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stafilococchi Gli stafilococchi sono batteri di forma sferica immobili, privi di una capsula evidente, Gram+ e crescono bene nei comuni terreni di coltura. Essi sono aerobi-anaerobi facoltativi, che utilizzano il sistema completo dei citocromi quando crescono in presenza di ossigeno, mentre in ambiente anaerobio utilizzano il metabolismo fermentativo. Pur non essendo sporigeni mostrano una notevole resistenza a condizioni ambientali sfavorevoli. Il genere staphilococcus comprende varie specie, tra cui la più importante è quella dello staphilococcus aureus Staphilococcus aureus Il nome deriva da un caratteristico pigmento giallo oro che il batterio presenta sulle culture in terreno solido. Questo batterio è ospitato dalla cute e a livello del naso-faringe. Le infezioni stafilocciche sono alla base di diversi quadri patologici che si differenziano notevolmente a seconda della sede del processo infettivo e delle sue modalità di diffusione. In particolare questi batteri sono gli agenti più frequenti delle infezioni cutanee (foruncoli), che iniziano a livello dei follicoli piliferi, in conseguenza della produzione da parte dei batteri di numerosi enzimi lipolitici che consentono l’eliminazione di alcuni componenti dei lipidi cutanei (sebo). La tossina epidermolitica prodotta da questi batteri può essere causa della malattia di Ritter. Oltre ai quadri patologici infettivi, alcuni stafilococchi, produttori di enterotossine sono la causa di intossicazioni alimentari quando sono in grado di contaminare alcuni cibi ricchi di lipidi. Strutture superficiali e caratteri antigeni La cellula di SA è provvista di una capsula dotata di potere antifagocitario che è neutralizzato dagli specifici anticorpi. Sulla cellula di SA sono presenti, con una collocazione superficiale alcune proteine che sembra svolgano un ruolo biologico di qualche rilievo. Tra le adesine è compresa una proteina denominata clumping factor, o coagulasi legata alla cellula, in grado di legarsi al fibrinogeno causando la precipitazione intorno alla cellula batterica; la proteina A in vivo sembra provocare l’attivazione del complemento l’inibizione della fagocitosi ad opera dei polimorfo nucleati, la comparsa di reazioni di ipersensibilizzazione e la moltiplicazione dei linfociti. Meccanismo dell’azione patogena SA è un batterio che può essere causa di infezione piogenica acuta a diversa localizzazione ed in alcun circostanze (osteomielite, ascessi cerebrali o renali), di infezioni ad andamento subacuto che si aggrava progressivamente. I principali strumenti dell’azione patogena sono una serie di fattori in grado di favorirne la moltiplicazione in vivo come le adesine sopra citate, l’abbondante produzione di catalasi in grado di garantire una protezione dai meccanismi di killing da parte dei fagociti e dalla produzione di una numerosa serie di tossine ed esoenzimi in grado di ledere vari elementi cellulari. Le tossine che intervengono sono fondamentalmente le emolisine o citolisine, mentre gli esoenzimi principali sono due: La coagulasi stafilococcica che, reagendo con un fattore plasmatico è capace di trasformare il fibrinogeno in fibrina in assenza di calcio; il fibrinogeno così depositato sulla superficie della cellula batterica potenzia l’azione fagocitaria Stafilochinasi in grado di legarsi al plasminogeno e trasformarlo nell’enzima fibrinolitico plasmina, con il possibile significato di strumento di invasività che il batterio utilizza per superare eventuali ostacoli meccanici alla sua diffusione. Altri esoenzimi sono la lipasi, la nucleasi termoresistente (nel test di ricerca DNAsica è utilizzata come strumento di identificazione diagnostica). Altre tossine ad essere prodotte sono la tossina
epidermolitica o esfoliativa e la tossina dello shock tossico. Quest’ultima è in grado di generare lo shock tossico da stafilococco e si identifica col TSST1 che è un fattore pirogenico e superantigenico ed è capace di diffondere in circolo attraverso le mucose senza la necessità della preventiva colonizzazione batterica e conseguente lesione dell’epitelio. Un’altra tossina prodotta è l’enterotossina che stimola l’attivazione policlonale dei linfociti T (è causa di allergie alimentari ) con la conseguente liberazione locale di citochine pro infiammatorie cui segue la comparsa di lesioni flogistiche che si accompagnano a sintomi enterici (diarrea). Metodi di identificazione L’esame microscopico diretto di materiale proveniente da raccolte ascessuali chiuse o comunque da zone dell’organismo che non comunicano con l’esterno, può consentire di identificare presuntivamente in SA, l’agente responsabile delle lesioni, quando si repertano cocchi Gram+ con disposizione a grappolo. L’esame colturale, invece, utilizza come terreno l’agar normale, inquanto SA non ha particolari esigenze nutritive: è meglio utilizzare però piastre agar-sangue di coniglio, in cui le colonie di SA appaiono circondate da un alone di emolisi, oppure piastre di agar addizionato al 7,5% di NaCl (che è ben tollerato a questa concentrazione da SA, mentre inibisce la maggiorparte degli altri batteri) eventualmente con l’aggiunta di mannite (che è uno zucchero costantemente fermentato da SA) e di un indicatore di pH come il rosso fenolo. Nelle piastre del cosiddetto terreno di Chapman che così si formano, le colonie di stafilococco sono circondate da un alone giallo causato dal viraggio dell’indicatore nella zona di terreno dove sono diffusi gli acidi prodotti dalla fermentazione dello zucchero. Dalle colonie sospette si allestisce un preparato microscopico colorato con il metodo di Gram per l’identificazione del batterio. I batteri dai quali l’SA deve essere differenziato sono rappresentati dagli streptococchi, dalle altre specie di stafilococchi generalmente apatogeni e dai possibili commensali dell’organismo umano. Dagli streptococchi e dagli pneumococchi, apparte il diverso aspetto delle colonie e i diversi caratteri morfologici, SA può essere facilmente differenziato per la produzione di catalasi. La differenziazione di SA da micrococchi e da altre specie di stafilococchi non è possibile sulla scorta dei caratteri rilevabili al microscopio: bisogna ricorrere alla ricerca della stafilocoagulasi o del clumping factor. Si utilizza in tal cao una reazione di agglutinazione passiva con globuli rossi ricoperti da fibrinogeno ed immunoglobuline che, mescolati su un vetrino insieme alla sospensione di SA, si agglutinano per la combinazione rispettivamente con il clumping factor e con la proteina A e possono essere utilmente impiegate nella routine diagnostica. Per l’identificazione di stipiti di stafilococco produttori di tossina esfoliativa o di TSST1, di può ricorrere alla ricerca della presenza delle varie tossine nei liquidi di coltura attraverso indagini immunologiche (tecniche immunoenzimatiche, agglutinazione passiva di particelle di latice ricoperte da anticorpi specifici per la tossina ricercata ecc.). Gli stessi tipi di indagine sono utilizzati per la ricerca di enterotossine stafilococciche nei cibi contaminati. Tipizzazione fagica SA è sensibile a numerosi batteriofagi virulenti che, moltiplicandosi nella cellula batterica, sono in grado si provocarne la lisi. La sensibilità ai vari batteriofagi non è uniformemente distribuita e un batteriofago può essere virulento per una stipite batterico e temperato per un altro. A tal proposito dobbiamo precisare alcuni concetti sui batteriofagi. Questi virus sono formati da una molecola di DNA racchiusa in un contenitore proteico che ha il compito di mediare la penetrazione nella cellula bersaglio dell’acido nucleico. Quest ultimo, in quello che prende il nome di ciclo litico, utilizzando i metodi metabolici cellulari, provvede alla propria replicazione, alla sintesi di nuove proteine dell’involucro e all’assemblaggio delle nuove particelle virali che fuoriescono in conseguenza della lisi della cellula infetta (fagi virulenti). Alternativamente, in quello che prende il nome di ciclo lisogeno, il batteriofago (in questo caso si parla di fagi temperati) può integrarsi nel genoma della cellula, ovviamente in corrispondenza di
α emolitici o viridanti : sono circondate da un ristretto alone di emolisi incompleta (osservando al microscopio l’alone si notano ancora numerose emazie intatte) con una tipica coloratura verdastra per la presenza di un composto con questa colorazione, prodotto dalla trasformazione metabolica dell’emoglobina. β emolitici : sono circondati da un alone di emolisi completa. Non emolitici Antigene C Sulla base del tipo di antigene polisaccaridico C estraibile dalle cellule batteriche mediante idrolisi acida a caldo gli streptococci sono divisi in una ventina di gruppi identificati con le lettere dell’alfabeto, nella cosiddetta classificazione di Lancefield. Le specie dotate di potenziale patogeno sono lo streptococcus pyogenes (SP), lo streptococcus agalactiae (SA) e lo streptococcus pneumoniae (pneumococco) Streptococcus piogenes L’SP è uno streptococco β-emolitico con antigene polisaccaridico del gruppo A. La manifestazione infiammatoria acuta più frequente è rappresentata dalla cosiddetta angina streptococcica che, nei casi in cui lo stipite batterico infettante sia in grado di produrre la tossina eritrogenica, si accompagna ad un caratteristico esantema e prende il nome di scarlattina. All’angina o alla scarlattina possono accompagnarsi complicanze infettive localizzate o a distanza ( meningite ) con la possibilità che i batteri vadano in circolo e, depositandosi a livello del tessuto valvolare cardiaco, determinino endocardite acuta ulcerativa. Le infezioni da stipiti produttori di tossine pirogene possono provocare la sindrome da shock tossico. Alle reazioni infiammatorie piogeniche acute possono seguire manifestazioni non suppurative collegate però alla prima causa. Tali complicanze sono costituite dalla glomerulo nefrite post-streptococcica e dalla febbre reumatica acuta. Strutture superficiali e caratteri antigenici La cellula batterica può presentare una capsula provvista di elevato potere antifagocitario e la cui presenza è collegata alla maggiore patogenicità del batterio. Essa è formata da acido ialuronico e non è imunogena presumibilmente perché indistinguibile dall’acido ialuronico presente nella matrice extracellulare del connettivo. Antigenicamente efficaci sono invece le fibrille che sono formate da una proteina denominata proteina M. Questa è un’importante fattore di virulenza, per la sua azione antifagocitaria. Esistono tuttavia 100 diversi tipi di proteina M, la maggiorparte dei quali può essere divisa in due classi principali; la classe 1 è caratteristica della maggiorparte degli SP associati alla comparsa di febbre reumatica. Il meccanismo attraverso il quale SP aderisce alle cellule epiteliali è rappresentato dall’interazione della proteine F con la matrice extracellulare Meccanismo di azione patogena L’infezione da SP non sempre si accompagna a segni clinici evidenti. Forme piogeniche acute L’esotossina principale di SP è costituita dalla streptolisina-o che fa parte delle emolisine e la cui attività è bloccata in presenza di ossigeno: essa agisce causando la formazione di pori che alterano la membrana di cellule come gli eritrociti. La streptolisina-o è antigenicamente identica indipendentemente dal sierotipo M e queste caratteristiche sono alla base delle indagini sierologiche (ricerca di anticorpi specifici); essa agisce sui cheratinociti e sui leucociti.
Gli stipiti SP producono un’altra sostanza ad azione citolitica che prende il nome di streptolisina S che in vitro viene liberata nel mezzo di coltura solo in presenza di alcune sostanze denominate carrier. Essa è ossigeno-stabile (a differenza della precedente tossina) e responsabile dell’alone di emolisi completa che si osserva intorno alle colonie di SP incubate in agar sangue. Essa è scarsamente immunogenica. Accanto alle esotossine sono presenti tutta una serie di esoenzimi quali la streptochinasi, la cisteino- proteinasi e la ialuronidasi, tutte sostanze con il significato di fattori in grado di favorire la diffusione del batterio nei tessuti circostanti il sito della colonizzazione primaria. Alcuni stipiti di SP producono tossine pirogene (SPE) e il cosiddetto superantigene streptococcico. Sequele non suppurative La febbre reumatica acuta e la relativa complicanza rappresentata dalla malattia cardiaca reumatica, sono connotate da lesioni flogistiche di tessuti connettivali e muscolari, con una probabile componente autoimmune; la loro comparsa è associata ad una pregressa lesione infiammatoria acuta a localizzazione faringea. Mentre la febbre reumatica dipende dalle conseguenze della localizzazione di autoanticorpi in alcuni tessuti connettivali e muscolari che esprimono epitopi antigenici simili a materiali presenti nella cellula streptococcica, la glomerulo nefrite sembra conseguenza della formazione di una notevole quantità di complessi antigene-anticorpo in soggetti che presentano una abnorme risposta immune umorale. La deposizione di complessi immuni a livello dei capillari del derma e del sottocute determina vasculite che può sfociare nella comparsa del cosiddetto eritema nodoso. Metodi di identificazione Nella ricerca colturale si cerca di isolare il batterio procedendo alla semina in piastre di agar- sangue. Le colonie appaiono con aspetto mucoso e si usa solitamente il sangue di pecora che inibisce l’emofilo emolitico, che è frequentemente presente nella rinofaringe dalla quale si esegue il tampone. Un secondo metodo è quello del terreno agar-batteri: il materiale viene sospeso in una piccola quantità di brodo, poi si aggiunge agar e poi il sangue. I terreni possono essere resi più selettivi con l’aggiunta si sostanze che inibiscono i Gram-. L’identificazione di SP può essere fatta in base alla sua sensibilità alla bacitracina rispetto agli altri streptococci, ponendo un disco imbevuto di questo antibiotico sulla piastra in cui si è seminato il ceppo in esame. Per una identificazione rapida è possibile ricorrere ad un’immonufluorescenza in cui si va alla ricerca di anticorpi contro l’antigene A. Reazioni sierologiche Queste si basano sulla ricerca della streptolisina-o che è fortemente immunogena ed è prodotta da tutti i tipi di SP. Una serie di provette contenenti una quantità nota di streptolisina vengono addizionate di quantità scalari di siero: si evidenzia un’emolisi solo in quelle provette in cui la streptolisina non è stata neutralizzata dagli anticorpi nel siero. Sensibilità ad antibiotici e chemioterapici L’antibiotico di elezione è la penicillina che viene utilizzata nella profilassi delle sequele non suppurative. Metodi di immunizzazione Non esistono attualmente vaccini anti streptococco di gruppo A: i soli anticorpi dotati di azione
popolazione batterica mista è preferibile usare terreni resi selettivi dall’aggiunta di farmaci, ai quali il pneumococco è insensibile. Le colonie di pneumococco possono essere distinti dagli altri streptococci in base alla sensibilità all’ optochina. Ponendo un disco impregnato di optochina su una paistra di agar-sangue e seminandovi il ceppo in esame, se si è in presenza di pneumococco sarà evidente intorno al disco una larga zona di inibizione. Altri metodi sono l’agglutinazione con un siero polivalente, in grado di attivare tutti i tipi di pneumococco e il metodo della sensibilità ai Sali biliari. Tipizzazione Per l’identificazione del tipo si può ricorrere all’agglutinazione su vetrino o alla reazione di rigonfiamento capsulare. Per quest ultimo test si mescolano insieme ad una sospensione batterica, antisiero antipneumococcico polivalente e blu di metilene e si osserva al microscopio; in caso di reazione positiva la capsula si dimostra notevolmente ingrossata in conseguenza della precipitazione del materiale capsulare che diventa più compatto e più evidente Reazioni sierologiche Essa non viene usata per fini diagnostici a causa della notevole varietà di tipi antigenici che possono essere implicati nell’infezione umana Sensibilità agli antibiotici e ai chemioterapici Un’accettabile sensibilità si riscontra nei confronti delle penicilline, anche se negli ultimi anni si sono verificati fenomeni di antibiotico-resistenza che non sembrano dovuti alla produzione di β lattamasi Metodi di immunizzazione Attualmente è disponibile un vaccino contenente 23 tipi di polisaccaride capsulare. L’uso pratico della vaccinazione è limitato dal fatto che molti dei pazienti a rischio sono immunodepressi, che la risposta anticorpale è scarsa. Per questo il materiale polisaccaridico capsulare viene coniugato ad alcune proteine allo scopo di intensificarne il potere immunogeno. MYCOBACTERI Il problema della tubercolosi i cui agenti sono i Mycobatteri non è da sottovalutare. I Mycobatteri appartengono ad un gruppo di microrganismi un po’ particolari perché sono tra bacilli Gram+ che hanno come caratteristica tintoriale particolare il fatto di essere alcool-acido-resistenti, ovvero la colorazione di Gram non è utile per riconoscere i Mycobatteri. Si usa una colorazione che è quella di Zighl-Nielsen che mette in evidenza una caratteristica di questi microrganismi. Ci sono della altre colorazioni, oltre a quella di Gram e di Zighl-Nielsen che dobbiamo sapere, per esempio quella di Gins-Albert per i Corynebacteri che sono degli agenti eziologici che sono i qualche modo simili ai Mycobatteri ma dobbiamo sapere solo il nome: serve a dimostrare nei Corynebatteri del granuli citoplasmatici che si chiamano Granuli Metacromatici. Quando parliamo di Mycobatteri ci riferiamo al genere Mycobacterium ma poi ci sono tutta una serie di genere di mycobatteri tra i quali coi interessano il Mycobacterium Tuberculosis che è l’agente etiologico della Tubercolosi Umana. La struttura della parete cellulare di MT non è uguale a quella di altri batteri incontrati finora, cioè assomiglia ai Gram positivi ma ha dei componenti in più; ha un metabolismo particolare, ha una struttura antigenica particolare. Contro questo batterio interviene specialmente l’immunità cellulo- mediata.
L’unico vaccino che c’è in circolazione per la tubercolosi è fatto con un ceppo di Mycobacterium bovis attenuato che genera la tubercolosi nei bovini. Tra le altre specie è opportuno ricordare il Mycobacterium Avium intracellulare : dopo gli anni 80 si è scoperto che come agente di patologie infettive terminali in pazienti che avevano l’AIDS si trovavo questo Mycobacterium che è un opportunista cioè non da patologie nell’organismo sano ma solo in quello in cui c’è una compromissione del sistema immunitario. Un altro importante Mycobacterium è il Mycobacterium Leprae che è l’agente etiologico della Lebbra; questo batterio non si riesce a coltivare in vitro (come il Treponema pallidum che non riesce a crescere neanche nei terreni universali). MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Il Mycobacterium tuberculosis si chiama anche Bacillo di Coke. Abbiamo detto che si colora con la colorazione di Zighl-Nielsen:
- fissazione del preparato
- si aggiunge il primo colorante che è la Fucsina Fenicata Basica e questa colorazione viene fatta a caldo scaldando il vetrino; il citoplasma dei batteri in generale è acido perché non avendo la membrana nucleare ed essendoci i ribosomi è acido per la presenza di RNA. Questa colorazione si fa a caldo perché questi Mycobatteri hanno dei lipidi sulla superficie e quindi riscaldare il vetrino serve a facilitare l’ingresso del colorante nella cellula
- dopo si fa una decolorazione con una soluzione di Alcool e acido (tipo HCl) e da ciò il termine di Alcool-Acido-Resistenza: i Mycobatteri trattengono la Fucsina anche se sono decolorati in maniera molto drastica con l’acido. I MT rimane perciò colorato in rosso.
- se vogliamo vedere nel preparato degli altri batteri dobbiamo aggiungere un colorante di contrasto e si mette il Blu di Metilene perciò alla fine della colorazione si vedrà il MT colorato in rosso mentre gli altri si colorano il blu. Parete cellulare dei Mycobatteri : c’è uno strato di peptidoglicano ma oltre a questo c’è tutto uno strato esterno che è costituito soprattutto da lipidi, da fosfolipidi da sulfatidi, il ArabinoGalactano, l’Acido Micolico ecc… queste molecole non si trovano negli altri batteri per cui sono simili ai Gram+ ma non identici. L’acido micolico è un fattore di virulenza che si trova sulla parete: è la struttura della parete cellulare che fa si che questi batteri interagiscano in modo particolare con il linfociti e i macrofagi. Il galabino-Galactano e gli acidi micolici rappresentano il cosiddetto “fattore corda” cioè il Trealoso di micolato : i ceppi di MT particolarmente virulenti, quando si coltivano in brodo tendono a formare dei veri e propri filamenti (da quaeto il nome di fattore corda). I mycobatteri sono patogeni per definizione ma questo non significa che tutti quelli che incontrano il micobatterio si ammalino di tubercolosi: la virulenza è il Grado di patogenicità che può essere indotto da un microrganismo per cui nell’ambito dei MT ci sono dei ceppi che sono più virulenti di altri che pure sono patogeni. Terreni per il Mycobacterium Tuberculosis Per il Mycobacterium Tuberculosis non si usano i terreni universali: questi batteri sono tanto esigenti che non gli bastano i componenti dell’Agar-Sangue. Il terreno classico di coltura è il Terreno di Petregnani la cui composizione è variegata: ci sono uova, c’è Fecola di Patate, latte e tutti i precursori dei componenti di cui il Mycobacterium ha di bisogno per crescere (glicerina, verde di Malachite il quale ultimo inibisce la crescita di microrganismi). Ci sono tutta una serie di altri terreni quali il Middelbrook (che è liquido) Lowen-stain-Jensen, IUTM la cui base è molto simile al vecchio terreno di Petragnani ma sono chimicamente più definiti. Il terreno IUTM e quello di Lowen-stain-Jensen, fanno parte dei terreni a base di tuorlo
cavo orale e delle vie aeree non include bacilli alcool-acido resistenti. La certezza diagnostica si raggiunge solo con l’isolamento colturale che va allestito, sia nel caso in cui l’esame microscopico risulti positivo, sia nel caso in cui esso risulti negativo. A causa del lento sviluppo dei micobatteri è opportuno preventivamente decontaminare il campione dalla popolazione microbica accessoria, onde evitare che microrganismi a crescita rapida possano moltiplicarsi nel terreno di coltura esaurendone le disponibilità alimentari. Ciò si ottiene grazie all’esposizione del materiale da esaminare a basi forti a concentrazioni e per periodi di tempo sufficienti ad uccidere gran parte degli altri microrganismi eventualmente presenti. In genere le colonie di MT si identificano per l’aspetto rigoglioso con leggera pigmentazione giallastra. L’identificazione definitiva può essere seguita con metodi convenzionali mediante la rilevazione di alcuni parametri biochimici oppure mediante sonde molecolari specifiche per sequenze di DNA esclusive di MT Intradermoreazione con tubercolina La tubercolina usata oggi è formata da proteine micobatteri che purificate mediante successive precipitazioni con solfato di ammonio ed è usualmente nota con l’acronimo di PPD. La PPD viene impiegata secondo la metodica proposta ma Mantoux per la rilevazione dell’esistenza di un’allergia ritardata specifica. La reazione viene praticata mediante iniezione intradermica di PPD nella faccia volare dell’avambraccio. Il trattamento non provoca alcuna reazione nei soggetti che non sono mai stati a contatto col bacillo. Nei soggetti che hanno subito un’infezione si osserva localmente, dopo 24-48 ore una reazione infiammatoria che si rende evidente con la comparsa di una papula eritematosa. Poiché l’allergia ritardata si mantiene per tutta la vita, anche quando le lesioni siano guarite, la positività della reazione non sta ad indicare un’affezione in corso, ma soltanto un precedentemente contatto con MT. Perciò la reazione alla tubercolina ha valore diagnostico soltanto quando si osserva il passaggio da una reazione negativa ad una positiva nello stesso soggetto in breve periodo di tempo, per cui essa è molto importante nel corso dell’infanzia. Sensibilità ad antibiotici e chemioterapici Gli antibiotici di elezione sono la streptomicina e la rifampicina, mentre i chemioterapici sono l’acido paramionosalicidico (APS), isoniazide ed etambutolo. MT tuttavia presenta facilmente la comparsa di varianti farmaco-dipendenti, per cui, da una parte è difficile predire a priori l’efficacia di un farmaco antimicobatterico, dall’altra è assolutamente da evitare il trattamento di una infezione tubercolare con un solo farmaco onde evitare la selezione di mutanti resistenti. Profilassi dell’infezione tubercolare Il vaccino antitubercolare oggi disponibile è costituito da una variante apatogena di mycobacterium bovis denominato BCG (bacillo di Calmette e Guerin). L’inoculazione di BCG per via intracutanea si accompagna di norma a modesti segni di reazione locale con, tutt’al più un interessamento transitorio delle linfoghiandole satelliti, ed è seguita dall’istaurarsi di immunità cellulo-mediata specifica di mostrabile con la positività alla intradermoreazione di Mantoux. Nei paesi industrializzati la vaccinazione tuttavia non è praticata e il controllo dell’infezione è piuttosto basato sul controllo capillare della comparsa di positività alla tubercolina nell’età scolare e un aggressivo trattamento chemioterapico nei casi di prima infezione, in maniera tale da garantire la positività alla tubercolina. MICOBATTERI NON TUBERCOLARI Una vecchia classificazione proposta da Runyon, li riunisce in quattro gruppi principali, distinti rispettivamente a seconda del ritmo di crescita nelle colture (a crescita lenta o a crescita rapida) e della produzione o meno (cromogeni, scarsamente cromogeni e non cromogeni) di un’intensa pigmentazione giallastra nelle colture, che si ottiene dopo esposizione ad una forte sorgente
luminosa o anche in assenza di luce. Mycrobacterium leprae Esso viene chiamato anche bacillo di Hansen ed è l’agente etiologico della lebbra. Quest’ultima è una malattia cronica a lungo decorso clinicamente caratterizzata dalla presenza di lesioni granulomatose cutanee o mucose che provocano spesso mutilazioni deformanti. La malattia si trasmette per contatto interumano. L’ML è un bacillo alcool-acido resistente che non è stato possibile coltivare in vitro. Nell’infezione umana l’ML è generalmente localizzato nel citoplasma dei macrofagi in cui sembra potersi moltiplicare e dove si dispone in ammassi di batteri paralleli. La diagnosi di lebbra è generalmente clinica ed è confermata batteriologicamente dal reperto microscopico di bacilli acido-resistenti nel citoplasma dei macrofagi provenienti da granulomi cutanei o mucosi. ENTEROBATTERI Gli enterobatteri comprendono un gran numero di batteri a prevalente Habitat intestinale nell’uomo e negli animali, correlati biochimicamente e antigenicamente. Nel loro insieme possono essere definiti: bacilli Gram-, asporigeni, mobili per flagelli peritrichi o immobili quasi costantemente provvisti di pili. Aerobi-anaerobi facoltativi, riducono i nitrati a nitriti e tutti crescono bene nei comuni terreni di coltura. In anaerobiosi o in ridotta tensione di ossigeno, sono tutti in grado di utilizzare il glucosio per via fermentativa con produzione di acidi e talora di gas. Questa proprietà e l’assenza del citocromo C sono caratteri molto importante per differenziare gli enterobatteri da vari altri bacilli Gram-, i quali sono sempre ossidasi positivi o in grado di portare a termine esclusivamente una demolizione ossidativa di glucosio. Gli EB sono tutti produttori di catalasi ad eccezoine del siero tipo 1 si Shighella dysenteriae. I principali generi di enterobatteri sono identificabili in base ad una serie di caratteri biochimici: capacità di utilizzare particolari substrati come unica fonte di carbonio : questa proprietà si evidenzia coltivando i batteri in appositi terreni contenenti il substrato (acidi organici) e un indicatore di pH (blu di bromotimolo). Poich+è i prodotti terminali dell’utilizzazione degli acidi organici sono composti basici, una reazione positiva si appalesa con un viraggio di colore dell’indicatore di pH (il blu di bromo timolo diventa blu a pH superiore a 7,5-7,6) presenza di particolari enzimi : gli enzimi sono l’ureasi, lisina e ornitina decarbossilasi, β galattosidasi. La presenza di ureasi si evidenzia coltivando il batterio in un terreno contenente urea ed un indicatore di pH (rosso fenolo); i batteri che scindono l’urea producono ammoniaca che alcalinizza il terreno, facendo virare il colore dell’indicatore da giallo arancio a rosso. La β galattosidasi è l’enzima principale per l’attacco del lattosio e la sua presenza può essere dedotta dalla capacità di fermentare il lattosio. La presenza dell’enzima si dimostra allestendo una densa sospensione di batteri in un terreno contenente lattosio. I batteri produttori di β galattosidasi scindono un substrato cromogeno incolore, liberando una sostanza che fa passare l’indicatore di pH ad un colore giallo produzione di specifici prodotti metabolici : i prodotti terminali di alcune vie metaboliche sono rappresentati dall’H2S, dall’indolo, dall’acetonio e dalla produzione di notevoli quantità di acidi come risultato della fermentazione del glucosio. La produzione di H2S si evidenzia per la formazione di solfuro ferroso nero con i Sali di ferro o per l’annerimento di una cartina imbevuta di acetato di piombo sospesa all’imboccatura della provetta contenente la coltura capacità di fermentare particolari zuccheri : essa si apprezza coltivando il batterio in terreno contenente lo zucchero e un indicatore di pH e giudicando l’avvenuta fermentazione grazie al viraggio dell’indicatore e all’eventuale produzione di gas
dell’azione patogena. Un altro importante gruppo di E. coli è rappresentato dagli stipiti enteritogeni, agenti etiologici di enteriti in conseguenza di infezioni contratte per l’ingestione di alimenti. Alcuni di questi stipiti enteritogeni devono la loro azione patogena alla capacità di invadere la mucosa intestinale provocando lesioni infiammatorie. A seconda del meccanismo patogenetico che sottintende l’azione entero-patogena si distinguono diversi gruppi di E. coli: EPEC (enteropatogeni) ETEC (enterotossigeni) EIEC (enteroinvasivi) EHEC (enteroemorragici) L’EPEC e l’EIEC non producono tossine e la loro azione è essenzialmente legata al danneggiamento diretto o indiretto delle mucose intestinali; l’ETEC e l’EHEC producono, invece, tossine denominate rispettivamente enterotossine e tossine shiga-like. Le enterotossine sono due distinte in: tossina termolabile e tossina termostabile. Gli stipiti EPEC sono provvisti di peculiare adesività localizzata legata alla presenza del fattore EAS; essi distruggono i microvilli aderendo strettamente alla membrana degli enterociti. Gli stipiti ETEC che producono l’LT e l’ST, che hanno un effetto clinico simile anche se agiscono con un meccanismo diverso. Gli stipiti EIEC, come le shigelle, si attaccano alla mucosa dell’intestino crasso e ne invadono le cellule da cui vengono inglobate, attraverso fenomeni di endocitosi. All’interno della cellula si moltiplicano, la uccidono e diffondono alle cellule contigue causando una distruzione della mucosa intestinale. La loro patogenicità è legata al fattore di invasività. Gli stipite EHEC, principalmente appartenenti al siero tipo O157:H7, elaborano due potenti citotossine quali la verotossina1 o shiga-like toxin1 e la verotossina2 o shiga-like toxin2. la tossina di shiga, diffondendo nella mucosa intestinale, raggiunge il circolo ematico e si lega specificatamente alle cellule vascolari endoteliali che ne risultano danneggiate. Il danno alle cellule endoteliali si accompagna alla liberazione di varie citochine e ad un aumentato accesso di endotossine. Per una corretta diagnosi delle forme sporadiche di enterite è auspicabile l’associazione tra sierotipizzazione e prove di enteropatogenicità, le quali ultime sono: valutazione dell’adesività batterica tramite lo studio della capacità emoagglutinante ricerca della produzione di enterotossine ricerca della produzione di tossine shiga-like ricerca del potere invasivo é bene sottolineare in ultimo che E. coli, con l’antigene K1, è uno dei più frequenti agenti etiologici della meningite dei neonati; quest’antigene infatti è simile all’antigene superficiale dello streptococco agalactiae e all’antigene capsulare di alcuni emofili, tutti agenti etiologici di meningiti neonatali. Shigelle Esse si dividono in quattro specie o sottogruppi: shigella disenteriae: non fermenta la mannite shigella flexneri: fermenta la mannite shigella boydii: fermenta la mannite shigella sonnei: fermenta la mannite ed anche il lattosio le shigelle sono parassiti esclusivi dell’uomo che rappresenta l’unica sorgente di infezione. Quelle introdotte con gli alimenti riescono a superare la barriera acida dello stomaco e si vanno a
localizzare nella mucosa del colon dove esercitano la loro azione patogena. Quest’ultima è dovuta alla loro capacità (condivisa dalle salmonelle) di penetrare nelle cellule dell’epitelio mucoso integro, passando poi nella lamina propria dove si moltiplicano con l’accumulo di prodotti metabolici e liberano l’endotossina in seguito alla lisi dei corpi bacillari. Nelle forme di dissenteria sostenute da shigella disenteriae di tipo1 viene prodotta la tossina di shiga. Tutte le altre shigelle, escluso quella di tipo2, non producono tossine e la loro azione tossica è riconducibile alla componente LPS. Salmonelle Il genere salmonella comprende numerosi enterobatteri differenziabili sulla base dei diversi caratteri antigenici, somatici (antigene O), capsulari (antigene Vi) e flagellari (antigene H). il genere salmonella contiene due specie che sono la salmonella enterica e la salmonella bongori. La salmonella enterica si divide in sub specie nel quale quella della sub specie enterica si divide a sua volta in diversi sierotipi o serovar, di cui il più importante è il serovar tiphi. Per quanto riguarda la patologia umana i serovar adatti all’uomo sono generalmente responsabili di gravi forma sistemiche e si trasmettono direttamente da uomo a uomo, senza ospiti intermedi attraverso il circuito oro- fecale. La forma più tipica e grave di infezione sistemica da salmonella è rappresentata dal tifo, il agente etiologico è la salmonella tiphi. Le salmonelle introdotte con i cibi raggiungono l’intestino dove hanno poche possibilità di attecchire direttamente essendo in modesto numero; se alcune salmonelle però riescono a penetrare nella mucosa, a raggiungere i linfonodi mesenterici, tramite i quali sboccano nel dotto toracico e poi nel circolo ematico, provocano una fugace batteriemia, la quale è contrastata dalle cellule reticolo endoteliali della milza, del fegato e di altri organi. Qui riescono a moltiplicarsi attivamente e, tramite la colecisti, si riversano in gran numero nell’intestino, dove penetrano la mucosa. La reazione immunitaria cellulo-mediata ed infiammatoria che ne segue provoca il distacco precoce della mucosa che è causa di emorragie intestinali. Klebsielle Sono abbondantemente provvisti di capsula ed immobili e si ritrovano spesso associate a diverse forme morbose dell’apparato respiratorio. La specie più importanti infatti è la k. Pneumoniae. Proteus Si trova in genere nella popolazione batterica intestinale dell’uomo. Rappresentano i più frequenti agenti etiologici di infezioni urinarie dopo il genere escherichia. Le specie più importanti sono il proteus vulgaris e il proteus mirabilis. Metodi di identificazione Il problema dell’identificazione si pone in una prospettiva differente a seconda che il quesito diagnostico riguardi un’affezione a localizzazione intestinale o extraintestinale. Le localizzazioni intestinali si manifestano clinicamente con diarrea e con febbri enteriche e sono date generalmente da E. coli, shigelle e salmonelle. Per la ricerca degli stipiti enteropatogeni di E. coli è sufficiente inoculare una sospensione di feci in piastre di terreni addizionali di sostanze dotate di azione batteriostatica nei confronti dei Gram+, addizionati di lattosio e di un indicatore di pH. Terreni di questo tipo sono il terreno EMV, il cui nome deriva dalla presenza di eosina e blu di metilene, che inibiscono i Gram+; il terreno di MC- conkey, in cui i batteri Gram+ sono inibiti dalla presenza di adeguate concentrazioni di Sali biliari e cristalvioletto; l’agar di Hektoen, in cui l’azione inibente è svolta da idonee concentrazioni di Sali biliari ed inoltre sono presenti anche tiosolfato e Sali di ferro per evidenziare la produzione di H2S.
Metodi di immunizzazione Nei confronti dell’infezione da salmonella tiphi è possibile una profilassi immunitaria attiva a mezzo di vaccini. I vaccini antitifici sono costituiti da vaccini a cellula intera, da vaccini preparati con il polisaccaride capsulare Vi purificato e da vaccini allestiti con batteri vivi e attenuati dello stipite Ty-21°. Questo manca di alcuni enzimi responsabili del metabolismo del galattosio che lo rendono incapace di sintetizzare l’LPS, pur potendo produrre adeguate quantità di polisaccaridi immunogeni. SPIROCHETE Le spirochete sono batteri di forma allungata con il corpo avvolto a spirale. La cellula delle spirochete è provvista di una parete cellulare che nella composizione chimica è simile a quella dei batteri Gram-; essa è dotata tuttavia di una notevole flessibilità dal che è facile dedurre che la parete cellulare delle spirochete non ha la caratteristica di essere un contenitore rigido. Un’altra caratteristica peculiare della spirochete è rappresentato dall’apparato locomotore che è formato da uno o più fasci di fibrille (ognuna delle quali è paragonabile ad un flagello batterico) che sono dislocate all’interno della cellula ancorandosi in corrispondenza di uno dei due poli della cellula. Il movimento delle spirochete è la conseguenza quindi della contrazione di questi endoflagelli che causano la contrazione passiva del soma batterico che ruota e trasla. Le spirochete si moltiplicano per scissione semplice e si dividono in due gruppi principali rappresentati dalle famiglie delle spirochetacee e leptospiracee. Alla prima famiglia appartengono il genere treponema e il genere borreia; alla seconda famiglia appartiene il genere leptospira che è parassita per gli animali e patogeno per l’uomo. I treponemi sono visibili al microscopio mediante l’impiego di particolari procedimenti di sovrapopolazone (colorazione argentica) che ne aumentano lo spessore. I treponemi patogeni per l’uomo sono il treponema pallidum ssp. Pallidum , agente etiologico della sifilide, nonché il treponema pallidum ssp. Endemicum , responsabile di Bejel (sifilide endemica), dei paesi tropicali e treponema pallidum ssp. Pertenue , responsabile di una forma attenuata di sifilide presente esclusivamente in paesi tropicali. I treponema patogeni per l’uomo non si coltivano in vitro in terreni di coltura abiotici. Le borrelie sono le uniche spirochete con un diametro sufficientemente grande per essere visibili direttamente al microscopio senza dovere fare ricorso a colorazioni particolari. Nell’uomo causano affezioni febbrili acute dette febbri ricorrenti o affezioni subacute sistemiche con spiccata tendenza ad evolvere in forma cronica (malattia di Lyme). La coltivazione in vitro delle borrelie è stata messa a punto da Kelly nel terreno che prende il suo stesso nome. Le leptospire pongono gli stessi problemi dei treponemi nella visione al microscopio (sono visibili solo all’osservazione in campo oscuro). Esse sono coltivabili in vitro in terreni ricchi di siero e sono aerobie; sono gli agenti etiologici della leptospirosi. Treponema pallidum ssp. Pallidum La sifilide è una malattia cronica con decorso differenziabile in tre stadi. Il contaggio iniziale avviene in corrispondenza delle mucose dell’apparato genitale: si crea una lesione (sifiloma primario) che, dopo mesi, si trasforma in esantema (sifilide secondaria). Segue poi un lungo periodo di latenza; in circa l’1% dei casi non trattati inizia la sifilide terziaria che può interessare qualsiasi organo ma, preferenzialmente, il sistema nervoso, il sistema cardio-vascolare e la cute. L’infezione sifilitica si trasmette dalla madre al feto che molto frequentemente muore prima del
parto oppure se sopravvive è destinato ad andare in contro a gravissimi vizi di sviluppo. Sul meccanismo dell’azione patogena si hanno molti dubbi ma sembra comunque che il treponema non produca esotossine o comunque tossine di natura proteica. Esso presenta una spiccata capacità invasiva perché è capace di passare attraverso le giunzioni intercellulari ed è capace di evadere la risposta immunitaria a causa di una bassa antigenicità. È assodato che il treponema esprime sulla superficie esterna rarissime molecole proteiche chiamate TROMP. Il modello sperimentale più utilizzato per il mantenimento in laboratorio del treponema pallido è quello della inoculazione intratesticolare nel coniglio. In questa maniera si crea un orchite accompagnata da un’abbondante proliferazione di treponemi che possono essere passati da animale ad animale senza difficoltà. Diagnosi batteriologica e sierologia della sifilide La diagnosi può essere posta mediante la ricerca microscopica dei treponemi nell’essudato delle lesioni primarie o secondarie. La tecnica di maggiore uso nella diagnosi è comunque rappresentata dalla ricerca di anticorpi nei confronti di antigeni treponemici. Un antigene non treponemico di natura lipidica è il cosiddetto aptene di Wasserman o cardiolipina, largamente impiegato nei saggi sierologici per la sifilide, ed è presente in vari tessuti umani ed animali. La risposta anticorpale nei confronti della cardiolipina (più che nei confronti di quella ritrovata nel treponema) è diretta principalmente nei confronti di quella che durante l’infezione viene ad essere liberata dagli organi dell’ospite danneggiati dalla presenza del treponema. Secondo quest’ipotesi perciò si creerebbero degli anticorpi che prendono il nome di reagine. La diagnosi sierologica di sifilide viene fatta con la ricerca degli anticorpi nei confronti dell’antigene lipoideo o di antigeni proteici treponemici. Nel primo caso la reazione oggi più utilizzata è la VDRL. A causa della possibile presenza anche in soggetti non sifilitici di anticorpi antilipoidei, tutti i sieri positivi alle prove VDRL vengono successivamente saggiati con metodiche che ricercano anticorpi nei confronti di proteine treponemiche. Per questo si usano la reazione di immunofluorescenza indiretta (FTA-ABS), la reazione di emoagglutinazione passiva, nella quale l’antigene è costituito da globuli rossi alla cui superficie sono adsorbiti antigeni treponemici (TPHA) e la reazione di immobilizzazione dei treponemi (TPI). Il TPI impiega come antigene una sospensione di treponemi ottenuti dal testicolo di conigli infettati sperimentalmente. I sieri di soggetti affetti da sifilide contengono anticorpi che reagiscono con la superficie della cellula dei treponemi immobilizzandoli. Nella reazione FTA l’antigene è costituito da una sospensione di treponemi uccisi che vengono messi a contatto con il siero del paziente. Si aggiunge un siero antiglobuline umane coniugate con fluorescina e dopo la reazione viene letta da un microscopio a luce ultravioletta. Un alternativa all’impiego dei test sierologici classici è rappresentata dalle metodiche immunoenzimatiche quali ELISA e immunoblotting ( western blot ). Quest’ultima reazione ci permette di cercare la presenza di anticorpi specifici per i singoli antigeni di un determinato microrganismo o virus. Il microrganismo viene frazionato nei singoli componenti polipeptidici mediante elettroforesi al termine della quale le proteine separate vengono trasferite su strisce di nitrocellulosa. Queste ultime vengono cimentate con il siero immune o presunto tale. Nel caso di positività gli anticorpi si legheranno in corrispondenza delle bande dei polipeptidi antigenici specifici. La formazione degli immunocomplessi viene evidenziata mediante un sistema rivelatore formato da anticorpi anti-Ig umane coniugate con un enzima, la cui presenza viene evidenziata mediante la reazione con un substrato cromogeno specifico. Questa metodica è altresì utilizzata per la diagnosi di infezione da HIV. Sensibilità ad antibiotici e chemioterapici Esso è sensibile al trattamento con penicillina e vari altri antibiotici.
livello del naso-faringe, da dove diffonde per via ematica localizzandosi a livello dell’SNC. Caratteri antigeni Oltre all’LPS i meningococchi sono provvisti di una capsula di natura polisaccaridica che può presentare caratteri antigenici diversi in base ai quali i meningococchi vengono divisi in 10 gruppi di cui i gruppi A, B, C, Y, E, W-135, sono responsabili della stragrande maggioranza dei casi clinici. Gli antigeni capsulari dei meningococchi possono essere correlati ad antigeni di specie batteriche diverse ed in particolare E. coli che presenta l’antigene k1 simile all’antigene capsulare dei meningococchi del gruppo B. Meccanismo dell’azione patogena Essi non sono capaci di vivere all’interno dei fagociti e pertanto sono parassiti extracellulari; non producono tossine e la loro azione patogena è dovuta all’azione dell’LPS alla cui azione segue un esteso danno vascolare complicato da reazioni infiammatorie localizzate e generalizzate. Metodi di identificazione Il reperto microscopico di diplococchi Gram- nel sedimento di liquor di un paziente affetto da maningite può fare avanzare un sospetto. Se il materiale in esame è ricco di batteri si può procedere direttamente alla reazione di immunofluorescenza con un pool di sieri specifici, in tutti gli altri casi è opportuno procedere all’isolamento colturale e alla successiva identificazione. Per l’isolamento colturale si impiegano piastre di agar cioccolato in presenza del 5% di anidride carbonica dove le colonie di NM si presentano rotondeggianti. Le colonie di neisseria possono inoltre essere identificate in base alla proprietà di ossidazione di alcuni composti aromatici incolori che assumono il colore. Il problema dell’identificazione di meningococchi è un po’ più complicato quando la ricerca del batterio si esegue non sul liquor di soggetto affetto ma nel muco naso-faringeo di soggetti apparentemente sani con lo scopo di identificare se sono portatori; la difficoltà consiste nel fatto che tale muco presenta numerose specie di neisserie apatogene. La differenziazione delle neisserie patogene da quelle apatogene viene fatta sia per i caratteri delle colonie (solo le neisserie patogene danno colonie di aspetto cremoso, mentre quelle apatogene sono in genere colorate in giallo) sia perché le neisserie apatogene crescono sui comuni terreni di coltura, laddove invece quelle patogene crescono sull’agar cioccolato. Sensibilità ad antibiotici e chemioterapici Il meningococco è sensibile alla penicillina e ai sulfamidici. Purtroppo in questi ultimi anni si sono succedute varie segnalazioni di meningococchi resistenti ai sulfamidici sicché oggi si preferisce sostituire questi con la rifampicina. Metodi di immunizzazione Ricerche recenti hanno portato all’isolamento in forma purificata del polisaccaride capsulare (A, C, Y, W-135) dei meningococchi e hanno dimostrato che l’inoculazione di tale materiale è sprovvista di effetti tossici indesiderati. Tuttavia esso è scarsamente immunogeno nei bambini e negli adulti conferisce un’immunità relativamente breve e non contiene antigeni per il siero gruppo B, il ci polisaccaride è dotato di un potere immunogeno praticamente nullo. Un vaccino allestito con l’antigene polisaccaridico dei meningococchi di gruppo C, coniugato ad una proteina immunogena si è dimostrato dotato di una duratura efficacia anche nei soggetti della prima infanzia.
Neisseria gonoree Insieme al meningococco è dotata di particolare fragilità al di fuori dell’organismo umano. Si localizza primitivamente a livello dell’apparato genitale e si trasmette solo attraverso i rapporti sessuali. Nell’uomo il gonococco penetra attraverso l’epitelio dell’uretra in cui affluiscono numerosi leucociti neutrofili, responsabili della formazione di un focolaio infiammatorio che si scarica successivamente nell’uretra sottoforma di secrezione purulenta. Nella donna, la sede dell’infezione primaria è rappresentata dalle ghiandole della cervice uterina e dalle ghiandole del bartolini. Caratteri antigeni e meccanismo dell’azione patogena Questo batterio nelle colture da luogo a varianti antigenicamente differenti in modo significativo dai batteri che si osservano al momento dell’isolamento. In questo momento il gonococco possiede un’antigene capsulare di natura polisaccaridica denominato antigene k che si perde nella colture. Il meccanismo dell’azione patogena ricalca quello del meningococco. Inoltre i gonococchi sono provvisti di pili la cui presenza favorisce l’adesione delle cellule delle mucose genitali; la colonizzazione delle mucose è inoltre favorita dalla produzione di proteasi in grado di attivare le IgA1. Metodi di identificazione A differenza delle prime vie respiratorie, l’apparato urogenitale possiede una popolazione batterica residente nella quale generalmente non sono comprese le neisserie. Per tale motivo il semplice reperto microscopico di diplococchi Gram-, di norma è sufficiente ad avanzare il sospetto di infezione gonococcica. La diagnosi può essere confortata dalla ricerca di anticorpi nei confronti di antigeni allestiti con estratti di gonococco da colture. Sensibilità ad antibiotici e chemioterapici Oggi buona parte degli stipiti si dimostrano resistenti ai sulfamidici. Le penicilline rappresentano il medicamento di elezione. CORINE BATTERI Essi sono bacilli a forma di clava per la presenza di una dilatazione della cellula ad uno o tutte e due gli estremi. Gram+ o Gram variabili sono provvisti di capsula, asporigeni ed immobili. Nella parete cellulare dei corine batteri sono presenti glicolipidi molto simili a quelli che costituiscono il fattore cordale dei micobatteri. Aerobi-anaerobi facoltativi i corine batteri crescono bene in terreni arricchiti con liquidi organici (siero); nei terreni producono catalasi e crescono in presenza di concentrazioni di tellurito di potassio, tossiche per la maggior parte degli altri batteri, riducendo il sale a tellurito metallico all’interno della cellula. Questa proprietà è sfruttata per allestire terreni selettivi per il loro isolamento. Il principale corinebatterio di interesse medico è il corinebacterium difteriae. Corinebacterium difteriae È l’agente etiologico della difterite che è l’infiammazione localizzata di una mucosa il cui epitelio va incontro a necrosi. Normalmente l’infezione si localizza nel naso-faringe, nelle tonsille, nella congiuntiva e nell’orecchio medio.
