Molekularna biologija , Beleške' predlog Molekularna i ćelijska biologija
sandra-antanasijevic
sandra-antanasijevic

Molekularna biologija , Beleške' predlog Molekularna i ćelijska biologija

24 str.
1broj preuzimanja
242broj poseta
Opis
translacija,dranskripcija ,dnk analize
20 poeni
poeni preuzimanja potrebni da se preuzme
ovaj dokument
preuzmi dokument
pregled3 str. / 24
ovo je samo pregled
3 prikazano na 24 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 24 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 24 str.
ovo je samo pregled
3 prikazano na 24 str.

Predmet izucavanja i istorijat razvoja molek bio:molek bio je relativno mlada naucna disc rodjena sredinom xx veka.Ona predstavlja poseban princip u izucavanju elementarnih procesa u biologiji sa osnovnom idejom da se na nivou mol pronadju prosesi koji bi odg makromanifestacijama u zivom svetu.Predmet izucavanja molek bio su odredjene klase mol koje svojom strukturom i medjusobnim interakcijama omogucuju ostvarivanje osnovnih f-ja karakteristicnih za zivi svet ,a to su reprodukcija i ............ to su NK (dnk i rnk) i proteini kao katalizatori svih bioloskih procesa .Termin molek bio potice od naucnika A. 1946.Molek bio proucava protok genetickih informacija u cel i organizmu kao celinu i kao i od roditelja ka potomstvu ,sa generacije na generaciju.Do kraja 2 svetskog rata naucnici sy formirali proteine kao gen materijal .Tome su doprinela sledeca tri faktora :1)velika zastupljenost proteina u celiji (vise od 50% suve tezine cel) i velika raznovrsnost 2)pogresna predstava o hem struk NK (nk su dobile naziv po prvom izvoru iz koga su izolovane ,dakle iz nukleusa ,kasnije je utvrdjeno da ih ima i u citoplazmi .Hemicar Miser 1868 uspeo je da odvoji nukleus od citoploazme i da iz nukleusa izoluje kiselinu kuju je nazvao nuklein.On je utvrdio da nuklein sadrzi veliku kolicinu P ,sa ne sadrzi S- sto je ukazalo da nije protein .1889 Ricard Atman predlaze naziv NK,sa napretkom analitickih tehnika pocetkom XX veka utvrdjeno je da se sastoje od 4 slicna mol bloka - nukleotida .1910 naucnik Fibus L. je predlozio tetranukleotidnu hipotezu po kojoj je dnk monotoni polimer 4 nukleotida tipa ATGC-ATGC odnosno odnos svih mol u nukleotidu je 1:1:1:1.Posto je ova hipoteza i suvise jednostavna i ne moze da obezbedi veliku kolicnu hem varijacija ocekivanih za gen mat ,tako da je ovo ucvrstilo tvrdnju da su proteini nosioci gen informacije . 3) u celom ovom periodu

naucnici su bili zaokupljeni istrazivanjem transmisione genetike i mutacija koja je bazirana na klasicnoj Mendelovoj genetici i nisu imali vremena da razmisljaju o prirodi mol koji sluze za tu gen transmisiju,pa su pasivno prihvatili da su to proteini.1994. kada je stampan rad naucnika Osvalda Averija ,K.Makleoda i M.Mekkartija koji je bio posvecen hem prirodi ''transformisuci princip '' u bakt doslo je do prihvatanja dnk kao gen mat.Sve je pocelo exp.

Frederika Grifita koji je prci spomenuo transformisuci princip jos 1928.Grifit je radio exp sa bakt Diplococcus (Streptococcus) pneumonie ,koja izaziva zapaljenje pluce ,u tom periodu smrtonosne bolesti.Grifit je izolovao dva soja ove bakt i ubrizgao ih u miseve :I soj je oznacen S (smooth) kada je ovaj soj ubrizgao u mis,mis je umro.II soj je oznacen R (Rough) kada je ubrizgao ovaj soj ,mis je prezioveo-nije patogen.Treci experiment- uzeo je S soj pa ga je toplotno inaktivirao i kada je takav soj ubrizgao u misa-mis je preziveo (ostao ziv).U cetvrtom

experimentu poceo je da kombinuje ,i krenuo je od S soja ,i dodao R soj,i sa ovim kootelom inficirao misa,mis je razvio bolest u umro.Zakljucio je da se u zadnjem experimentu pojavljuje transformisuci princip koji transformise R soj u patogeni S soj i zato mis umire.Rad je publikovao a naucnici su ga kritikovali .40-tih godina .Ejveri Makloud ,i Mekkarti se vracaju zaboravjeni ,Grifitovim exp-ima i gaje S i R soj diplococcusa ,oni su uspeli da od kulture ovog patogenog S soja liziranjem cel i talozenjem u centrifugi ,dobiju u epruveti cell-free (bezcel.ekstrat) rastvor svih molekula koji postoje u celiji i radili su exp sa ovim ekstraktom i ponovi su poslednji Grifitov exp.Uzeli su kulturu soja R i dodali bezcelijski ekstrakt soja S i to su kultivisali .Ovaj tim je utvrdio da kada iz bezcelijskog ekstrakta uklonimo proteine ,lipide i oligosaharide i u njemu ostanu samo NK dolazi do cije R soja u bezopasni S soj.DNK je taj transformisuci princip .Danas se zna da je u konkretnom exp u bezcelijskom ekstraktu ovog tima ili u potpuno inaktivisanom S soju Grifita ,preziveo dnk koji nosi S gen koji je odgovoran za transformaciju R soja u s soju .Taj S gen dovodi do formiranja karakteristicnog morfoloskog izgleda - zaobljenu kapsulu.Sam proces transformacije poznat u prirodi kao jedan vid prenosenja gena i usvajanja gena iz splj sredine .Naredni exp koji je definitivno potvrdio da je dnk nosilac gen mat - finalni dokaz stigao je 1952 od strane Hrsija i Cesove -u ovom eksperimentu naucnici su obelezili proteine kapsida bakteriofaga sumporom 35S a proteine dnk su obelezili zitopom 32P i onda je takvim bakteriofagom inficirana E.coli,a da 32P ulazi u cel i na osnovu toga je dokazano da je DNK mol koji sadrzi infmormaciju za formiranje citavog organizma

Struktura NK-rješavanje sekundarne strukture DNK bio je ključ razumijevanja njene funkcije U transferu naslednih informacija. Između 1749 i 1753 Erwin Chargoff i nejgovi saradnici su koristili tehniku hromatografije za razdvajanje nukleotida DNK uzorka različitog porekla. Kvantitativna analiza rezultata dobijenih hromatografijom mi nukleotida iz DNK različitih uzoraka dovela je do sljedećih zaključka(Šargahova pravila): 1)količina A ostatka proporcionalna je T ostatka i količina G ostatka proporcionalna je količini C ostatka kod svake vrste.A=T,G=C=>A/T=G/C=1..2) na osnovu prvog zaključka slijedio i naredni po kome je suma Purina (A + G) proporcionalna ekvimolarna sumi pirimidina(C+T)...A+G=T+C=>A+G/T +C=1...3)procenat odnosno sadržaj C + G nije jednak procentu A+T već varira od vrste do vrste G+C/A+T nije jednako 1. Navedena 3 pravila su do tada pobila važeću tetranueotidnu hipotezu po kojoj su

sve 4 baze prisutne u jednoj kolicini DNK.1938. Urađena je prva rengenska (x- ray) difrakciona analiza DNK od strane naucnika Wiliama Aspebery-a.Do 1947. naucnici su detektovi periodicitet u okviru strukture molekula DNk od 3,4A•(1nm=10 Angstrema) koji je sugerisao da su azotne baze poredjane kao novcici jedna na drugu.Izmedju 1950. I 1953.god Rozalin frenklin koja je radila u lanoratoriji kojom je rukovao Moris Wilkins potvrdila je taj periodicitet od 3,4 A• i sugerisala da je sekundarna struktura DNk neka vrsta heliksa. Nije odmah predlozila model i publikovala rad. Na osnovu Šargofove analize baznog sastava i rengenskih difrakcionih analiza DNK Dzejms Votson i Krik su 1953. Predlozili i publikovali model dvostrukog heliksa. 1962.nobelova nagrada za medicinu je dodeljena njima i Morisu Vilkinsu za otkrice sekundarne strukture . Predloženi model sekundarne strukture DNK ima slične karakteristike:1) DNK se sastoji od dva duga polinukleotidina lanca koje se međusobno uvijaju oko centralne ose, formirajući desnogiru dvostruku zavodnicu (heliks).Desnogiro znaci da se lanci uvijaju oko ose u smeru kazaljke na satu. 2)Ova dva polinukleotidna lanca su antiparalelna,odnosno suprotno orijentisana 5'-3' i 3'-5'..3)

Azotne baze su ravne strukture postavlje perpendikularno (ugao 90) u odnosu na centralnu (zamisljenu) osu i naslonjene jedna na drugu.Azotne baze su udaljene od druge 3,4A•(0,34nm) i nalaze se u unutrasnjosti heliksa.4) azotne baze suprotnih polinukleotidinih lanaca su međusobno sparene formiranjem vodoničnih veza A=T i G-C. Parovi su dozvoljeni (ova osobina se zove komplementarnost, a sparine baze su komplementarne.).5) svaki zavoj polinukleotidnog lanca je dug 34A•(3,4nm) i sadrzi 10 baza.6) U svakom segmentu DNK molekula neizmjenično se smenjuje veliki i mali Žleb duz centralne ose.7) dvostruki Helix DNK ima dijametar od 20A•(2nm). Po ovom modelu sekundarne strukture šećerno fosfatne osnove se nalaze spolja i nose-naelektrisanje zbog fosfatnih grupa, tako da je DNK molekul u rastvoru in vitro (-)naelektrisan. Prirodnom stanju, in vitro (u nukleusu) ovakav molekul privlaci + naelektrisane proteine,koje ga neutralizuju i pakuju(histoni). Opisani model primene strukture danas odgovara takozvanom B-DNK formi. Ovakva forma DNK je desnogiri dvostruki Helix DNK u vodenim slabo slanim uslovima i predstavljaju veoma važnu konformaciju DNK.(3D raspored molekula).B i A formu je otkrila Rozalin Frenklin.A-DNA forma je istai desnogiri dvostruki heliks DNK ali u veoma slanim i dehidratacionim uslovima. U poredjenju sa B-DNK,A-DNK je kompaktnija.ima 9bp po hodu spirale a dijametar joj je 23A•.Iako je desnogira orjentacija baza je drugacija,pa je pojava velikog i malog zljeba drugacija u odnosu na B formu. U laboratorijskim uslovima

otkrivene su još 3 desnogire forme DNK heliksa(C,D,E).C-DNK se formira pod jos vecim dehidratacionim uslovima.ina ima 9,3bp/po hodu spirale i manje je kompaktna.Dijametar je 19A•.B.parovi leže ravno nego su malo iskrivljeni u odnosu na centralnu osu. Druge dvije forme D i E se javljaju kod heliksa bez gunina u baznom sastavu(vestacka DNk).Ove forme imaju manje bp po hodu.D-8,E-7 po hodu spirale.Otkrivene su i levogire dvostruke spirale .Predstavnik takve forme je 2- DNA.ona predstavlja malu sinteticku DNA koja sadrzi samo G-C parove i ovde imamo 2 antiparalelna lanca C i G vodonicnim vezama ,ali se one rotiraju suprotno od casovnika(levogira spirala).Dijametar 2- DNK je 18A•,sadrzi 12bp po hodu spirale i ima ziv-zag konformaciju. Veliki zljeb gotovo da ne postoji u 2-DNA. Krajem 20. veka u veštačkim uslovima pojavila se još jedna forma DNK radi se od dNK koja je fiksirana veštački za krajeve i razvučena i dobijena farme je označena P-DNK.P- DNK ju u odnosu na osnovu D-DNK je duza i uza ali se pri tom razvlacenju fosfatne grupe u P-formi su unutra a azotne baze su blize spoljnoj povrsini heliksa i u P-DNK ima 2,62bp po hodu spirale.

Denaturacija i renaturacija :Struktura Dnk se odrzava slabim vezama ,uglavnom vodonicnim pa se denaturacija ove strukture postize slabim agensima kao sto su povisena T i promena pH Denaturacija dnk promenom pH vrednosti :Pri snizavanju ph dolazi do proteinizacije amino ili NH2 grupe A,G,C sto uslovljava medjusobno odbijanje baza koje se nalaze jedna nad drugom.Tako dolazi do razaranja helixa .Pri povisenju pH vrednosti dolazi do slicne pojave ali ovog puta uzled jonizacije hidoksilne -OH. Denaturacija povisenom T Proces denaturacije dnk kao rezultat zagrevanja oznacava se terminom topljenje dnk (melting)Tokom denaturacije dolazi do razdvajanja lanaca ,pad viskoznosti dnk,rasta apsorpcije na 260nm (ultraljub.svetlosti) sto se prati merenjem parametra OD260(optical density).Ovaj fenomen povecanja adsorpice UV pri zagrevanju dnk naziva se HIPERHROMNI EFEKAT .Posto GC imaju 1 vodonicnu vezu vise od AT,GC su stabilnije od AT i na tretmanu toplotom.Zbog toga dnk sa vecim sarzajem GC parova u sebi zahteva vise T za denaturaciju.Kada se uporode vrednosti OD260 sa temperaturama na kojima se dnk zagreva ,dija se tzv kriva topljenja (profil topljenja ) Sredina ove krive oznacena je tm(temp.melting)temp. topljenja koja predstavlja tacku temp.na kojoj je 50% mol dnk denaturisano i razdvojeno.Kada kriva dosegne plato ,denaturajia je kompletna odnosno svi vidovi dnk su u vidu jednolancane forme tacka topljenja (tm) govori o procentu GC parova i koristi se

za karakterizaciju dnk razlicitih vrsta .Pri denaturaciji dvolancanog molekula dnk prelazi u jednolancanu ,tako sto se vodonicne veze razdvajaju ,heliks se razvija i lanci se razdvajaju.Medjutim kovalente fosfodietarske veze (kicma dnk) ostaje intaktna .Razdvojeni jednolancani molekul dnk prelazi u klupcasti oblik,bez odredjene sekundarne strukture (randam coil)- haoticno klupko.Pod odgovarajucim uslovima moze doci do renaturacije molekula dnk.Do ponovnog spajanja kompl.lanaca,taj proces renaturacije je koriscen za stvaranje molekulskih hibrida .

Molekularna hibridizacija:Sposobnost renaturacije i ponovne denaturacije NKje iskorisceno u mnogim tehnikama koje su

oznacene kao molekularne hibridizacije .Sve tehnike su dobile naziv po cinjenici da jednolancani molekuli dnk ne moraju da poticu iz istog izvora ,od istih organizama.Dovoljno je da postoji neki stepen slicnosti u njihovom sastavu,pa ce se na osnovu koml.baza formirati novi dvolancani hibridi procesom renaturacije.Ako napravimo u epruveti smesu jednolancane dnk i rnk desice se hibridizacija na osnovu kompl.izmedju njih i to se oznacava dnk-rnk dupleks ili hibrid .Tehnikem olek hibridizacije su primenjene u razlicitim metodama kao sto je sother blot (gde imamo dnk-dnk hibridizaciju)Druga tehnika nothern blot (gde imamo rnk-dnk hibridizaciju )Tehnika Fish(fluorescence in situ hybridisation).In situ -na licu mesta (u celiju).To je dnk-dnk hibridizacija (na plocici je dnk a probu koju koristimo je dnk).

Kinetika reasocijacije (renaturacije ):Stepen molekula hibridizacije ,odnosno brzine renaturacije kompl.jednolancanih dnk molekula oznacena je kao kinetika renaturacije.Ovaj fenomen je I put primecen u experimentu Roja Britena i Dejvida Kona,koji su genomsku dnk fragmentisali na male komadice celicine nekoliko stotina bp i denaturisali ih zagrevanjem.Zatim su epruvetu hladili i pratili proces renaturacije tih fragmenata.Tokom renaturacije koml jednolanc dnk su se medjusobno sudarale i pri sudaru dva komplementarna komadica dolazilo je do formiranja stabilnog jednolancanog molekula .Pri sudaru onih koji nisus komplementarni dolazi do njihovog razdavajanja i slobodni su za sudar sa drugim dnk fragmentom,dok svaki fragment ne nadje svoj par ,taj proces se ne zavrsava .Procenat renaturisanih dnk u toku vremena je pracen i napravljena je tzv kriva renaturacije ./pored grafik se pise :Procenat preostalih jednolanc (Co/Co) fragmenata /.Proces renaturacije ima kinetiku renaturacije 2. reda C/Co =1/1 +kxCoxt gde je Co-polazna konc dnk koji su u vremenu to svi bili jednolancani .C-molarna koncentracija jednolacnane dnk nakon t ,t-vreme,k-konstanta brzine r-je .Na pocetku exp. C=Co tj svi molekuli su jednolancani.Na osnovu ovih exp u kojima se prati renaturacija dnk mol. moze se dobiti velika kolicina informacije o velicini genoma i slicnosti genoma izmedju razlicitih vrsta .Na krivu renaturacije postoji parametar koji se moze ocitati kao vrednost Coxt1/2 ili polureakciono vreme.To je vrednost u kojoj je 50% molekula u jednolancanu a 50% u dvolancanu formu.Ova vrednost govori o slozenosti genoma kod razlicitih organizama i jednostvena je za svaki genom.Renaturacija se desava usporeno kod vecih genoma jer treba vise vremena za sparivanje kompl. dnk fragmenata.Kod eukariota je primeceno ocekivano da je proces renaturacije spor i da je brzina procesa mala zbog velicine eukariotskog genoma ,veci je od genoma lamda faga .Medjutim exp.je utvrdjeno da neki delovi denaturisu sbrze od nekih delova bakt E.coli.To je kasnije objasnjena kad je utvrdjena sekvenca tih delova .Oni su sadrzali repetitivnu dnk (lakse se spajaju sa kompl.delovima ).

Geneticki kod :Po otkrivanju 2.strukture dnk bilo je bitno otkriti nacin transfera gen informacije u prirodi.Wotson i Krik su vec u svom radu o 2.strukturi nagovestili da samo 2. struktura omogucava da se nasluti nacin transfera nasledne informacije .Wotson i Krik su formulisali nesto sto je dans poznato kao osnovna dogma molek.biologije i po njoj postoji jedan opsti tok prenosa gen informacije koji se moze opisati :DNK ↔dnk- replikacija ;dnk→rnk-transkripcija ;rnk→proteini-translacija ;Dogma(smatra se da je neoboriva istina u tom trenutku) .Osim ovog postoje i izuzeci koji su otkriveni kasnije :1)rnk→dnk- reverzna transkripcija kod virusa (reverzna transriptoza)2)rnk→rnk→rnk virusi kod kojih je genom rnk a enzim replikaza 3)dnk→direktno proteine (in vitro,nemoguce u prirodi)4)proteini→proteine →prioni (bolest ludik krava ).Gen. kod je set bioloskih pravila po kojima se sekvenca nukleotida dnk prevodi u odg sekvencu proteina .(redosled ak u proteinu) .Glavne karakteristike gen koda su :1.on je zapis u linearnoj fazi u kome su ''slova '' ribonukleotidi informacione rnk (mENA) .Ova rnk je nastala procesom prepisivanja (transkripcije) dnk u kompl.irnk 2)Svaka ''rec''u okviru irnk sadrzi tri slova tj tri ribonukleotida i naziva se kodon .Grpa od 3 nukleotida(triplet)nazvana kodon determinise jednu ak 3)kod je nedvosmislen -svaki triplet determinise jednu sk 4)kod je degenerativan ili izrodjen -neka ak determinise vise tripleta kodona .To je slucaj za 18-202 ak.5)kod sadrzi ''start''AUG ,i ''stop''kodone UGA UAG UAA,triplete koji su neophodni za terminiciju,zavrsetak terminacije 6)znaci interpukcije ,,'' ne postoje u gen kodu tj kada transkripcija informacione rnk pocne ,kodoni se citaju jedni bez druge u pauze 7)kod je nepreklopljiv -kada translacija odpocne svaki ribonukleotid na datoj lokaciji u okviru irnk jedeo samo jednog kodona .8)gen kod je univerzalan (izuzeci su mitohondrijalna dnk ,dnk protozoa) znaci da vazi kod svih biolokih formi.

;S obzirom da su nk izgradjene od 4 nukleotida (4,,slova") postavlja se pitanje kako oni desifruju 20 sk(20,,reci") .Pocetkom 60-tih naucnih Sidni Brener je na osnovu logicnog razmisljanja dosao do zakljucka da gen kod mora da bude triplet jer je to minimun upotrebe 4 ,,slova" koji je dovoljan da se determinise 20 reci tj ak.Ako bismo od 4 slova koristili 2 istovremeno ona bi mogla da daju samo 16 jedinstvenih reci (4 na 2 =16 permutacija) .Upotrebom tripleta (tri ,,slova") dobija se (4 na 3=64 razlicitih permutacija ,,reci") sasvim dovoljno za def.ak. 4 na 4 =256 .Kasnije su exp Krika Brenera i Wats-tobina na sistemu faga T-4 u kojima je koriscena akridinska boja za indukovanje mutacija potvrdili tripletnu prirodu Gen koda .Proflovin 1 kao mutageni agens interkalira u dvostruki heliks dnk i i zaziva inserciju(ugradjivanje -dodavanje )ili deleciju (gubitak)jednog ili vise nukleotida tokom replikacije .Insercija jednog nukleotida ili delecija izaziva pomeranje okvira citanja ORF (open reading frame) otvoreni okvir citanja .To su tzv frame shift mutacije -pomeranje normalnog okvira citanja.Kod njih nakon translacije ak sekvenca kodirajuceg proteina bice promenjena .Ovaj tim naucniak je primetio:U exp na T-4 fagu insercija(adicija)ili delecija samo jedan ili dva nukleotida u genomu ovog virusa dovodi do pojave potpuno nefunkcionalnog proteina usled izmene okvira citanja .Adicija ili delecija 3 nukleotida dovodila su do ubacivanja ili izostavljanja gubitka samo jedne ak sto u vecini slucajeva ne utice na biolosku aktivnost proteinskog produkta ,tako da je dobijen bioloski funkcionalan protein sa jednu ak vise ili jednu ak manje .Tako je pokazano da kodoni koji odg jednoj ak sadze 3 nukleotida .Koriscenjem in vitro sistema sa translaciju (sinteza proteina ) desifrovani gen kod za svaku od 20 ak je nadjen odg triplet ribonukleotida .Nirenberg i Matej su vestacki sintetizovali rnk homopolimere koji su se sastojali od samo jednogh tipa nukleotida npr PolyURNA se sastojala od UUU...niza.Oni su obelezavali jednu po jednu ak radioizotopima .Utvrdjeno je da Poly URNA dovodi do ugradjivanja samo 14C-fenilalanina (14 je na C gore) u homopolimer polifenilalanin .Svaki triplet UUU kodira fenilalanin .Slicnim exp otkrili su da AAA kodira lizin ,CCC kodira prolin .A zatim heteropolimere.Na kraju je definisano 64 kodona ,tripleta od kojih je 61 sluzio za kodiranje indukovanih ak.Preostala 3 kodona su ,,besmisleni kodoni '' ili stop signali UAA UGA UAG .Triplet AUG je start signal za translaciju od koga pocinje citanje irnk al ii kodon za ak metionin .U najvecem broju slucajeva 1 ak je kodirana od strane nekoliko tripleta .Samo ak metionin AUG i triptofan UGG kodira jedan kodon .Velicinu ak kodira 2.3.4... 6 kodona .

Replikacija kod eukariota : Proces replikacije kod eukariota je sličan procesu replikacije kod prokariota ali mnogo složeniji u smislu da ima mnogo više učesnika u njemu. Replikacija se dešava u petoj fazi celijskog ciklusa i ovde postaje oridzine replikacije , replikacioni mehur i viljuške i dešava se di-direkciona sinteza na vodećem i zaostajucem lancu. Međutim pošto je DNK kod eukariota mnogo duža replikacija započinje u isto vreme na više mesta odnosno na više oridzina i tako se formiraju takozvani REPLIKONI ili jedinice replikacije. Brzina replikacija eukariotske DNK je 20 puta manja od brzine replikacije prokariotske DNK i iznosi 50 nukleotida u sekundi. Što znači kada bi se proces replikacije odvijao samo na jednom oridzinu sinteza replikacije DNK bi trajala danima. Pošto se istovremeno dešava na više oridzina sinteza traje nekoliko časova. Glavni enzim koji učestvuje u procesu replikacije DNK je DNK polimeraza stim što kod eukariota postoji čak šest različitih polimeraza označenih slovima alfabeta. Polimeraza alfa ,sigma ,E, katalizuju proces replikacije. Polimeraza Beta i Zeta učestvuju u reparaciji i polimeraza učestvuje u replikaciji mitohondrijalne dnk. Proces replikacije je složeniji od procesa replikacije kod prokariota jer podrazumeva i proces prelaska sa jedne na drugu polimerazu koji se označava kao Switching-prekidac . Switching prelaz za polimerazu Alfa na polimerazu beta koja uklanja greške tokom replikacije vrši reparaciju svojom egzonukleazom aktivnošću, uklanja pogrešno sparene nukleotide. Da bi uopšte došlo do procesa replikacije eukariotska DNK mora biti despiralizovana i oslobođena proteina-histona. Enzimi koji učestvuju u procesu replikacije mogu da pristupe samo goloj DNK. Mesta START-a replikacije ili tzvoridzini su su bogati A=T parovima.

Ovo čini proces lokalne denaturacije DNK i rad helikaza na odvijanju heliksa, energetski efikasniji jer je dvostruku vodonicnu vezu između a i t lakše raskinuti nego trostruku vodonicnu vezu između g i c. Proces inicijacije i elegancije replikacije kod eukariota je sličan procesima kod prokariota jedino su okazakijevi fragmenti kod eukariota kraći od bakterijskih i iznose 100 do 150nukleotida da bi opslužio veliki broj replikona ,eukariotska celija poseduje veliki broj molekula DNK polimeraze. Jedina razlika izmedju prokariotske i eukariotske replikacije proizilazi iz razlike u prirodni hromozoma i manifestuje se u fazi terminacije replikacije (u završnoj fazi replikacije). Bakterijski hromozomi su cirkularni i zatvoreni molekuli ,eukariotski hromozomi su linearni i poseduju slobodne krajeve hromozoma ili telomere. Telomere predstavljaju veliki problem u procesu replikacije. Sinteza vodećeg lanca se odvija normalno ali sinteza zaostaju check lanca Ima poteškoće kada se ukloni RNK prajmer ispred zadnjeg okazakijevi fragmenti nema ničeg što bih obezbedilo3'-OH ( hidroksilne grupu) za vezivanje komplementarnog dezoksiribonukleotid monofosfata zbog toga bi se svaki ciklus završavao sa skraćenim zaostajućim lancem za dužinu tog jednog r n k prajmera. Tokom evolucije pronađeno je rešenje ovog problema u vidu enzima telomeraze telomeraza je ribonukleoprotein odnosno protein koji sadrži kratku Rnk u sebi ,sekvence 5'AAUCCC3' ,ova rnk sluzi za sintezu 5'TTAGGG3' ponovka koji formiraju 2. struk. u vidu ukosnice (hairpin) i sluze kao supstrat za dnk polimerazu .Nas taj nacin se popunjava prekid na mestu rnk prajemra na zaostajucem lancu i zavrsava se sinteza dnk na telomerama .Enzim telomeraza je aktivan samo u euk.embrionalim celijama .U euk.somatskim celijama ovaj enzim je neaktivan tako da se krajevi hromozoma odnoso telomere skracuju tokom svakog ciklusa deobe sve do potpunog gubitka sposobnosti deobe i smrti celije .Zbog toga se telomeraze smatraju unutrasnjim tj intracelularnim bioloskim satovima.Njihova aktivacija u somatskim adultnim celijama dovodi do besmrtnsosti tih celija koje imaju neogranicenu moc deobe i postaju tumorske celije .

Replikacija DNK:proces sinteze dnk .U ovom procesu ucestvuju brojni enzimi koji cine kompleksnu strukturu oznacenu kao replizom u kojoj se odvija replikacija.Pored enzima koji direktno sintetisu dnk na osnovu na postojecih dnk lanaca(polimeraza).Replizom cine : enzimi koji razdvajaju oba lanca dnk i obrazuju replikacionu viljusku (helikaze) enzimi koji iniciraju sintezu dnk lanca na osnovu postojeceg ,koji sluzi kao matrica i to na tacno odredjenom mestu (Inicijalni faktori primaze) kao i enzimi koji omogucavaju pocetog celog procesa repl. promenom strukturne organizacije hromatina dovodeci dnk (oslobadjajuci) histona cime ona postaje dostupna predhodno navedenim enzimima replikacije (Arhitektonski proteini ).1958 Mezelson i Ston su exp.u kulturi bakt E.coli definisali model repl dnk .Do tada su naucnici predlagali tri hipoteticka modela sinteze dnk . 1)konzervativni-novi lanci dnk nastaju nezavisno od starih lanaca dnk

2)semikonzervativni-po kome roditeljski lanci daju novosintetisane lance i novi lanci sadrze jedan lanac od roditelja i jedan novosintetsian lanac.3)disperzivni model -novosintetisani lanci sastoje se iz komadica roditeljski i novosintetisanih lanaca .Oni su potvrdili semikonzervativni nacin repl dnk .gajali su e.coli u medijumu sa amonijum hloridom kao izvod azota pri cemu je taj azot u soli amonijaka bio 15(gore)N(15N -teski izotop azota koi sadrzi jedan neutron vise od onog u prirodi zatupljenog ,,lakseg" azota 14N .) Iz takve kulture e,cli izolovana je dnk metodom ultracentif. u gradijentu CsCl .E.coli je tokom sinteez dnk koristila nukleotide sa ugradjenim 15N pa je nakon izolacije dnk da ona sadrzi teski izotop N i ova kultura je oznacena kao nulta generacija .Od te nulte gen. tj polazne ,je rasadjena nova kultura (1. gener.) u medijumu u kome je dodata so amonijaka sa laksim izotopom 14N,nakon prekonocne inkubacije bakt dobijene su nove bakt gener 1 iz kojih je izolovana dnk koja je u sebi sadrzala i 15 Ni 14N tj u epruveti sa gradijentom gustine.CsCl nakon ultracentrif. ta dnk je formirala 1 traku ali je pozicija te trake bila drugacija od od dnk izolovane iz nulte gener (bila je laksa jer sadrzi jedan lanac 15N/14N .Zatim je ponovljen exp u smislu da je kultura bakterisjke gener I sdrzala za inakulaciju medijuma koji je opet sadrzao laksi azot i nakon prekonocne inkubacije na 37C dobili smo gener II .Iz ove kulture izolovana je dnk metodo multracentif.ali sam osada u gradijentu CsCl dobili su dve trake dnk ,1 traka je odgovarala dnk koja se sastojala samo iz lakih lanaca 14N/14N i nalazila se iznad Z trake koja je odgovarala dnk hibridnog tipa tipa 15N/14N.Naredni exp u ome je zasadjena III generacija iz koje je izolovana dnk dobila je slican rezultat u gradijentu CsCl tj 2 populacije dnk kao i kod predhodne gener bakt.(14N/14N)i 15N/14N) s tim sto je ovde proporcija lakse trake mnogo veca .Na osnovu exp su zakljucili da svaki lanac dnk sluzi kao matrica za sintezu novog lanca i sa njim formira helix i time potvrdili semikonzervativni model.Do istog zakljucka su dosli Tejlor,Wuds i Hjudzer u exp u kome su gajali celije korena graska Vicia foba u medijumu sa 3 H(tricijum) .

Replikacija dnk kod prokariota :Repl.cirk.bakt.dnk ili bakt. ,,hromozoma" zapocinje na tacnom mestu OORIDZIN(origine) .Nova dnk se sintetise od njega u oba smera (bidirekciono) istom brzinom ,dok se ne iskopira cela dnk i ne iskopiraju dva hromozoma.Kod e.coli postoji region duzine 245 bp karakteristicne gradje sastavljen od repetitivnih sekvenci tipa 9 -mer i 13- mer (ponocni 9 i 13 bp)Ovaj region je mesto starta repl ili oridzina repl i oznacen je kao OriC.Protein DnA A produkt gena DnA.Specificno prepoznavanje 9-mer u vidu oridzina inicira proces odvijanja helixa dnk .Njegova interakcija sa oridzinom olaksava vezivanje nA B i C proteina .Svi ovi proteini DnA,Bi C pripadaju helikazama koje vrse kidanje H veza izmedju kompl.baza i denaturaciju dvolancanoh heliksa DNK i utrosak energije iz molekula ATP.Ova lokalna denaturacija stvara morfolosku prepoznatljivu formu replikacioni mehur.Svaki repl.mehur se sastoji od 2 repl viljuskeu otvorenu i njegovu konformaciju stabilizuju SSBP (single stronde binding proteins) proteini koji se vezuju za jednolanc dnk Kako proces odvijanja tece ispred repl viljuske dolazi do dodatnog izuvijanja i savijnja dnk i raste tenzija duz ostatka heliksa.Ovde dolazi enzim dnk topoizomeraza(dnk giraza ) koji pravi i dvolancane prekide uz pomoc energije iz hidrolize ATP-a u predelu superspirala vrsi relaksaciju dnk.Ovako pripreljena dnk ulazi u repl.On se odvija uz pomoc eznima dnk polimeraza.Ovaj enzim koristi jednolancane dnk kao matricu na osnovu koje se vrsi sinteza dodavanje mkompl nukleotida.Kao supstrat za dnk polimerazu koristi se dNTp(opsta oznaka za ove nukleotide tipa trifosfat),ali se oni ugradjuju u lanac u visu dNMP(mono) uz oslobadjanje trifosfata.Proces polimerizacije dnk lanca vrsi se od 5' kraja ka 3' kraju.Kod e.coli izolovano je i prouceno ise enzima dnk polimeraza (I,II,III).Najbitnija je III,to je holoenzim koji se sastoji iz subjedinica (alfa-5'-3' polimerizacija) e-3'-5' egzonukleaza ,e teta sluzi za formiranje jezgra (srzi) enzima do alfa i E, (kruzic sa crticu na sredinu ) subjed.(e-epsilon).

Srz je aktivni centar enzima gde se vrsi aktivni proces polimerizacija .Da bi proces repl krenuo potreban je kratki molekul rnk duzine 5-15 nukleotida koji se zove prajmer ,tu kratku rnk sintetise rnk polimeraza (primaza )i time obezbedjuje slobodnu 3'OH grupu na D-ribozi za vezivanje prvog nukleotida dNMPuz pomoc enzima dnk polimeraza III.Nakon toga proces repl i elongacije tece jednostavno medjutim posto si dva lanca dnk antiparalelna jedan 5'-3' a drugi 3'-5' smera enzim dnk polimeraza III vrsi polimeraznu aktivnost samo u 5'-3' smeru ,onda moze da kosti kao matricu samo jedan lanac 3'-5' orijentacije.Taj lanac 3'-5' se naziva vodeci lanac i na njemu se proces repl jednostavno desava od pocetka do kraja .lanac 5'-3' orijentacije koji se oznacava zaostajuci lanac ima proces replikacije koji je diskontinuiran ,odvija se u vise kratkih fragmenata duzine 1000-2000 bb kroz okazakijevi fragmenti i svaki ima svoj rnk prajmer .Proces sinteze vodeceg i zaostajuceg lanca iste repl viljuske se vrsi uz pomoc jedne dnk polimeraze III,zahvaljujuci njegovoj dimernoj strukturi .Zaostajuci lanac formira petlju s ciljem zauzimanja orijetacije ,i za njega je zaduzena jedna subjedinica polimera po sintezi 1000-2000bb .Ova subjedinica je zavrsila okazakijev fragmet i oslobadja zaostajuci lanac ,formira se nova petlja ,vezuje se novi rnk prajmer i sinteza novog oki-fragmenta .Sinteza na ovom lancu zahteva prisustvo novih enzima za uklanjanje novih prajmera i popunjavanje praznina komplementarnim dNMP kao i spajanje svih oki-fragmenata u novi lanac.Sintezu nukleotida vrsi dnk polimeraza I,proces povezivanja dnk ligaza formiranjem fosfodiestarskih veza izmedju oki-fragmenta i ako je proces repl precizan,pnekd se prave neke greske i tada se aktivira subjedinica dnk polimeraza III koja egzonukleaznom aktivnoscu vrsi uklanjanje pogresno spojenih nukleotidai na njegovom mestu se ugradjuje komplementarni nukleotid .

Replikacija kod eukariota-proces replikacije kod eukariota je slican kao kod prokar ali mnogo sloyeniji u smislu da ima mnogo vise ucesnika u njemu.Rep se desava u S fazi cel ciklusa i ovde postoje oridyin replikacije,rep mehir i viljuske i desava se bidirekciona sinteza na vodecem i zaostajucem lancu.Medjutim posto je DNK kod eukar mnogo duza replikacija zapocinje u isto vreme na vise mesta odnosno vise oridzina i tako se formiraju replikoni.Brzina rep eukar DNK je 20 puta manja od brzine replikacije prokariotske DNK i iznosi 50 nukleotida u sekundi sto znaci kad bi se proces replikacije odvijao na 1 oridyin sinteza DNK bi trajala danima,posto se desava na vise oridzina sinteza traje nekoliko sati.Glavni enzim u replikaciji DNK je DNK giraza,s tim sto kod eukar postoji 6 razlicitih polimerazaoznacenih slovimaalfabeta.Polimeraza alfa,sigma i epsilon-katalizuju procese replikacije,polimeraza beta,zeta-ucestvuju u replikaciji,polimeraza gama-ucestvuje u replikaciji mitohondrijalne DNK.Proces replik je slozeni od prokar jer podrazumeva proces prelaza sa 1 na 2 polimerazu koja se oznacava kao svicing(switching).npr.Sweitching prelaz polimeraze alfa na polim beta koja uklanja greske u toku replikacije egzonukleaznom aktivnoscu.Da bi doslo do procesa rep ukar DNK mora biti despiralizovana i oslobodjena proteina histona.Enzimi koji ucestvuju u replik mogu da pristupe samo goloj DNK.Mesto starta repl(origin)su regioni bogati AT parovima.Ovo cini proces lokalne renaturacije DNK i rad helikaya na odvijanje heliksa energetski efikasniji jer je dvostruku vodonicnu vezu A=T lakse raskinuti od GΞC .Proces inicijacije i elongacije kod eukar je slican kao kod prokar.Jedino su okazaki fragmenti kod eukar kraci od bakt. i iznosi 100-150 nukleotida da bi opkruzila veli br replikona euk cel poseduje veliki br molek dnk polimeraza. jedina razlika izmedju prokari. i eukar repl proizlazi iz razlike u prirodi hromozoma i manifestuje se u terminaciji .Bakt hromozomi su cirkularni a euk linearni i poseduju slobodne krajeve telomere .

Proces transkripcije-Proces prepisivanja DNK u komplementarnu RNK.Proces trankripcije se odvija u nukleusu uz pomoc brojnih proteina ili tzv. transkripcionih faktora i enzima RNK polimeraze.Sam proces je slican kod prokar i eukar ali postoje i neke razlike.Prva razlika-je ta da je kod prokariota DNK gola pa sam proces,odnosno enzim koji ucestvuje u inicijaciji procesa RNK polimeraza lako prolanazi promotor,eukariotcka DNK je u vidu sloyenog organiyovanog hromatina uz pomoc proteina histona u strukture koje se zovu hromozomi tako da je kod njih promot sakriven u okviru nukleozoma i nedostupan enzimu RNk polimeraze.Kod eukariockih hromozoma mora doci do reorganizacije strukture,do njene dispiralizacije,oslobadjanja od proteina histona,uz pomoc specif enzima:HAT-(histon-acetil transveraze),ovi enzimi daju acetil grupu ak koji ucestvuju u gradji histona posto sama grupa nosi -naelektrisanje,onda histoni koji su po svom satavu prirodno pozitivno naelekstrisani postaju negativno naelektrisanji proteini posto je DNK i sama negativno naelektrisana zbog fosfatnih grupa ,onda dolazi do odbijanja izmedju nje i modifikovanih acetilovanih histona I DNK se ogoljuje-gubi proteine,i tek u tom stanju toj otvorenoj konformaciji kada je DNK ogoljena i despiralizovana RNK polimeraza morze da krene proces trakskcipcije.

Druga razlika-kod prokariota sekvenca DNk i iRNK (mRNA) je kolinearna odnosno identicna.Proces replikacije odnosno sinteze proteina kod prokariota krece i pre nego sto je proces transkripcije zavrsen.Za razliku od prokariota u eukar celijama se proces transkripcije desava u nukleusu i pritom se prvo od DNk sintetise primarni transkript,pre-iRNK ili postoji naziv heteronuklearna RNK →HN RNK.Ova RNK je prekursor iRNk.Zrela iRNk se formira uklanjanjem nekodirajucih sekvenci (introna) iz primarnog tranksripta.Tako da se ona finalno sastoji od slepljenih kodirajucih sekvenci koje se nazivaju egzoni.Ovaj proces se naziva proces obrade ili procesovanja RNK ili splajsovanja.Zrela tRNK napusta nukleus kroz nukleusne pore i sluzi kao matrica za sintezu proteina u ribozomima u citoplazmi.Proces transkripcije katalizyje enzim RNk polimeraza.Radi se o holoenzimu koji kod E.COli prokariota sadrzi 5 sub.jed i to

0 2 C 8alfa-2 betabeta sigma.Alfa i beta subjedinice imaju fukciju elongacije.Beta i beta 0 2C 8subjedinice

formiraju tkz aktivni centar ovog enzima u kome se krece transkripcija.Sigma subjedinica ucestvuje u procesu inicijacije transkripcije.Postoje vise razlicitih sigma faktora koji ucestvuju u varijacijama-promenljivosti strukture jedne jedine RNk polimeraze koja postoji kod E.Coli.Nasuprot prokariota sa jednim enzimom RNk polimeraze eukarioti poseduju 3 razlicite polimeraze koji su takodje holoenzimi ali su satvaljeni od mnogo vise od 8 do 14 subjedinica.tRNk polimeraze kod eukariota oynacavamo rimskim brojevima (1,2,3) pri cemu RNK polimerza 1 koja se nalazi u nukleusu u jedarcu vrsi transkripciju rbozomalne RNk .RNk poli 2 vrsi sintezu informacionih ili messenger RNA snRNA malih nuklearnih RNA i nalazi se u nuklesu.Rnk pol 3 vrsi sintezu 5SrNRK i tRNK i ona se nalazi u nukleusu

.Nivoi regulacije genske ekspresije-postoje razliciti regulatorni mehanizmi koji kontolisu da li ce neki gen odnosno DNk sekvenca koja kodira odredjeni protein biti transkribvan a kasnije transiran u taj protein .1)reulacija transkripcije 2)regulacija post transkipcione obrade odnosno splajsovanje primarnog transkripta 3)regulacija transkripta kroz nukleusne pore 4)regulacija duzine nukleusnih pora iRNk(kontrola njegove degradacije 5)kontrola translacije 6)post translaciona kontrola posttranslacione obrade odnosno manifestacija proteina.Cis i trans- odlucujuci njivo kontrolne genske ekspresije je regulacija inicijacije transkripcije i ona je rezultat slozene interacije izmedju proteina,transkripcionih faktora i specificnih DNk sekvenci.Na osnovu analogije stereohemije upotrebljeni su termini cis i trans za ove ucesnike u regulacije transkripcije.Tako da su ove specificne DNk sekvence oznacene su kao cis- transkripcioni regulatorni elementi (jer cis u stereohemiji znaci na istoj stran,na istom DNK molekulu kao i gen.)Dok su ovi transkripcioni faktori i proteini koji se vezuju za DNK sekvence oznaceni kao trans-regulatorni elementi(trans u stereohemiji znaci na suprotnim stranama,ovde znaci van molekula DNk ,van gena).Cis transkripcioni regulatorni elementi-Podeljeni su u 3 geupe:1)promotori 2)stimulatorni nizovi(pozitivno transkripcioni regulatorni elementi ili enhenseri ) 3)prigusivaci(negativni transkripcioni regulatorni elementi ili sajlenseri .1)Promotori-to su regioni u neposrednoj blizini mesta od pocinjanja starta transkipcije ili cap mesta (cap-kapica).Promotori se sastoje od jezgra i promotorskih uzvodnih reulatornih elemenata.Jezgro promotora cini TATA box i inicijatorni region za koje se vezuje osnovna transkripciona masinerija(kod eukariota je to RNK polimeraza 2i opsti traksripc faktori).Promotorski uzvodni regulatorni elementi su kratke DNK sekvence (6-12 nukleotida) koje prepoznaju specif transkr faktori.Gradja prokariotskog hromozoma-prokariocki promotor sadrzi TATA box u poziciji -15 i on je oznacen po naucniku Pribnovlju -Pribnovljev box .-35 blok ili element ,jedna specificna sekvenca

.Gradja promtora kodeukariota-TATA blok (koji se po drugim naucnicima zove goldberg- hodznes sout blok je u poziciji -30 zatim u poziciji -70 imamo CAAT blok ili element) i u poziviji -110 jedan GC blok bogat G-C parovima.2)Enhenseri-koji su najpre uoceni kod visursa ,a kasnije su otkriveni kod svih drugih genoma.Ove DNk sekvence se od promotora razlikuju u sledecem ,a)stimulisu transkripciju sa homologih(originalnih)promotora i heterodobnih promotora(vestacki dodati od drugih organizama promotora-metodama geneckog inzinjerstva).Bez obzira na orjentaciju,polozaj i raspojanje.B)nalazi se uzvodno i nizvodno od gena ali i u samom genu u njegovim intronima i regulisu transkripciju.c)imaju sposobnost da regulisu transkripciju i sa velike odaljenosti od gena praveci pritom DNk petlju uz pomoc transkripcionog faktora odnosno proteina koji se vezuje za te enhensere i koji stupa u fizicki kontakt sa RNK polimerazom 2 i kompleksom opstih transkripcionih faktora vezanih za TATA blok.3)PRIgusivaci-negativni transkripcioni regulatorni elementi ili sajlenseri(gase transkripciju gena).Ovi elementi poseduju sve karakteristike enhensera ali je njihovo dejstvo na transkripciju suprotno odnosno gase je (inhibiraju)

nema postavljenih komentara
ovo je samo pregled
3 prikazano na 24 str.