LEZIONE 16

Oggi parleremo di come impedire la crescita batterica, degli approcci che si

utilizzano.

Vedremo che impedire la crescita, tenere sotto controllo o eliminarli sono livelli

differenti ma sono la stessa cosa cambia solamente l’efficacia, impedire che si

riproducano è la prima soluzione, è quello che fanno i medicinali. Questi infatti

hanno una facoltà batteriostatica non li eliminano ma non gli permettono di

riprodursi,

Quindi tenere sotto controllo la crescita microbica è la base

Abbiamo già detto in passato che conoscere i batteri, il loro metabolismo e il

loro ambiente ci permette di trovare strategie per combatterli.

Individuiamo due grandi gruppi, quelli che usano metodi fisici e quelli che

invece hanno un approccio chimico.

La STERILIZZAZIONE è il livello più alto, comprende qualsiasi processo che

riesce ad eliminare ogni forma di vita comprese quelle più resistenti

(endospora) qualsiasi oggetto sterile non ha forme di vita, infatti si applica

solamente ad oggetti inanimati, si può anche applicare a sostanze liquide (es.

soluzione salina). I terreni che si utilizzano in laboratorio sono ovviamente

sterili, perché quando si vuole far crescere un batterio bisogna essere sicuri che

non ci siano già altri batteri. Il concetto di sterilità non va applicato solo ai

terreni di laboratorio è un concetto che vale per moltissime cose.

Ora andiamo su due concetti molto simili DISINFEZIONE e ANTISEPSI tanto

che spesso vengono utilizzati come sinonimi, sono simili perché si riferiscono

all’eliminazione della gran parte delle forme vegetative (non eliminano le

endospore) però c’è una piccola differenza il termine disinfezione è rivolta alle

superfici inanimate, per le ferite si potrebbe dire applicare un disinfettante, ma

sarebbe meglio dire si usa un antisettico, perché questo è adatto quando si

parla di superfici corporee, e soprattutto l’antisettico è sempre di natura

chimica mentre il disinfettante può anche non esserlo, esistono anche alcuni

processi fisici come l’utilizzo dei raggi ultravioletti.

Questo ci risulta naturale se si considera che il concetto di antisettico è rivolto

alla prevenzione dalla sepsi e quindi dall’infezione, lo dice il termine stesso.

Nel pensiero comune questi due processi si pensa che servano a eliminare i

patogeni, ma in realtà eliminano tutti i batteri nella forma vegetativa non solo

quelli patogeni.

Eliminano la gran parte dei batteri ma non tutti, sono meno efficaci della

sterilizzazione.

L’ultimo termine da ricondurre a questi è il concetto di CHEMIOTERAPIA, è

una terapia farmacologica riferita appunto all’utilizzo di farmaci presi per via

sistemica che hanno l’obbiettivo di eliminare o di impedire la riproduzione dei

batteri, per esempio gli antibiotici sono farmaci chemioterapici. La differenza

tra antisepsi e chemioterapia sta nel fatto che entrambe sono riferite a un

ospite ma gli antisettici hanno un effetto superficiale e locale (ferite e cavo

orale) mentre invece i chemioterapici (antibiotici e antimicrobici) hanno

un’azione sistemica. In entrambi i casi, lo sottolineo non esistono farmaci a

stretto spettro che vanno ad eliminare i patogeni, la maggior parte degli

antibiotici hanno un ampio spettro. E’ il motivo per cui non si deve abusare

degli antibiotici.

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LEZIONE 16

Oggi parleremo di come impedire la crescita batterica, degli approcci che si utilizzano. Vedremo che impedire la crescita, tenere sotto controllo o eliminarli sono livelli differenti ma sono la stessa cosa cambia solamente l’efficacia, impedire che si riproducano è la prima soluzione, è quello che fanno i medicinali. Questi infatti hanno una facoltà batteriostatica non li eliminano ma non gli permettono di riprodursi, Quindi tenere sotto controllo la crescita microbica è la base Abbiamo già detto in passato che conoscere i batteri, il loro metabolismo e il loro ambiente ci permette di trovare strategie per combatterli. Individuiamo due grandi gruppi, quelli che usano metodi fisici e quelli che invece hanno un approccio chimico. La STERILIZZAZIONE è il livello più alto, comprende qualsiasi processo che riesce ad eliminare ogni forma di vita comprese quelle più resistenti (endospora) qualsiasi oggetto sterile non ha forme di vita, infatti si applica solamente ad oggetti inanimati, si può anche applicare a sostanze liquide (es. soluzione salina). I terreni che si utilizzano in laboratorio sono ovviamente sterili, perché quando si vuole far crescere un batterio bisogna essere sicuri che non ci siano già altri batteri. Il concetto di sterilità non va applicato solo ai terreni di laboratorio è un concetto che vale per moltissime cose. Ora andiamo su due concetti molto simili DISINFEZIONE e ANTISEPSI tanto che spesso vengono utilizzati come sinonimi, sono simili perché si riferiscono all’eliminazione della gran parte delle forme vegetative (non eliminano le endospore) però c’è una piccola differenza il termine disinfezione è rivolta alle superfici inanimate, per le ferite si potrebbe dire applicare un disinfettante, ma sarebbe meglio dire si usa un antisettico, perché questo è adatto quando si parla di superfici corporee, e soprattutto l’antisettico è sempre di natura chimica mentre il disinfettante può anche non esserlo, esistono anche alcuni processi fisici come l’utilizzo dei raggi ultravioletti. Questo ci risulta naturale se si considera che il concetto di antisettico è rivolto alla prevenzione dalla sepsi e quindi dall’infezione, lo dice il termine stesso. Nel pensiero comune questi due processi si pensa che servano a eliminare i patogeni, ma in realtà eliminano tutti i batteri nella forma vegetativa non solo quelli patogeni. Eliminano la gran parte dei batteri ma non tutti, sono meno efficaci della sterilizzazione. L’ultimo termine da ricondurre a questi è il concetto di CHEMIOTERAPIA, è una terapia farmacologica riferita appunto all’utilizzo di farmaci presi per via sistemica che hanno l’obbiettivo di eliminare o di impedire la riproduzione dei batteri, per esempio gli antibiotici sono farmaci chemioterapici. La differenza tra antisepsi e chemioterapia sta nel fatto che entrambe sono riferite a un ospite ma gli antisettici hanno un effetto superficiale e locale (ferite e cavo orale) mentre invece i chemioterapici (antibiotici e antimicrobici) hanno un’azione sistemica. In entrambi i casi, lo sottolineo non esistono farmaci a stretto spettro che vanno ad eliminare i patogeni, la maggior parte degli antibiotici hanno un ampio spettro. E’ il motivo per cui non si deve abusare degli antibiotici.

Lo schema seguente indica tutti i metodi che abbiamo osservato dividendoli secondo il tipo di agenti che utilizzano. Nella parte in sinistra si hanno quelli fisici, al centro quelli chimici e a destra quelli meccanici che riguardano unicamente la filtrazione. Alla fine delle colonne troviamo i metodi, potete osservare in nero la sterilizzazione, in bianco la disinfezione, in giallo la chemioterapia e infine in grigio l’antisepsi. STERILIZZAZIONE MEDIANTE CALORE Ovviamente il calore può sia sfavorire che favorire la crescita batterica, dipende ovviamente dal range di sopportazione del batterio. Se ho un batterio psicotropo una temperatura di 20° lo eliminerà, mentre un mesofilo starà bene a 20°. L’agente fisico in questo caso è il calore, ha un effetto dose dipendente, tanto più la temperatura è alta tanto meglio avverrà la sterilizzazione così come è anche tempo dipendente. Cosa vuol dire? E’ vero che tanto maggiore sarà la temperatura tanto meno sarà la frazione di sopravviventi, ma anche il tempo incide sul livello di sopravvivenza dei batteri sottoposti a calore. Quindi l’agente fisico calore nell’eliminazione dei batteri dipende sia dal tempo che dalla temperatura (questo vale per tutti gli agenti sopra elencati). Ci sono due metodi di calore diverso, calore secco e calore umido. Il calore secco è aria calda mentre quello umido è vapore acqueo saturo, quindi la differenza fondamentale è che in un caso il calore viene trasferito attraverso l’aria (calore secco) e nell’altro attraverso l’acqua (calore umido) e ciò succede solamente quando il vapore acqueo è saturo, ovvero quando il recipiente in cui avviene la

valvola non permette alla pressione di aumentare ulteriormente) e in questo modo il vapore diventa più caldo (121°). Quando vi chiederò le condizioni operative dell’autoclave, la prima cosa che voglio sapere è che l’autoclave funziona a una atmosfera (1 atm) perché è questo che permette al vapore di arrivare a 121°. Riassumendo: crea definizione per l’autoclave atm – gradi – tempo L’autoclave non ha bisogno di molta acqua perché una volta chiusa la valvola il vapore non esce, possiede poi un timer che conta i 15 minuti e poi stacca. Nell’autoclave si possono sterilizzare oggetti inanimati che ovviamente non devono essere termolabili, si sterilizzano soprattutto oggetti che hanno a che vedere con i liquidi, si possono sterilizzare le provette in plastica termostabile o la vetreria, le pinzette anche se tutto ciò che è fatto di vetro e metallo può essere sterilizzato anche in un altro apparato molto più semplice di cui parleremo dopo, infatti l’autoclave viene utilizzata soprattutto per sterilizzare cose liquide. Qui sorge una domanda come fanno a non evaporare a 121°? E’ vero che il liquido evapora ma rimane nell’autoclave, poi ricondensa, tanto che il volume prima e dopo rimane lo stesso. L’autoclave viene anche usata per sterilizzare i terrenti di coltura. Come potremmo controllare se l’autoclave è ben funzionante? Un modo per testarla è mettere una coltura in autoclave e poi controllare che sia stato tutto eliminato, però più precisamente vengono venduti dei kit contenenti della provette con all’interno delle spore, il contenuto delle provette dopo l’autoclave viene messo in un terreno dove non dovrà crescere niente.

CALORE SECCO

Sterilizzazione con Calore Secco  FIAMMA DIRETTA (FLAMBAGGIO)  INCENERIMENTO  ESPOSIZIONE AD ELEVATE TEMPERATURE in Stufa In laboratorio produciamo diversi rifiuti, tra questi abbiamo quelli a rischio infettivo, che vanno inceneriti o sterilizzati. Parleremo ora della sterilizzazione fatta con la stufa che è basata sul calore secco, più precisamente sull’aria. Nella stufa possiamo mettere molti materiali termoresistenti, non ci si mettono liquidi ovviamente e nemmeno oggetti di plastica perché le temperature

Un altro tipo di sterilizzazione a freddo è quella della sterilizzazione mediante filtrazione. Si attua utilizzando un filtro con dei pori abbastanza piccoli da trattenere i batteri in modo da separarli dal liquido in cui sono presenti. Il filtrato sarà sterile perché verranno trattenute anche le spore, le uniche cose che riescono a passare sono i virus, ma non è importante visto che non sono viventi. Hanno inventato però dei filtri EPA con dei fori ancora più piccoli che trattengono anche i virus. La grandezza dei pori va da 0,45 micron a 0, micron (a questa grandezza non passano neanche i virus). In realtà può essere filtrata anche l’aria, con il vantaggio che si possono utilizzare anche pori più piccoli, per i virus. Soprattutto nei laboratori di classe 3 e 4 dove si lavora con virus molto pericolosi l’aria viene filtrata attraverso questi filtri EPA ma anche con le cappe a flusso Laminare si possono eliminare i virus. Si tratta di una cappa dove l’aria viene fatta passare in questi livelli lamellari dove i batteri vengono intrappolati all’interno. Parliamo di coltivazione in laboratorio, la microbiologia nasce dal momento in cui nasce questa possibilità, per questo è considerata una scienza recente e tutt’ora la coltivazione il laboratorio rappresenta un aspetto fondamentale per la microbiologia, anche se più recentemente si sta cercando di distaccarsi da questo metodo proprio perché ha dei limiti, la gran parte dei batteri non possono essere coltivati in laboratorio. Negli ultimi anni infatti la coltivazione rimane comunque un grande pilastro della microbiologia ma si stanno trovando delle tecniche alternative che la bypassano. Per coltivare dei batteri in laboratorio dobbiamo andare incontro alle loro esigenze nutrizionali e quindi dobbiamo conoscere quali esse siano. Perché poterli coltivare significa farli crescere in modo che raggiungano un numero tale da poter essere studiati e per poterlo fare dobbiamo conoscere il loro metabolismo e non solo, anche le loro condizioni ambientali favorevoli e quindi i range di tolleranza (temperatura, pH, forza ionica ecc.) del batterio in studio. E’ inutile per esempio dare a un batterio un terreno ricco di nutrienti organici se questo è un batterio unicamente chemiolitotrofo, è inutile mettere un batterio in una provetta se questo è un anaerobio stretto e quindi è costretto a stare lontano dall’ossigeno mentre le provette odierne sono proprio fatte per farlo

passare (è molto difficile infatti lavorare con gli anaerobi stretti, infatti spesso con questi si lavora sotto cappa perché se vengono a contatto con l’ossigeno muoiono). Quindi per poter coltivare bisogna conoscere sia gli aspetti nutrizionali che quelli ambientali. Esigenze e fattori nutrizionali dei batteri  NUTRIENTI (composti organici vari, C,N,P,S, ioni metallici, es Fe)  OSSIGENO (presenza o assenza)  ENERGIA (ricavata da composti o da luce)  ACQUA  TEMPERATURA  pH  FORZA IONICA ESIGENZE NUTRIZIONALI Fattori di crescita organici  Aminoacidi  Vitamine  Alcune purine e pirimidine etc.  Sangue  Siero  Liquido ascitico etc. ESIGENZE NUTRIZIONALI Sali minerali  P, S  K, Mg, Ca, Na, Fe ESIGENZE NUTRIZIONALI AZOTO ORGANICO

Aminoacidi
Molecole organiche complesse
Fattori di accrescimento Le esigenze nutrizionali non si riferiscono solamente alle fonti di carbonio ma anche alle fonti di azoto per poter fare il punto di biosintesi, spesso alcuni batteri hanno bisogno di amminoacidi ben precisi perché non riescono a sintetizzarli o spesso dalle molecole organiche complesse ricavano sia il carbonio che l’azoto, vedremo che tra gli ingredienti inseriti nei terreni non troveremo il singolo zucchero ma degli ingredienti complessi come gli estratti di lievito che avranno una parte zuccherina e una parte amminoacidica in modo che il batterio abbia tutto quello di cui ha bisogno. Vi invito ad osservare bene questa tabella sui micronutrienti che molto spesso vengono sottovalutati ma sono utilizzati per svolgere importanti funzioni.

batterio è antibiotico resistente, o per esempio per i batteri ambientali e trovare quelli che hanno una valenza biotecnologica, si isola il batterio e poi si estrae il DNA per identificarlo. Si applica alla microbiologia applicata, quando si ha bisogno di un batterio che produce una determinata sostanza. Nella prossima lezione osserveremo i vari tipi di terreno, in primis faremo una distinzione sullo stato fisico del terreno, poi per la composizione chimica e infine per l’utilizzo che hanno. Per quanto riguarda lo stato fisico ciò si riferisce al fatto che un terreno può essere solido o liquido, la scelta dipende da cosa si vuole fare, perché la crescita avviene in maniera diversa. In uno liquido la crescita si nota per intorbidimento, nel terreno solido invece il batterio non è libero di muoversi e quindi cresce fermo sul posto fino a che la colonia diventa visibile a occhio nudo. Le colture su terreno solido acquistano morfologie diverse. Il fatto di avere una colonia isolata è il presupposto per ottenere una coltura pura, perché una colonia è fatta da una moltitudine di cellule ammassate, e siamo sicuri che una colonia sia isolata perché è omogenea e lontana da altre colonie, si dice anche clonata, perché ogni cellula è identica alle altre e identica alla madre. Da un punto di vista della formulazione (nutrizionale, caratteristiche) il terreno liquido e solido sono identici, l’unico ingrediente in più è un solidificante, molto spesso l’agar, che è un ingrediente liquido aggiunto ai terreni che viene riscaldato (100°/120°) una volta che si raffredda solidifica.

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