u je kao 2n (gdje n ozna~uje hap loid ni sadr`aj DNA ge no ma). Za vri je me S-fa ze pro ce som rep li ka ci je po ve }a va se sad r ̀ aj DNA od 2n na 4n, tako da sta ni ce u S-fa zi ima ju kon ste la ci ju DNA iz me |u 2n i 4n. Na da lje, sad r ̀ aj DNA os ta je na ra zi ni 4n u sta ni ca ma ko je ula ze u G2- fazu i M-fa zu, da bi se na kon ci to ki ne ze sma njio na 2n. Ek spe ri men tal no se sta ni ~na kon ste la ci ja DNA mo ̀ e pri ka za ti in ku ba ci jom sta ni ca s fluo res cen- tnom bo jom ko ja ima afi ni tet ve za nja za DNA, a po tom se ja ko st fluo res cen- ci je po je di ne sta ni ce ana li zi ra pro to~ nim ci to met rom te na taj na ~in razvr- sta va sta ni ce ko je se na la ze u G1, S i G2/M-fazi sta ni~ no ga cik lu sa.

Djelovanje sta ni~ no ga ras ta i iz van sta ni~ nih sig na la na re gu la ci ju sta ni~ no ga cik lu sa Nap re do va nje sta ni ce kroz dio be ni cik lus re gu li ra ju iz van sta ni~ ni sig na li iz ok ru ̀ e nja kao i unu tar nji sig na li ko ji pra te i koor di ni ra ju broj ne pro ce se ko ji se od vi ja ju tije kom raz li ~i tih fa za sta ni~ no ga cik lu sa. Prim jer ut je ca ja iz van sta ni~ nih sig na la na re gu la ci ju sta ni~ no ga cik lu sa vid ljiv je u dje lo va- nju fak to ra ras ta kod pro li fe ra ci je `i vo tinj ske sta ni ce. Raz li ~i ti sta ni~ ni pro- ce si, kao {to je sta ni~ ni ra st, rep li ka ci ja DNA i mi to za, mo ra ju bi ti koor di ni- ra ni ti je kom sta ni~ no ga cik lu sa. Za to je pot reb an niz kon trol nih to ~a ka ko je re gu li ra ju nap re do va nje kroz raz li ~i te fa ze sta ni~ no ga cik lu sa.

Glav na re gu la tor na to~ ka sta ni~ no ga cik lu sa, u mno gih vr sta sta ni ca, na- la zi se pri kra ju G1-faze i kon tro li ra nap re do va nje iz G1 u S-fa zu. Ova re gu- la tor na to~ ka pr vi je put pre poz na na u is pi ti va nji ma kvas ca Sac cha ro myces ce re vi siae, gdje se spo mi nje kao START (sli ka 14-5). Kad jed nom sta ni ca pri- je |e START, de fi ni tiv no ula zi u S-fa zu i pro la zi je dan sta ni~ ni dio be ni ci- klus. Me |u tim, pro la zak kroz START je vi so ko re gu li ran do ga |aj u sta ni- ~nom cik lu su kvas ca, ko ji se kon tro li ra vanj skim sig na li ma, kao {to je do- stup no st hra nji vim tva ri ma, ali i ve li ~i nom sta ni ce. Na prim jer, ako kvas cu ne dos ta ju hra nji ve tva ri, sta ni~ ni se cik lus zaus tav lja na STA R T i ula zi u fa- zu mi ro va nja um jes to nap re do va nja pre ma S-fa zi. Ta ko START pred stav lja od lu ~u ju }u to~ ku u ko joj sta ni ca ut vr |u je ima li do volj no hra nji vih tva ri za nap re do va nje kroz os ta tak dio be no ga cik lu sa. Po li pep tid ni fak to ri ko ji sig- na li zi ra ju spa riva nje kva{ ~e vih sta ni ca, ta ko |er mo gu zaus ta vi ti sta ni~ ni cik lus na STA R T, {to omo gu }u je hap loid nim sta ni ca ma da se stope, um jes to da pri je |u u S-fa zu.

Osim {to je od lu ~u ju }a to~ ka za motrenje iz van sta ni~ nih sig na la, START je to~ ka na ko joj se koor di ni ra sta ni~ ni ra st s rep li ka ci jom DNA i dio bom sta ni ce. Va` no st ove re gu la ci je po seb no je zna ~aj na kod pupanja kvas ca gdje sta ni~ nom dio bom nas ta ju sta ni ce po tom ci ko je su raz li ~i te po ve li ~i ni: ve li ka sta ni ca-maj ka i ma la sta ni ca-k}i. Ka ko bi sta ni ce kvas ca zad r ̀ a le kon- stan tnu ve li ~i nu ma la sta ni ca-k}i mo ra ras ti br ̀ e od ve li ke sta ni ce-maj ke pri je po nov ne dio be. Pra }e njem ve li ~i ne sta ni ce us kla |u je se sta ni~ ni ra st s os ta lim do ga |a ji ma sta ni~ no ga cik lu sa. Ovu re gu la ci ju obav lja kon trol ni me ha ni zam ko jim se od sva ke sta ni ce zah ti je va da dos tig ne mi ni mum ve li- ~i ne pri je ne go pri je |e START. Zbog to ga, ma le sta ni ce-k}e ri pro ve du du lje vri je me u G1-fazi i ras tu br ̀ e od sta ni ce-maj ke.

Pro li fe ra ci ja ve }i ne `i vo tinj skih sta ni ca u G1-fazi sta ni~ no ga cik lu sa od vi- ja se sli~ no. Ta ko se od lu ~u ju }a to~ ka pri kra ju G1-faze, kod `i vo tinj skih sta- ni ca naz va na restrikcijskom to~ kom (en gl. res tric tion poi nt) po na {a jed na ko kao START kod kvas ca (sli ka 14-6). No, kod `i vo tinj skih sta ni ca, pro la zak kroz sta ni~ ni cik lus kon tro li ra ju pog la vi to iz van sta ni~ ni fak to ri ras ta ko ji sig na li zi ra ju sta ni~ nu pro li fe ra ci ju, dok su kod kvas ca to hra nji ve tva ri. Pri- klad ni fak to ri ras ta omo gu }u ju sta ni ci prje la zak restrikcijske to~ ke i ula zak

Stani~ni ciklus 595

G1

S

M

stanica-majka

stanica-k}i(A)

(B)

start faktori parenja

veli~ina stanice

hranjive tvari

G2

1 mm

Slika 14-5. Regulacija stani~noga ciklusa kvasca Saccharomyces cerevisiae. (A) Stani~ni ciklus kvasca Saccharomyces cerevisiaepoglavito je reguliran u to~kipri kraju G1-faze, nazvanoj START. Prolazak kroz to~ku START kontrolira dostupnost hranjivih tvari, faktori sparivanja (engl. mating factors) i veli~ina stanice. Treba na- pomenuti da se ove kva{~eve stanice dijele pupanjem. Pupoljci se formiraju odmah nakon prolaska kroz START, te nastavljaju rasti sve dok se ne odvoje od stanice-majke nakon mitoze. Nastala stanica-k}i je manja od stanice-majke te joj je potrebno dulje vrijeme rasta u G1-fazi sljede}ega stani~noga ciklusa. Iako se faze G1 i S odvijaju nor- malno, diobeno vreteno zapo~inje se oblikovati tijekom S-faze, tako da stani~nom ciklusu kvasca nedostaje G2-faza. (B) – Mikrofotografija S. cerevisiae do bivena pretra`nim elektronskim mikroskopom. Veli~ina pupoljka odra`ava poziciju stanice u stani~nomu ciklusu. (B, David M. Phillips/Visuals Unlimited.)

Slika 14-6. Regulacija stani~noga ciklusa `ivotinjske stanice faktorima rasta. Dostupnost faktora rasta kontrolira sta ni~ni ciklus `ivotinjske stanice u to~ki pred kraj G1-faze koja se naziva re strikcijskom to~kom. Ako faktor rasta nije prisutan tijekom G1-faze, stanica ulazi u stanje mirovanja stani~noga ciklusa, nazvano G0-faza.

G2

restrikcijska to~ka

S

M

G1 G0-faza

faktori rasta

u S-fa zu. Kad jed nom sta ni ca pri je |e restrikcijsku to~ ku, ula zi u S-fa zu i na- pre du je do kra ja sta ni~ no ga cik lu sa, ~ak i on da ako ne pos to ji dalj nja sti mu- la ci ja fak to rima ras ta. S dru ge stra ne, ako prik lad ni fak to ri ras ta ni su pri sut- ni u G1-fazi pro ces kroz sta ni~ ni cik lus se zaus tav lja na restrikcijskoj to~ ki. Tak ve sta ni ce ula ze u fa zu mi ro va nja, naz va nu G0, gdje mo gu os ta ti du lje vri je me bez pro li fe ra ci je. Sta ni ce u G0-fa zi me ta bo li~ ki su ak tiv ne, ia ko im je zaus tav ljen ra st i sma nje na sin te za pro tei na. Ka ko je ve} re ~e no, mno ge `i vo tinj ske sta ni ce os ta ju u G0-fazi sve do tre nut ka po ja ve prik lad nog fak to- ra ras ta ili ne kih dru gih iz van sta ni~ nih sig na la ko ji ih po tak nu na pro li fe ra- ci ju. Na prim jer, ko` ni fib rob las ti os ta ju u G0-fazi ta ko du go dok ih iz van sta- ni~ ni sig nal ne po tak ne na dio bu ka ko bi pop ra vi li {te tu nas ta lu zbog oz lje- de. Pro li fe ra ci ju ovih sta ni ca po ti ~e trom bo cit ni fak tor ras ta (PDGF, en gl. pla te let-de ri ved growth fac tor), ko ji se os lo ba |a za vri je me zgru {a va nja kr vi te sig na li zi ra pro li fe ra ci ju fib rob las ta u oko li ni oz li je |e nog tki va.

Kod ve }i ne sta ni ca re gu la ci ja pro li fe ra ci je ug lav nom se do ga |a u G1- fazi, no kod ne kih se to do ga |a u G2-fazi. Prim jer je za to sta ni~ ni cik lus fi sij- sko ga kvas ca Schi zo sac cha ro mycespom be (sli ka 14-7). Za raz li ku od Sac cha ro- myces ce re vi siae, re gu la ci ju sta ni~ no ga cik lu sa pri mar no obav lja kon tro la prje las ka iz G2 u M-fa zu i to je glav na to~ ka na ko joj se prov je ra va ve li ~i na sta ni ce i dos tup no st hra nji vih tva ri. Najbolji prim jer kon tro le sta ni~ noga cik lu sa u G2-fazi kod `ivotinja jesu oo ci te. Oo ci te kra lje` nja ka mo gu du go vre me na (ne ko li ko de set lje }a kod lju di) os ta ti zaus tav lje ne u G2-fazi, sve dok ih na nap re do va nje u M-fa zu ne po tak ne hor mon ska sti mu la ci ja. Iz-

596 Poglavlje 14

G2

G1

S

M

(A) (B) 1 2 3 4 5 6 7 8

5 mm Slika 14-7. Sta ni~ ni cik lus kidaju- }ega kvas ca. A) Kva sac ras te pro du ̀ u ju }i se jed na ko s obi ju stra na i di je li se ta ko da ob li ku je sti jen ku po sre di ni sta ni ce. Za raz li ku od sta ni~ no ga cik lu sa kod pupaju }eg kvas- ca, sta ni~ ni cik lus kidaju}ega kvasca pro- la zi kroz nor mal ne fa ze G1, S, G2 i M. Tre ba nag la si ti da se ci to ki ne za od vi ja u G1-fazi. Du lji na sta ni ce upu}u je na nje zi- nu po zi ci ju u sta ni~ no me cik lu su. B) Svjet los na mik rog raf ija pri kaz po ka- zu je uzas top ne fa ze mi to ze i ci to ki ne zu u Schi zo sac cha ro myces pom be. (B, do pu{ te- njem C. F. Ro bi now, Uni ver si ty of Wes t- ern On ta rio).

Sli ka 14-8. Kon trol ne to~ ke u sta ni~ no me cik lu su. Od re |e ne kon trol ne to~ ke u sta ni~ no me cik lu su osi gu ra va ju da sa mo kom plet ni ge- no mi pre la ze u sta ni ce-k}e ri. Jedna va`na kon trol na to ~ ka zaus tav lja sta ni~ ni cik lus u fa zi G2, kao od go vor na o{ te }e nu ili ne rep li ci ra nu DNA. Zbog o{ te }e nja DNA ta ko |er do la zi do zaus tav lja nja sta ni~ no ga cik lu sa u kon trol noj to~ ki u G1 i S-fa zi. Kon trol na to~ ka u M-fa zi zaus tav lja mi to zu u slu ~a ju ka da kro mo so mi-k}e ri ni su pra vil no po re- da ni na diobenom vretenu.

G2

o{te}ena DNA

nereplicirana ili o{te}ena DNA

G1

S

M

nepravilno poredani kromosomiSTOP

STOP

STOP

o{te}ena DNA

STOP

van sta ni~ ni sig na li ta ko kon tro li ra ju sta ni~ nu pro li fe ra ci ju re gu la ci jom nap- re do va nja od G2 do M-fa ze, kao i od G1 do S-fa ze sta ni~ no ga cik lu sa.

Kon trol ne to~ ke sta ni~ no ga cik lu sa Kon trol ne to~ ke, ob ja{ nje ne u pret hod nom od lom ku, re gu li ra ju nap re do va- nje kroz sta ni~ ni cik lus u od no su na ve li ~i nu sta ni ce i iz van sta ni~ ne sig na- le, kao {to su hra nji ve tva ri i fak to ri ras ta. Na da lje, u raz li ~i tim fa za ma sta ni- ~no ga cik lu sa, do ga |a ji se mo ra ju koor di ni ra ti je dan s dru gim na na ~in da se po jav lju ju po to~ no od re |e nom re du. Na prim jer, vr lo je va` no da sta ni- ca ne za po~ ne mi to zu dok rep li ka ci ja ge no ma ne bude dovr{ena. U sup rot- nom, do go di la bi se ka tas tro fal na dio ba sta ni ce pri ~e mu sta ni ce-k}e ri ne bi nas li je di le kom plet ne ko pi je gen sko ga ma te ri ja la. Kod ve }i ne sta ni ca je ko- or di na ci ja iz me |u raz li ~i tih fa za sta ni~ no ga cik lu sa ovis na o ni zu kon trol- nih to ~a ka sta ni~ no ga cik lu sa ko je ne do pu{ ta ju ula zak u slje de }u fa zu cik- lu sa ako ni su iz vr {e ne sve rad nje iz pret hod ne fa ze.

Ne ke kon trol ne to~ ke sta ni~ no ga cik lu sa osi gu ra va ju rep li ka ci ju sa mo pot pu nih i neo{ te }e nih kro mo so ma i nji ho vu pre da ju sta ni ca ma-k}e ri ma (sli ka 14-8). Ove kon trol ne to~ ke ot kri va ju ne rep li ci ra ne ili o{ te }e ne DNA i koor di ni ra ju dalj nje nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus dov r {e njem rep li ka- ci je DNA ili nje nim pop rav kom. Na prim jer, kon trol na to~ ka u G2-fazi ne do pu{ ta po ~e tak mi to ze dok se ne oba vi rep li ka ci ja DNA. Ona ot kri va ne- rep li ci ra ne di je lo ve DNA i sig na li zi ra mi ro va nje sta ni~ no ga cik lu sa. Na taj na ~in spr je ~a va po ~e tak M-fa ze dok se ne zav r {i S-fa za, pa sta ni ce os ta ju u G2-fazi ta ko du go dok se ge nom pot pu no ne rep li ci ra. Je di no ta da sta ni ca mo ̀ e za po ~e ti mi to zu i pot pu no rep li ci ra ne kro mo so me pre da ti sta ni ca ma -k}e ri ma. Osim to ga, kon trol na to~ ka G2-faze ta ko |er ot kri va o{ te }e nja DNA mo le ku le nas ta la zbog zra ~e nja. Ako je ot kri ve no o{ te }e nje DNA, zaus tav lja se cik lus na kon trol noj to~ ki i pop rav lja nas ta lo o{ te }e nje, kako se ono ne bi prenijelo na sta ni ce-k}e ri.

Stani~ni ciklus 597

zaustavljanje stani~noga ciklusa

Chk2

ATRATM

P

Chk1

P

o{te}ena ili nereplicirana DNA

senzorni proteini

ADP ADP

Sli ka 14-9. Zastoj sta ni~ no ga cik lu- sa na kon trol nim to~ ka ma u G1, S i G2-fazi. Kom ple ks sen zor skih pro tei na ve ̀ e se za o{ te }e nu ili ne rep li ci ra nu DNA i ak- ti vi ra ATM i ATR pro tei n-ki na ze. ATM za tim fos fo ri li ra i ak ti vi ra Chk2 pro tei n- ki na zu, a ATR Chk1 protein-kinazu, {to do vo di do zaus tav lja nja sta ni~ no ga cik lu sa.

O{ te }e nja DNA ne zaus tav lja ju sta ni~ ni cik lus sa mo u G2-fa zi, ve} i na kon trol nim to~ ka ma u G1 i S-fa zi. Na kon trol noj to~ ki u G1-fazi mo ̀ e se po- pra vi ti o{ te }e nje pri je ulas ka u S-fa zu u ko joj bi se do go di la rep li ka ci ja o{ te- }e ne DNA. Kon trol na to~ ka S-fa ze omo gu }u je nep re kid no mot re nje in te gri- te ta DNA ka ko bi o{ te }e nje bi lo ot klo nje no pri je rep li ka ci je. Na taj na ~in, kon trol na to~ ka S-fa ze omo gu }u je kva li tet nu kon tro lu i pop ra vak bi lo kak- ve pog rje{ ke ko ja se mo ̀ e do go di ti ti je kom rep li ka ci je DNA, kao {to je ugradnja pog rje{ nih ba za ili ne pot pu na rep li ka ci ja seg me na ta DNA.

Zaus tav lja nje cik lu sa na kon trol nim to~ ka ma u G1, S i G2-fazama po ti ~u pro tein ski kom plek si ko ji se ve ̀ u za o{ te }e ne ili ne rep li ci ra ne DNA (sli ka 14-9). Ti pro tei ni (ko ji jo{ ni su sas vim prou ~e ni) dje lu ju kao sen zo ri za DNA o{ te }e nja i za tim pok re }u sig nal ne pu te ve ko ji vo de ne samo ka zaus tav lja- nju sta ni~ no ga cik lu sa, ve} i ak ti va ci ji pop ra vka DNA, a po ne kad i do sta- ni~ ne smr ti. Pro tei ni sen zo ri dje lu ju na dvi je srod ne pro tei n-ki na ze, oz na ~e- ne kao ATM i ATR ko je se ak ti vi ra ju zbog o{ te }e nja DNA. Ovi su pro tei ni za ra na iden ti fi ci ra ni, jer mu ta ci je u ge nu za ATM do vo de do bo les ti ataxia te lan giec tasia, ko ja uz ro ku je pog rje{ ke u `iv ~a no mu i imu no lo{ ko mu sus ta- vu, kao i ~es tu po ja vu tu mo ra kod tak vih bo les ni ka. Zatim je otkriven ATR koji je bliski srodnik ATM. Kad se jed nom ak ti vi ra ju, ATM fosforilira i akti- vira protein-kinazu Chk2, a ATR protein-ki na zu Chk1. Chk1 i Chk2 sada fos fo ri li ra ju sas tav ne di je lo ve re gu la tor nog apa ra ta sta ni~ no ga cik lu sa ka- ko bi zaus ta vi le nap re do va nje sta ni~ no ga cik lu sa, o ~e mu }e mo go vo ri ti u nas tav ku ovo ga pog lav lja.

U sta ni ca ma si sa va ca, zaus tav lja nje na kon trol noj to~ ki u G1-fa zi pos ti ̀ e se dje lo va njem jed no ga do dat nog pro tei na, p53, kojeg fos fo ri li ra ATM, no ta ko|er i Chk2 (sli ka 14-10). Fos fo ri la ci ja sta bi li zi ra p53, koji se ina~e brzo

598 Poglavlje 14

ORC

ORC

MCM

MCM

MCM

G1

G2

M

Sli ka 14-11 Og ra ni ~a va nje rep li ka ci je DNA. Rep li ka ci ja DNA og ra ni ~e na je na sa mo jed nu u jed nom sta ni~ nom cik lu su, a to se pos ti ̀ e pro tei ni ma MCM ko ji se ve ̀ u za is ho di{ te rep li ka ci je za jed no s pro tei ni ma ORC (kom ple ks rep li ka cij skog is ho di{ ta) i pot reb ni su za pok re ta nje rep li ka ci je DNA. Pro tei ni MCM mo gu ve za ti na DNA jedino u fa zi G1 {to omogu}uje inicijaciju rep li- ka ci je DNA u S-fa zi. Ka da rep li ka ci ja za po~ ne, MCM pro tei ni se uklanja ju ta ko da se slje de }a rep li ka ci ja mo ̀ e do go di ti tek na kon mi to ze.

Sli ka 14-10. Ulo ga p53 u zaus tav lja nju sta ni~ no ga cik lu sa u G1-fazi. Pro tein p53 ima klju~ nu ulo gu u zaus tav lja nju sta ni~ no ga cik lu sa u kon trol noj to~ ki fa ze G1. ATM i Chk2 fos fo ri la ci jom sta bi li zi ra ju p53 do vo de }i do br zog po vi {e nja ra zi- ne p53 kao od go vor na o{ te }e nje DNA. Pro tein p53 za tim po ti ~e ek spre si ju ge na {to do vo di do zaus tav lja nja sta ni~ no ga cik lu sa.

G2

o{te}enje DNA

razina povi{enja p53

S

M

G1

zastoj u G1-fazi

p53

STOP

Chk2ATM

P

PP

raz gra |u je, {to rezultira brzim podizanjem razine p53 u slu~aju o{te}enja DNA. Pro tein p53 je tran skrip cij ski fak tor i nje go va po vi {e na ekspresija do- vo di do indukcije cilj nih ge na ko ji zaus tav lja ju sta ni~ ni cik lus. Za nim lji vo je da je gen za p53 ~es to mu ti ran u tumorima. Gubitak funkcije p53, kao pos lje di ce ovih mu ta ci ja, spr je ~a va zastoj u G1-fa zi koji nastpa kao od go vor na o{ te }e nje DNA, ta ko da se o{ te }e na DNA rep li ci ra i pre da je sta ni ca ma- k}e ri ma bez pret hod nog pop rav ka. Nas lje |i va njem o{ te }e ne DNA po ve }a- va se broj mu ta ci ja i op }a nes ta bil no st sta ni~ no ga ge no ma, a sve to pri do no- si raz vo ju tu mo ra. Mu ta ci je ge na p53 je su naj ~e{ }e gen ske prom je ne pri po ja vi ra ka u lju di (vi di 15. pog lav lje) i po ka zu ju izu zet nu va` no st re gu la ci- je sta ni~ no ga cik lu sa u `i vo tu vi {es ta ni~ nih or ga ni za ma.

Pos to ji jo{ jed na kon trol na to~ ka sta ni~ no ga cik lu sa ko ja nad zi re cje lo vi- to st ge no ma, a smje{ te na je pri kra ju mi to ze (sli ka 14-8). U toj kon trol noj to ~ki, naz va noj kon trol na to~ ka dio be nog vre te na, nad gle da se ras po re |i va- nje kro mo so ma u dio be nom vre te nu osi gu ra va ju }i pre ci zan i is pra van ras- po red kro mo so ma u sta ni ce-k}e ri. Na prim jer, ako se je dan ili vi {e kro mo so- ma ne ras po re di is prav no u dio be nom vre te nu, mi to za se zaus tav lja u me ta- fa zi i ne do la zi do od va ja nja no vo rep li ci ra nih kro mo so ma u jez gre-k}e ri. Re zul tat kont rol ne to ~ke dio be nog vre te na je da se kro mo so mi ne od va ja ju sve dok kom plet ni se to vi kro mo so ma ni su po slo ̀ e ni za pod je lu sta ni ca ma - k}e ri ma.

Og ra ni ~a va nje na sa mo jed nu rep li ka ci ju DNA ti je kom sta ni ~no ga cik lu sa Kon trol na to~ ka u G2-fazi ne do pu{ ta po ~e tak mi to ze ako pri je to ga ni je do- vr {e na S-fa za i na taj na ~in ne do pu{ ta dis tri bu ci ju ne pot pu no rep li ci ra ne DNA u sta ni ce-k}e ri. Jed na ko je va` no da se ge nom rep li ci ra sa mo jed nom u ok vi ru jed no ga sta ni~ nog cik lu sa. Dak le, kad se jed nom seg me nt DNA rep li ci ra u S-fa zi, mo ra pos to ja ti kon trol ni me ha ni zam ko ji bi spri je ~io po- nov nu rep li ka ci ju DNA za vri je me dok sta ni ca ne zav r {i svoj cik lus i pro |e kroz mi to zu. Kao {to je ob ja {nje no u 5. po glav lju, sta ni ce si sa va ca ko ri ste na ti su }e is ho di {ta rep li ka ci je za vri je me ud vo stru ~a va nja DNA, pa po ~e- tak rep li ka ci je na sva kom od tih is ho di {ta mo ra bi ti pa ̀ lji vo kont ro li ran ka- ko bi se sva ki po je di ni seg ment ge no ma ud vo stru ~io sa mo jed nom za vri je- me S -fa ze sva kog sta ni ~nog cik lu sa.

Mo le ku lar ni me ha niz am ko ji og ra ni ~a va na sa mo jed nu rep li ka ci ju DNA ti je kom sta ni~ no ga cik lu sa uklju~uje dje lo va nje po ro di ce pro tei na (naz va nih MCM pro tei ni) ko ji se ve ̀ u za is ho di{ te rep li ka ci je za jed no s pro- te inima kom plek sa is ho di{ ta rep li ka cije (ORC, en gl. ori gin rep li ca tion com- plex) (vi di sli ku 5-16). MCM pro tei ni dje lu ju kao »fak to ri do pu{ te nja« (en gl. li cen si ng fac to rs) ko ji do pu{ ta ju po ~e tak rep li ka ci je (sli ka 14-11). Njihovo ve-

Stani~ni ciklus 599

G2

progesteron

M

mikroubrizgavanje citoplazme

M

Sli ka 14-12. Ot kri }e MPF. @ab lje oo ci te na la ze se zaus tav lje ne u G2-fazi sta ni~ no ga cik lu sa, a ula zak u M-fa zu mejoze po tak nut }e hor mon pro ges te ron. Na di jag ra mu je pri ka zan ek spe ri me nt gdje je u oo ci tu, zaus tav lje nu u G2-fazi, ub riz ga na ci top laz ma oo ci te ko ja je pro{ la prje la zak iz G2 u M-fa zu. Ci top laz mat ski tran sfer pok re nuo je u no voj oo ci ti prje la- zak iz G2 u M-fa zu bez hor mon ske sti mu la ci je, do ka zu ju }i ti me da je ci top laz mat ski fak tor (MPF) do vo ljan za indukciju ula ska u M-fa zu me jo ze.

za nje za DNA je re gu li ra no za vri je me sta ni~ no ga cik lu sa ta ko da se MCM pro tei ni mo gu ve za ti za is ho di{ te rep li ka ci je sa mo ti je kom G1-faze, do pu {ta- ju }i ini ci jaciju rep li ka ci je DNA u tre nut ku kad sta ni ca u|e u S-fa zu. Kad ini ci ja ci ja jed nom za po~ ne, MCM pro tei ni se uklanjaju iz is ho di{ ta ta ko da rep li ka ci ja ne mo ̀ e za po ~e ti jo{ jed nom ta ko du go dok sta ni ca ne pro |e kroz mi to zu i u|e u G1-fazu slje de }e ga sta ni~ noga cik lu sa. Pro tei n-ki na ze ko je re gu li ra ju nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus (o ~e mu }e bi ti ri je~ u slje- de }em od lom ku) spr je ~a va ju spa ja nje MCM pro tei na s DNA ti je kom S, G2 i M-fa ze sta ni~ no ga cik lu sa s po mo }u raz li ~i tih me ha ni za ma ~i je dje lo va nje jo{ ni je pot pu no raz ja{ nje no.

Re gu la to ri napredovanja kroz stani~ni cik lu s Jed no od naj za nim lji vi jih ot kri }a u suv re me noj sta ni~ noj bio lo gi ji je st na- ~in fun kcio ni ra nja mo le ku lar nih me ha ni za ma ko ji kon tro li ra ju nap re do va- nje eu ka riot ske sta ni ce kroz sta ni~ ni cik lus. Na {e sa da{ nje ra zu mi je va nje regu la ci je sta ni~ no ga cik lu sa proiz la zi iz objedinjavanja re zul ta ta do bi ve- nih ek spe ri men ti ma pro ve de ni ma na or ga niz mi ma raz li ~i tim po put kva- sca, je ̀ inca, `a be i si sav aca. Stu di je su po ka za le da sta ni~ ni cik lus kod svih eu ka rio ta kon tro li ra ju o~uva ni ni zo vi pro tei n-ki na za ko ji su od go vor ni za pok re ta nje glav nih prje la za ka u sta ni~ nom cik lu su.

MPF: Di mer Cdc2 i cik li na Tri, u po ~et ku od vo je na, ek spe ri men tal na pris tu pa pri do ni je la su iden ti fi ka- ci ji klju~ nih mo le ku la ko je sud je lu ju u re gu la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa. Pr vo is- tra ̀ i va nje za po ~e lo je is pi ti va njem `ab ljih oo ci ta (sli ka 14-12). Oo ci te su zaus tav lje ne u G2-fazi sta ni~ no ga cik lu sa i na la zi le su se u sta nju mi ro va nja ta ko du go dok ih hor mo nal ni sti mu la ns ni je pok re nuo u M-fa zu me jo ze (ob ja{ nje nje sli je di da lje u ovom pog lav lju). Dva neo vis na ti ma is tra ̀ i va ~a (Yo shio Ma sui i Cle me nt Mar ke rt bi li su je dan tim, a ~la no vi dru gog ti ma bi li su Den nis Smi th i Ro be rt Ec ker) 1971. go di ne ot kri li su da se oo ci te, ko je su u sta nju mi ro va nja u G2-fazi, mo ̀ e po tak nu ti na ula zak u M-fa zu mi- krou briz ga va njem ci top laz me oo ci ta ko je su bi le hor mon ski sti mu li ra ne. Dak le, ci top laz mat ski fak tor, pri su tan u hor mon ski tre ti ra nim oo ci ta ma bio je do vo ljan da po tak ne prje la zak iz G2 u M-fa zu kod oo ci ta ko je ni su bi le hor mon ski tre ti ra ne. Ula zak oo ci ta u me jo zu ~es to se na zi va saz ri je va njem oo ci ta pa je zbog to ga ovaj ci top laz mat ski fak tor do bio na ziv fak tor poti- canja sa zri je va nja – MPF (en gl. matu ra tion pro mo ti ng fac tor). No, dalj nje stu- di je po ka zu ju da ak tiv no st MPF ni je og ra ni ~e na sa mo na ula zak oo ci ta u me jo zu. Nap ro tiv, MPF je pri su tan i u so mat skim sta ni ca ma gdje po ti ~e ula- zak u M-fa zu mi to ti~ ko ga cik lu sa. Sto ga se dr ̀ i da je MPF glav ni re gu la tor prje las ka iz G2 u M-fa zu sta ni~ no ga cik lu sa.

Dru go is tra ̀ i va nje ko je je pri do ni je lo bo ljem ra zu mi je va nju re gu la ci je sta ni~ no ga cik lu sa od no si se na ge ne ti~ ku ana li zu kvas ca, a pred vo dio ga je Lee Har twe ll sa svo jim ko le ga ma ra nih 1970-tih go di na. Prou ~a va ju }i pupaju}i kvas ac (Sac cha ro myces ce re vi siae) iden ti fi ci ra li su mu tan te, os jet lji-

600 Poglavlje 14

Otkri}e MPF

Cytoplasmic Control of Nuclear Behavior during Meiotic Maturation of Frog Oocytes

Yoshio Masui i Clement L. Markert Yale University, New Haven, CT Journal of Experimental Zoology, 1971, Volume 177, Pages 129–146

KLJU^NI POKUS

U oo ci te pri ma te lje ub riz ga na je od re |e na ko li ~i na ci top laz me oo ci ta ko je su ob ra |e ne pro ges te ro nom. Ci top laz ma-da va telj iz vu~e- na je iz sre di{ nje ga pod ru~ ja oo ci te s po mo- }u mik ro pi pe te (pu na cr ta), ili pri prem lje na ho mo ge ni za ci jom ci je le oo ci te (is pre ki da na cr ta). Re zul ta ti po ka zu ju po sto tak oo ci ta pri- ma te lja u ko ji ma se na sta vi la me jo za.

0 10 20 30

ubrizgana citoplazma (nl)

40 50

20

40

60

80

100

m ej

o za

( %

)

ve na tem pe ra tu ru i de fek tne u pro ce su sta ni~ no ga cik lu sa (naz va ni engl. cdc-ce ll di vi sion cycle mu tan ts/mutanti sta ni~ no ga dio be nog cik lu sa). Nji ho va je glav na ka rak te ris ti ka u to me {to u od re |e noj to~ ki sta ni~ no ga cik lu sa do- la zi do zaus tav lja nja ras ta. Na prim jer, po seb no va ̀ an mu ta nt naz van cdc28 zaus tav lja sta ni~ ni cik lus na STA R T, upu }u ju }i na va`nost pro tei na Cdc28, ko ji omo gu }u je prjela zak kroz kri ti~ nu re gu la tor nu to~ ku u G1–fa zi (sli ka 14-13). Sli~ nu sku pi nu mu tan ti sta ni~ no ga cik lu sa ot krio je kod cijepaju}eg kvas ca Schi zo sac cha ro myces pom be, Paul Nur se sa svo jim su rad ni ci ma. Iz me- |u os ta lih, izo li ra li su i mu ta nt cdc2 ko ji zaus tav lja sta ni~ ni cik lus S. pom be u G1, ali i u G2–fa zi pri prjelas ku u M-fa zu (glav na re gu la tor na to~ ka kod fi sij-

Kontekst

Ek spe ri men ti tran splan ta ci je jez gre i sta ni~ ne fu zi je pro ve de ni {ez de se tih go di na 20. sto lje }a, po ka za li su da je- zgra pre ne se na u sta ni ce ko je se na la- ze u raz li ~i tim fa za ma mi to ti~ ko ga sta- ni~ noga cik lu sa, u ve }i ni slu ~a je va, pri- hva }a po na {a nje sta ni ce do ma }i na. Iz to ga proiz la zi da ci top laz ma re gu li ra mi to ti~ ku ak tiv no st jez gre. Me |u tim, pos to ja nje pret pos tav lje nih ci topla- z mat skih fak to ra ko ji kon tro li ra ju mi to ti~ ku ak tiv no st jez gre tre ba lo je pot vr di ti ek spe ri men tal no. Do kaz za to pri ba vi li su Ma sui i Mar ke rt u svo joj stu di ji is tra ̀ u ju }i ulo gu ci top laz mat- skoga fak to ra u re gu la ci ji po na {a nja jez gre ti je kom me jo ze `ab ljih oo ci ta.

Ne ka obi lje` ja me jo ze `ab ljih oo ci ta po ka zi va la su da ci top laz mat ski fak tor kon tro li ra me jo zu. Po se bi ce, me jo za `ab ljih oo ci ta bi la je zaus tav lje na pri kra ju pro fa ze me jo ze I. Pos tu pak s hor mo nom pro ges te ro nom po tak nuo je nas ta vak pro ce sa me jo ze, {to je is to- zna~ na po ja va kod so mat skih sta ni ca na prje las ku iz G2 u M-fa zu. Oo ci te nap re du ju do slje de }eg zaus tav lja nja u me ta fa zi me jo ze II te za tim mi ru ju do op lod nje. Ma sui i Mar ke rt su pret- pos ta vi li da pos lje di ce dje lo va nja

hor mo na i op lod nje na me jo zu nas- ta ju zbog prom je na u ci top laz mi ko ja pos red no kon tro li ra po na {a nje jez gre. Svo ju su hi po te zu iz rav no prov je ri li pre no se }i ci top laz mu iz hor mon ski sti mu li ra ne oo ci te u dru gu oo ci tu ko ja ni je bi la hor mon ski ob ra |e na. Ek spe ri- men ti su po ka za li da je ci top laz mat ski fak tor, ko ji su Ma sui i Mar ke rt naz va li fak tor poticanja doz ri je va nja (MPF), od go vo ran za in duk ci ju me jo ze na kon hor mon ske ob ra de.

Ek spe ri men ti

@ab lje oo ci te, zbog svo je ve li ~i ne i spo- sob nos ti da pre ̀ i ve injekciju sta kle nim mik ro pi pe ta ma, oso bi to su po god ne za ek spe ri men tal na tes ti ra nja ak tiv- nos ti ci top laz mat skih fak to ra. Osnova ek spe ri me na ta bi la je va|enje ci top- laz ma iz oo ci te da va te lja podvr gnu te dje lo va nju pro ges te ro na ka ko bi se po tak nuo nas ta vak me jo ze. Po tom se raz li ~i ta ko li ~i na cit plaz me uno si la u net re ti ra nu oo ci tu pri ma te lja. Klju~ ni je re zul tat bio da ci top laz ma iz va |e na na kon {e st ili vi {e sa ti hor mon sko ga dje lo va nja u oo ci ti dava te lja in du ci ra nas ta vak me jo ze u oo ci ti pri ma te lju (vi di sli ku). Sup rot no to mu, ci top laz ma iz kon trol nih oo ci ta ko je ni su bi le

ob ra |e ne pro ges te ro nom, une se na u oo ci tu pri ma te lja ni je izaz va la ni kak vu

Stani~ni ciklus 601

Clement Markert

Yoshio Masui

G1

S

M

START

G2

mutanta cdc28 – osjetljiva na temperaturu

nepovoljna temperatura

povoljna temperatura

G1

S

M

stanica-majka

stanica-k}i

START

G2

Sli ka 14-13. Svoj stva mu tan te cdc28S. ce re vi siae. Mu tan ta cdc28 os jet lji va na tem pe ra tu ru, rep li ci ra se nor mal no na po volj noj tem pe ra tu ri. Pri ne po volj noj tem pe ra tu ri, me |u tim, nap re do va nje sta ni~ no ga cik lu sa blo ki ra se na to~ ki START.

reak ci ju. Sli je dom to ga zak lju ~i li su da hor mon ski ob ra |e ne oo ci te sad r ̀ a va ju ci top laz mat ski fak tor ko ji po ti ~e nas- ta vak me jo ze u oo ci ti pri ma te lju ko ja ni ka da ni je bi la iz lo ̀ e na dje lo va nju pro ges te ro na.

Kon trol ni ek spe ri men ti is klju ~i li su mo gu} no st da je sam pro ges te ron fak tor ko ji po ti ~e me jo zu u ci top laz mi da ro va te lja. Da pa ~e, po ka za no je da uno {e nje pro ges te ro na iz rav no u oo ci tu pri ma te lja ne po ti ~e me jo zu. U~in ko vi ta je sa mo vanj ska prim je na hor mo na, do ka zu ju }i ti me da pro ge- ste ron dje lu je na re cep tor smje{ ten na pov r {i ni sta ni ce ko ji ak ti vi ra od re- |e ni ci top laz mat ski fak tor. Sli~ ne e ks- pe ri men te neo vis no od pret hod nih, iz vo di li su Den nis Smi th i Ro be rt Ec ker (In te rak ci ja ste roi da s oo ci ta ma Ra na pi pie ns u in duk ci ji saz ri je va nja. Dev.Biol. 25:232–247,1971) i do{ li do is tih zak lju ~a ka. Za nim lji vo je, da je dje lo va nje pro ges te ro na u ovom su- sta vu sas vim raz li ~i to od dje lo va nja u ve }i ne sta ni ca, u ko ji ma pro la zi kroz plaz mat sku mem bra nu i ve ̀ e za unu- tar sta ni~ ni re cep tor (13. pog lav lje). Me |u tim, u oo ci ta ma pro ges te ron dje lu je na sta ni~ nu pov r {i nu ka ko bi

ak ti vi rao od re |e ni fak tor u ci top laz mi. Nas ta vak me jo ze oo ci ta uo bi ~a je no se na zi va saz ri je va njem oo ci ta pa su Ma sui i Mar ke rt za svoj no voot kri ve ni re gu la tor me jo ze sko va li ter min fak tor poticanja saz ri je va nja.

Utjecaj

Na kon nji ho va ot kri }a u `ab ljim oo ci- ta ma, pri sut no st MPF ta ko |er je pro- na |e na u so mat skim sta ni ca ma gdje po ti ~e prje la zak iz G2 u M-fa zu mi to ze. Pre ma to me, MPF je glav ni re gu la tor ulas ka u M-fa zu mi to ti~ koga, kao i me jo ti~ koga sta ni~ no ga cik lu sa. Na kon ko na~ nog ob ja{ nje nja ulo ge MPF u `ab ljim oo ci ta ma, go di ne 1988. stu di je o ge ne ti ci kva sa ca i em bri ja mor skog je ̀ in ca ta ko |er su ob zna ni le ot kri }e iden ti te ta glav no ga re gu la to ra sta ni- ~no ga cik lu sa. Nai me, MPF je di mer ci- kli na B i Cdc2 pro tei n-ki na ze. Dalj nje su stu di je do ka za le da su cik lin B i Cdc2 ~la no vi ve li ke po ro di ce pro tei na, ko ji s raz li ~i tim cik li ni ma i pro tei n-ki na- za ma srod nim Cdc2, dje lu ju go to vo jed na ko kao MPF u re gu la ci ji dru gih prje la za ka sta ni~ no ga cik lu sa. Ot kri }e MPF u `ab ljim oo ci ta ma ut r lo je put k ra zu mi je va nju re gu la tor nog apa ra ta

sta ni~ no ga cik lu sa svih eu ka riot skih sta ni ca.

602 Poglavlje 14

interfaza

ra zi

n a

ci kl

in a

mitoza interfaza mitoza interfaza mitoza

vrijeme

Sli ka 14-14. Aku mu la ci ja i deg ra da ci ja cik li na u em bri ju mor sko ga je ̀ in ca. Cik li ni su iden ti fi ci ra ni kao pro tei ni ko ji se aku mu li ra ju ti je kom in ter fa ze, a za tim se br zo deg ra di ra ju pre ma kra ju mi to ze.

MPF

ciklin B

Cdc2

Sli ka 14-15. Struk tu ra MPF. MPF je di mer, a sas to ji se od cik li na B i Cdc2 pro tein-ki na ze.

sko ga kvas ca). Dalj nje stu di je po ka zu ju da su cdc28 S. ce re vi siae i cdc2 S. pom- be fun kcio nal no ho mo log ni ge ni pot reb ni za prje la zak STA R T i za ula zak u mi to zu kod ob je vr ste kvas ca. Da bi se iz bjeg le za bu ne zbog raz li ~i te ge ne- ti~ ke no men kla tu re iz me |u S. ce re vi siae i S. pom be, pro tein ko ji ko di ra ju oba ge na u dalj njem tek stu bit }e oz na ~en kao Cdc2. No vi ja is tra ̀ i va nja cdc2 do- no se dva zna ~aj na ot kri }a. Pr vo, mo le ku lar no klo ni ra nje i sek ven ci ra nje nuk leo ti da ot kri va da cdc2 ko di ra pro tei n-ki na zu, {to je pr va in di ka ci ja is- tak nu te ulo ge fos fo ri la ci je pro tei na u re gu la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa. Dru go, ident i fi ci ran je ljud ski gen sro dan cdc2 i po ka za no je da on dje lu je u kvas- cu, {to je dra ma ti ~na de mon stra ci ja o~u va no sti funk ci je ovog re gu la to ra sta ni ~no ga cik li sa.

Tre }e is tra ̀ i va nje, ko je se naj vi {e prib li ̀ a va prou ~a va nju MPF i ge ne ti ke u kva sa ca, proiz la zi iz prou ~a va nja sin te ze pro tei na u ra nih em bri ja mor- skog je ̀ in ca. Na kon op lod nje, em brio pro la zi kroz se ri ju br zih sta ni~ nih dio ba. Ana li ze in hi bi to ra sin te ze pro tei na po ka za le su da ula zak u M-fa zu sta ni~ no ga cik lu sa ra nih em bri ja zah ti je va no vu sin te zu pro tei na. Tim Hunt je sa svo jim ko le ga ma 1983. go di ne iden ti fi ci rao dva pro tei na, u em- bri ju mor skog je ̀ in ca i {kolj ke, ko ji se po na {a ju po mo de lu pe rio di~ ke aku- mu la ci je i deg ra da ci je. Aku mu la ci ja se do ga |a ti je kom in ter fa ze, a br za deg ra da ci ja sli je di pred kraj sva ke mi to ze (sli ka 14-14). Ove pro tei ne Hu nt je naz vao cik li ni (dva pro tei na oz na ~e na su cik lin A i cik lin B) i pret pos ta- vio je nji ho vu ulo gu u in du ci ra nju mi to ze gdje svo jom pe rio di~ kom aku- mu la ci jom i deg ra da ci jom kon tro li ra ju ula zak i iz la zak iz M-fa ze. Joan Ru- der man i su rad ni ci, go di ne 1986. do ka za li su ovu ulo gu cik li na. Ub riz ga li su cik lin A u `ab lju oo ci tu i do ka za li da je nje go va pri sut no st dostatna za zapo~injanje prje la ska iz G2 u M-fa zu.

Na ve de na is tra ̀ i va nja, u po ~et ku neo vis na, us ko su se prib li ̀ i la 1988. go di ne, kad je MPF izo li ran iz ja ja ̀ a be u la bo ra to ri ju Ja me sa Mal le ra. Mo le- ku lar na ka rak te ri za ci ja MPF, pro ve de na u ne ko li ko la bo ra to ri ja, po ka za la je da se kon zer vi ra ni re gu la tor sta ni~ no ga cik lu sa sas to ji od dvi ju pod je di- ni ca: Cdc2 i cik li na B (sli ka 14-15). Cik lin B je re gu la tor na pod je di ni ca po- treb na za ka ta li ti~ ko dje lo va nje Cdc2 pro tei n-ki na ze, {to je u skla du sa sta ja- li{ tem da ak tiv no st MPF kon tro li ra pe rio di~ na aku mu la ci ja i deg ra da ci ja cik li na B za vri je me pro ce sa sta ni~ no ga cik lu sa.

Mno gob roj ne dalj nje stu di je pot vr di le su ulo gu cik li na B, kao i re gu la ci- ju MPF fos fo ri la ci jom i de fos fo ri la ci jom Cdc2 (sli ka 14-16). U sta ni ca ma si sa- va ca, sin te za cik li na B za po ~i nje u S-fa zi. Cik lin B ta da se aku mu li ra i for mi- ra kom plek se s Cdc2 ti je kom S i G2-faze. Kad su kom plek si ob li ko va ni, fos- fo ri la ci ja Cdc2 od vi ja se na dva kri ti~ na re gu la tor na mjes ta. Jed na je fos fo ri- la ci ja na treo ni nu-161 i pot reb na je za ak tiv no st Cdc2 ki na ze. Dru ga je fos fo-

Stani~ni ciklus 603

ciklin B

sinteza ciklina B

defosforilacija

defosforilacija

mitoza

fosforilacija

Cdc2

ciklin B

Cdc2

Cdc2 Cdc2

ciklin B

razgradnja ciklina B

P

ciklin B

P

P

P

Thr 14

Thr 161 Tyr 15

Sli ka 14-16. Re gu la ci ja MPF. Cdc2 for mi ra kom plek se s cik li nom B ti- je kom fa za S i G2. Za tim sli je di fos fo ri la ci- ja Cdc2 na treo ni nu-161 {to je pot re bno za ak tiv no st Cdc2, kao i na ti ro zi nu-15 (i ti ro zi nu-14 kod kra lje` nja ka) {to in hi bi- ra ak tiv no st Cdc2. De fos fo ri la ci jom Thr 14 i Tyr 15 ak ti vi ra se MPF i po ti ~e prje- la zak iz G2 u M-fa zu. Ak tiv no st MPF prekida se pred kraj mi to ze pro teo li ti- ~kom deg ra da ci jom cik li na B.

ri la ci ja ti ro zi na-15 i sus jed no ga treo ni na-14 kod kra lje` nja ka. Fos fo ri la ci ja ti ro zi na-15, ko ju ka ta li zi ra pro tei n-ki na za naz va na Wee1, spr je ~a va ak tiv no- st Cdc2 i do vo di do aku mu la ci je neak tiv nog kom plek sa Cdc2/ciklin B ti je- kom S i G2-faze. Prje la zak iz G2 u M-fa zu po tak nut je ak ti va ci jom kom plek- sa Cdc2/ciklin B, {to je pos lje di ca de fos fo ri la ci je treo ni na-14 i ti ro zi na-15, a ko ju po ti ~e pro tei n-fos fa ta za, naz va na Cdc25C.

Jed nom ak ti vi ra na, Cdc2 pro tei n-ki na za fos fo ri li ra mno{ tvo cilj nih pro- tei na ko ji ini ci ra ju zbi va nja u M-fa zi, {to }e mo raz mat ra ti da lje u ovom pog- lav lju. Na da lje, ak tiv nos t Cdc2 poti~e deg ra da ci ju cik li na B, putem pro teo li- ze pos re do va ne ubik vi ti nom. Ta pro teo li ti ~ka deg ra da ci ja cik li na B zatim inaktivi ra Cdc2, {to vo di sta ni cu k iz las ku iz mi to ze, obav lja nje ci to ki ne ze i po nov no vra }a nje u in ter fa zu.

Porodice cik li na i ki na za ovis nih o cik li ni ma Struk tu ra i fun kci ja MPF (Cdc2/ciklin B) pru`a, ne samo molekularnu o- snovu za razumjevanje ulaska i iz las ka iz M-fa ze, nego ob ja{ nja va na ~in re- gu la ci je dru gih prje la za ka u sta ni~ nom cik lu su. Ka rak te ri za ci jom kom plek- sa Cdc2/ciklin B pro tu ma ~en je nje gov ve li ki ut je caj u re gu la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa. Na da lje, po ka za lo se da su Cdc2 i cik lin B ~la no vi ve li ke po ro di ce srod nih pro tei na s ko ji ma se po ve zu ju i kon tro li ra ju nap re do va nje kroz po- je di ne fa ze sta ni~ no ga cik lu sa.

Ka ko smo ve} ra ni je ob jas ni li, Cdc2 kon tro li ra pro la zak kroz START, kao i ula zak u mi to zu kod kvas ca. No, on to ~i ni u ve zi s od re |e nim cik li ni ma (sli ka 14-17). Po se bi ce, prje la zak iz G2 u M-fa zu po ti ~e Cdc2 po ve zan s mi to- ti~ kim cik li ni ma B-ti pa (Clb1; Clb2; Clb3 i Clb4). Prje la zak kroz START kon- tro li ra Cdc2 u spo ju s od re |e nom vr stom cik li na naz va nih G1 cik li ni ili Cln. Cdc2 se za tim po ve zu je s raz li ~i tim cik li ni ma B-ti pa (Clb5 i Clb6), ko ji

604 Poglavlje 14

PP

P Thr Thr

Cdk

2. Aktiviraju}a fosforilacija treonina oko pozicije 160.

4. Povezivanje s inhibitorima Cdk (CKI).

3. Inhibitorna fosforilacija treonina-14 i tirozina-15.

1. Povezivanje s ciklinima

ciklin

CKI

Tyr Sli ka 14-18. Me ha ni zam re gu la ci je Cdk. Ak tiv no st Cdk re gu li ra ju ~e ti ri mo le ku- lar na me ha niz ma.

G1

S

M

G2

Cdc2/Clb5, Clb6

Cdc2/Cln1, Cln2, Cln3

Cdc2/Clb1, Clb2, Clb3, Clb4

kvasac

`ivotinjska stanica

G2

Cdk4, 6/CycD

Cdk2/CycE

Cdc2/CycB

Cdk2/CycA

G1

S

M

START

restrikcijska to~ka

Sli ka 14-17. Kom plek si cik li na i ki na za ovis nih o cik li ni ma. Kod kvas ca prje la zak kroz START kon- tro li ra Cdc2 po ve zan s G1 cik li ni ma (Cln1, Cln2 i Cln3). Kom plek si Cdc2 s od re |e nim cik li ni ma B-ti pa (Clb) re gu- li ra ju nap re do va nje kroz S-fa zu i ula- zak u mi to zu. Kod `i vo tinj ske sta ni ce, pro la zak restrikcijske to~ ke u G1-fa zi kon tro li ra kom ple ks Cdk4 i Cdk6 s cik- li nom D-ti pa. Kom ple ks Cdk2/ciklin E dje lu je kas ni je u G1-fazi i pot re ban je kod prje las ka iz G1 u S-fa zu. Kom ple ks Cdk2/ciklin A pot re ban je za nap re do va- nje kroz S-fa zu, a kom ple ks Cdc2/ciklin B omo gu }u je prje la zak iz G2 u M-fa zu.

su pot reb ni za nap re do va nje kroz S-fa zu. Po ve zi va nje Cdc2 s od re |e nim cik li ni ma B-ti pa i cik li ni ma G1 us mje ru je Cdc2 na fos fo ri la ci ju raz li ~i tih pro- tei na ko ji su pot reb ni u nap re do va nju kroz spe ci fi~ ne fa ze sta ni~ no ga ci- klusa.

Sta ni~ ni cik lus vi {ih eu ka rio ta ne kon tro li ra ju samo mno gob roj ni cik li ni, ve} i mno go broj ne Cdc2-srod ne pro tei n-ki na ze. Cdc2-srod ne pro tei n-ki na- ze poz na te su kao Cdk (ki na ze ovis ne o cik li ni ma, en gl. cyclin de pen de nt ki- na ses). Kao prvi ~lan ove po ro di ce, Cdc2 je ta ko |er poz nat kao Cdk1.

Mno gob roj ni ~la no vi po ro di ce Cdk ud ru ̀ u ju se s od re |e nim cik li ni ma ka ko bi nap re do va li kroz raz li ~i te fa ze sta ni~ no ga cik lu sa (sli ka 14-17). Na prim jer, nap re do va nje od G1 do S-fa ze ug lav nom re gu li ra ju Cdk2, Cdk4 i Cdk6 spo je ni s cik li ni ma D i E. Kom plek si Cdk4 i Cdk6 s cik li ni ma D-ti pa (cik lin D1, D2 i D3) ima ju va` nu ulo gu u nap re do va nju kroz restrikcijsku to~ ku u G1-fazi. Cik lin E se po jav lju je kas ni je u G1, a kom ple ks Cdk2/ciklin E je pot re ban u prje las ku iz G1 u S-fa zu i za ini ci ja ci ju sin te ze DNA. Kom- plek si Cdk2 s cik li nom A ima ju fun kci ju u nap re do va nju sta ni ce kroz S-fa- zu. Prjela zak iz G2 u M-fa zu pok re }u kom plek si Cdc2 s cik li nom B.

Ak tiv no st Cdk ti je kom nap re do va nja kroz sta ni~ ni cik lus re gu li ra ju naj- ma nje ~e ti ri mo le ku lar na me ha niz ma (sli ka 14-18). Kao {to smo ve} ob jas ni- li za Cdc2, pr vi stu panj re gu la ci je uk lju ~u je spa ja nje Cdk sa svo jim cik lin- skim par tne ri ma. Na taj se na ~in for mi ra njem po seb nih kom plek sa Cdk/ cikli na kon tro li ra sin te za i deg ra da ci ja cik li na. Dru go, ak ti va ci ja kom plek sa Cdk/ciklin zah ti je va fos fo ri la ci ju kon zer vi ra nog Cdk treo ni na oko po zi ci je 160. Ak ti vi raju}u fos fo ri la ci ju Cdk ka ta li zi ra en zim naz van CAK (ki na za ko- ja ak ti vi ra Cdk, en gl. Cdk-ac ti va ti ng ki na se), a sam mo ̀ e bi ti sas tav ljen od kom plek sa Cdk (Cdk7) s cik li nom H. Kom plek si Cdk7 i cik lina H ta ko |er se ud ru ̀ u ju s tran skrip cij skim fak to rom TFIIH ko ji je pot re ban u ini ci ja ci ji tran skrip ci je ko ju obav lja RNA-po li me ra za II (vi di 5. pog lav lje). Ta ko iz gle- da da ovaj ~lan po ro di ce Cdk mo ̀ e sud je lo va ti i u tran skrip ci ji, kao i u re gu- la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa.

U sup rot nos ti s me ha niz mom gdje CAK ak ti vi ra fos fo ri la ci ju, tre }i me ha- ni zam re gu la ci je Cdk uk lju ~u je in hi bi tor nu fos fo ri la ci ju ti ro zi na smje{ te- nog bli zu ami no-k ra ja Cdk, {to ka ta li zi ra Wee1 pro tei n-ki na za. Kod kra lje- `nja ka su i Cdc2 i Cdk2 in hi bi ra ni fos fo ri la ci jom ti ro zi na -15 i su sjed nog treo ni na -14. Ak ti va ci ja ovih Cdk post i ̀ e se de fos fo ri la ci jom tih ami no ki se- lin skih o sta ta ka s po mo }u pro tei n -fos fa ta za iz obi te lji Cdc25.

Stani~ni ciklus 605

G2 sinteza ciklina tipa D

restrikcijska to~ka

G1

S

M

faktori rasta

Cdk4, 6/CycD

Ras/Raf/ERK

Sli ka 14-19. In duk ci ja cik li na ti pa D. Fak to ri ras ta re gu li ra ju nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus pre ko restrikcijske to~ ke u G1- -fazi, induciraju}i sin te zu cik li na ti pa D pre ko sig nal no ga pu ta Ras/Raf/ERK.

Inhibitor Kompleksi Cdk/ciklin Faza stani~noga ciklusa

Porodica Cip/Kip (p21, p27, p57) Cdk4/ciklin D G1 Cdk6/ciklin D G1 Cdk2/ciklin E G1/S Cdk2/ciklin A S

Porodica Ink4 (p15, p16, p18, p19) Cdk4/ciklin D G1 Cdk6/ciklin D G1

Tablica 14-1. Cdk inhibitori

Pored re gu la ci je fos fo ri la ci jom, dje lo va nje Cdk ta ko |er kon tro li ra ve za- nje pro tei na in hi bi to ra (naz va ni Cdk-in hi bi to ri ili CKI) na kom plek se Cdk/ ciklini. U sta ni ca ma si sa va ca pos to je dvi je po ro di ce Cdk-in hi bi to ra od go- vor nih za re gu la ci ju raz li ~i tih kom plek sa Cdk/ciklina (tab li ca 14-1). ^la no vi obi te lji In k4 spe ci fi ~no ve ̀ u i in hi bi ra ju Cdk4 i Cdk6, te sto ga In k4 CKI one- mo gu }a va ju na pre dak kroz re strik cij sku to ~ku u G1 -fa zi. Na sup rot to mu, ~la no vi obi te lji Cip/Kip re gu li ra ju sve sta di je nap re do va nja kroz G1 i S-fa zu ve ̀ u }i se za kom plek se Cdk2, 4 i 6 s cik li ni ma A, D i E. Za nim lji vo je da ~la- no vi po ro di ce Cip/Kip in hi bi ra ju kom plek se Cdk2 s cik li ni ma A i E, ali ak ti- vi ra ju kom plek se Cdk4 i Cdk6 s cik li nom D, ta ko da po ro di ca Cip/Kip CKI zapravo ima dvos tru ku ulo gu, kao ak ti va tor i kao in hi bi tor ovis no o fa zi sta- ni~ no ga cik lu sa. Na taj na ~in, kon tro la Cdk-in hi bi to ra pru`a i do dat ni me- ha ni zam za re gu la ci ju ak tiv nos ti Cdk. Kom bi ni ra ni u~in ci ovih vi {e stru kih na ~i na re gu la ci je CKI od go vor ni su za kont ro lu na pre do va nja kroz sta ni ~ni cik lus, ka ko u od go vo ru na prov je re pu tem kont rol nih to ~a ka sa mog cik lu- sa, ta ko i u od go vo ru na raz li ~i te iz van sta ni ~ne pod ra ̀ a je ko ji re gu li ra ju pro li fe ra ci ju sta ni ca.

Fak to ri ras ta i cik li ni ti pa D Ka ko je ve} re ~e no, pro li fe ra ci ju `i vo tinj skih sta ni ca re gu li ra ju raz li ~i ti iz- van sta ni~ ni fak to ri ras ta ko ji kon tro li ra ju nap re do va nje sta ni ce kroz re- strikcijsku to~ ku pri kra ju G1-faze. U ne dos tat ku fak to ra ras ta, sta ni ce ne mogu pri je }i restrikcijsku to~ ku i ta ko pre la ze u sta nje mi ro va nja, oz na ~e no s G0, iz ko je ga se mo gu po nov no uk lju ~i ti u sta ni~ ni cik lus kao od go vor na sti mu la ci ju fak to rima ras ta. Kon tro la nap re do va nja kroz sta ni~ ni cik lus iz- van sta ni~ nim fak to ri ma ras ta pod ra zu mi je va da su unu tar sta ni~ ni sig- nal ni pu te vi sti mu li ra ni niz vod no od re cep to ra fak to ra ras ta (ob ja{ nje- no u pret hod nom pog lav lju) i ima ko na~ nu ulo gu u re gu la ci ji sas tav nih di je lo va me ha niz ma sta ni~ no ga cik lu sa.

Kri ti~ nu ve zu iz me |u sig nal izacije fak to rima ras ta i nap re do va nja kroz sta ni~ ni cik lus omo gu }u ju cik li ni ti pa D (sli ka 14-19). Sin te zu cik li- na D po ti ~e sti mu la ci ja fak to rima ras ta kao re zul tat sig na li zi ra nja kroz Ras/Raf/ERK sig nal no ga pu ta, te se sin te za cik li na ti pa D nas ta vlja ta ko du go dok su fak to ri ras ta pri sut ni. Me |u tim, cik li ni ti pa D ta ko |er se vr lo br zo razgra|uju pa nji ho va un tar sta ni~ na kon cen tra ci ja br zo pa- da nakon {to se uk lo ne fak to ri ras ta. Ta ko du go dok su fak to ri ras ta pri- sut ni u G1-fazi, kom plek si Cdk4, 6/ciklin D vo de sta ni cu kroz restrikci- jsku to~ ku. S dru ge stra ne, ako se fak to ri ras ta uk lo ne pri je ove klju~ ne re gu la tor ne to~ ke, ra zi na cik li na D vr lo br zo pa da i sta ni ca ne mo ̀ e nap re do va ti od G1 do S-fa ze te zbog to ga ula zi u fa zu mi ro va nja G0. Na taj na ~in in du ci bil nost i br za raz grad nja cik li na D uje di nju je sig na li- za ci ju fak to ri ma ra sta sa su sta vom sta ni ~no ga cik lu sa, omo gu }u ju }i da

606 Poglavlje 14

do stup nost iz van sta ni ~nih fak to ra ra sta kont ro li ra na pre do va nje sta ni ca kroz G1 -fa zu.

Bu du }i da je cik lin D klju~na meta sig nalizacije fak to rima ras ta, o~e ki va- lo bi se da pog rje{ ke u re gu la ci ji cik li na D mo gu bi ti raz lo gom gu bit ka re gu- la ci je ras ta ko ji je ka rak te ris ti ~an za sta ni ce ra ka. Dos ljed no to mu, ut vr |eno je da raz li ~i te vr ste ra ka kod lju di nas ta ju kao pos lje di ca pog rje{ ke u re gu la- ci ji sta ni~ no ga cik lu sa, kao i zbog nep ra vil nos ti na unu tar sta ni~ nim sig nal- nim pu te vi ma ko je aktiviraju re cep to ri fak to ra ras ta (vi di 13. pog lav lje). Na pri mjer, mu ta ci je ko je uz ro ku ju kon ti nui ra nu ne re gu li ra nu ek spre si ju cik li- na D1 pri do no se raz vo ju raz li ~i tih vr sta ljud sko ga ra ka, kao {to su lim fo mi i rak doj ke. Sli~ no to mu, mu ta ci je ko je inaktiviraju in hi bi to re In k4 Cdk (npr. p16) ko ji se ve`u na kom plek se Cdk4, 6/ciklin D ~este su u sta ni ca ma ra ka.

Po ve za no st iz me |u cik li na D, kon tro le ras ta i ra ka, na da lje pot vr |u je ~i nje ni ca da klju~ ni pro tein u kom plek si ma Cdk4,6/ciklin D, u~es ta lo sam mu ti ra u raz li ~i tim vr sta ma ljud skih tu mo ra. Ovaj pro tein, naz van Rb, prvi je put iden ti fi ci ran kao pro du kt ge na ko ji je od go vo ran za re ti nob las tom, vr lo ri jet ki nas ljed ni o~ ni tu mor u djece (vi di 15. pog lav lje). Dalj nje stu di je po ka zale se mu ta ci je koje uzrokuju ne dos tat ak fun kcio nal no ga pro tei na Rb ni su og ra ni ~e ne sa mo na re ti nob las to me, ve} pridonose mno gim ve} poz na- tim ljud skim tu mo ri ma. Rb je pro to tip tumor-supresorskog gena (engl. tu- mor sup res sor ge ne) – gen ~i ja inak ti va ci ja do vo di do raz vo ja ra ka. Dok on ko- ge ni pro tei ni, kao {to je Ras (vi di 13. pog lav lje) i cik lin D vo de sta ni~ nu pro- li fe ra ci ju, pro tei ni ko di ra ni ge ni ma tumor-sup re so rski m genima djeluju kao ko~nice koje us po ru ju nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus. Daljni pri- mjeri re gu la to ra sta ni~ no ga cik lu sa ko je ko di raju tumor-sup re so rski geni je in hi bi tor In k4 Cdk i va ̀ an re gu la tor ras ta p53, o ko jem smo ve} pri je go vo ri- li.

Dalj nje stu di je o Rb ut vr di le su nje go vu klju~ nu ulo gu u spa ja nju me ha- niz ma sta ni~ no ga cik lu sa i ek spre si ju ge na pot reb nih u nap re do va nju kroz sta ni~ ni cik lus i sin te zu DNA (sli ka 14-20). Nje go va ak tiv no st ti je kom sta ni- ~no ga cik lu sa re gu li ra na je prom je na ma u nje go voj fos fo ri la ci ji. Ta ko, kom- plek si Cdk4, 6/ciklin D fos fo ri li ra ju Rb dok sta ni ca pro la zi kroz res trik cij sku to~ ku u G1-fazi. U ne dovoljno fos fo ri li ra nom ob li ku (pri sut nom u G0 i u po- ~et ku G1-faze), Rb se ve`e na ~la no ve obi te lji E2F tran skrip cij skih fak to ra ko ji re gu li ra ju ek spre si ju vi{e ge na uk lju ~e nih u sta ni~ ni cik lus, uklju~uju}i i gen ko ji ko di ra cik lin E. E2F se ve`e za svo je cilj ne sljedove, bi lo da je Rb pri su tan ili od su tan. No, Rb dje lu je kao rep re sor, ta ko da kom ple ks Rb/E2F zaus tav lja tran skrip ci ju ge na re gu li ra nih s E2F. Re zul tat fos fo ri la ci je Rb kom ple ksom Cdk4, 6/ciklin D je st nje go vo od va ja nje od E2F, ko je za tim ak- ti vi ra tran skrip ci ju cilj nih ge na. Na taj na ~in Rb dje lu je kao mo le ku lar ni pre ki da~, pret va ra ju }i E2F od rep re so ra u ak ti va to ra ge na pot reb nih u na- pre do va nju kroz sta ni~ ni cik lus. S druge strane kon tro la Rb pre ko fos fo ri la- ci je Cdk4, 6/ciklin D povezuju ovu kri ti~ nu re gu la ci ju gen ske ek spre si je s dostupno{}u fak to ra ras ta u G1-fazi.

In hi bi to ri napredovanja kroz sta ni~ ni cik lu s Pro li fe ra ci ja sta ni ce ni je re gu li ra na sa mo fak to ri ma ras ta, ve} i raz li ~i tim sig- na li ma ko ji inhibiraju napredak kroz sta ni~ ni cik lu s. Na prim jer, na dje lo va- nje age na sa ko ji o{ te }u ju DNA, sta ni ca rea gi ra zaus tav lja njem sta ni~ no ga cik lu sa, ka ko bi pop ra vi la nas ta lu {te tu. Na da lje me|ustani~ni kontakti i raz li ~i ti iz van sta ni~ ni fak to ri ne poti~u, ve} inhibiraju pro li fe ra ci ju cilj nih sta ni ca. U~inci ovak vih in hi bi tor skih sig na la ta ko |er su posredovani re gu la-

Stani~ni ciklus 607

transkripcija gena S-faze

RNA

Cdk4, 6/ciklin D

P

Rb

E2F

Rb

E2F

E2FRb

E2F

Sli ka 14-20. Ulo ga Rb i E2F u re gu la ci ji sta ni~ no ga cik lu sa. U svom nedovoljno fos fo ri li ra nom ob li ku Rb se ve ̀ e za ~la no ve po ro di ce E2F spr je ~a- va ju }i tran skrip ci ju gena koje regulira E2F. Kom plek si Cdk4, 6 /ciklin D fos fo ri li ra ju Rb i zbog to ga se Rb od va ja od E2F pri kra ju fa ze G1. E2F ta da sti mu li ra ek spre si ju svo jih cilj nih ge na ko ji ko di ra ju pro tei ne pot reb ne za nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus.

Sli ka 14-21. In duk ci ja p21 zbog o{ te }e nja DNA. Zbog o{ te }e nja DNA po ve }a va se unu- tar sta ni~ na ra zi na p53 ko ji ak ti vi ra trans- krip ci ju ge na koji kodira Cdk in hi bi tor p21. Osim {to in hi bi ra nap re do va nje sta ni~ no ga cik lu sa ve ̀ u }i se za kom- plek se Cdk/ciklin, p21 mo ̀ e i izravno in hi bi ra ti sin te zu DNA u uza jam nom dje lo va nju s PCNA (pod je di ni ca DNA- -po li me ra ze d).

Cdk PCNA

inhibicija stani~noga ciklusa

inhibicija replikacije DNA

p21

p53

povi{enje razine p53 to rima me ha niz ma sta ni~ no ga cik lu sa, ~es to pre ko in duk ci je in hi bi to ra Cdk.

Do bar prim jer ko ji po ka zu je dje lo va nje in hi bi to ra Cdk s po mo }u pro tei- na p53 (ob ja{ nje no ve} pri je), na la zi mo u kon trol noj to~ ki u fa zi G1, gdje do la zi do zaus tav lja nja sta ni~ no ga cik lu sa zbog o{ te }e nja DNA. Pro tein p53 je tran skrip cij ski re gu la tor ko ji fun kcio ni ra, ba rem dje lo mi~ no, u sti mu- la ci ji ek spre si je in hi bi to ra Cdk p21 (sli ka 14-21). Pro tein p21 in hi bi ra ne ko li- ko kom plek sa Cdk/ciklin, a nje go va in duk ci ja s po mo }u p53 pred stav lja ba- rem je dan od o p53-ovisnih me ha ni zama zaus tav lja nja sta ni~ no ga cik lu sa na kon o{ te }e nja DNA. Osim {to in hi bi ra nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus putem svo je in te rak ci je s Cdk-i ma, p21 mo ̀ e i di rek tno spri je ~i ti rep li ka ci- ju DNA. Na po se, p21 se ve ̀ e s jez gre nim an ti ge nom pro li fe ri ra ju }ih sta ni- ca (en gl. pro li fe ra ti ng ce ll nuc lear an ti gen – PCNA), ko ji je, ka ko je ve} re ~e no u 5. po glav lju, pod je di ni ca DNA-po li me ra ze d. Na taj na ~in p21 ima dvo- stru ku ulo gu u zaus tav lja nju sta ni~ no ga cik lu sa zbog o{ te }e nja DNA, ne sa- mo in hi bi ra ju }i Cdk, ve} i izravnom in hi bi ci jom rep li ka ci je DNA u S-fa zi.

Najbolje prou~en iz van sta ni~ ni in hi bi tor pro li fe ra ci je `i vo tinj skih sta ni- ca je TGF-b -po li pep tid ni fak tor ko ji in hi bi ra pro li fe ra ci ju raz li ~i tih ti po va epi tel nih sta ni ca zaus tav lja ju }i nap re do va nje kroz sta ni~ ni cik lus u G1-fazi. Nje go vo dje lo va nje pos ti ̀ e se in duk ci jom in hi bi to ra Cdk p15, ko ji se ve ̀ e za kom plek se Cdk4,6/ciklin D. U ne dos tat ku ak tiv nos ti Cdk4,6, fos fo ri la ci ja Rb-a je blo ki ra na i sta ni~ ni se cik lus zaus tav lja u G1-fazi.

Sas vim je raz li ~it mo le ku lar ni me ha ni zam ko ji dje lu je u kon tro li sta ni- ~no ga cik lu sa u kon trol nim to~ ka ma ti je kom S i G2-faze te spr je ~a va nap re- do va nje kroz sta ni~ ni cik lu s kao od go vor na ne rep li ka ci ju ili o{ te }e nje DNA. Ka ko je ve} ra ni je ob ja{ nje no u ovom pog lav lju, zaus tav lja nje sta ni- ~no ga cik lu sa na ovim kon trol nim to~ ka ma zbi va se s po mo }u pro tei n-ki na- za Chk1 i Chk2 (sli ka 14-9). Chk1 i Chk2 fos fo ri la ci jom in hi bi raju pro tei n- fos fa ta zu Cdc25C, ko ja je od go vor na za de fos fo ri la ci ju i ak ti va ci ju kom plek- sa Cdc2/ciklin B (sli ka 14-22). Ako se Cdc2 ne ak ti vi ra, prog re si ja u mi to zu

608 Poglavlje 14

Cdc25C

zavr{ena replikacija nereplicirana ili o{te}ena DNA

ciklin B

napredovanje u mitozu

zaustavljanje u G2-fazi

Cdc2

ciklin B

Cdc2

P P

Chk1

Chk2

Cdc25C

ciklin B

Cdc2

aktivan MPFneaktivan MPF neaktivan MPF

aktivan

neaktivan

P

senzorni proteini

senzorni proteini

Chk2

ATRATM

Chk1

ATM

ATR

Sli ka 14-22. Nad zor u kon trol noj to~ ki G2-faze. Kom ple ks sen zo rnih pro tei na pre poz- na je ne rep li ci ra nu ili o{ te }e nu DNA i ak ti vi ra ATM i ATR pro tei n-ki na ze {to do vo di do ak ti vi ra nja Chk1 i Chk2. Pro- tei n-ki na ze Chk1 i Chk2 fos fo ri li ra ju i in hi bi ra ju Cdc25C pro tei n-fos fa ta zu. In hi bi ra njem Cdc25C spr je ~a va se de- fos fo ri la ci ja i ak ti va ci ja Cdc2.

se blo ki ra i sta ni ca os ta je zaus tav lje na u G2-fazi. Jed na ko ta ko, Chk1 i Chk2 fos fo ri li ra ju srodnog ~lana obi te lji Cdc25, Cdc25A. Cdc25A de fos fo ri li ra i ak ti vi ra kom plek se Cdk2 s cik li ni ma A ili E, ko ji ta da pok re }u nap re do va- nje kroz S-fa zu. Fos fo ri la ci ja do vo di do br ze deg ra da ci je Cdc25A i ti me zaus tav lja sta ni~ ni cik lus kao od go vor na o{ te }e nje DNA.

Do ga |a ji u M-fa zi

M-fa za je naj dra ma ti~ ni je raz dob lje sta ni~ no ga cik lu sa, a uk lju ~u je ve li ku reor ga ni za ci ju prakti~no svih di je lo va sta ni ce. Ti je kom mi to ze (dio ba sta ni- ~ne jez gre) kro mo so mi se zgu{ nja va ju, jez gri na se ovoj ni ca ras pa da kod ve- }i ne sta ni ca, ci tos ke let se reor ga ni zi ra ka ko bi se for mi ra lo dio be no vre te no, a kro mo so mi pu tu ju na sup rot ne po lo ve. Na kon od va ja nja kro mo so ma obi~ no sli je di dio ba sta ni ce (ci to ki ne za). Ia ko smo mno ge od ovih do ga |a ja ve} ob jas ni li u pro{ lim pog lav lji ma, s ob zi rom na struk tu ru i fun kci ju jez gre i ci tos ke le ta, ov dje }e mo to po no vi ti s ob zi rom na dje lo va nje MPF u M-fa zi.

Stani~ni ciklus 609

ponovno stvaranje jezgrine ovojnice

mikrotubuli iz diobenog vretena vezani za kinetohore

interfaza

profaza

prometafaza

metafaza

anafaza

citokineza

sestrinske kromatide

mikrotubuli

centrosom

telofaza

Sli ka 14-23. Fa ze mi to ze u `i vo tinj- skoj sta ni ci. Ti je kom pro fa ze kro mo so mi se kon den- zi ra ju i cen tro so mi se kre }u na sup rot ne stra ne jez gre po ti ~u }i for mi ra nje dio be- noga vre te na. Ras pad jez gri ne ovoj ni ce do pu{ ta mik ro tu bu li ma iz dio be noga vre te na da se ve ̀ u za ki ne to ho re kro- mo so ma. Ti je kom pro me ta fa ze kro mo- so mi se kre }u nap ri je d-nat rag iz me |u cen tro so ma i sre di ne stanice da bi se na kra ju po re da li u sre di ni dio be noga vre te na (me ta fa za). U ana fa zi ses trin ske se kro ma ti de od va ja ju i kre }u pre ma su - prot nim po lo vi ma dio be noga vre te na. Mi to za zav r {a va po nov nim for mi ra- njem jez gri ne ovoj ni ce i de kon den za- ci jom kro mo so ma ti je kom te lo fa ze, a ci to ki ne zom nastaju dvi je sta ni ce- k}e ri. Tre ba na po me nu ti da sva ka sta ni ca-k}i do bi va je dan cen tro som ko ji se dup li ci- ra pri je slje de }e mi to ze.

Fa ze mi to ze

Ia ko se mno gi de ta lji u mi to zi raz li ku ju kod raz li ~i tih or ga ni za ma, os nov- ni pro ces koji osigurava pouzdano od va ja nja ses trin skih kro ma ti da zad r- `an je kod svih eu ka rio ta. Te melj na do ga |a nja u mi to zi uk lju ~u ju kon den- za ci ju kro mo so ma, for mi ra nje dio be noga vre te na i ve za nje kro mo so ma za mik ro tu bu le u dio be nom vre te nu. Ses trin ske se kro ma ti de od va ja ju i kre }u na sup rot ne po lo ve dio be noga vre te na te sli je di for mi ra nje dviju jez gara- k}e ri.

Mi to zu uo bi ~a je no di je li mo u ~e ti ri fa ze pro fa za, me ta fa za, ana fa za i te lo fa za – ko je su pri ka za ne na sli ka ma 14-23 i 14-24 (za `i vo tinj sku sta ni- cu). Pro fa za za po ~i nje zgu{ nja va njem kro mo so ma, a sva ki se sas to ji od dvi- ju ses trin skih kro ma ti da (mo le ku le DNA k}e ri nas ta ju u S-fa zi). No vorep li-

610 Poglavlje 14

rana profaza

mitoza

interfaza

prometafaza

kasna profaza

metafaza rana anafaza

kasna anafaza telofaza

Sli ka 14-24. Fluo res cen cij sko- mik ros kop ske sli ke kro ma ti na, ke ra ti na i mik ro tu bu la ti je kom mi to ze plu} ne sta ni ce da` dev- nja ka. Kro ma tin je obo jen pla vo, ke ra tin cr ve no, a mik ro tu bu li ze le no (Con ly L.Rieder/Biological Pho to Ser vi ce).)

ci ra ne mo le ku le DNA os ta ju is prep le te ne ti je kom S i G2-faze, a ot pli }u se ti- je kom pro ce sa kon den za ci je kro ma ti na. Zgus nu ti ses trin ski kro ma ti di dr ̀ e se za jed no u pod ru~ ju cen tro me ra (obja{nje no u 4. pog lav lju), a ona je sli- jed DNA na ko ji se ve ̀ u pro tei ni i for mi ra ju ki ne to ho re – mjes to ko na ~no- ga spa ja nja mik ro tu bu la dio be noga vre te na. Za vri je me pro fa ze osim kon- den za ci je kro mo so ma, zapo~inju i ci top laz mat ske prom je ne koje vo de do raz vo ja dio be noga vre te na. Cen tro so mi (duplicirani u in ter fa zi) se od va ja- ju i kre }u na sup rot ne stra ne jez gre i pred stav lja ju dva po la dio be noga vre- te na ko je se po ~i nje for mi ra ti u kasnoj pro fa zi.

Kod vi {ih eu ka rio ta pri kra ju pro fa ze do la zi do ras pa da jez gri ne ovoj ni- ce. Ka ko je ob ja{ nje no u 8. pog lav lju, ras pad jez gri ne ovoj ni ce ni je op }e ni ta zna ~aj ka mi to ze. Na po se, kva sac i mno gi dru gi jed nos ta ni~ ni eu ka rio ti pro- la ze »zat vo re nu mi to zu« kod ko je jez gri na ovoj ni ca os ta je nep ro mi je nje na (sli ka 8-30). U tim sta ni ca ma tjele{ca po lo va dio be noga vre te na ug ra |e na su u jez gri nu ovoj ni cu i dio ba jez gre od vi ja se na kon {to se kro mo so mi k}e- ri od mak nu na sup rot ne po lo ve dio be noga vre te na.

Na kon zav r {et ka pro fa ze, sta ni ca ula zi u pro me ta fa zu – pri je laz nu eta- pu iz me |u pro fa ze i me ta fa ze. Ti je kom pro me ta fa ze mik ro tu bu li dio be-

Stani~ni ciklus 611

ciklin B

MPF

formiranje diobenoga

vretena

kondenzacija kromatina

fosforilacija kondenzina

fosforilacija lamina

nestabilnost mikrotubula

Cdc2

raspad jezgrine ovojnice

fragmentacija Golgijeva aparata

i ER

fosforilacija GM 130

Sli ka 14-25. Mjes ta dje lo va nja MPF. Na po ~et ku M-fa ze MPF pok re }e mno ge prom je ne u jez gri i ci top laz mi i to na dva na ~i na – ak ti vi ra ju }i dru ge pro tei n-ki na ze i fos fo ri la ci jom pro tei na, kao {to su kon- den zi ni i nuk lear ni la mi ni.

noga vre te na ve ̀ u se na ki ne to ho re kon den zi ra nih kro mo so ma. Ki ne to ho- ri ses trin skih kro ma ti da ori jen ti ra ni su pre ma sup rot nim stra na ma kro mo- so ma, ta ko da se ve ̀ u za mik ro tu bu le iz la ze }i iz sup rot nih po lo va dio be- noga vre te na. Kro mo so mi se kre }u nap ri jed-nat ra g sve dok se ko na~ no ne po re da ju u me ta faz noj rav ni ni u sre di ni dio be noga vre te na. Na ovom stup- nju sta ni ca do la zi do me ta fa ze.

Mno ge sta ni ce sa mo nak rat ko os ta ju u me ta fa zi prije no {to nastave u anafazu. Prjela zak iz me ta fa ze u ana fa zu po tak nut je ras pa dom ve ze iz me- |u ses trin skih kro ma ti da koje se od va ja ju i kre }u ka sup rot nim po lo vi ma dio be noga vre te na. Mi to za zav r {a va u te lo fa zi kad se po nov no for mi ra jez- gra i kro mo so mi se de kon den zi ra ju. Ci to ki ne za obi~ no za po ~i nje u kasnoj ana fa zi i skoro je gotova na kra ju te lo fa ze stva ra ju }i dvi je sta ni ce-k}e ri ti je- kom in ter fa ze.

MPF i nap re do va nje do me ta fa ze Ti je kom mi to ze zbi va ju se dra ma ti~ ne prom je ne u mno gim sta ni~ nim di je- lo vi ma {to do vo di do zna ~aj ne reor ga ni za ci je cje lo kup ne sta ni~ ne struk tu- re. Ka ko je ve} ra ni je u ovom pog lav lju re ~e no, ova do ga |a nja pok re }e ak ti- va ci ja MPF pro tei n-ki na za (Cdc2/ciklin B). ^i ni se da MPF ne dje lu je sa mo kao glav ni re gu la tor pre las ka u M -fa zu fos fo ri li ra ju }i i ak ti vi ra ju }i dru ge niz vod ne pro tei n -ki na ze, ve} ta ko |er dje lu je iz rav no fos fo ri li ra ju }i ne ke struk tur ne pro tei ne ko ji sud je lu ju u sta ni ~noj reor ga ni za ci ji.

Zgu {nja va nje int er faz nog kro ma ti na u svr hu for mi ra nja kom pak tnih kro mo so ma u mi to ti ~koj sta ni ci klju ~ni je do ga |aj u mi to zi jer omo gu }a va kre tanje k ro mo so ma po dio be nom vre te nu bez nji ho va lom lje nja ili me |u- sob nog zap li ta nja. Ka ko je re ~e no u 4. pog lav lju, kro ma tin se u in ter faz noj jez gri zgu{ nja va sko ro ti su }u puta ti je kom for mi ra nja me ta faz nih kro mo so-

612 Poglavlje 14

0,5 mm

Sli ka 14-26. Elek tron skomik ro skop- ska sli ka mik ro tu bu la ve za no ga na ki ne to ho re kro mo so ma. (L. Rie der / Bio lo gi cal Pho to Ser vi ce).

ma. Ta ko vi so ko kon den zi ra ni kro ma tin ne mo ̀ e se prepisivati pa tran skrip- ci ja prestaje dok je zgu{ nja va nje kro ma ti na u ti je ku. Una to~ te melj noj va`- nos ti ovo ga pro ce sa, jo{ u pot pu nos ti ne ra zu mi je mo ni struk tu ru me ta faz- nih kro mo so ma, ni mo le ku lar ni me ha ni zam zgu{ nja va nja kro ma ti na. No, poz na to je da zgu{ nja va nje kro ma ti na po ti ~u pro tein ski kom plek si, pod na- zi vom kon den zi ni ko ji uk lju ~u ju ~la no ve po ro di ce pro tei na SMC (struk tur- nog od r ̀ a va nja kro ma ti na, en gl. struc tu ral main te nan ce of chro ma tin) o ko ji- ma smo go vo ri li u 8. pog lav lju. Pro tei n-ki na za Cdc2 izravno fos fo ri li ra kon- den zi ne ~ime ih aktivira i po ti ~e zgu{ nja va nje kro ma ti na na kon ulas ka sta- ni ce u mi to zu. Mo le ku lar na promjena ko ja re do vi to pra ti zgu{ nja va nje kro- mo so ma je fos fo ri la ci ja his to na H1, a va` no je nag la si ti da je his ton H1 ta ko- |er sup strat za Cdc2. Me |u tim, fos fo ri la ci ja his to na H1 ni je neophod na za zgu{ nja va nje kro mo so ma u mi to zi, pa je zna ~e nje fosforilacije H1 s pomo}u Cdc2 ne jas no. S dru ge stra ne, za zgu{ nja va nje kro mo so ma pot reb na je fos- fo ri la ci ja his to na H3 koja mo`da slu ̀ i za regrutaciju kon den zi na. Mo` da je iz ne na |u ju }e da fos fo ri la ci ju his to na H3 ne obav lja Cdc2, ve} dru ga pro- tei n-ki na za (au ro ra B) ko ja se ta ko |er ak ti vi ra ti je kom mi to ze.

Ras pad jez gri ne ovoj ni ce, {to je je dan od naj dra ma ti ~ni jih do ga |a ja u mi to zi, pred stav lja naj bo lje de fi ni ra ni cilj dje lo va nja MPF. U 8. pog lav lju, ob jas ni li smo da Cdc2 fos fo ri li ra la mi ne i ti me do vo di do de po li me ri za ci je jez gri ne la mi ne (sli ka 8-31). Za tim sli je di frag men ta ci ja jez gri ne ovoj ni ce u mje hu ri }e ko ji se ko na~ no spa ja ju u te lo fa zi ka ko bi for mi ra li no ve jez gre- -k}eri. En dop laz mat ski re ti kul i Gol gi jev apa rat ta ko |er se frag men ti ra ju u mje hu ri }e ka ko bi se ti je kom ci to ki ne ze ras po re di li u sta ni ce-k}eri. Ras pad ovih ovoj ni ca ta ko |er po ti ~e MPF, a dje lo mi~ no mo ̀ e bi ti pos re do van dje lo- va njem Cdc2 ko ji fos fo ri li ra pro tein GM130 iz mat rik sa Gol gi ja, ko ji je po- tre ban za prih va }a nje CO PI-ob lo ̀ e nih ve zi ku la na Gol gi je vu ovoj ni cu. Fos- fo ri la ci ja i inak ti va ci ja GM130 s po mo }u Cdc2 spr je ~a va pristajanje i sta pa- nje ve zi ku la te do vo di do frag men ta ci je Gol gi je va apa ra ta. No, Cdc2 mo ̀ e dje lo va ti i na dru ge ci lje ve, a me ha ni zam dje lo va nja MPF ko ji do vo di do frag men ta ci je ovoj ni ca jo{ ni je u pot pu nos ti raz ja{ njen.

Reor ga ni za ci ja ci tos ke le ta, ~i ji je vr hu nac for mi ra nje dio be noga vre te na, prois ti ~e iz di na mi~ ke nes ta bil no sti mik ro tu bu la (vi di 11. pog lav lje). U po- ~et ku pro fa ze cen tro so mi se od mi ~u na sup rot ne stra ne jez gre. Po ve }a nje ak tiv nos ti MPF za tim iza zi va dra ma ti~ nu prom je nu u di na mi~ kom po na {a- nju mik ro tu bu la. Pr vo, razgradnja mik ro tu bu la se ub r za va {to do vo di do de po li me ri za ci je i skra }e nja in ter faz nih mik ro tu bu la. Vje ru je se da je razgradnja pos lje di ca fos fo ri la ci je pro tei na po ve za nih s mik ro tu bu li ma, bi- lo od sa mog MPF ili ne ke dru ge pro tei n-ki na ze ko ju ak ti vi ra MPF. Dru go, broj mik ro tu bu la ko ji proiz la ze iz cen tro so ma po ve }a va se na na ~in da se in ter faz ni mik ro tu bu li na dom je{ ta ju mno{ tvom krat kih mik ro tu bu la ko ji zra kas to iz bi ja ju iz cen tro so ma.

Ras pad jez gri ne ovoj ni ce omo gu }u je ne kim mik ro tu bu li ma iz dio be- noga vre te na da se ve ̀ u na ki ne to ho re kro mo so ma (sli ka 14-26) i ta ko za po- ~i nju pro ces kre ta nja kro mo so ma ko ji je ka rak te ris ti ~an za pro me ta fa zu. Me |u pro tei ni ma ve za nim na ki ne to ho ra ma na la ze se i mikro tu bu lar ni mo- to ri ko ji kro mo so me pok re }u pre ma mi nu s -kra je vi ma mi kro tu bu la dio be- nog vre te na (ko ji su usid re ni u cent ro so mu). Dje lo va nju ovih pro tei na, ko ji vu ku kro mo so me pre ma cent ro so mu, sup rot stav lja ju se mo tor ni pro tei ni us mje re ni pre ma plu s -kra ju i pro du lji va nje mi kro tu bu la vre te na, {to obo je tje ra kro mo so me od po lo va vre te na. Pos lje di ca to ga je da se kro mo so mi u pro me ta fa zi kre }u nap ri je d-nat rag iz me |u cen tro so ma i cen tra dio be noga vre te na.

Stani~ni ciklus 613

(B)

(A)

astralni mikrotubuli

polarni mikrotubuli

kinetohorni mikrotubuli

10 mm

Sli ka 14-27. Dio be no vre te no. A) Dio be no se vre te no sas to ji od tri ju vr sta mik ro tu bu la. Ki ne to hor ni mik ro tu bu li ve- za ni su za kro mo so me, po lar ni mik ro tu bu li prek la pa ju se u sre di ni sta ni ce i as tral ni mik ro tu bu li ko ji zra kas to iz la ze iz cen tro so ma pre ma rub nim di je lo vi ma sta ni ce. B) Sta ni ca bi je le ri be (lo sos) u me ta fa zi (B, Mic hael Ab bey / Pho to Re sear che rs Inc.).

razgradnja sekurina

aktivacija separaze

kompleks koji poti~e anafazu

inaktivacija MPF

razgradnja ciklina B

izlazak iz mitoze, citokineza

razgradnja kohezina Scc1

separacija sestrinskih kromatida

po~etak anafaze

Bub

kontrolna to~ka diobenoga vretena

Mad

Sli ka 14-28. Dje lo va nje pro teo li ti~ ko ga sus ta va cik li na B. Kom ple ks ko ji po ti ~e ana fa zu je st ubik vi ti n-li ga za ko ju in hi bi ra ju Mad/Bub pro tei ni za vri je me dok sta ni ca pro la zi kroz kon trol nu to~ ku dio be noga vre te na. Ak ti vi ra njem kom plek sa ko ji po ti ~e ana fa zu po ti ~e se prjela zak iz me ta fa ze u ana fa zu, {to dovodi do razgradnje ko he zi na Scc1 i prekida veze iz me |u ses trin skih kro ma ti da. Kom ple ks ko ji po ti ~e ana fa zu ta ko |er razgra|uje cik lin B {to uz ro ku je inak ti va ci ju MPF, iz la zak iz mi to ze i ci to ki ne zu.

Mik ro tu bu li ko ji iz vi ru iz sup rot nih po lo va dio be noga vre te na ko na~ no se ve ̀ u za dva ki ne to ho ra ses trin skih kro ma ti da (ko je se na la ze na sup rot- nim stra na ma kro mo so ma) te se us pos tav lja rav no te ̀ a si la ko je dje lu ju na kro mo so me ta ko da se oni ras po re de na me ta faz noj rav ni ni u sre di ni dio be- noga vre te na (sli ka 14-27). U 11. pog lav lju ob jas ni li smo da se dio be no vre- te no sas to ji od ki ne to hor nih mik ro tu bu la ko ji su ve za ni na kro mo so me, po lar nih mik ro tu bu la ko ji se prek la pa ju u sre di ni sta ni ce i as tral nih mik ro- tu bu la ko ji zra kas to iz la ze iz cen tro so ma pre ma rub nom di je lu sta ni ce.

Pro teo li za i deak ti va ci ja MPF: ana fa za i te lo fa za Ra ni je smo ve} nag la si li va` no st kon trol ne to~ ke sta ni~ no ga cik lu sa ko ja nad zi re ras po re |i va nje kro mo so ma u dio be nom vre te nu u me ta fa zi. Kad je ras po re |i va nje zav r {e no, sta ni~ ni se pro ces nas tav lja u ana fa zi te se za- tim zav r {a va mi to za. Nap re do va nje iz me ta fa ze u ana fa zu nas ta je zbog ubik vi ti nom pos re do va ne pro teo li ze klju~ nih re gu la tor nih pro tei na, a po- tak nu to ak ti va ci jom ubik vi ti n-li ga ze (sli ka 7-41) naz va ne kom ple ks ko ji po ti ~e ana fa zu (en gl. anap ha se-pro mo ti ng com plex). Ak ti va ci ju kom plek sa ko- ji po ti ~e ana fa zu pok re }e MPF na po ~et ku mi to ze, tako da MPF u kona~nici pokre}e vlas ti tu des truk ci ju. Kom ple ks ko ji po ti ~e ana fa zu in hi bi ran je ti je- kom pro las ka sta ni ce kroz kon trol nu to~ ku dio be noga vre te na, na kon ~e ga se ak ti vi ra ubik vi tin ski sus tav raz grad nje ko ji pok re }e prjela zak iz me ta fa- ze u ana fa zu i nas ta vak pro ce sa kroz os ta tak mi to ze.

Kon trol na to~ ka dio be noga vre te na je din stve na je po to me {to je pri sut- no st ma kar sa mo jed nog neraspore|e nog kro mo so ma do volj na da zaus ta- vi ak ti va ci ju kom plek sa ko ji po ti ~e ana fa zu. Bio ke mij ski me ha ni zam ko ji re gu li ra ovu kon trol nu to~ ku ni je jo{ do sa da pot pu no ras vi jet ljen, ali se pret po stav lja da neraspore|e ni kro mo so mi uz ro ku ju pro duk ci ju kom ple- ksa pro tei na (naz va nih Mad/Bub pro tei ni) ko ji in hi bi ra ju kom ple ks ko ji po- ti ~e ana fa zu (sli ka 14-28). In hi bi ci ja pres ta je onog tre nut ka kad su svi kro- mo so mi pra vil no raspore|eni, {to vodi do ak ti va ci je kom plek sa ko ji po ti ~e ana fa zu i deg ra da ci je dva ju klju~ nih cilj nih pro tei na. Ana fa za za po ~i nje pro teo li ti~ kom razgradnjom pro tei na, naz va nog Scc1, ko ji je sas tav ni ca kom plek sa pro tei na naz va nih ko he zi ni, a ko ji od r ̀ a va ju ve ze iz me |u se- strin skih kro ma ti da dok se na la ze po ve za ne u me ta faz noj rav ni ni. Raz grad- nja Scc1 ni je ka ta li zi ra na iz rav no kom ple ksom koji poti~e ana fa zu, ve} kompleks koji poti~e anafazu raz gra |u je pro tein naz van se ku rin ko ji je re- gu la cij ska pod je di ni ca pro tea ze naz va ne se pa ra za. Razgradnja se ku ri na iza zi va ak ti va ci ju se pa ra ze ko ja razgra|uje ko he zin Scc1. Razgradnja Scc1 ki da ve ze me |u ses trin skim kro ma ti di ma pa sa da od vo je ne kre }u pre ma

614 Poglavlje 14

kontraktilni prsten

(A)

1 mm

(B)

Sli ka 14-30. Ci to ki ne za `i vo tinj ske sta ni ce. A) Ci to ki ne za nas ta je kao pos lje di ca ste za nja kon trak til noga pr ste na ko ji je gra- |en od vla ka na ak ti na i mio zi na te di je li sta ni cu na dvi je. B) Pretra`na ele ktron- skomikroskopska fotografija jaj ne sta ni ce `a be za vri je me ci to ki ne ze (B, Da vid M. Phil li ps / Vi sual Un li mi ted).

10 mm

Sli ka 14-29. Sta ni ca bi je le ri be u ana fa zi. (Mic hael Ab bey / Pho to Re sear che rs, Inc.)

sup rot nim po lo vi ma dio be noga vre te na (sli ka 14-29). Ras tav lja nje kro mo so- ma ti je kom ana fa ze za tim se nas tav lja kao pos lje di ca dje lo va nja ne ko li ko vr sta mo tor nih pro tei na ko ji su po ve za ni s mik ro tu bu li ma u dio be nom vre- te nu (sli ke 11-51 i 11-52).

Dru gi klju~ ni re gu la tor ni pro tein na ko ji dje lu je kom ple ks ko ji po ti ~e ana fa zu je st cik lin B. Razgradnja cik li na B do vo di do inak ti va ci je MPF, {to je potrebno stanici za iz la zak iz mi to ze i pov ra tak u in ter fa zu. Mno ge sta ni- ~ne prom je ne ko je se zbi va ju u ovim pri je laz nim raz dob lji ma jed nos tav no su obrat do ga |a ja ko je iza zi va MPF ti je kom ulas ka u mi to zu. Na prim jer, po nov no spa ja nje jez gri ne ovoj ni ce, de kon den za ci ja kro ma ti na, pov ra tak mi kro tu bu la u in ter faz no sta nje, vje ro jat no su iz rav ni re zul tat gu bit ka ak- tiv nos ti MPF i de fos fo ri la ci je pro tei na ko je je MPF fos fo ri li rao u po ~et ku mi to ze. Inak ti va ci ja MPF tako|er po ti ~e ci to ki ne zu {to }e mo ob jas ni ti u na- stav ku.

Ci to ki ne za Po zav r {et ku mi to ze uo bi ~a je no sli je di ci to ki ne za, fa za u ko joj nas ta ju dvi je sta ni ce-k}e ri. Ci to ki ne za za po ~i nje od mah na kon po ~et ka ana fa ze, a pok re- }e ju inak ti va ci ja MPF, koor di ni ra ju }i pri to me dio bu jez gre i ci top laz me. Ka ko smo ve} na po me nu li u 11. pog lav lju, ci to ki ne za `i vo tinj ske sta ni ce od vi ja se s po mo }u kon trak til nog pr ste na ko ji je gra |en od vla ka na ak ti na i mio zi na II, a for mi ra se is pod mem bra ne (sli ka 14-30). Po zi ci ja kon trak til- nog pr ste na od re |e na je pre ma po zi ci ji dio be noga vre te na, ta ko da se kona~ no sta ni ca po di je li u rav ni ni ko ja pro la zi kroz me ta faz nu rav ni nu oko- mi to na dio be no vre te no. Od va ja nje se na stav lja ste za njem ak tin sko -mio- zin skih vla ka na ko ja vu ku sta ni ~nu mem bra nu pre ma unut ra {to na kra ju re zul ti ra raz dva ja njem sta ni ce po po lo vi ni. Mo st iz me |u dvi ju sta ni ca-k}e- ri ta da se pre ki da i sta ni~ na se ovoj ni ca po nov no zat va ra.

Me ha ni zam je ci to ki ne ze raz li ~it u sta ni ca ma vi {ih bi lja ka, jer su one o kru ̀ e ne ~vr stom sta ni~ nom sti jen kom. Um jes to da kon trak til ni pr ste n svo jim ste za njem podijeli stanicu, ove se sta ni ce di je le tako da se unu tar sta ni ce for mi ra ju no ve sta ni~ ne sti jen ke i membrane (sli ka 14-31). Na po ~et- ku te lo fa ze, ve zi ku le iz Gol gi je va apa ra ta ko je pre no se pret hod ni ke sta ni~- ne sti jen ke spa ja ju se s mik ro tu bu li ma iz dio be nog vre te na i sa kup lja ju se na pri ja{ njem mjes tu me ta faz ne rav ni ne. Ve zi ku le se za tim stapaju kako bi

Stani~ni ciklus 615

Sli ka 14-31. Ci to ki ne za kod vi {ih bi lja ka. Ve zi ku le iz Gol gi je va apa ra ta koje pre no se pre te ~e sta ni~ ne sti jen ke ve`u se na po lar- ne mik ro tu bu le na pri ja{ njem mjes tu me ta faz ne rav ni ne. Fu zi jom ve zi ku la nas ta je struk tu ra u ob li ku dis ka oba vi je na membranom (sta ni~ na plo ~a) ko ja se {i ri pre ma vanj skim sti jen ka ma i spa ja se sa ro di telj skom stani~nom membranom.

Golgijeve vezikulepolarni mikrotubuli

stapanje Golgijevih vezikula

pro{irivanje rane stani~ne plo~e

nova stani~na stijenka

rana stani~na plo~a

stvorile ve li ku struk tu ru u ob li ku dis ka, ok ru ̀ e nu ovoj ni com, a od po li sa- ha rid nog sad r ̀ a ja nas ta je os no va (naz va na sta ni~ na plo ~a) za no vu sta ni~- nu stijen ku. Sta ni~ na se plo ~a {i ri pre ma vanj skim sti jen ka ma oko mi to na dio be no vre te no dok ne do seg ne membranu. Membrana koja obavija sta- ni~ nu plo ~u za tim se spa ja s ro di telj skom (pa ren tal nom) stani~nom mem- branom te na taj na ~in po di je li sta ni cu na dvi je.

Me jo za i op lod nja Ko na~ ni is hod sta ni~ no ga cik lu sa so mat ske sta ni ce, ko ji smo opi sa li u ovom pog lav lju, je st nas ta nak dip loid nih sta ni ca-k}e ri s iden ti~ nim gen skim sad r- `a jem. Sup rot no to mu, me jo za je po seb na vr sta sta ni~ no ga cik lu sa ko jom se broj kro mo so ma re du ci ra na po lo vi cu i ta ko nas ta ju hap loid ne sta ni ce- k}eri. Jed nos ta ni~ ni eu ka rio ti, kao {to je kva sac, mo ̀ e se rep ro du ci ra ti me- jo zom i mi to zom. Dip loid Sac cha ro myces ce re vi siae, na prim jer, stva ra spo re me jo zom u nepovoljnim uv je ti ma. Me |u tim, kod vi {es ta ni~ nih bi lja ka i `i- vo ti nja me jo za je og ra ni ~e na na ger mi na tiv ne sta ni ce ko je su bit ne u spol- noj rep ro duk ci ji. Pro li fe ra ci ja so mat skih sta ni ca od vi ja se mi to zom, dok germinativne sta ni ce me jo zom stva ra ju hap loid ne ga me te (sper mij i jaj nu sta ni cu). Raz voj no vog or ga niz ma po tom ka za po ~i nje spa ja njem ga me ta pri op lod nji.

Pro ces me jo ze Za raz li ku od mi to ze, u me jo zi se dip loid na ro di telj ska sta ni ca di je li na ha- ploid no po tom stvo, a sva ka sta ni ca sad r ̀ a va sa mo je dan ~lan para ho mo- log nih kro mo so ma ko ji su bi li prisutni u dip loid noj ro di telj skoj sta ni ci (sli- ka 14-32). Re duk ci ja bro ja kro mo so ma post i ̀ e se sli je dom dvi ju uza stop nih dio ba jez gre i sta ni ce (naz va ne me jo za I i me jo za II) na kon sa mo jed ne re- pli ka ci je DNA. Kao i kod mi to ze, me jo za I za po ~i nje na kon dov r {e nja S-fa- ze i na kon rep li ka ci je ro di telj skih kro mo so ma ko jom nas ta ju iden ti~ ne se- strin ske kro ma ti de. Me |u tim, u me jo zi I ob ra zac od va ja nja kro mo so ma sas vim je dru ga ~i ji od onog u mi to zi. Ti je kom me jo ze I, ho mo log ni se kro- mo so mi naj pri je spa ru ju je dan s dru gim, a za tim od va ja ju u raz li ~i te sta ni- ce-k}e ri. Ses trin ske kro ma ti de os ta ju za jed no i dov r {e njem me jo ze I nas ta- ju sta ni ce-k}e ri ko je sad r ̀ a va ju po je dan ~lan od sva ko ga kro mo som skog pa ra (ko ji se sas to ji od dvi ju ses trin skih kro ma ti da). Na kon me jo ze I sli je di me jo za II ko ja je sli~ na mi to zi po to me {to se ses trin ske kro ma ti de raz dva ja- ju i pre la ze u raz li ~i te sta ni ce-k}e ri. Dov r {e njem me jo ze II ta ko nas ta ju ~e ti- ri hap loid ne sta ni ce-k}e ri, od ko jih sva ka sad r ̀ a va sa mo jed nu ko pi ju sva- ko ga kro mo so ma.

Spa ri va nje ho mo log nih kro mo so ma omogu}ava na kon rep li ka ci je DNA re kom bi na ci ju iz me |u o~e vih i maj ~i nih kro mo so ma i na taj je na ~in geneti~ka re kom bi na ci ja izravno ve za na s raz dva ja njem kro mo so ma ti je- kom me jo ze. Re kom bi na ci ja iz me |u ho mo log nih kro mo so ma od vi ja se za vri je me pro {i re ne pro fa ze me jo ze I, ko ja je po di je lje na u pet pod fa za s ob zi- rom na mor fo lo gi ju kro mo so ma (lep to ten, zi go ten, pa hi ten, dip lo ten i di ja-

komentari (0)

nema postavljenih komentara

budi prvi koji ce napisati!

ovo je samo pregled

3 shown on 40 pages

preuzmi dokument