REPLICAZIONE DEL DNA

La struttura a doppia elica proposta da Watson e Crick suggerisce il meccanismo di duplicazione del DNA

Tre ipotesi sono state prese in considerazione per la replicazione del DNA, considerando che i due filamenti della

doppia elica parentale fungono da stampo per costruirne due nuove, questo può avvenire mediante:

- replicazione semiconservativa in cui la doppia elica parentale si dissocia nei due filamenti che la compongono

ognuno dei quali gli viene sintetizzato a fianco un filamento nuovo quindi la doppia elica sarebbe denaturata e

ognuno dei due filamenti parentali è servito da stampo per costruirne uno nuovo con cui è rimasto avvolto perciò le

due doppie eliche che derivano dalla duplicazione del DNA dovrebbero contenere un filamento parentale e un

filamento di nuova sintesi; se la duplicazione è avvenuta senza errori (fedeltà del 100%) le due doppie eliche

dovrebbero essere uguali a quella di partenza

- replicazione conservativa in cui la doppia elica parentale si dissocia ogni filamento serve da stampo per costruirne

uno nuovo però alla fine della sintesi i due filamenti di nuova sintesi si appaiano tra loro e lo stesso i due filamenti

parentali

La terza ipotesi sosteneva che durante la duplicazione del DNA avveniva una frammentazione dei filamenti parentali

quindi le doppie eliche che si ottenevano erano formati da pezzi nuovi e vecchi questa ipotesi è stata scartata come

anche la seconda

Per scegliere l’ipotesi giusta hanno utilizzando isotopi più o meno pesanti di un certo elemento

Gli sperimentatori hanno prima sintetizzato gli acidi nucleici all’interno delle cellule dando come fonte di azoto

l’isotopo 14 (N14) ottenendo un DNA con una certa densità poi hanno fatto crescere le cellule in un terreno di

coltura N15 (più pesante) ottenendo un DNA che doveva deve essere più denso per verificare se la differenza di

densità era sostanziale hanno utilizzato la centrifugazione su gradiente di densità in CsCl (cloruro di cesio)

dimostrando che un DNA sintetizzato con 14N si colloca in una posizione di densità minore rispetto al DNA

sintetizzato con 15N che si colloca in densità maggiore

Quindi è possibile distinguere il DNA in azoto 14 e quello in azoto 15

Meselson – Sthal hanno fatto crescere i batteri per diverse generazioni in presenza di 15N poi hanno centrifugato i

batteri che si posizionano sul fondo mentre il terreno di coltura rimane sopra quindi si preleva e si mettono i batteri

in un nuovo terreno di coltura con 14N, dopo ogni generazione si estrae il DNA, dopo una generazione se fosse vera

l’ipotesi semiconservativa si avrebbe un filamento di 15N (parentale) e uno di 14N (di nuova sintesi) avendo densità

intermedia, per le generazioni successive ognuna delle due doppie eliche duplicandosi davano origine a una doppia

elica ibrida e una tutta leggera

Centrifugazione in gradiente di densità significa preparare una soluzione di Cesio ad alta densità e metterla in una

provetta, caricarci sopra i campioni di DNA estratti e fare una centrifugazione, per la forza centrifuga questa

soluzione forma un gradiente con la densità più elevata sul fondo della provetta, i DNA si posizionano nel punto di

gradiente in cui la densità è uguale alla loro

Per monitorare la presenza di acido nucleico vengono raccolte delle frazioni del volume totale della provetta che

vengono lette a 260 nm

Quindi la duplicazione del DNA è semiconservativa

Nel momento in cui si inizia la duplicazione la doppia elica parentale si deve aprire

La duplicazione inizia in punti specifici chiamati origini di duplicazione da questi punti si poteva espandere sia a

destra che a sinistra (duplicazione bidirezionale) o in un solo verso (duplicazione unidirezionale) entrambi i modelli

potevano andare bene quindi per dimostrarlo hanno sfruttato la marcatura autoradiografica

Le cellule venivano prima fatte duplicare utilizzando come precursori i nucleotidi che avevano sintetizzato al loro

interno poi veniva tolto il terreno di coltura vecchio e inserite in uno nuovo con i 4 grossi ribonucleotidi necessari di

cui uno marcato radioattivamente con il fosforo 32 in posizione alfa

Prima il DNA di nuova sintesi non aveva marcatura poi invece venivano incorporati i nucleotidi radioattivi che

marcava il DNA ed esposto ad una lastra radiografica questa doveva rilevarne la presenza, il DNA doveva essere

rilevato nell’ultima porzione sintetizzata, quindi se la duplicazione era unidirezionale ci doveva essere una punta di

segnale solo al termine della forca di replicazione mentre se era bidirezionale il segnale marcatura si doveva avere in

entrambe le parti (la parte centrale non è marcata perché ancora non vi era la presenza del nucleotide marcato con

32P). questa tecnica è stata fondamentale per affermare la direzionalità della sintesi del DNA ma per fare ciò si può

anche monitorare il dosaggio genico

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REPLICAZIONE DEL DNA

La struttura a doppia elica proposta da Watson e Crick suggerisce il meccanismo di duplicazione del DNA Tre ipotesi sono state prese in considerazione per la replicazione del DNA, considerando che i due filamenti della doppia elica parentale fungono da stampo per costruirne due nuove, questo può avvenire mediante:

replicazione semiconservativa in cui la doppia elica parentale si dissocia nei due filamenti che la compongono ognuno dei quali gli viene sintetizzato a fianco un filamento nuovo quindi la doppia elica sarebbe denaturata e ognuno dei due filamenti parentali è servito da stampo per costruirne uno nuovo con cui è rimasto avvolto perciò le due doppie eliche che derivano dalla duplicazione del DNA dovrebbero contenere un filamento parentale e un filamento di nuova sintesi; se la duplicazione è avvenuta senza errori (fedeltà del 100%) le due doppie eliche dovrebbero essere uguali a quella di partenza
replicazione conservativa in cui la doppia elica parentale si dissocia ogni filamento serve da stampo per costruirne uno nuovo però alla fine della sintesi i due filamenti di nuova sintesi si appaiano tra loro e lo stesso i due filamenti parentali La terza ipotesi sosteneva che durante la duplicazione del DNA avveniva una frammentazione dei filamenti parentali quindi le doppie eliche che si ottenevano erano formati da pezzi nuovi e vecchi questa ipotesi è stata scartata come anche la seconda Per scegliere l’ipotesi giusta hanno utilizzando isotopi più o meno pesanti di un certo elemento Gli sperimentatori hanno prima sintetizzato gli acidi nucleici all’interno delle cellule dando come fonte di azoto l’isotopo 14 (N14) ottenendo un DNA con una certa densità poi hanno fatto crescere le cellule in un terreno di coltura N15 (più pesante) ottenendo un DNA che doveva deve essere più denso per verificare se la differenza di densità era sostanziale hanno utilizzato la centrifugazione su gradiente di densità in CsCl (cloruro di cesio) dimostrando che un DNA sintetizzato con 14N si colloca in una posizione di densità minore rispetto al DNA sintetizzato con 15N che si colloca in densità maggiore Quindi è possibile distinguere il DNA in azoto 14 e quello in azoto 15 Meselson – Sthal hanno fatto crescere i batteri per diverse generazioni in presenza di 15N poi hanno centrifugato i batteri che si posizionano sul fondo mentre il terreno di coltura rimane sopra quindi si preleva e si mettono i batteri in un nuovo terreno di coltura con 14N, dopo ogni generazione si estrae il DNA, dopo una generazione se fosse vera l’ipotesi semiconservativa si avrebbe un filamento di 15N (parentale) e uno di 14N (di nuova sintesi) avendo densità intermedia, per le generazioni successive ognuna delle due doppie eliche duplicandosi davano origine a una doppia elica ibrida e una tutta leggera Centrifugazione in gradiente di densità significa preparare una soluzione di Cesio ad alta densità e metterla in una provetta, caricarci sopra i campioni di DNA estratti e fare una centrifugazione, per la forza centrifuga questa soluzione forma un gradiente con la densità più elevata sul fondo della provetta, i DNA si posizionano nel punto di gradiente in cui la densità è uguale alla loro Per monitorare la presenza di acido nucleico vengono raccolte delle frazioni del volume totale della provetta che vengono lette a 260 nm Quindi la duplicazione del DNA è semiconservativa Nel momento in cui si inizia la duplicazione la doppia elica parentale si deve aprire La duplicazione inizia in punti specifici chiamati origini di duplicazione da questi punti si poteva espandere sia a destra che a sinistra (duplicazione bidirezionale) o in un solo verso (duplicazione unidirezionale) entrambi i modelli potevano andare bene quindi per dimostrarlo hanno sfruttato la marcatura autoradiografica Le cellule venivano prima fatte duplicare utilizzando come precursori i nucleotidi che avevano sintetizzato al loro interno poi veniva tolto il terreno di coltura vecchio e inserite in uno nuovo con i 4 grossi ribonucleotidi necessari di cui uno marcato radioattivamente con il fosforo 32 in posizione alfa Prima il DNA di nuova sintesi non aveva marcatura poi invece venivano incorporati i nucleotidi radioattivi che marcava il DNA ed esposto ad una lastra radiografica questa doveva rilevarne la presenza, il DNA doveva essere rilevato nell’ultima porzione sintetizzata, quindi se la duplicazione era unidirezionale ci doveva essere una punta di segnale solo al termine della forca di replicazione mentre se era bidirezionale il segnale marcatura si doveva avere in entrambe le parti (la parte centrale non è marcata perché ancora non vi era la presenza del nucleotide marcato con 32P). questa tecnica è stata fondamentale per affermare la direzionalità della sintesi del DNA ma per fare ciò si può anche monitorare il dosaggio genico

Quando il DNA si duplica viene raddoppiato anche il dosaggio genico quindi se la duplicazione fosse unidirezionale il gene ad aumentare per ultimo il suo dosaggio è quello vicino all’origine mentre se fosse bidirezionale l’ultimo a essere duplicato sarebbe il gene più lontano all’origine Inoltre la replicazione del DNA è semidiscontinua perché la DNA-polimerasi lavora solo in direzione 5’->3’ e deve muoversi in maniera antiparallela per creare un filamento antiparallelo a quello del filamento stampo, però questo va bene solo per un filamento Tutti gli enzimi polimerizzanti degli acidi nucleici lavorano in direzione 5’->3’ Allora nel secondo filamento si deve mantenere la direzionalità di lavoro dell’enzima ma non si deve venir meno alla regola dell’antiparallelismo quindi si deve sintetizzare questo nuovo filamento a frammenti Le DNA-polimerasi non riescono a iniziare dall’inizio ma sanno solo allungare perciò un nucleotide deve essere posizionato e legato ad un nucleotide complementare del filamento stampo e deve fornire quel gruppo 3’-OH a cui l’enzima è in grado di legarsi attraverso un ponte fosfodiesterico al deossiribonucleotide successivo, quindi necessitano di un innesco Le RNA-polimerasi (primasi) sintetizzano gli inneschi (8-10 ribonucleotidi) per la DNA-polimerasi I due filamenti chiamati leading strand (filamento veloce) e lagging strand (filamento lento) sono replicati in maniera sincronizzata quindi in realtà non sono uno più veloce e uno più lento ma uno si replica in maniera continua e uno discontinua In questo processo di sintesi del DNA sono coinvolte proteine con attività enzimatica altre con funzione strutturale o di trasporto, una delle più importanti è la DNA polimerasi, tutti gli enzimi si possono modificare durante il ciclo catalitico per poi tornare al loro stato originario Anche la DNA polimerasi abbraccia il DNA cambiando conformazione durante il ciclo catalitico La DNA polimerasi I è stata la prima ad essere scoperta ed ha molte attività enzimatiche tra cui l’attività di polimerizzazione dei deossiribonucleotidi in direzione 5’->3’ attraverso legami fosfodiesterici, attività esonucleasiche, le nucleasi si suddividono in endonucleasi che sono enzimi che tagliano in mezzo mentre le esonucleasi sono enzimi che degradano il DNA partendo dalle estremità, se parte dall’estremità 3’ allora si dice attività esonucleasica 3’->5’ che è un attività riparativa mentre se si parte dall’estremità 5’ si parla di attività esonucleasi 5’->3’ che ha un ruolo nella rimozione degli inneschi Le DNA polimerasi possiedono entrambe le attività esonucleasiche La selettività (fedeltà con cui duplicano il DNA), frequenza degli errori, delle polimerasi arriva a 10-6^ però hanno un’attività di correzione degli errori Quindi queste DNA polimerasi hanno funzioni specifiche collocate in tre domini differenti e attraverso una proteasi è possibile tagliare il dominio dell’attiva esonucleasica 5’->3’, la parte di enzima che rimane si chiama frammento di Klenow Per creare un legame fosfodiesterico è necessaria energia, questa reazione è favorevole perché il nucleotide utilizzato è un deossiribonucleotide trifosfato che quando si forma il legame il gruppo 3’-OH esposto attacca il fosfato del nucleotide entrante e si libera energia dalla scissione del trifosfato in monofosfato e pirofosfato Il pirofosfato che si è liberato viene immediatamente idrolizzato da una pirofosfatasi inorganica in una molecola di ortofosfato liberando ulteriore energia La DNA polimerasi utilizza come substrati i deossiribonucleotidi trifosfati con specificità elevata, l’enzima non riesce ad accogliere nel suo sito attivo i ribonucleotidi trifosfati La DNA polimerasi è incapace di: riconoscere i siti di inizio, separare le due strand del DNA, polimerizzare in direzione 3’->5’, iniziare ex-novo la polimerizzazione di nucleotidi senza un innesco preformato La proteina DnaA è l’iniziatrice si lega al DNA in modo cooperativo, è l’unica proteina sequenza-specifico, monomerica, avvolge il DNA attorno a sé che provoca una denaturazione spontanea della doppia elica nella regione ricca di T L’elicasi (proteina enzima) taglia i legami a idrogeno e viene trasportata dal caricatore dell’elicasi ne sono necessari due perché entrambi i filamenti devono essere caricati dalla Single strend binding protein ricoprono i filamenti rendendoli inaccessibili alle endonucleasi e evitano la riformazione della doppia elica Polimerasi necessita di un innesco sintetizzato dalla primasi che è una RNA polimerasi che fornisce il 3’-OH

scindendo l’ATP in AMP (momentaneamente legato al sito attivo dell’enzima viene poi trasferito sull’estremità 5’- fosfato dove si deve formare il legame) e pirofosfato inorganico La duplicazione termina in una regione opposta a quella di origine chiamata regione di terminazione che è più ampia ed è caratterizzata da 10 siti di terminazione (siti Ter) di cui 5 sono nella metà destra e 5 nell’altra questi siti sono polarizzati, orientati in maniera diversa, quelli che stanno su un versante hanno orientazione opposta a quelli dell’altro versante Durante il processo di copiatura di copiatura del DNA ci sono due forche di replicazione una gira in senso orario e una in senso antiorario perché questo processo è bidirezionale I siti TerH TerI TerE TerD TerA non bloccano la forca di replicazione che va in senso orario ma questa viene bloccata dai siti che sono orientati in senso opposto quindi allo stesso modo la forca che si muove in senso antiorario non viene ostacolata dai siti TerJ TerG TerF TerB TerC ma viene bloccata dagli altri siti Quindi le due forche si incontrano circa a 180 gradi tra il sito TerC e il sito TerA Questi siti di terminazione sono riconosciuti e occupati dalle proteine che non costituiscono un blocco per le forche di replicazione e supportano la separazione dei cromosomi completati Anche durante la sintesi del DNA ci possono essere delle RNA polimerasi che trascrive qualche gene e che può rallentare il replisoma quindi l’altro replisoma supera di poco la metà perché arriva prima I superavvolgimenti se non bloccati e rimossi possono bloccare il processo di duplicazione Il replisoma è costituito da un elicasi che taglia i legami a idrogeno Davanti alla forca di replicazione si creano dei superavvolgimenti detti positivi uno per ogni giro di elica che noi apriamo quindi contemporaneamente vi sono delle topoisomerasi che rimuovono questi superavvolgimenti Esistono due grandi famiglie di topoisomerasi: le topoisomerasi I per allentare la tensione torsione e tagliano solo un filamento della doppia elica di DNA mentre le topoisomerasi II tagliano entrambi i filamenti della doppia elica, facendo srotolare gli avvolgimenti, poi li riuniscono quindi variano il numero di legame di un unità ogni ciclo catalitico mentre le II variano di due unità ogni ciclo catalitico Le topoisomerasi I sono a loro volta suddivise in topoisomerasi IA che lavorano con un meccanismo di taglio e il filamento non tagliato passa attraverso l’apertura, questi enzimi fungono da endonucleasi (tagliano) e da ligasi (ricuciono), e topoisomerasi IB taglia un filamento e l’altro si srotola Topoisomerasi I tagliano il ponte fosfodiesterico ma poi lo devono ricreare, nel loro sito attivo hanno degli aminoacidi tra cui un residuo di tirosina che ha un gruppo funzionale OH al 5’- fosfato che si è liberato ricreando un ponte temporaneo covalente L’energia che si ha dalla rottura del legame fosfodiesterico viene immagazzinata in un legame simile Se si devono muovere più superavvolgimenti questo ciclo catalitico si ripete n volte Nel sito attivo delle topoisomerasi II ci sono due residui di tirosina, questi enzimi necessitano di ATP a causa dei cambiamenti conformazionali che subiscono Sottofamiglia di topoisomerasi Rottura del DNA Meccanismo di variazione di Lk IA (^) I filamenti di DNA vengono rotti uno per volta, il sito tirosinico attivo viene legato covalentemente al gruppo 5’-fosforilico Enzima-ponte : le estremità interrotte del DNA sono attraversate a ponte dall’enzima e i singoli filamenti passano uno attraverso l’altro IB I filamenti di DNA vengono rotti uno per volta, il sito tirosinico attivo viene legato covalentemente al gruppo 5’-fosforilico Rotazione controllata : l’estremità 3’ del filamento tagliato rimane attaccata alla tirosina, le iterazioni ioniche con l’altra estrmità permettendo la rotazione del segmento di DNA trattenuto dall’enzima II (^) Una coppia di filamenti nella doppia elica viene rotta in modo transitorio da enzimi dimerici, la reazione di rottura del filamento è la stessa descritta per l’enzima IA Cancello : l’enzima utilizza ATP pre trasportare un DNA duplex intatto attraverso una rottura a doppio filamento creata in un secondo duplex

La regione di origine è superavvolta negativamente, questi superavvolgimenti si creano quando un DNA è sottoavvolto (meno giri di elica rispetto a quelli richiesti dalla sua lunghezza) e quindi soggetto a denaturazione, e porta alla formazione della bolla di apertura Quindi il ruolo delle topoisomerasi nella replicazione del DNA consiste nel: (A) introduzione di superavvolgimenti negativi in corrispondenza del sito oriC (B) rimozione dei superavvolgimenti positivi che si formano davanti alla forcella di replicazione (C) decatenazione delle molecole di DNA circolare neosintetizzate La decatenazione delle molecole di DNA in fase di replicazione può avvenire sia da parte di una topoisomerasi I che da parte della topoisomerasi II che taglia entrambi i filamenti (se i due anelli sono completi) Le topoisomerasi sono essenziali, alcuni inibitori di delle topoisomerasi vengono utilizzati in cocktail chemioterapici DnaA : proteina che riconosce oriC (origine della replicazione) DnaB elicasi : separa le due eliche del DNA, rompendo i legami idrogeno, con consumo di ATP SSB (single-strand binding proteins): stabilizzano le regioni di DNA a singolo filamento Topoisomerasi : introducono superavvolgimenti negativi per favorire lo srotolamento localizzato della doppia elica (ori C); rimuovono superavvolgimenti positivi per consentire l’avanzamento della forca di replicazione; decatenano le molecole di DNA neosintetizzate Primasi : sintetizza il primer di RNA, complementare allo stampo di DNA DNA polimerasi III : catalizza l’aggiunta di deossiribonucleotidi all’estremità 3’ del primer di RNA preformato (polimerizzazione in direzione 5’3’): un filamento è sintetizzato in modo continuo (= filamento guida) un filamento è sintetizzato in modo discontinuo (= filamento discontinuo) sotto forma di frammenti di DNA di circa 1000-2000 nt (frammenti di Okazaki). Ciascun frammento contiene un primer di RNA. Il filamento discontinuo viene reso continuo per l’azione successiva di: DNA polimerasi I : rimuove il primer (esonucleasi 5’3’) e contemporaneamente riempie l’interruzione con deossiribonucleotidi (polimerasi 5’3’) [nick translation]nick translation] DNA ligasi : unisce covalentemente (legame fosfodiesterico) i frammenti adiacenti completati Anche il genoma batterico è condensato grazie ad un’impalcatura proteica Le sequenze intergeniche sono circa il 10%, ma tutto viene copiato Molti geni dell’E.coli codificano per proteine o subunità di enzimi che hanno a che fare con la duplicazione o riparazione del DNA Il genoma è duplicato una sola volta prima di essere suddiviso tra le cellule figlie, inoltre la replicazione del DNA è coordinata con la divisione cellulare, i prodotti della replicazione sono segregati nella progenie Ogni replisoma deve gestire un filamento continuo e uno discontinuo Quando una cellula (E. coli) si prepara a dividersi deve duplicare il suo DNA e aumenta di dimensioni, necessitando di molta energia, quando si fanno crescere i batteri in coltura nella fase iniziale hanno una crescita esponenziale poi si arriva a fase stazionaria quando i nutrienti del terreno sono stati quasi tutti esauriti e la duplicazione viene rallentata Nella fase di inizio è implicata il sito di origine e la proteina DnaA che quando è legata all’ ATP è attiva mentre quando lo idrolizza in ADP diventa inattiva Le polimerasi che lavorano sul genoma di E.coli polimerizzano 1000 paia di basi al secondo quindi 60.000 al minuto, 600.000 in 10 minuti, ma ci sono 4.600.000 paia di basi da duplicare quindi la duplicazione del cromosoma avviene all’incirca in 40 minuti perché ci sono due forche di replicazione che lavorano contemporaneamente La divisione cellulare avviene in 20 minuti Quindi in teoria il tempo necessario per duplicare il genoma e dividere la cellula è di circa un’ora in realtà questo avviene solo quando il batterio si trova in condizione energeticamente sfavorevoli ma normalmente è possibile sovrapporre gli step infatti la duplicazione del DNA della generazione 2 inizia quando è ancora in corso la divisione cellulare precedente La cellula inizia a dividersi, i due genomi completati vanno ai poli opposti per essere segregati nelle cellule figlie, ma intanto in quei 20 minuti i due genomi riiniziano a dividersi, duplicarsi ciò significa che le cellule figlie ricevono un DNA completo che si sta già a sua volta duplicando

Gli istoni sono proteine basiche perché sono costituiti da aminoacidi basici, in una struttura nucleosomale ci sono otto proteine istoniche di quattro tipi (ognuna è presente in duplicato), H2A e H2B si associano a formare due eterodimeri, H3 e H4 si associano a formare tetramero, ottenendo un ottamero Queste proteine istoniche sono molto piccole (100-150 aminoacidi) hanno una modalità di ripiegamento molto conservata, dominio Histon-fold che prevede strutture ad alfa elica (globulari a cilindro) e i tratti centrali si ripiegano per dare forma globulare, le code non subiscono alcun ripiegamento particolare Quando gli istoni sono piegati il DNA si avvolge e le code n-terminali, cariche positivamente, rimangono fuori dalla doppia elica del DNA carica negativamente L’istone H1 rimane esternamente, è più grande, contiene un’elevata quantità di lisina e arginina Il ciclo cellulare di una cellula eucariotica può durare circa 24 ore, la duplicazione del DNA che avviene nella fase S che occupa circa 8 ore Si parte da una certa quantità di DNA in fase G1 che durante la fase S inizia ad aumentare fino a raddoppiare alla fine della fase S, poi durante la divisione cellulare si ritorna alle condizioni pre fase S L’andamento della sintesi degli istoni nella prima parte della fase S si ha il picco I cromosomi eucariotici sono replicati in modo bidirezionale a partire da numerose origini di replicazione Per rilevare le bolle di replicazione è possibile far esprimere all’interno delle cellule una proteina fusa con una proteina fluorescente Nei lieviti vi sono sequenze di replicazioni autonome (Autonomously replicating sequence) caratterizzate da sequenze particolari riconosciute da un complesso di riconoscimento dell’origine ORC Le origini di replicazioni si trovano in zone più sgombre di nucleosomi quindi più accessibili Non tutte le origini di replicazioni vengono utilizzate contemporaneamente ma ci sono alcune preferenziali, alcune che non iniziano mai e altre alternativamente Alcune origini possono essere replicate passivamente da una DNA polimerasi che è partita da un’altra origine di replicazione quindi per quel ciclo cellulare sono inattivate dalla replicazione del loro DNA Origini costitutive che sono sempre attive, utilizzate in ogni ciclo cellulare, perché si trovano in regioni più accessibili Origini dormienti che sono inattive si trovano in zone cariche di nucleosomi Origini flessibili che nei vari cicli cellulari si attivano alternativamente Le origini utilizzate nella fase S che quindi sono attive in quel ciclo cellulare ma non contemporaneamente si distinguono in iniziali, intermedie e tardive (classificazione temporale del momento di attivazione) I complessi di pre-replicazione iniziano ad assemblarsi nel genoma molto prima dell’inizio della replicazione ORC complesso di riconoscimento dell’origine Cdc6 e Cdt1 sono proteine necessarie per caricare l’elicasi esamerica (Mcm2-7) Pre-RC complesso di pre-replicazione Fattori addizionali che si uniscono al pre-RC Pre-IC complesso di pre-inizio che prepara le origini a essere caricate con la primasi e la DNA polimerasi Le chinasi sono enzimi che fosforilano altre proteine, meccanismo utilizzato per attivarlo o inattivarle Le cicline sono proteine variabili la cui concentrazione varia durante le varie fasi del ciclo, queste attivano le chinasi che a loro volta attivano i complessi di inizio fosforilandoli L’elicasi fosforilata attiva separa i filamenti della doppia elica tagliando i legami a idrogeno DNA polimerasi replicative degli eucarioti: Polimerasi α/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakiprimasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazaki Polimerasi δ (delta) si occupa del filamento discontinuo (allungamento dei filamenti di Okazaki) Polimerasi ε (epsilon) si occupa del filamento continuo (riparazione del DNA) La processività degli enzimi indica il numero di nucleotidi che polimerizzano prima di dissociarsi PCNA corrisponde alla pinza scorrevole dei batteri La polimerasi α/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakiprimasi ha una processività moderata e una frequenza di errore 10^4 -10^5 Le polimerasi delta e epsilon hanno attività polimerasica e esonucleasica (riparare gli errori) Meccanismi per prevenire un re-inizio della replicazione: A. La geminina inibisce la funzione Cdt1 sulle origini inibendo il caricamento dell’elicasi B. Inattivazione dell’origine dipendente dalla replicazione: Cdt1 è degradata nella fase S in modo dipendente dalla replicazione

C. Chinasi dipendente dalla ciclina che ha elevata attività in G2 ed M, fosforila e inattiva, o destabilizza, i componenti del pre-RC e/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakio ORC La polimerasi α/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakiprimasi sintetizza il primer poi lascia il posto alle altre due polimerasi Differenze tra il replisoma di una cellula di E.coli (batterica) e di una cellula eucariotica :nella prima ci sono due polimerasi uguali che si occupano della sintesi dei due filamenti mentre in quella eucariota ci sono due polimerasi diverse, a dare processività alle polimerasi vi è la pinza scorrevole nella cellula batterica β-clamp in quella eucariota PCNA ma hanno la stessa funzione, ad aprire la doppia elica vi è un elicasi DnaB nei batteri e Mcm2-7 negli eucarioti, la primasi nei batteri vi è la DNA G primasi mentre negli eucarioti polimerasi α/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakiprimasi, nei batteri vi sono le single stand binding protein che hanno funzione analoga alle proteine RPA degli eucarioti Dall’origine di replicazione parte forcella di replicazione bidirezionale, due filamenti uno continuo e uno discontinuo, ognuno dei quali inizia con un primer (uno per il filamento continuo, molteplici per quello discontinuo) La prima ad iniziare è la polimerasi α/primasi sintesi degli RNA primer e dei 20-30 nucleotidi di DNA nei frammenti di Okazakiprimasi che sintetizza il primer, poi le altre due polimerasi ciascuna nel filamento corrispondente entrambe scortate dalla pinza scorrevole PCNA che è caricata dal complesso RCF I frammenti del filamento discontinuo sono tanti e più corti, la polimerasi delta si occupa di questo filamento, si lega all’innesco di ogni frammento di Okazaki e lo allunga fino ad arrivare al primer del frammento precedente, quindi questa polimerasi ha anche l’attività di scostamento perché non degrada Il filamento scostato viene poi tagliano da un endonucleasi FEN1 e per dare continuità al filamento discontinuo interviene la DNA ligasi che catalizza la formazione del ponte fosfodiesterico mancante utilizzando energia Short Flap Pathway (scostamento breve) la polimerasi delta sposta ed espone un flap corto che è riconosciuto e tagliato da un endonucleasi, poi la DNA ligasi sigilla il nick Mentre nella Long Flap la polimerasi delta sposta ed espone un flap corto che è ulteriormente svolto, il flap allungato La differenza sta nella lunghezza del filamento scostato e nella seconda vengono utilizzate ulteriori proteine ma la prima è quella maggiormente utilizzata Per la rimozione degli inneschi a RNA può essere utilizzata anche una proteina RNasi H che degrada l’RNA ogni volta che è appaiato ad un filamento di DNA, tagliando i ponti fosfodiesterici che legano due ribonucleotidi (quindi può tagliarli tutti tranne l’ultimo che è tagliato dal FEN1) Il replisoma lega davanti la strutta a doppia elica avvolta attorno ai nucleosomi Il disassemblaggio dei nucleosomi parentali avviene in due eterodimeri H2A-H2B e un tetramero H3-H La sintesi di nuovi istoni avviene tramite l’assemblaggio di nuovi eterodimeri H2A-H2B e tetrameri H3-H4, questi dimeri H2A-H2B e tetrameri H3-H4, vecchi e nuovi si assemblano a caso perché gli istoni una volta che partecipano alla struttura della cromatina possono subire delle modifiche post-traduzionale Ci sono proteine chiamate chaperon di istoni che fungono da trasportatori e favoriscono il riassemblaggio della struttura cromatinica. La sintesi degli istoni va di pari passo alla sintesi del DNA I genomi lineari hanno il problema della replicazione delle estremità perché quando un primer di RNA viene rimosso dopo aver iniziato un filamento di DNA lineare, il gap che si crea non può essere riempito di DNA in quanto non vi è un 3'-OH a monte per accettare i nucleotidi, quindi il DNA lineare verrebbe accorciato durante ogni ciclo di replica La telomerasi è un enzima che si occupa dei telomeri cercando di contrastare il loro progressivo accorciamento, allungandoli in particolare è una DNA polimerasi RNA-dipendente cioè polimerizza deossiribonucleotidi e utilizza come stampo una molecola di RNA che è contenuta all’interno di questo enzima Quindi la telomerasi è costituita da subunità proteiche ma contiene anche una componente di RNA con funzione di stampo, una porzione di quell’RNA presenta ripetizioni complementari alla sequenza telomerica di quella specie L’RNA si appaia per complementarità in direzione antiparallela fungendo da stampo La telomerasi può prendere il nome anche di trascrittasi inversa La sequenza telomerica umana: TTAGGG La telomerasi allunga il filamento più lungo in modo che ci possa essere sintetizzato un innesco dalla primasi Caratteristiche peculiari della telomerasi:

Attività DNA polimerasica RNA-dipendente
Non ha necessità di uno stampo esogeno
Produce ssDNA
Separa il DNA dall’RNA stampo: attività RNA-DNA elicasica

2. REPLICAZIONE DNA PROCARIOTI E EUCARIOTI, Appunti di Biologia Molecolare

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