Técnicas de Cultivo e Identificación Microbiana en el Laboratorio, Study notes of Medicine

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MICROBIOLOGIA

GENERALIDADES

ISAAC AGUIRRE 2025

PRUEBA DE OXIDASA

La prueba de oxidasa usa el reactivo de Kovac (una solución al 1% de N, N, N’, N’ –tetrametil-p-dihidroclorofenilendiamina) para detectar la presencia de citocromo c en la cadena respiratoria de la bacteria; para detectar oxidorreductasa localizada en las membranas de las Bacterias PRUEBA DE LA CUERDA Si el resultado es positivo, las células bacterianas serán lisadas por el desoxicolato de sodio, la solución perderá turbidez y el ADN se desprenderá de las células lisadas, causando la viscosidad de la mezcla. Se formará una “cuerda” mucoide cuando se introduzca lentamente un asa de inoculación en la suspensión PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Fundamento: La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio Materiales

1. Balón volumétrico
2. Probeta
3. Hotplate
4. Balanza granataria
5. Autoclave (esterilizador)
6. Papel
7. Tijeras
8. Algodón
9. Baja lenguas
10. Agua destilada
11. Cinta testigo
12. Placas de Petri desechables

CULTIVOS ANAEROBIOS Y MICROAEROFÍLICOS

CULTIVO ANAEROBIO

El cultivo de bacterias anaerobias requiere de una atmósfera libre de oxígeno, que puede lograrse mediante remoción o consumo de este gas y sustitución de la atmósfera con gases libres de oxígeno como bióxido de carbono, nitrógeno o una mezcla de ambos. CULTIVO MICROAEROFÍLICO El microaerófilo hace referencia a las condiciones de baja y estricta concentración de oxígeno que requieren determinados organismos para su desarrollo. ASEPSIA  Destrucción de los microorganismos sobre las superficies u objetos inanimados.  Eliminar contaminación por microorganismos patógenos ANTISEPSIA  Remoción o destrucción de microorganismos sobre seres vivos.  Destrucción de los microorganismos sobre las superficies u MECHERO DE BUNSEN En el laboratorio, el trabajo al lado de un mechero crea un flujo ascendente del aire con la convección, bajando el riesgo de contaminantes que se establecerán en la superficie o el equipo estéril. ASAS BACTERIOLÓGICAS

OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

¿QUE ES UN CULTIVO PURO?

Es un cultivo con una sola cepa bacteriana. Todo crecimiento sobre la placa de agar debe proceder de un solo tipo de célula. MÉTODOS DE SIEMBRA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. TÉCNICAS DE SIEMBRA Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios. Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior.

VENTAJAS DE LA FILTRACION POR MEMBRANA

➔ Buena reproducibilidad. ➔ Con frecuencia se obtienen resultados en un solo paso. ➔ Los filtros pueden intercambiarse entre medios diferentes. ➔ Pueden procesarse grandes volúmenes de agua, para aumentar la sensibilidad del ensayo. ➔ Ahorro de tiempo considerable. ➔ Posibilidad de realizar la filtración in situ. ➔ El coste es bajo en comparación con el método NMP. ➔ El agua con mucha turbidez puede limitar el volumen de las muestras. ➔ Poblaciones numerosas de bacterias ocasionan una formación excesiva de colonias, incontables. ➔ Los metales y los fenoles pueden adsorberse en los filtros e inhibir el crecimiento.

2. RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN MASA Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50 °C sobre la placa Petri que contiene una cantidad determinada de muestra diluida 3. RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE

El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de microorganismos viables en un medio líquido. Consiste en la siembra de un volumen conocido de muestra diluida sobre la superficie de una placa de agar. TÉCNICAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

1. COLORACIÓN DE GRAM Se basa en la diferencia de la estructura de las paredes celulares de las bacterias, grampositivas y gramnegativas. Pruebas bioquímicas Permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación. 1. PRUEBA DE CATALASA La enzima catalasa cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno.

VP: Detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo.

8. PRUEBA DE UREA Las bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberan amoníaco y dióxido de carbono.

9. GALERIAS DE IDENTIFICACIÓN API Combina un método estandarizado simple con amplias y sólidas bases de datos de identificación microbiana, y se implementa rápida y fácilmente en cualquier laboratorio de microbiología. **INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
10. VITEK**

El sistema VITEK es un sistema automatizado de identificación bacteriana y estudio de sensibilidad antimicrobiana. La identificación de las bacterias se basa en la inoculación de una suspensión de microorganismos en tarjetas con determinados paneles de reacciones bioquímicas. CULTIVO DE HONGOS Y LEVADURAS CULTIVO DE HONGOS El cultivo es más sensible que el examen directo; debe cultivarse una porción del material obtenido para microscopia.