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ANTIBIOTICI 30 Aprile
Il primo approccio al concetto di antibiotico risale alla fine dell’ 800/primi del ‘900. La prima definizione fu quella di utilizzare un farmaco che avesse un’azione precisa,tossica per l’organismo patogeno … quindi l’idea era quella di sviluppare un farmaco che avesse una tossicità selettiva nei confronti solo di alcuni organismi che non fossero tossici per l’uomo. Da dove è venuto fuori questo concetto? È venuto da una semplice osservazione … avendo un preparato istologico e facendo delle colorazioni per evidenziare il tessuto si vedeva che erano presenti microrganismi che non si coloravano allo stesso modo e che quindi assumevano il colorante in maniera differente … si cominciò quindi a pensare che si poteva sfruttare questa differenza nella struttura dei batteri per poterli distinguere dalle cellule dell’ospite … e quando parliamo di chemioterapia in generale ,il concetto si riferisce all’utilizzo di un farmaco per scopi terapeutici che può essere antimicrobico ,quando parliamo di chemioterapia parliamo anche di antivirali, di antimicotici … oggi faremo gli antibiotici nei confronti dei batteri però in generale antibiotico è qualcosa che è contro la vita , può essere antiblastico per le terapie antitumorali o immuno modulante quando utilizziamo farmaci che regolano il sistema immunitario .Il primo antibiotico è quello che è stato scoperto da Fleming per puro caso. Egli aveva una piastra di batteri (stafilococchi) su cui crebbe una muffa, il penicillium notatum ,e notò che laddove la muffa era cresciuta aveva creato un alone di inibizione tutto intorno ,quindi qualcosa era stato prodotto nella muffa che,diffondendo,aveva impedito la crescita dei batteri. Da qua la prima scoperta della penicillina. Il nome“penicillium notatum” deriva proprio dalla forma a pennello che ha questa muffa. Non è un aspetto da sottovalutare il fatto che I microorganismi di per sé hanno questa capacità di produrre qualche sostanza capace di inibire la crescite di altre sostanze come la competizione di batteri nella flora, le batteriocine per esempio …. Quindi, anche le muffe producono delle sostanze che magari hanno un altro effetto..non tutti i metaboliti che vengono prodotti sono noti o ne è noto il meccanismo … spesso non si sa perché quella muffa produce la penicillina o qual è funzione che ha per la muffa stessa … l’importante è sapere se ha una funzione importante per noi e infatti dalla scoperta della penicillina in poi è stato messo a punto il metodo della purificazione e si sono incrementati sempre di più gli studi per cercare di individuare altre molecole che avessero lo stesso effetto ,o che avessero un effetto migliore, e quindi praticamente la ricerca ha preso il sopravvento in questo campo, andando ad analizzare tanti microorganismi,purificandone le sostanze … cosa che facciamo ancora tutt’oggi ,cioè vedere se i microrganismi che noi cresciamo,coltiviamo producono sostanze di nostro interesse, e l’interesse può essere inibire la crescita di altri batteri o di un fungo per scoprire nuovi antibiotici,nuovi antimicotici ma anche per vedere se queste sostanze hanno un effetto antitumorale, penicillium, per esempio, produce molte molecole che hanno un’attività antitumorale perché molte di queste vanno ad agire proprio sulla proliferazione cellulare, sui meccanismi del ciclo cellulare. Dalla scoperta del primo antibiotico in poi, sono state individuate tantissime altre molecole e diciamo che la percentuale di malattie infettive si è notevolmente ridotta, infatti ormai molte malattie sono debellate proprio grazie all’utilizzo di antibiotici, antivirali …. Un tempo si moriva di polmonite o per una semplice influenza che poi prendeva un decorso più grave in un soggetto particolarmente immunocompromesso … mentre oggi ,al contrario ,c’è un uso addirittura sconsiderato degli antibiotici. DEFINIZIONE Di ANTIBIOTICO: sostanza capace di inibire la crescita di altri microorganismi; L’antibiotico è una molecola naturale, un metabolita secondario di funghi e di altri batteri; Gli antibiotici sono molecole che hanno una specializzazione ,cioè una capacità selettiva di attaccare solo le cellule batteriche …. L’antibiotico è un veleno selettivo, e si differenzia da un disinfettante perché mentre quest’ultimo agisce con un meccanismo aspecifico ( cioè una polimixina ,per esempio, intercalandosi nella parete cellulare,altera la funzionalità della membrana ,determinando un afflusso /efflusso di ioni, e causa così la morte cellulare, potendo risultare dannosa anche per noi) l’ antibiotico, invece, và a targettare [ targhettare]delle funzioni precise del metabolismo batterico … Sono prodotte in una situazione in cui c’è una carenza di metaboliti , quindi quando il batterio si trova in difficoltà mette in atto la produzione di queste sostanze(tra cui queste molecole che hanno la funzione di antibiotici per noi) che il più delle volte vengono formate in fase di sporulazione, processo che si compie quando la cellula è in situazioni ambientali difficili come quando vi è carenza di nutrienti che porta a far prevalere la morte cellulare sulla crescita(osservando la
fine della curva di crescita, in fase stazionaria, la percentuale di cellule che muoiono è in maggioranza su quelle che crescono). Qual è la base per l’ individuazione di una nuova molecola con attività chemioterapica? Come facciamo a capire che và bene per noi? Deve avere, innanzitutto, una tossicità selettiva e deve essere in grado di riconoscere recettori specifici sul microrganismo in modo tale da poter essere attivo solo nei confronti del microorganismo, poi, è importante poter fare uno screening di vari prototipi naturali e semisintetici (dato che possiamo partire da una sostanza completamente naturale oppure possiamo realizzare una semisintesi partendo da una molecola base e poi costruirci intorno la molecola finale)oppure fare uso di analoghi), i modelli animali sono fondamentali per poter testare la tossicità , anche perché bisogna fare infezione in vivo e vedere l’ efficacia delle molecola e poi occorre valutare la chemio resistenza. Il principio su cui ci basiamo per l’ individuazione di molecole ,la base razionale su cui si è basata l’individuazione di nuovi chemioterapici è l’ assenza nelle cellule cariotiche del target molecolare. DOMANDA della prof: Quali sono i target molecolari presenti nelle cellule batteriche e non in quelle umane? Risposta: peptidoglicani(se io impedisco la sintesi del peptidoglicano induco la cellula a morire);LPS fa parte della membrana per cui potrebbe non esserci; il DNA perché è diverso,gli enzimi sono diversi; sintesi proteica→ribosomi procariotici … ci sta però un problema:Se io attacco i ribosomi procariotici posso creare danni alla cellula umana ?Si, per i mitocondri … infatti il cloramfenicolo ,che agisce sui ribosomi, è tossico sulle cellule in attiva replicazione come nel caso del midollo osseo. Gli antibiotici agiscono su questi meccanismi. Gli Antibiotici sono divisi in famiglie secondo: lo Spettro d’azione, il tipo di azione, l’origine, la carica elettrica e in base al meccanismo d’azione. CLASSIFICAZIONE IN FAMIGLIE : molecole che presentano le stesse caratteristiche strutturali , quindi li raggruppiamo in base alla struttura molecolare , per esempio, i β-lattami, accumunati dalla presenza dell’anello β- lattamico; i glicopeptidi; gli amminoglicosidi ; i macrolidi; i chinoloni, che agiscono sul DNA. CLASSIFICAZIONE secondo lo spettro d’azione: un antibiotico può essere ad ampio spettro quando agisce sia sui gram positivi che negativi, oppure a medio spettro se è invece attivo solo sui gram positivi o negativi mostrando una ristrettezza nel suo campo d’azione … gram positivi e negativi rappresentano due raggruppamenti completamente diversi per struttura, infatti nei gram negativi l’antibiotico deve attraversare la membrana esterna per poi raggiungere il petidoglicano,la membrana plasmatica,e infine le strutture che deve attaccare all’interno della cellula. CLASSIFICAZIONE secondo il tipo di azione: Può essere Batteriostatico o Battericida …. Batteriostatico:impedisco la replicazione cellulare, Battericida:uccido completamente la cellula … ma se io do per il tempo sufficiente l ‘antibiotico ad azione batteriostatica che effetto ottengo? La cellula MUORE … infatti se , a lungo, si impedisce al batterio di replicare alla fine lo induco a morire. CLASSIFICAZIONE secondo l’origine : si può parlare di origine naturale, quindi estrattiva … io prelevo/estraggo il principio attivo direttamente da una coltura di funghi ,per esempio, oppure ,per fare prima, posso partire da una base/un anello, montando poi la molecola intorno , realizzando dunque una semisintesi, oppure si può ricorre ad una sintesi chimica,giocando in questo caso sugli analoghi,su piccole differenze tali da vedere se una molecola rispetto ad un’altra migliora nella sua azione; Inoltre un antibiotico non necessariamente viene estratto da un solo tipo di microorganismo ma possiamo trovarlo in organismi differenti che possono produrre la stessa molecola con quella azione. CLASSIFICAZIONE secondo la carica elettrica: questo è un aspetto importante visto che stiamo parlando di batteri che hanno per lo più una carica netta negativa per la presenza dell’LPS come nei gram negativi,ma anche il peptidoglicano conferisce una carica negativa, e allora è importante la ionizzazione del farmaco perché questo và ad influenzare direttamente la farmacocinetica, quindi la capacità propria del farmaco di essere assorbito e metabolizzato. CLASSIFICAZIONE secondo il meccanismo d’azione : antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare, che inibiscono la sintesi proteica, che agiscono direttamente sui meccanismi di replicazione e trascrizione del DNA , antibiotici che alterano la membrana citoplasmatica, e poi ci sono quelli che agiscono come antimetaboliti, cioè come analoghi di molecole del batterio per esempio ed entrano in un pathway metabolico interrompendolo perché si sostituiscono ad un intermedio. ANTIBIOTICI ATTIVI SULLA PARETE CELLULARE: il primo raggruppamento è dato dai β-lattamici, accumunati dalla presenza di un anello tetra- atomico e dal legame β- lattamico , molti batteri producono le β- lattamasi , enzimi che scindono l’anello β- lattamico, per cui i batteri che producono le β- lattamasi impediscono agli antibiotici β-
membrana biologica in quanto hanno una struttura particolare molto simile alla membrana biologica,presentano una coda idrofilica ed una idrofobica, per cui riescono ad inserirsi nella membrana biologica per affinità(introducendo la coda idrofobica tra i fosfolipidi mentre quella idrofilica è rivolta verso l’esterno) e,in questo modo, interrompono la continuità della membrana alterandone le proprietà. Dunque l’azione della polimixina è simile a quella dei disinfettanti (quest’ultimi non possiamo utilizzarli sulla cute perché sono tossici ); diciamo che tali molecole vengono più utilizzate per uso topico e sono più attive nei confronti di batteri non metabolizzanti proprio perché non devono tergettare una funzione specifica del metabolismo batterico, bisogna necessariamente agire in maniera più diretta. ANTIBIOTICI CHE AGISCONO SULLA SINTESI PROTEICA: La tossicità selettiva per gli antibiotici che agiscono sulla sintesi proteica è dovuta al fatto che vanno ad attaccare i ribosomi proteici che ,come sappiamo, sono composti di unità differenti rispetto a quelli eucariotici; li dividiamo in antibiotici che agiscono sulla subunità 50 S e in antibiotici che agiscono sulla subunità 30 S. Le tetracicline sono antibiotici che hanno una struttura molecolare tetraciclica e vanno a bloccare la sintesi proteica nella fase iniziale , si legano alla subunità ribosomiale 30 S, quindi, le cause del 30 S impediscono l’attacco del t RNA (RNA transfer) , di conseguenza, l’RNA transfer non può portare l’amminoacido. Mi potete dire come agisce una tetraciclina , che agisce bloccando il ribosoma 30 S nella fase d’inizio , oppure, mi potete dire che l’amminoglicoside, per esempio, interferisce con il complesso d’inizio e poi provoca il misreading dell’RNA … Che cosa fanno gli Amminoglicosidi? Si legano alla subunità 30 S e ne vanno impedire il complesso d’inizio, la formazione del peptide ma,non solo, si possono posizionare nel sito di lettura nell’anticodone e addirittura provocare una errata lettura dell’anticodone da parte del t RNA , di conseguenza, viene portato un amminoacido al posto di un altro … Che cosa ne deriva fuori?Una proteina difettiva! Ma questa proteina difettiva è necessariamente negativa? Potrebbe essere positiva, tanto è vero che , se da un lato provoca la morte della cellula, s’introduce una proteina difettiva, in altri casi, invece, hanno dato una marcia in più ai batteri, addirittura hanno provocato un effetto mutageno in senso positivo , tanto da poter saltare dei pathway metabolici e non crescere più … per esempio, i batteri per crescere hanno bisogno per forza di un metabolita, magari diventano incapaci di poter utilizzare quel metabolita e riescono a colonizzare altri ambienti … quindi, diciamo che l’ utilizzo di questo antibiotico potrebbe “provare”? delle mutazioni che trovano delle resistenze. Gli Amminoglicosidi,per esempio, sono tossici per i nervi cranici e per il rene in quanto si può provocare ..?.. locale. Tra gli Amminoglicosidi: la Straptomicina, gentamicina, amikacina , neomicina ,che conosciamo molto bene, in particolare la gentamicina utilizzata anche a livello topico. (LA PROF SUGGERISCE Di FAR RIFERIMENTO AD UNO SCHEMA SUL VECCHIO “LA PLACA” CON LE FUNZIONI PRINCIPALI DEGLI ANTIBIOTICI) Abbiamo visto gli antibiotici che agiscono sul 30 S , vediamo adesso quelli che agiscono sul 50 S Il Cloramfenicolo,ad esempio, agisce attaccando la subunità ribosomiale 50 S , quindi impedisce l’attività della peptidiltransferasi interferendo con i legame di altri amminoacidi e la formazione del peptide. Il cloramfenicolo è tossico perché agisce sui mitocondri e può creare tossicità alle cellule eucaristiche; viene utilizzato,per esempio, per la salmonellosi sistemica; è un antibiotico batteriostatico: se si interrompe il trattamento , i batteri riprendono a crescere e magari diventano resistenti, crescendo con più vigore( c’è più substrato per loro e meno competizione). I macrolidi pure agiscono sulla subunità 50 S. ANTIBIOTICI CHE AGISCONO SULLA REPLICAZIONE DEL DNA: sappiamo che il DNA cromosomico batterico è una molecola altamente spiralizzata quindi ,prima di replicare, dobbiamo despiralizzare, indurre degli avvolgimenti in senso negativo per poterla aprire e poi occorre tagliare il punto di origine per poter procedere con la replicazione; tutto questo avviene grazie a degli enzimi:DNA Girasi. I chinolonici sono antibiotici che agiscono sulle DNA girasi impedendo al DNA di despiralizzarsi e quindi di poter trascrivere la propria informazione; hanno un’azione particolarmente precisa perché impediscono proprio a monte la formazione del messaggero. Le girasi hanno 2 subunità, una che induce lo srotolamento e una che induce avvolgimenti in senso negativo. I chinoloni possono agire su una subunità o sull’altra con l’azione finale di impedire alle girasi di funzionare: i chinoloni agiscono in sinergia con altri antibiotici;l’effetto sinergico si ha quando potenziamo l’effetto di un antibiotico, uno magari agisce su una subunità, un altro su di un’altra,andando ad inibire l’attività dell’enzima. Possiamo anche agire sulla RNA polimerasi , impedire quindi il suo funzionamento , ostacolando la formazione del messaggero. Abbiamo
antibiotici che fanno al nostro caso, come la Rifampicina e la Rifamicina ; quindi viene inibita la sintesi del RNA, sono particolatamente attivi nei confronti dei micobatteri. Il Metronidazolo contiene un gruppo -NO che funziona liberando dei composti intermedi reattivi dell’azoto e quindi andando ad agire come una borsa ossidativa come avviene nei macrofagi. Andiamo a vedere come funzionano gli ANTIMETABOLITI : i batteri, rispetto a noi che assumiamo acido folico dall’esterno (in particolare durante la gravidanza ), riescono a sintetizzarlo , non sono in grado di utilizzare quello già formato. I sulfamidici sono degli antimetaboliti, vanno ad alterare una delle due vie metaboliche in cui si ha la formazione degli acidi folici o la formazione delle purine (fondamentali per la formazione delle basi azotate). Come funziona?Il sulfanilamide compete con la formazione dell’acido p-aminobenzoico, quindi interviene in questa fase della via metabolica impedendo la formazione dell’acido diidro- “pterico”(acido diidro-pteroico) e quindi non può proseguire il pathway metabolico della formazione degli acidi folici perché si sostituisce a questo acido che entra nel pathway metabolico delle reazione per la formazione delle purine. Il simetropim??? Per esempio agisce invece in quest’altra parte del pathway metabolico andando ad inibire l ‘enzima diidrofolato- reduttasi , agendo un po’ più a valle ma la conseguenza finale è che non si possono formare le purine , quindi vengono meno gli scheletri carboniosi per poter costruire le basi azotate. RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI: Che cos’è la resistenza? E’ la capacità dei batteri di essere o diventare resistenti nei confronti degli antibiotici riuscendo a moltiplicarsi indisturbati. Come origina tale resistenza? Può essere naturale perché si acquisisce per mutazione, quindi qualcosa che può essere geneticamente trasmesso , e da cosa dipende? Ovviamente, tutti i ceppi della stessa specie originati da quel batterio presenteranno la stessa resistenza , e dipende dalle caratteristiche dell’antibiotico, dalle caratteristiche del microorganismo o la mancata, ridotta capacità dell’antibiotico di ..?... il microorganismo e quindi provocare danno. La resistenza agli antibiotici ,come per esempio quelli che agiscono sulla parete, come i macrolidi , o altri antibiotici che agiscono sui micobatteri( in questo caso c’è un grosso problema circa la resistenza : si sviluppano infatti continuamente nuove specie sempre più resistenti) riguarda la permeabilità della parete oppure la mancanza del bersaglio, come i beta-latammici; una modifica di un enzima , di una Penicillin-Binding-Protein può determinare che il beta-lattamico non è più in grado di andare a saturare il sito perché magari il bersaglio cellulare si è modificato. La resistenza batterica può essere cromosomica , quindi facente parte del genoma del batterio, oppure acquisita , esogena, mediante i processi di coniugazione , quindi può essere una resistenza mediante plasmidi. Perché questa resistenza si acquisisce? Perché i batteri si dividono velocemente e quindi vanno incontro ad una rapida moltiplicazione e di conseguenza è più facile che gli errori ,i difetti vengano trasmessi alla progenie, e quindi si può formare una popolazione resistente .Può esserci a livello cromosomico un alterazione dovuta ad una mutazione spontanea che modica il sito del bersaglio, che modifica la Penicillin-Binding-Protein , e quindi i beta-lattamici non possono più legarsi, non riescono più a modificare l’attività di quell’enzima, oppure di per sé l’antibiotico può avere un’azione selettiva che riesce a selezionare i mutanti e si può trasmettere verticalmente …. questo è quello che succede nel corso della selezione naturale. Quando invece è extra-cromosomica , la possiamo trasferire mediante meccanismi di trasferimento genico, mediante trasposoni, mediante trasferimento fagico.., ; in questo modo possiamo fare acquisire una resistenza alla tetraciclina se un batterio “X” acquisisce questo plasmide che prima non possedeva, oppure sui trasposoni. Questi sono gli scambi che avvengono tra batteri gram positivi e negativi , in cui ci può essere il passaggio dei plasmidi. In caso di resistenza possono anche modificarsi i canali d’entrata, le pompe d’efflusso oppure possono verificarsi modificazioni a carico degli enzimi che vengono individuati, cambia la via metabolica che porta alla formazione delle purine per cui il sulfamidico non ha più efficacia …. In pratica, le varie alterazioni che interessano i pathway metabolici inattivano l’antibiotico. L’azione del biofilm determina l’incapacità di agire dell’antibiotico; per come è strutturato il biofilm, l’antibiotico non riesce a penetrare ed ad agire sul batterio. ANTIBIOGRAMMA: è un metodo che ci consente di valutare se il microorganismo isolato può essere ucciso utilizzando una determinata terapia, un determinato farmaco. Esistono delle linee guida da seguire per la scelta dei vari antibiotici nei confronti dei vari microorganismi; quello che fa il laboratorista è quello di studiare l’azione degli antibiotici su un determinato microorganismo; quando si esamina un campione ,in seguito a biopsia, e c’è uno stafilococco , dobbiamo sapere se è possibile eliminarlo tramite penicillina o un altro antibiotico. Come procediamo?
