Biologia applicata e molecolare, Dispense di Biologia

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Sommario ORGANIZZAZIONE MATERIA VIVENTE E TEORIA CELLULARE......................................................... 5 Caratteristiche degli esseri viventi.................................................................................................................. 5 Classificazione dei viventi.............................................................................................................................. 5 Teoria cellulare:.............................................................................................................................................. 5 Eccezioni alla teoria cellulare..................................................................................................................... 6 CELLULA PROCARIOTA................................................................................................................................ 6 CELLULA EUCARIOTA...................................................................................................................................8 Dimensioni cellulari........................................................................................................................................9 Membrana Plasmatica....................................................................................................................................... 10 Modello a mosaico fluido......................................................................................................................... 10 Funzioni della membrana..........................................................................................................................10 Composizione della membrana..................................................................................................................... 10 Componente lipidica................................................................................................................................. 10 Componente proteica................................................................................................................................ 12 Componente glucidica.............................................................................................................................. 12 Fisiologia della membrana............................................................................................................................13 Trasporto................................................................................................................................................... 13 Trasduzione del segnale (da completare).................................................................................................. 17 Giunzione intercellulare e Adesione al substrato..........................................................................................17 Citoplasma (Ialoplasma e organuli).................................................................................................................. 19 Mitocondri..................................................................................................................................................... 20 Struttura..................................................................................................................................................... 20 Eredità e Malattie mitocondriali................................................................................................................... 21 Funzioni secondarie dei mitocondri.............................................................................................................. 22 Apoptosi..................................................................................................................................................... 23 Trasporto proteine nel mitocondrio...............................................................................................................23 Metabolismo cellulare...................................................................................................................................24 Molecole energetiche................................................................................................................................ 24 Catabolismo del glucosio.......................................................................................................................... 25 Reticolo endoplasmatico................................................................................................................................... 27 Funzioni REL................................................................................................................................................27 Funzioni RER................................................................................................................................................27 Funzioni..................................................................................................................................................... 29 Struttura..................................................................................................................................................... 30 Spostamento delle vescicole......................................................................................................................... 30 Indirizzamento delle vescicole......................................................................................................................30 Traffico vescicolare.......................................................................................................................................31 Vescicole rivestite da COPII (trasporto anterogrado)............................................................................... 32 Vescicole rivestite da COPI (trasporto retrogrado)................................................................................... 32 Ribosomi..................................................................................................................................................... 33 Perossisomi..................................................................................................................................................... 34 Funzioni..................................................................................................................................................... 34 Metabolismo del perossido di idrogeno....................................................................................................34 Detossificazione........................................................................................................................................35 Degradazione degli acidi grassi................................................................................................................ 35 Sintesi dei plasmalogeni........................................................................................................................... 36 Metabolismo dei composti azotati............................................................................................................ 36 Formazione dei Sali biliari........................................................................................................................36 Catabolismo di sostanze insolite...............................................................................................................37 Citoscheletro..................................................................................................................................................... 37 Microfilamenti (filamenti actinici)............................................................................................................... 38 Polimerizzazione.......................................................................................................................................38 Proteine associate......................................................................................................................................38 Filamenti intermedi....................................................................................................................................... 39 Polimerizzazione.......................................................................................................................................39 Lamìne..................................................................................................................................................... 39 Proteine associate......................................................................................................................................39 Microtubuli................................................................................................................................................... 39 Polimerizzazione.......................................................................................................................................39 Replicazione DNA (procarioti)......................................................................................................................... 40 DNA Polimerasi e DNA Primasi...............................................................................................................42 DNA Elicasi.............................................................................................................................................. 43 Proteine SSB............................................................................................................................................. 43 Topoisomerasi........................................................................................................................................... 43 Proofreading..................................................................................................................................................43 Replicazione DNA (eucarioti)...........................................................................................................................44 DNA polimerasi............................................................................................................................................ 45 Telomero..................................................................................................................................................... 46 Riparazione del DNA........................................................................................................................................46 La riparazione del escissione nucleotidica (NER)........................................................................................ 46 Riparazione per escissione di base (BER).................................................................................................... 47 Riparazione degli appaiamenti errati (MMR, Mismatch repair).................................................................. 47 Ricombinazione DNA.......................................................................................................................................48 ORGANIZZAZIONE MATERIA VIVENTE E TEORIA CELLULARE Caratteristiche degli esseri viventi • Ordine: organizzazione strutturale precisa, permessa da: • Cellularità: tutti gli esseri viventi sono costituiti da unità strutturali e funzionali elementari, chiamate cellule, capaci di svolgere tutte le funzioni proprie dei viventi. • Complessità: i viventi hanno livelli di organizzazione crescenti in base alla complessità dei costituenti (es. cellula - tessuto - organo - apparato). • Codifica dell’Informazione: L’informazione genetica contenuta in ogni cellula definisce la suo struttura, funzione, differenziamento e interazione con le altre cellule e/o l’ambiente; viene espressa durante la vita dell’individuo e trasmessa alla prole. • Metabolismo: Ogni organismo vivente è un sistema termodinamico aperto, in grado di assimilare e cedere energia. Il metabolismo è suddiviso in: anabolismo (biosintesi di macromolecole complesse) e catabolismo (idrolisi delle macromolecole per ottenere energia, come prodotti si hanno sostanze strutturalmente più semplici e povere di energia) • Sviluppo e Accrescimento • Regolazione: Tutti gli organismi sono in grado di regolare finemente i processi che avvengono al loro interno e mantenere autonomamente l'omeostasi (equilibrio). • Riproduzione: consente la trasmissione dell’informazione genetica dai genitori alla prole e lo sviluppo di nuovi individui • Interazione I livelli organizzazione materia vivente sono caratterizzati dalla comparsa di nuove caratteristiche in funzione della crescente complessità del livello di organizzazione. Classificazione dei viventi Gli organismi viventi sono classificati in: Procarioti • Archaea, procarioti con caratteristiche biochimiche uniche, principalmente di composizione della membrana cellulare, spesso viventi in condizioni ambientali estreme per composizione chimica, pressione e temperatura (estremofili). • Bacteria, eubatteri, cioè batteri più evoluti, comprendente la maggior parte dei procarioti. Eucarioti • Protista, o protozoi in senso stretto, costituito dagli eucarioti unicellulari o pluricellulari, privi di differenziamento in tessuti. • Chromista, cromisti eucarioti unicellulari o pluricellulari, per la maggior parte fotosintetici, con caratteristiche proprie, come il reticolo periplastidiale. • Fungi, funghi, eucarioti eterotrofi, unicellulari o pluricellulari, individuati da alcune particolarità strutturali e metaboliche (saprofiti). • Plantae, piante, costituito dagli organismi autotrofi con differenziamento cellulare. • Animalia, animali, costituito dagli organismi eterotrofi con differenziamento cellulare. È riconosciuto in biologia un ottavo regno “Acyota”, che include i virus e comprende tutti gli organismi privi di struttura cellulare, ma biochimicamente e riproduttivamente dipendenti da un organismo ospite (quindi anche prioni, viroidi, trasposoni, ecc...). Teoria cellulare: Matthias Jacob Schleiden - Theodor Schwann: tutti gli organismi sono costituiti da cellule [piante (Schleiden) o animali (Schwann)], la cellula è l’unità base della materia vivente. Rudolf Virchow: "Omnis cellula e cellula", ogni cellula deriva da una progenitrice. “Teoria cellulare” moderna: 1. Tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule; 2. Le reazioni chimiche di un organismo hanno luogo all'interno della cellula; 3. Le cellule hanno origine da altre cellule mediante la riproduzione; 4. Le cellule contengono le informazioni ereditarie, e tali informazioni passano dalla cellula madre alla cellula figlia. Quando la cellula madre si è riprodotta non esiste più. Le cellule discusse nella teoria cellulare possono essere eucariotiche o procariotiche. Eccezioni alla teoria cellulare: Virus: entità biologiche elementa di forma e dimesioni variabili, (più piccoli delle più piccole cellule conosciute, diametro tra 20 e 300 nm). Sono costituiti da: 1. capside: involucro esterno proteico, formato da subunità identiche, dette capsomeri, codificate dal genoma virale. 2. DNA o RNA: presentano solo uno degli acidi nucleici presenti nelle cellule. 3. eventuale rivestimento lipidico: derivato dalla membrana plasmatica della cellula ospite I virus vengono assemblati dopo la sintesi delle singole componenti. Sono parassiti obbligati, non presentano apparati biosintetici propri e sfruttano quello delle cellule ospiti. (Sintesi delle singole componenti e replicazione genoma virale). Viroidi: piccole molecole di RNA in grado di auto replicarsi. Non presentano un capside né alcun rivestimento proteico (a differenza dei virus) Agenti eziologici di numerose patologie delle cellule vegetali (es. cadang cadang delle palme da cocco). Prioni: acronimo di "PRoteinaceus Infective ONly particle" = particella infettiva solamente proteica. Isomero conformazionale di una glicoproteina normalmente espressa, è in grado di trasferire la propria anomalia alle molecole non alterate dello stesso tipo. CELLULA PROCARIOTA Le cellule, in base alla complessità organizzativa, vengono generalmente suddivise in Procariote ed Eucariote. Cellule Procariote: • Sono esclusivamente microrganismi unicellulari • Dimensione da 1 a pochi µm • Mancanza di organizzazione citoplasmatica (assenza sistema endomembrane) • Metabolismo: • Eterotrofi (parassiti, simbionti) • Autotrofi, (o Fototrofi, le cianofite o cianobatteri presentano sistemi clorofilliani) • Aerobi obbligati • Anaerobi facoltativi • Anaerobi obbligati. • Struttura: • Citoplasma non compartimentato • Nucleoide (zona di raggruppamento del materiale genetico non delimitata da membrana) • Filamento anulare di DNA, detto anche genoforo, costituisce il materiale genetico privo (o quasi) di proteine associate, lungo 1mm. È ancorato mediante un punto, perno, a una plica della membrana plasmatica, mesasoma (nei batteri più grandi è il luogo in cui sono sono disposti gli enzimi respiratori) • Riproduzione asessuata (scissione trasversale o binaria) • Duplicazione del materiale genetico a partire dal perno • Fenomeni di parasessualità: scambio di porzioni di DNA sotto forma di plasmidi, piccoli anelli, responsabili della variabilità genetica, contengono: fattori di sessualità (ceppi F+), fattori di resistenza, responsabili della resistenza agli antibiotici. • Membrana plasmatica • Parete cellulare contenente un peptidoglicano, mureina, costituito da lunghe catene polisaccaridi che unite trasversalmente da corti bracci peptidici. Parete è necessaria a proteggere il procariota dalla lisi dovuta alla diversa pressione osmotica fra l'interno della cellula e il mezzo esterno. Batteri che vivono in ambienti fluidi stabili possono essere sprovvisti di parete cellulare (es. PPLO pleuro- pneumonia-like-organism). La parete permette di classificare i Batteri in: • Gram+: la parete è colorabile • Gram-: la parete non è colorabile • Movimento: • Browniano: trasportati passivamente dal fluido in cui sono inseriti • Flagelli: appendici cellulari, i batteri sono in grado di riconoscere dei gradienti di concentrazione di certe sostanze presenti nel mezzo. In base al movimento diretto dal flagello, questi sono suddivisi in: ■ movimenti chemiotattici: riconoscimento gradiente di concentrazione di sostanze nutritive e/o tossiche ■ movimenti aerotattici: risposta a gradienti di concentrazione dell'ossigeno ■ movimenti fotoattici: nel caso dei batteri fotosintetici flagellati, dovuti alla presenza di zone diversamente illuminate I procarioti sono incapaci di organizzarsi a formare tessuti e/o organismi pluricellulari. La classificazione morfologica dei batteri: • cocchi: forma sferoidale • bacilli: forma bastoncellare • vibrioni: forma “a virgola” • spirochete: spiraliformi Le dimensioni della cellula possono dipendere dalla quantità di DNA: cellule a diverso grado di ploidìa mostrano volumi cellulari pari al prodotto tra il volume cellulare iniziale e il grado di ploidìa. Membrana Plasmatica Membrana cellulare (o membrana plasmatica o plasmalemma) è un involucro che delimita fisicamente la cellula, separandola dall’ambiente esterno. Ha uno spessore compreso tra i 7 e i 10 nm, non è visibile al microscopio ottico. Modello a mosaico fluido È presente un doppio strato lipidico (bilayer) in cui le molecole interagiscono (attraverso le catene carboniose degli acidi grassi che instaurano interazioni idrofobiche) formando due versanti idrofilici (teste dei fosfolipidi) tra i quali è presente uno strato idrofobico intermedio (code degli acidi grassi). Le interazioni dei lipidi sono favorite termodinamicamente: le teste polari dei lipidi di membrana interagiscono con l’ambiente esterno acquoso. Le membrane cellulari sono strutture dinamiche le cui componenti sono mobili e capaci di instaurare interazioni transitorie e/o semipermanenti. I fosfolipidi si possono muovere all’interno della membrana cellulare, in una condizione di semi-fluidità. Sia le proteine estrinseche che intrinseche sono in grado di effettuare movimenti laterali e o rotazionali. Le proteine globulari, intrinseche, espongono sul versanti extra o citoplasmatico determinati domini in base alle interazioni tra gli amminoacidi (polari e non polari) e i lipidi di membrana. Il dominio esposto, in un dato momento, è quello reso accessibile dalle interazioni tra amminoacidi e lipidi di membrana. Funzioni della membrana • Compartimentazione: racchiude il contenuto della cellula e definisce le attività interne della cellula isolandole, con opportuna regolazione, dall’ambiente. • Trasporto di sostanze: trasporto fisico di sostanze da un versante all’altro del plasmalemma • Trasduzione del segnale: risposta a segnali extracellulari • Interazione intercellulari e adesione al substrato: mediazione delle interazioni tra cellule vicine e formazione di sistemi di giunzione Composizione della membrana Composizione chimica:40% lipidi, 60% proteine in peso secco, massimo 10% glucidi (solamente in associazione a lipidi, glicolipidi, o proteine, glicoproteine). Componente lipidica La componente lipidica può essere classificata in: fosfolipidi e colesterolo. 1. Fosfolipidi: 1.a.Glicerofosfolipidi (Fosfogliceridi): Sono i principali costituenti della membrana. Sono esteri del glicerolo (glicerofosfolipidi, cioè fosfolipidi propriamente detti), sono digliceridi (solo due gruppi OH sono esterificati con acidi grassi), derivano dai trigliceridi per sostituzione di un acido grasso con un gruppo fosfato. Sono formati da una testa polare idrofila (contenete il gruppo fosfato) e due code idrofobe (contenete i due acidi grassi). • C1: legame tipo estere (alcool + acido) con acido grasso C16, spesso saturo • C2: legame tipo estere (alcool + acido) con acido grasso C16 o C18, spesso monoinsaturo • C3: legame con fosfato più una base X Generalmente, i glicerofosfolipidi presentano un gruppo aggiuntivo (fortemente idrofilo) legato al gruppo fosfato, dal quale derivano: ■ Fosfatidilcolina, PC (Colina) (testa carica neutra) ■ Fosfatidiletanolammina, PE (Etanolammina) (testa carica neutra) ■ Fosfatidilserina, PS (Serina) (testa carica neegativa) ■ Fosfatidilinositolo, PI (Inositolo) (testa carica negativa) I glicero-fosfolipidi si dispongono a formare un doppio strato, con le teste rivolte verso no della cellula, e le code rivolte nello spazio compreso tra le due file di teste. Hanno tutti proprietà antipatiche. Le catene di acidi grassi sono generalmente lunghe 16-22 C e possono essere: ■ Saturi: solo legami singoli C-C ■ Monoinsaturi: presente un legame doppio C-C ■ Polisaturi : presenti più legami doppi C-C 1.b. Sfingolipidi (Sfingomieline) Derivano dalla sfingosina (un amminoalcol) che si lega ad un acido grasso, ad un gruppo fosfato e ad un altro gruppo polare (fosforilcolina) che conferisce il nome e le caratteristiche agli sfingolipidi. Anch’essi hanno una testa polare e due code idrofobe. 1.c.Sfingolipidi (Glicolipidi) Tutti i glicolipidi si trovano sul versante esterno della membrana. Se il gruppo esterificato è un carboidrato si avranno: ■ Cerebrosidi: singolo residuo monosaccaridico esterificato ■ Gangliosidi: residuo olisaccaridico esterficato 2. Colesterolo: Gli anelli idrofobici, piani e rigidi, e interferiscono con i movimenti delle code degli acidi grassi dei fosfolipidi. È situato nel doppio strato di fosfolipidi, con la porzione idrofila rivolta verso la testa dei fosfolipidi e la porzione idrofoba immersa tra le code, dove tende ad assemblarsi in microdomini detti raft (zattere lipidiche). ■ Regola la fluidità della membrana: ad alte temperature, evita che i fosfolipidi si allontanino troppo tra di loro, mentre a basse temperature, grazie all’ingombro sterico che produce, impedisce ai fosfolipidi di aggregarsi eccessivamente. Fludità della membrana Un bilayer lipico può passare da uno stato compatto e rigido a uno stato più fluido (transizione di fase) a una temperatura caratteristica (temperatura di transizione). I fosfolipidi non sono fissi ma si muovono all’interno della membrana cellulare. I principali movimento che compiono sono: • Diffusione laterale: si spostano da una parte all’altra dell’emistrato cui appartengono. • Rotazione attorno al proprio asse • Flip-flop: passano da un emistrato all’altro, grazie all’azione di enzimi (flippasi). Fattori che influenzano la fludità della membrana: • Grado di insaturazione degli acidi grassi: maggiore è il grado di insaturazione e minore è la temperatura di transizione • Proteine carrier (o proteine vettrici o permeasi): permettono il passaggio di molecole polari troppo grandi per diffondere liberamente (glucosio, saccarosio, amminoacidi ...); [Trasporto del glucosio: la maggior parte delle cellule possiede una proteina di membrana che facilitala diffusione del glucosio. Il glucosio entrato nel citoplasma viene immediatamente fosforilato. La fosforilazione abbassa la concentrazione di glucosio (non fosforilato) intracellulare, mantenendo un gradiente di concentrazione favorevole alla diffusione del glucosio all’interno della cellula. Vi sono cinque isoforme di trasportatori del glucosio nell’uomo: da GLUT1 a GLUT5, differenziate in base alla loro espressione nei tessuti e alle loro caratteristiche cinetiche e di regolazione. Ad es. gli adipociti e le cellule muscolari scheletriche sono sensibili all’insulina, che stimola il riassorbimento del glucosio da parte di queste cellule bersaglio. Entrambi i tipi di cellule esprimono la GLUT4. Con livelli bassi di insulina circolante nel sangue, queste cellule esprimono un numero modesto di GLUT4 sulla membrana e la maggior parte sono conservati all’interno di vescicole nel citoplasma. Ad alti livelli di insulina, le cellule sono indotte a rilasciare i trasportatori contenuti nelle vescicole sulla membrana, per permettere il riassorbimento del glucosio.] • Canali ionici (o proteine canale): permettono la conduttanza (rapido passaggio di ioni). Sono necessari per il trasporto di ioni come H+, Na+, K+, Cl-, HCO3-, Ca2+, ecc... Formano dei canali idrofili che attraversano il doppio strato lipidico. I canali sono altamente specifici, possono trasportare solo lo ione per il quale sono predisposti . I canali ionici che possono esistere in una conformazione aperta o chiusa sono definiti “a sbarramento” e sono classificati in base a come cambiano conformazione: ■ Canali ionici voltaggio-dipendenti: (a controllo di voltaggio) lo stato conformazionale dipende da differenze nella carica ionica sui due versanti della membrana ■ Canali ionici ligando-dipendenti: (a controllo di ligando): lo stato conformazionale dipende dal legame con una molecola che non è il soluto che attraversa il canale (es. cAMP agisce sulla superficie interna di alcuni canali per il calcio) ■ Canali a controllo meccanico: stato conformazionale dipende da forze meccaniche applicate alla membrana (es. stereo ciglia cellule capellute orecchio interno, aprono e chiudono determinati canali ionici). [il canale ionico per il potassio Kv eucariotico contiene 6 eliche associate di membrana (da S1 a S6) raggruppate in due domini: dominio del poro e dominio voltaggio dipendente. Nel complesso tetramerico, il segmento P costituisce un rivestimento interno di un “filtro di selettività” che permette solo agli ioni K+ di interagire con il poro del canale e di attraversarlo, perché delle esatte dimensioni dello ione K+ disidratato. I gruppi carbonilici (carichi negativamente) attragono K+, Na+ non è abbastanza grande da poter interagire in maniera elettrostatica.] La selettività dipende dalla interazione tra lo ione trasportato e i domini della proteina interni al canale che dipendono dalla carica elettrica e dalle dimensioni dello ione. La chiusura del canale è determinata da: ■ Cambimento di conformazione delle sub unità costituenti il canale ■ Blocco da ingombro sterico ■ Appendici di una delle subunità proteiche costituenti il canale 1. Osmosi: la membrana semipermeabile permette il passaggio del solvente e non dei soluti per annullare il gradiente di concentrazione. Il solvente si sposta dal versante con la soluzione più diluita a quello con la soluzione più concentrata. Il processo di diffusione dell’acqua (solvente) è facilitato da proteine canale specifiche, acquaporine,che permettono il libero spostamento del solvente (in direzione opposta al gradiente di concentrazione dei soluti) nonostante la sua polarità. Trasporto attivo È un meccanismo di trasporto più complesso rispetto alla diffusione; esso, infatti: • Avviene contro gradiente di concentrazione; • Avviene sempre con l’aiuto di proteine carrier; • Richiede consumo di energia (per questo “attivo”). L’energia per il trasporto attivo è fornita dall’idrolisi dell’ATP. Il trasporto attivo può essere: primario e secondario. 1. Trasporto attivo primario: 1.a.L’energia (idrolisi ATP) viene utilizzata direttamente per il trasporto delle molecole contro gradiente di concentrazione 1.b.L’idrolisi dell’ATP viene operata dallo stesso complesso molecolare che attua il trasporto (proteina carrier è un’ATPasi) Può avvenire secondo le modalità: 1.d. uniporto, se il trasporto avviene in un'unica direzione (es. pompa Ca++); 1.e. antiporto, se il trasporto avviene contemporaneamente in due direzione opposte (pompa Na+/K+). Le proteine che intervengono nel trasporto primario sono di due tipi: pompe e trasportatori ABC. a. Pompe ■ Pompe di tipo P: chiamate così perché hanno un sito in cui si lega il gruppo P proveniente dall’ATP. Il legame con il gruppo P (sul residuo di acido aspartico della proteina), determina un cambiamento conformazionale della proteina, che le permette di svolgere la sua funzione. Queste pompe trasportano soprattutto ioni positivi (Na+/K+, K+/H+, Ca++). [La Na+/K+ ATPasi: è formata da almeno due sub unità che attraversano la membrana. La subinutà α, più grande, è implicata nel trasporto, la suunità β è implicata nell’assemblaggio della pompa L’idrolisi dell’ATP ad ADP permette il cambio conformazionale della proteina (da E1 a E2) che serve ad esporre i siti di legame per gli ioni verso l’uno o l’altro versante della membrana. (stadio 1) Nello stato E1, il sito di legame per gli ioni è accessibile dall’interno della membrana e lega tre ioni Na+ e un ATP. (stadio 2) Il legame porta la proteina ad assumere una conformazione chiusa ed avviene l’idrolisi dell’ATP (stadio 3) L’idrolisi dell’ATP e il rilascio dell’ADP cambia la conformazione della proteina a E2) e ciò permette il rilascio degli ioni Na+ perché l’affinità per tali ioni diminuisce. (stadio 4) Il sito di legame per i due ioni K+ è esposto sul versante extracellulare e avviene il legame tra ioni e proteina. (stadio 5) Avviene la defosforilazione della proteina e il legame con un’altra molecola ATP, la proteina assume nuovamente la conformazione E1 (stadio 6) Avviene il rilascio degli ioni K+ nel citoplasma per ridotta affinità della proteina per questi ioni. Il rapporto di Na+:K+ pompati ad ogni ciclio è di 3:2 La Ca2+ ATPasi: è presente nelle membrane del reticolo endoplasmatico dove trasporta gli ioni al lume del RE dal citoplasma. La K+/H+ ATPasi: è localizzata sulle membrane citoplasmatiche delle cellule parietali dello stomaco. I messaggi ormonali stimolano l’esposizione delle pompe sulla membrana (dalle vescicole in cui sono contenute) e la loro attivazione.] ■ Pompe di tipo V: che trasportano solo ioni H+. La loro funzione è quella di acidificare un ambiente delimitato da membrana. Si trovano sulla membrana dei lisosomi e degli endosomi. (es. nella membrana plasmatica delle cellule dei tubuli renali, aiuta a mantenere l’equilibrio acido/base secernendo protoni nell’urina in via di formazione). ■ Pompe di tipo F: sono strutturalmente simili a quelle di tipo V. Il trasporto di ioni H + avviene secondo gradiente e serve a convertire ADP in ATP. Si trovano sulla membrana interna dei mitocondri. b. Trasportatori ABC (ATP binding cassette): tutti questi trasportatori sono caratterizzati da un dominio omologo che lega l’ATP. Sono proteine che trasportano grandi quantità di sostanze e farmaci (in quest’ultimo caso si chiamano MDR – multi-drug-resistance). Sono una famiglia di trasportatori attivi con sito di legame per l’ATP (conservato a livello evolutivo in piante, animali e procarioti) 49 geni codificano per trasportatori ABC nell’uomo. Sono classificabili varie superfamiglie di ABC transporters: ■ Superfamiglia A • ABCA: colesterolo e omeostasi dei fosfolipidi • ABCR: trasportatore specifico di fotorecettori nella retina ■ Superfamiglia B • TAP1: pompa peptidi citosolici degradato atttraverso la membrano o all’interno di compartimenti delimitati da membrane • ABCB6: trasporto del ferro • ABC7: trasporto gruppi eme • BSEP: trasporto della bile ■ Superfamiglia C • Placche di adesione (contatti focali): regioni specializzate per l’adesione modulabile alla matrice extracellulare (riscontrate soprattutto nei fibroblasti in coltura). Costituiscono aree membranose ristrette a livello delle quali si attua la connessione tra gli elementi actinici del citoscheletro e il substrato di matrice extracellulare.I filamenti di actina non interagiscono direttamente con i componenti proteici trans membrana. Un complesso proteico contenente tensina, vincolina e talina áncora un polipeptide (HA1) i filamenti di actina a proteine trans membrana della famiglia delle integrine. Le integrine permettono la connessione alle proteine fibrose della matrice extracellulare. La stabilità delle placche di adesione è proporzionale al livello di immobilità e, quindi, dell’adesione della cellula al substrato. L’insieme delle fasce aderenti e delle fasce occludenti costituisce il quadro di chiusura o terminal bar ■ Giunzioni comunicanti: • Giunzioni serrate (gap junction, nexus o maculae communicantes): (macula: zona limitata ad una specifica regione della membrana) area differenziata delle membrane plasmatiche adiacenti, a livello delle quali è facilitata la diffusione di ioni o piccole molecole da una cellula all’altra, attraverso una via a bassa resistenza. Lo spazio intra-membrane è compreso tra i 2-4 nm. Sono costituite da un aggregato, con disposizione poligonale di particelle proteiche omogenee sul verante citoplasmatico e da infossamenti corrispondenti al versante extracellulare della stessa membrana. Nello spessore tra le due membrane giustapposte sono rappresentati numerosi tragitti delimitati da proteine integrali tra loro giustapposte. Le loro particelle globulari sono disposte a intervalli di 10 nm e hanno spessore di 7-8 nm, presentano una forma esagonale. (costituita da subunità proteiche di connessine) che mettono in connessione due cellule tramite un canale idrofilo di 1,5 nm. Le molecole scambiate tramite giunzioni serriate è di circa 1 kD. Le giunzioni serrate non sono stabili ma sono costruite in base alla necessita delgli scambi cellulari, possono oscillare tra stati di chiusura e di apertura regolando il flusso di ioni e molecole. La comunicazione è permessa tra giunzioni che presentano sequenze amminoacidi che di connessine simili, cioè con una certa omologia in un dato tessuto, ciò consente la comunicazione tra cellule con ruoli biologici sovrapponibili. • Specializzazioni della superficie libera (microvilli, ciglia vibratili, stereo ciglia, cuticole) • Specializzazione della superficie basale (emidesmosomi) ■ Inclusi tra le giunzioni aderenti (fasce aderenti o zonula adherens): • Emidesmosomi: dispositivi di giunzione che stabiliscono l’ancoraggio della superficie basale degli epiteli alla matrice basale sottostante: lamina basale. Morfologicamente, sono costituiti da una sola delle due metà simmetriche dei desmosomi. Prendono connessione con elementi del citoscheletro (sul versante citoplasmatico) e con elementi della matrice extracellulare. Le integrine (etero dimeri glicoproteici costituiti da una sub unità α e una β) agiscono come recettori per molecole della matrice quali: laminina, collagene e fibronectina.La porzione citoplasmatica degli emidesmosomi prende indirettamente contatto con i filamenti intermedi del citoscheletro. Citoplasma (Ialoplasma e organuli) Il volume della cellula è costituito da un nucleo circondato da una zona più o meno estesa di citoplasma, suddiviso in • Citosol (o matrice ialoplasmatica): sistema colloidale polifasico costituito da due fasi: ■ Fase disperdente: soluzione acquosa di Sali, ioni e macromolecole ■ Fase dispersa: macromolecole che aumentano la viscosità della soluzione rendendola in fase gel • Organuli: strutture presenti nelle cellule eucariote, separate dal resto della cellula da una membrana propria, a specifica competenza biochimica • Inclusioni citoplasmatiche: accumuli di metaboliti e prodotti elaborati dalla cellula Nel citosol avvengono numerosi processi del metabolismo cellulare, tra cui reazioni sia cataboliche che anaboliche. Vengono sintetizzati alcuni amminoacidi, acidi grassi, basi puriniche e pirimidiniche, glucidi e precursori di ormoni. Esempi: Vie metaboliche del glucosio 6-fosfato, molecola che serve a: ■ Dare origine a polimeri con funzioni di riserva (glicogeno) ■ Produrre metaboliti intermedi (attraverso la sua demolizione) per la sintesi di altre molecole ■ Utilizzata come fonte di energia per processi sintetici e attività cellulari Le tre vie del glucosio-6-fosfato • Glicolisi: Il G6P è un intermedio metabolico della glicolisi, la via catabolica del glucosio. • Via dei pentosi: processo metabolico citoplasmatico, parallelo alla glicolisi, in grado di generare NADPH e zuccheri pentosi (a 5 atomi di carbonio). • Gliconogenesi: partendo dal G6P forma il glucosio-1-fosfato o G1P. Il G1P, attraverso l'UDP- glucosiopirofosfato ed il consumo di UTP, forma l'UDP-glucosio. l'UDP-glucosio, attraverso la glicogeno sintasi, cede il glucosio al glicogeno consentendone la polimerizzazione. Mitocondri Organelli addetti alla respirazione cellulare. Sono presenti in quasi tutte le cellule eucariote. La presenza dei mitocondri in una determinata cellula varia: • Di numero, da cellula a cellula, a seconda delle necessità energetiche della cellula; • Di numero, all’interno di una stessa cellula, a seconda dello stato funzionale della cellula; • Di posizione, a seconda della sede di bisogno dell’energia (es. negli spermatozoi sono dislocati attorno al flagello). Secondo la teoria dell'endosimbiosi, i mitocondri deriverebbero da cellule procariote libere, adattatisi ad una relazione di simbiosi dentro la cellula ospite. Struttura Il mitocondrio ha la forma di un “salsicciotto” lungo 1-4 μm (talvolta fino a 6-10 µm) ed ha un diametro di circa 1,5 µm; ha forma ovoidale (in sezione longitudinale) e circolare (in sezione trasversale) ed è formato da 4 componenti che, dall’esterno verso l’interno, sono: • Membrana esterna: spessore di circa 6 nm, separa lo spazio intermembrana dal citoplasma, delimitando il mitocondrio. È separata dalla membrana interna da uno spazio di 6-8 nm. È ricca di lipidi (50%) e di enzimi. È permeabile, presenta delle porine (proteine integrali di membrana che formano canali di 2-3 nm, circondati da foglietti β), che sono permeabili a molecole come ATP, NAD e coA. • Spazio intermembrana: è uno spazio tra le due membrane indispensabile per la creazione del gradiente protonico durante la fosforilazione ossidativa • Membrana interna: dello spessore di circa 6 nm, È priva di porine ed impermeabile. Possono passare solo ioni e molecole specifici attraverso trasportatori transmembrana altamente selettivi. Può essere ulteriormente suddivisa in due domini: ■ Membrana delimitante interna: si estende appena al di sopra della membrana mitocondriale formando un rivestimento esterno a doppia membrana. È posta tra lo spazio intermembrana e la matrice mitocondriale. È ricca di proteine (contiene circa un centinaio di diversi polipeptidi con un rapporto proteine:lipidi in peso 3:1, circa 15 proteine ogni fosfolipide) ed è priva di colesterolo ma presenta cardiolipina (difosfatidil-glicerolo), fosfolipide doppio che contiene quattro code di acidi grassi. ■ Creste: dominio della membrana che si estende all’interno dell’organello, sono disposte perpendicolarmente rispetto all’asse longitudinale del mitocondrio. Ampliano la superficie interna, permettendole di contenere i componenti richiesti per la respirazione aerobica e la produzione di ATP. Sono collegate alla membrana delimitante interna da connessioni chiamate giunzioni delle creste. • Matrice mitocondriale: è una sostanza gelatinosa discretamente viscosa, può essere presente una componente granulare (di circa 30 nm ciascuno) che è legata all’accumulo di ioni quali Ca2+ (i mitocondri sono anche dei depositi intracellulari di ioni Ca2+) e Mg2+. Al suo interno sono contenuti: ■ Ribosomi (con subunità più piccole di quelli presenti nel resto della cellula, più simili a quelli procarioti. ) ■ DNA circolare a doppio filamento (mtDNA): DNA simile a quello batterico (una catena a doppia elica, senza istoni e non organizzata in cromosomi). Il DNA mitocondriale ha caratteristiche particolari: ■ Permette al mitocondrio di dividersi indipendentemente dalla cellula ■ Si trasmette per via matrilineare. Al momento della fecondazione i mitocondri dello spermatozoo, una volta entrati nell’ovocita, vengono eliminati. Il nuovo individuo • Vari tipi di stress inducono l’oligomineralizzazione dei membri proapoptotici della famiglia di proteine Bcl-2-Bax o Bax all’interno della membrana dei mitocondri • Vengono formati dei canali che favoriscono il rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrana. • Nel citosol, i citocromi c formano un complesso multimerico con una proteina citosolica chiamata Apaf-1 e molecole di procaspasi-9. • La completa attività proteolitica delle procaspasi-9 è attivata da un cambiamento di conformazione indotto da Apaf-1. • Le caspasi-9 tagliano e attivano le caspasi esecutrici che inducono la risposta apoptotica. In alcune cellule, come gli epatociti, la via intrinseca dell’apoptosi può essere attivata da segnali extracellulari. • La caspasi iniziatrice della via estrinseca (caspasi-8) taglia una proteina del gruppo BH3-only, chiamata Bid. • Il taglio di Bid forma un frammento proteico tBid, che si lega a Bax. • Il legame porta l’inserimento di Bax nella membrana mitocondriale esterna e il rilascio dei citocromi c dai mitocondri. Trasporto proteine nel mitocondrio I mitocondri hanno quattro subcompartimenti in cui le proteine possono essere trasportate: • Membrana mitocondriale esterna (outer mitochondrial membrane, OMM) • Membrana mitocondriale interna (inner mitochondrial membrane, IMM) • Spazio intermembrana • Matrice mitocondriale Il 99% delle proteine mitocondriali è sintetizzata nel citosol e importata post-trduzionalmente. b.1.Le proteine mitocondriali contengono sequenze segnale rimovibili (presequenza) localizzata all’estremità N-terminale della molecola, mentre le proteine destinate alla IMM contengono sequenze interne che restano parte della molecola. b.2.Chaperoni molecolari (le cui funzioni predominanti sono la prevenzione di associazioni non corrette e aggregazione di catene polipeptidiche non ripiegate), Hsp70 e Hsp90 denaturano il polipeptide prima del suo ingresso nel mitocondrio. b.a. (destinate alla OMM) Le proteine sono riconosciute da recettori di membrana e sono traslocate attraverso i pori del complesso TOM (transporter of the outer membrane. b.b. (destinare alla IMM) Le proteine sono dirette al complesso TIM22 che le guida nel doppio strato lipidico. b.c. (destinate alla matrice mitocondriale) Le proteine sono traslocate attraverso il complesso TIM23. Entrata nella matrice, viene legata ad uno chaperone mitocondriale. Raggiunta la matrice, la proteina assume la sua conformazione nativa grazie a Hsp60. Metabolismo cellulare Il metabolismo cellulare indica l’insieme delle reazioni che la cellula compie per procurarsi energia o per sintetizzare molecole di varie funzioni. • Catabolismo: processi che portano alla degradazione delle molecole organiche con liberazione di energia. (accumulata principalmente nei fosfati ad alto contenuto energetico, essenzialmente, ATP, e in elettroni ad alta energia, fondamentalmente NADPH) • Anabolismo: le reazioni che assorbono energia per costruire molecole complesse. I prodotti che si formano ad ogni passaggio della via metabolica sono detti metaboliti intermedi. È necessario che la liberazione di energia o la sintesi della molecole avvenga gradualmente in più fasi, altrimenti il flusso di energia (dovuto alla rottura e alla creazione di legami) diverrebbe incontenibile e disperso, In ogni tappa interviene un enzima diverso che converte un intermedio in un altro intermedio. Il prodotto finale si ottiene dal completamento della via metabolica (molecole utili alla cellula nel caso delle reazioni anaboliche, molecole prive di energia utilizzabile nel caso delle reazioni cataboliche). Le tappe possono essere: • Limitanti, se si tratta di reazioni con una cinetica di reazione lenta. La velocità delle tappe successive dipendono dalla regolazione delle tappe limitanti (definiscono la cinetica della vita metabolica e lo sviluppo delle varie reazioni). • Non limitanti, se si tratta di reazioni con una cinetica di reazione veloce (favorite termo dinamicamente).. Le vie metaboliche, nel complesso, sono sempre attive, ma vengono più o meno attivate a seconda delle necessità cellulari. Molecole energetiche Esistono varie molecole in grado di accumulare energia, in quantità definire dalle proprie proprietà chimiche. Oltre all’ATP, esistono altre molecole che accumulano quantità maggiori di energia, generalmente usate per sintetizzare l’ATP stesso (una molecola energetica usata come reagente è sempre più energetica del prodotto) • ATP: (adenosina trifostato) è il composto ad alta energia richiesto più utilizzato nelle reazioni metaboliche endoergoniche. Viene prodotto secondo la reazione endoergonica: ADP + Pi + E → ATP. È la molecola energetica più comune. Accumula l’energia nei legami tra i suoi 3 atomi di fosforo. Dona energia grazie reazione di idrolisi, mediata dall'enzima ATPasi, che nella maggior parte dei casi coinvolge il trasferimento di un gruppo fosfato con una variazione di energia libera di −30,5 kJ/mole (esoergonica). L’energia di questi legami è dovuta alla forte repulsione elettrica degli ossigeni negativi legati agli atomi di fosforo. • Equivalenti riducenti: ■ coenzima NAD+ (vitamina B3): permettere le ossido-riduzioni trasferendo elettroni. È un coenzima ossidoriduttivo. ■ coenzima FAD+ (vitamina B2): fattore ossidante nella b-ossidazione degli acidi grassi e nel ciclo di Krebs. Interviene nel trasporto degli elettroni nel processo di catena di trasporto degli elettroni. È un coenzima ossido riduttivo Si caricano di ioni idrogeno ed elettroni persi dalle reazioni di ossidoriduzione che avvengono nella cellula riducendosi a NADH e FADH2. Donano gli elettroni acquisiti ai complessi respiratori, che li useranno per produrre ATP. Con gli elettroni ceduti da una molecola di NADH si formano 3 molecole di ATP, mentre con quelli ottenuti da una molecola di FADH2 se ne formano 2. • Intermedi della glicolisi ■ fosfoenolpiruvato (PEP) (la cui idrolisi rilascia 62 Kj/mol) ■ 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG) (l’idrolisi fornisce) 49 Kj/mol. • Tioesteri: composti organici con un gruppo -COSH utilizzati spesso nelle vie anaboliche. Es. coenzima A (vitamina B5), la cui idrolisi rilascia 31 Kj/mol. Catabolismo del glucosio 1. Glicolisi: via catabolica in cui una molecola di glucosio viene convertita in 2 molecole di acido piruvico (o piruvato). Avviene nel citoplasma e in 10 reazioni, è divisa in due fasi: • Di investimento (5 tappe): nella prima fase, la cellula consuma 2 ATP per dividere il glucosio (che ha 6 atomi di carbonio – 6C) in 2 molecole di gliceraldeide 3 – fosfato (GAP - 3C). In questa fase la cellula spende energia per produrre due molecole ad alto valore energetico, che potranno essere ossidate e defosforilate per ottenere energia. La prima fase ha 2 tappe limitanti, la prima e la terza. • Di rendimento (5 tappe): nella seconda fase, la cellula modifica le due GAP, trasformandole in acido piruvico. Durante la seconda fase, si ha in totale la produzione di 4 ATP (2 per ogni GAP) e 2 NADH (1 per ogni GAP). Anche la seconda fase ha due tappe limitanti, la settima e l’ultima. Quindi, alla fine della glicolisi, la cellula ha guadagnato 2 ATP (2 ATP consumate nella prima fase e 4 guadagnate nella seconda) e 2 NADH (che potranno essere utilizzati per produrre ATP). Il piruvato prodotto ha due destini diversi a seconda della quantità di O2 in cellula: • Condizioni anaerobie (carenza di O2), avviene la fermentazione (respirazione anaerobia). • Condizioni aerobie (è presente O2), seguono il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa (respirazione aerobia) 1. Fermentazione: Avviene nel citoplasma. Serve principalmente a rifornire la glicolisi di NAD+, senza il quale essa si blocca. Infatti, all’inizio della fase di rendimento della glicolisi, la GAP viene ossidata e gli elettroni vengono trasferiti sul NAD+ che diventa NADH.Se la quantità di NAD+ scende considerevolmente (come nel caso di glicolisi accelerata in sforzi intensi), la glicolisi rischia di fermarsi. La fermentazione usa NADH per ridurre l’acido piruvico (formando il lattato o l’alcol etilico) e ricreare il NAD+ .Essa può essere di due tipi, a seconda del prodotto: ■ L’informazione viene codificata e tradotta in una sequenza amminoacidica da un ribosoma libero nel citosol, ( peptide di 15-30 amminoacidi presente all'estremità N-terminale della maggior parte delle proteine di nuova sintesi che sono destinate verso la via secretoria). ■ l'SRP (signal recognition particle, complesso ribonucleoproteico formato da sei differenti polipeptidi e un filamento di RNA di 300 nucleotidi) con un'estremità riconosce e lega la sequenza e con un'altra estremità arresta la traduzione (ciò impedisce l’erroneo rilascio della proteina del citoplasma). ■ Con il terzo dominio, l'SRP lega il ribosoma ad una struttura posta sulla membrana del RER, recettore per l’SRP, composto da due subunità ad attività GTPasica. ■ L’SRP si stacca dal ribosoma che viene attaccato ad un complesso proteico transmembrana del reticolo, traslocone (che forma un canale acquoso dinamico che permette al polipeptide nascente di passare attraverso la membrana, contiene un recettore per il ribosoma che ancora l’organulo al reticolo). ■ Peptidasi scinde il peptide segnale dal resto della catena. • N-Glicosilazione: l'aggiunta di una catena glucidica standard a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di asparagina. ■ trasferimento di una catena di 14 zuccheri (assemblata a partire da singoli monosaccaridi, è trasferita dalla glicosiltransferasi da una molecola di dolicolo fosfato, che funge da donatore, alla proteina come singolo elemento), è formata da 2 N-acetilglucosammina, 3 glucosio e 9 mannosio. L'attacco può avvenire su un'asparagina qualsiasi presente nella sequenza Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, (dove X rappresenta un amminoacido qualunque ad esclusione della prolina). ■ Nel lume del RER vengono rimossi dalla catena 3 residui di glucosio ed uno di mannosio (Trimming), da parte delle glicosidasi. La presenza della porzione glucidia è necessaria ■ aumentare solubilità delle proteine ■ impedire l’attacco delle proteasi ■ conferisce un corretto ripiegamento alla proteina • Folding proteico (ripiegamento delle proteine): Il folding proteico avviene attraverso diverse fasi: ■ La proteina è prodotta dal ribosoma, viene N-glicosilata e agiscono le glicosidasi di tipo I e II, che sottraggono all’oligosaccaride 2 molecole di glucosio. ■ La calnexina, si attacca sia al glucosio rimanente che alla proteina e compie un primo ripiegamento della proteina, eliminando il glucosio La proteina può: ■ Ripiegamento fatto dalla calnexina è sufficiente: la proteina esce dal RER. Mannosidasi rimuove ultimo residuo di mannosio ■ La proteina necessita di ulteriori ripiegamenti: • GGT (Glicoprotein-Glucosil-Transferasi) aggiunge una molecola di glucosio. La proteina si può legare nuovamente alla calnexina e venir ripiegata. È un processo ciclico che si conclude con l’ottenimento dei ripiegamenti necessari. Le proteine misfolding vengono riconosciute da una proteina degradante che porta la proteina verso il proteo soma. Apparato di Golgi È un organulo localizzato in prossimità del nucleo la cui funzione è quella di modificare il contenuto delle vescicole provenienti dal reticolo endoplasmatico. Funzioni Il Golgi svolge tre funzioni principali: • Maturazione delle proteine: proteine provenienti o dal RER o dal citoplasma vengono modificate prima di essere trasferite alla loro destinazione finale. Le modifiche apportate sono essenzialmente di 4 tipi: ■ Glicosilazione (aggiunta di zuccheri) ■ Deglicosilazione (rimozione di zuccheri) ■ Solfatazione (aggiunta di gruppi solfato) ■ Fosforilazione (aggiunta di gruppi fosfato) • Smistamento delle proteine: dopo i rimaneggiamenti delle proteine, il Golgi interviene nell’indirizzamento delle proteine al compartimento di destinazione. L’indirizzamento avviene mediante l’aggiunta di molecole che fungono da segnale sui rivestimenti delle vescicole. Le possibili destinazioni delle macromolecole modificate dal Golgi sono: ■ L’esterno della cellula: processo detto secrezione e può essere di 2 tipi: • Secrezione costitutiva: Funzione propria di tutte le cellule. Le vescicole si staccano dal versante trans e migrano in modo continuo (senza accumularsi nel citoplasma) verso la membrana citoplasmatica, fondendosi con essa e liberando (mediante esocitosi) nella matrice extracellulare il contenuto. Queste vescicole sono rivestite da proteine di rivestimento chiamate coatomeri. • Secrezione regolata: funzione che riguarda solo alcune cellule. Le vescicole si accumulano nel citoplasma e vengono espulse dalla cellula solo in seguito a specifici segnali. Le vescicole di questo tipo sono rivestite da clatrina. ■ Verso la membrana cellulare: il Golgi invia alla membrana citoplasmatica glicoproteine inserite nello spessore della membrana delle vescicole con la componente carboidratica rivolta verso l’interno. Le vescicole si fondono con la membrana. La porzione glucidia della glicoproteina sporge all’esterno mentre la parte proteica è accolta integralmente nella membrana. ■ Verso gli endosomi ■ Verso i lisosomi: vengono inviate dal Golgi le idrolasi acide, in forma inattiva ■ Verso il reticolo endoplasmatico: alcune proteine modificate nel Golgi possono non essere totalmente mature e necessitare di un ulteriore rimaneggiamento da parte del RER • Sintesi di sfingomielina e glicosfingolipidi Struttura E’ formato da una serie di sacche membranose impilate le une sulle altre. Queste cisterne costituiscono un sistema estremamente dinamico che si rinnova e si trasforma continuamente. Si distinguono due versanti nel Golgi: ■ il versante cis (rivolto verso il nucleo) ■ il versante trans (rivolto verso la membrana citoplasmatica). Il Golgi è costituito da tre elementi, diversi tra di loro, sia morfologicamente che funzionalmente: • Reticolo cis (Cis Golgi Network - CGN). Composto da piccole vescicole provenienti dal reticolo endoplasmatico, si raggruppano e si fondono con l’apparato del Golgi formando una sorta di reticolo. La sua funzione è quella di fosforilare gli zuccheri delle glicoproteine destinate ai lisosomi • Sistema delle cisterne. Si tratta di una serie di 4-10 cisterne appiattite, con una faccia concava sul versante nucleare (faccia cis) ed una faccia convessa verso la membrana (faccia trans). Le cisterne sono raggruppabili in tre regioni, ciascuna con funzioni e struttura diverse: ■ Regione cis: rimuove in mannosio (con la monossidasi di tipo I) ■ Regione mediana: rimuove il mannosio (con la monossidasi di tipo II) e aggiunge la N-acetil-glucosamina ■ Regione trans: aggiunge il galattosio e l’acido sialico • Reticolo Trans (Trans Golgi network - TGN). È una serie di piccole vescicole provenienti dal versante Trans dell’ultima cisterna. Queste tendono a fondersi tra loro formando macrovescicole con destini diversi. La funzione del TGN è quella di aggiungere solfati e glicosamminoglicani. Spostamento delle vescicole Le vescicole di trasporto (dette cargo) provenienti dal reticolo endoplasmatico e che attraversano il Golgi vengono processate attraverso due modalità: • Progressione delle vescicole: il materiale, elaborato in una cisterna, viene in incluso in microvescicole di trasporto che gemmano lateralmente dai margini della cisterna per fondersi con la cisterna successiva. Il movimento avviene in direzione anterograda (da Cis a Trans). • Progressione delle cisterne: il cargo rimane nelle cisterne. Le cisterne avanzano in direzione Cis- Trans maturando progressivamente. C’è una migrazione di vescicole che gemmano lateralmente. Il movimento avviene in senso retrogrado (direzione Trans-Cis ) e il contenuto delle vescicole è composto dagli enzimi che si fondono con le cisterne a monte. Questo tipo di trasporto viene solitamente utilizzato per le grandi molecole che non possono essere contenute nelle microvescicole di trasporto. b.9.La vescicola si separa dalla membrana del RE. b.10. Il disassemblaggio del rivestimento proteico avviene in seguito all’idrolisi del GTP legato a Sar1. Vescicole rivestite da COPI (trasporto retrogrado) Le vescicole rivestite da COP I sono implicate nel trasporto: • Enzimi del Golgi, in direzione trans-cis • Enzimi del RE dall’ERCIG o dal Golgi verso il RE Le proteine vengono mantenute in un determinato organello tramite una combinazione di due meccanismi: 1. Ritenzione: le molecole residenti sono escluse dalla vescicola di trasporto 2. Recupero: le molecole vengono riportate nel compartimento originario Le proteine che risiedono normalmente nel RE (es. PDI, BiP) contegono all’estremità C-terminale corte sequenze amminoacidiche (KDEL e KXXX) che servono da riconoscimento. Il recupero avviene: 1. Una proteina solubile del RE si lega al recettore di KDEL sulla parete membranosa del reticolo cis del Golgi 2. I recettori del KDEL i legano alle proteine che compongono il rivestimento di COPI 3. Si forma la vescicola che ritorna come in origine al RE Ribosomi Sono organuli citoplasmatici non delimitati da membrana presenti in tutte le cellule (sia eucariote che procariote), possono essere: • Liberi nel citoplasma: sintetizzano proteine destinate a restare diffuse nel citosol • Adesi al RER: formano proteine destinate ad essere secrete o proteine integrali di membrana • Contenuti nei mitocondri (ribosomi mitocondriali) Tutti i ribosomi sono inizialmente liberi nel citoplasma, aderiscono al RER in funzione del messaggio espresso dall’mRNA. In entrambi i casi, i ribosomi possono associarsi in gruppi detti poliribosomi o polisomi, costituiti da 3 a 30 ribosomi, legati ad una molecola di RNA messaggero. Il genoma umano contiene circa cinque raggruppamenti di rDNA (DNA codificante per rRNA), ognuno localizzato su un cromosoma differente. In interfase gli rDNA sono raggruppati in strutture nucleari, granulari e dalla forma irregolare, dette nucleoli. Hanno forma ellissoidale e sono costituiti da materiale ribonucleoproteico (rRNA e proteine, che negli eucarioti sono presenti all’incirca nelle stesse proporzioni). I ribosomi eucariotici sono detti 80S (Svedberg, unità di misura del coefficiente di sedimentazione). Sono composti da due subunità volumetricamente differenti: • Subunità maggiore: 60S, che contiene tre rRNA (28S, 5,8S e 5S). Interagisce con le estremità –CCA del tRNA e catalizza, mendiante l’enzima peptidil-transferasi, la formazione dei legami peptidici tra i vari amminoacidi. Presenta un canale dal quale passa la catena proteica in via di formazione, protetta dall’azione delle proteasi citoplasmatiche. • Subunità minore: 40S, che contiene un rRNA (18S). è la subunità che lega l’mRNA e su di essa avviene il riconoscimento codone (mRNA) - anticodone (tRNA). Lateralmente al corpo della subunità è presente una sporgenza che crea una fessura (cleft) in cui avviene l’interazione codone- anticodone. I singoli trascritti di rRNA sono capaci di auto-assembrarsi (ad eccezione della 5S), tale processo avviene nel nucleo per venir poi rilasciati nel citoplasma. Gli rRNA hanno ruolo strutturale e si legano tramite interazioni specifiche a proteine fino a costituire la subunità completa (legami tra specifici domini di rRNA e proteine). I ribosomi contengono all’incirca 80 proteine, delle quali 33 ascrivibili alla subunità minore e da 45 alla subunità maggiore. Tali subunità sono associate solo nel momento della sintesi proteica (traduzione) allineandosi su un filamento di mRNA. Nella subunità minore sono rintracciabili: • sito A (amminoacidico), a cui si lega il tRNA, è formato dalle proteine S21, S7,S11,S13 e S19 • sito P (peptididico) formato dalle proteine S1, S3, S5, S12 e S18 • sito E (exit) ciascun sito riceve in passaggi successivi del ciclo di allungamento della proteina neotradotta. Perossisomi I perossisomi (microbodies) sono degli organelli multifunzionali, specializzati nell’utilizzo dell’ossigeno, si trovano in praticamente tutti i tipi di cellule eucariotiche, in un numero che varia da uno (nei lieviti) a centinaia (es. nelle cellule renali o epatiche dei mammiferi). Hanno un diametro compreso tra 0,1‐1,0 µm, sono delimitati da membrana e spesso presentano un nucleo denso, contenente materiale finemente granulare, detto nucleoide, costituito da enzimi ossidativi. Sono organelli estremamente diversificati, anche in cellule diverse di un singolo organismo, potendo contenere diversi insiemi di enzimi. Svolgono sia reazioni cataboliche che processi biosintetici. Sono il sito di produzione e di degradazione del perossido di idrogeno (H2O2), agente ossidante tossico e altamente reattivo. Contengono inoltre circa il 20% dell’attività totale di due enzimi della via del pentoso fosfato (essenziale per la sintesi di NADPH e/o dei pentosi come il ribosio o il desossiribosio). Altre funzioni perossisomiali includono, nelle piante: • il ciclo del gliossilato nei semi germoglianti (“gliossisomi”) • fotorespirazione nelle foglie • glicolisi nei tripanosomi (“glicosomi”) Funzioni Le funzioni metaboliche dei perossisomi dei mammiferi: • β‐ossidazione di acidi grassi (acidi grassi a catena molto lunga (“Very Long Chain Fatty Acids”, VLFA; C24-C26), acidi dicarbossilici, acidi grassi ramificati, acidi grassi insaturi, metabolismo dell’acido arachidonico e di composti xenobiotici) • Biosintesi di lipidi [etere fosfolipidi (plasmalogeni), acidi biliari, colesterolo e dolicolo, allungamento della catena degli acidi grassi] • γ‐ossidazione di acidi grassi (acido fitanico, composti xenobiotici) • Catabolismo degli aminoacidi • Catabolismo delle poliamine • Catabolismo delle purine • Metabolismo del gliossilato [sopratutto nelle piante] • Via dell’esoso monofosfato (“shunt” dei pentosi; “shunt” del pentoso monofosfato) • Metabolismo del perossido di idrogeno (mediante catalasi e ossidasi generanti H2O2) e di altri ROS Metabolismo del perossido di idrogeno I perossisomi usano l’ossigeno molecolare e il perossido di idrogeno per svolgere reazioni ossidative. Le ossidasi che generano H2O2 trasferiscono elettroni e ioni idrogeno dai loro substrati all’ossigeno molecolare (O2), riducendolo a (H2O2): RH2 + O2 → R + H2O2 (RH2: substrato ossidabile) La catalasi può decomporre il H2O2 in due modi: 1. Quando la concentrazione di H2O2 è molto abbondante: la catalasi può detossificare due molecole di H2O2 contemporaneamente, in una reazione di dismutazione (una viene ossidata a ossigeno e l’altra ridotta ad acqua): 2 H2O2 → 2 H2O + O2 2. La catalasi può funzionare come una perossidasi, catalizzando una reazione in cui gli elettroni derivati da una sostanza organica sono usati per ridurre il perossido di idrogeno ad acqua: H2O2 + R’H2 → R’ + 2H2O ossidando una grande diversità di altri substrati (incluso fenoli, acido formico, formaldeide e alcool) Mediante l’attività della catalasi, il perossido di idrogeno, estremamente tossico, viene degradato in loco. Detossificazione Nel fegato una delle principali funzioni dei perossisomi è la detossificazione, mediante ossidazione di sostanze potenzialmente pericolose quali. Molte sostanze tossiche (metanolo, etanolo, acido formico, formaldeide, nitriti, fenoli, ecc) possono agire come donatori di elettroni (R’H2). Detossificazione di specie reattive derivate dall’ossigeno (ROS) (es. anione superossido, O2‐ , radicale idrossilico, OH°; °: elettrone spaiato, altamente reattivo). Si formano come sotto‐prodotti del metabolismo cellulare. Se si accumulano producono stress ossidativo. • La resistenza è determinata dall'associazione di più protofilamenti (rendendo ciascun filamento del citoscheletro termicamente stabile) e le singole subunità sono sfalsate l'una dall'altra conferendo resistenza alla trazione e al ripiegamento. • I filamenti del citoscheletro più stabili e resistenti perché presentano una diversa struttura delle subunità proteiche (allungate e fibrose invece che globulari) e del filamento (coiled coil). Funzioni del citoscheletro nella cellula: • Struttura e supporto: determina la forma della cellula e fornisce supporto e resistenza alle forze meccaniche applicate su di essa. • Trasporto intracellulare: fornisce una rete sulla quale vengono spostati e distribuite: molecole di mRNA, trasportatori di membrana dal RE al Golgi, trasporto delle vescicole lungo l’assone della cellula nervosa, ecc… • Contrattilità e motilità: permette lo spostamento delle cellule su un substrato solito o attraverso strutture specializzare (ciglia e flagelli). • Organizzazione spaziale: permettono di stabilire la posizione degli organuli cellulari (es. cellule epiteliali) e la distribuzione ordinata dei cromosomi nei processi di divisione cellulare. Microfilamenti (filamenti actinici) • Composti da subunità monomeriche di l'actina • Si formano per aggiunta di unità monomeriche di actina, una proteina globulare che lega ATP. • Sono i filamenti citoscheletrici più sottili hannoo uno spessore di 6-7 nm. • Hanno una polarità strutturale (un'estremità più, chiamata "barbed end", dove avviene preferenzialmente l'aggiunta di g-actina, contribuendo all'allungamento del filamento, ed un'estremità meno, chiamata "pointed end", in cui prevalgono i fenomeni di depolimerizzazione actinica). • Dopo l'accrescimento del filamento l'ATP viene idrolizzata in ADP. Polimerizzazione Inizia con 3 molecole di actina che si legano tra loro. Nella cellula la concentrazione di actina libera è alta, permettendo alle molecole di legarsi al polimero neo-formato, il processo aumenta la sua velocità fino a raggiungere uno stadio stazionario, steady state. Lo steady state è uno stato dinaco che segue il modello del "treadmilling", quando la velocità di aggiunta di monomeri è uguale a quella di rilascio, non avviene nessun cambiamento netto nella lunghezza del polimero, ma avviene un continuo ricambio di subunità. Proteine associate • Proteine che inibiscono la polimerizzazione • Proteine che tagliano i filamenti (gelsolina) • Proteine che incappucciano il filamento (CapZ) per evitare che si accrescano • Proteine che collegano i microfilamenti formando fasci (fascina), come avviene nei microvilli • Proteine che conferiscono la contrattilità ai filamenti actinici Miosina • È presente in tutte le cellule eucariotiche. • È dotata di attività ATPasicA. • Esiste in diverse isoforme che funzionano da "motori proteici" per l'actina (accoppiano l'idrolisi della molecola di ATP con cambiamenti conformazionali che contribuiscono a generare la forza meccanica per i vari tipi di motilità cellulare e sub-cellulare), es. contrazione cellulare, citocinesi, traffico di vescicole. • La struttura consiste in due parti principali: ■ la testa globulare: lega la molecola di actina ed è dotata di attività ATPasica ■ la coda: unita alla testa, consiste in due catene proteiche con conformazione elicoidale avvolte insieme. • Il complesso actina-miosina, nelle cellule muscolari scheletriche dei Vertebrati, forma una struttura detta sarcomero, da cui dipende la contrazione delle fibre muscolari • La contrazione è influenzata dalla concentrazione intracellulare dello ione calcio, e da altre proteine (come la tropomiosina, la troponina e la nebulina). Filamenti intermedi • Hanno uno spessore di circa 10 nm (intermedio tra quello dei microtubuli e quello dei filamenti actinici). • Sono costituiti da molecole filamentose che variano a seconda del tipo di cellula • Possiedono una grande resistenza alla trazione e consentono alla cellula di sopportare stress meccanici. • Non sono polarizzati e sono più stabili. Polimerizzazione 1. Due monomeri si aggregano formando un dimero 2. Il dimero si unisce lateralmente ad un altro dimero formando un tetramero 3. I tetrameri si aggregano a loro volta fino a formare un filamento costituito da 32 monomeri. 4. I tetrameri si associano lateralmente a tandem, costituendo delle formazioni piane che successivamente si ripiegano in strutture cave. Lamìne Sono un tipo di filamenti che va a costituire la lamina nucleare. Per procedere alla divisione cellulare, le proteine costituenti i filamenti intermedi della lamina nucleare vengano fosforilate. La fosforilazione destabilizza i filamenti e li porta alla depolimerizzazione. Le chinasi controllano i processi di polimerizzazione e depolimerizzazione della lamina. Proteine associate I filamenti intermedi possono legare: 1. Desmoplacchina: connette i filamenti intermedi ai desmosomi e agli emidesmosomi 2. Plectrina: connette i filamenti intermedi ai microtubuli 3. Ankyrina: connette i filamenti intermedi ai microfilamenti Microtubuli • Sono strutture proteiche cilindriche cave dal diametro esterno di 25 nm. • Sono composti da eterodimeri formati da una molecola di tubulina-α e una di tubulina-β. Esiste l’isoforma γ-tubulina, che si localizza negli MTOCs. La tubulina è una proteina capace di legarsi a GTP, ma solo la tubulina-β può idrolizzare GTP a GDP.Le molecole di γ-tubulina sono funzionali al processo di nucleazione dei dimeri di α e β-tubulina, e formare un anello collegato ai microtubuli in allungamento. • Sono capaci di autodemolirsi rapidamente in una sede e ricostituirsi in un'altra. • Hanno pareti formate da 13 protofilamenti. • Sono polari. Polimerizzazione Tramite un processo detto di nucleazione, più eterodimeri di tubulina-αβ vanno a formare un piccolo microtubulo. Il microtubulo si accresce da entrambe le parti (la velocità di accrescimento è maggiore all'estremità più). In vitro: a basse concentrazioni di tubulina libera, sia l'estremità positiva che quella negativa si accorciano. Aumentandola, la depolimerizzazione rallenta fino a raggoiugere un punto di equilibrio, punto critico. L'equilibrio è di tipo dinamico. Nella cellula: la concentrazione di tubulina libera non è sufficiente da poter permettere la formazione spontanea dei microtubuli, per formarsi hanno bisogno di un punto di innesco. Nelle cellule animali l’innesco è costituito dalla tubulina-γ. Mantenendo bassa la concentrazione di tubulina libera, la cellula può controllare la formazione dei microtubuli, i quali presenteranno quindi un'instabilità dinamica (si depolimerizzerano e ripolimerizzerano in un processo continuo a partire dal centrosoma). I microtubuli possono stabilizzarsi se alla loro estremità positiva si forma un cappuccio di GTP, (ciò avviene se prima che la tubulina-β idrolizzi il GTP si attacca al microtubulo un altro etero dimero). Un microtubulo che nasce dal centrosoma può non depolimerizzarsi se alla sua estremità positiva (quella più lontana da centrosoma) si va ad attaccare una molecola o una struttura cellulare. Due microtubuli possono scorrere l'uno sull'altro grazie a speciali proteine presenti sui microtubuli che trasformano l'energia derivante dall'idrolisi di ATP in energia motrice. Al microtubulo si ancorano organuli e vescicole, che possono scorrere per mezzo delle proteine motrici, verso l'estremità più (chinesine) o verso l'estremità meno (dineine) del microtubulo. Alcune proteine, dette proteine associate ai microtubuli, possono stabilizzare in maniera permanente i microtubuli, permettendo la formazione dello scheletro di ciglia e flagelli. DNA Polimerasi e DNA Primasi La DNA polimerasi e’ un complesso multimerico formato da diverse unità enzimatiche con diverse attività catalitiche. Tutte le DNA polimerasi condividono la stessa struttura molecolare, paragonabile a quella di una mano destra. I tre domini della DNA polimerasi: palmo, dita, pollice • Le dita e il pollice sono composte da α eliche • Il palmo è composto da un foglietto β e contiene il sito catalitico (in cui si trovano siti di legame per due ioni metallici) ed è associato al DNA neo-sintetizzato. Il complesso “innesco-stampo” attraversa il “palmo”, dove viene controllata l’accuratezza dell’appaiamento tra le basi, in una scanalatura creata dalle “dita” e dal “pollice”. La DNA polimerasi catalizza l’aggiunta sequenziale di deossiribonucleotidi all’estremita’ 3’-OH di una catena polinucleotidica accoppiata ad un filamento stampo, formando un legame fosfodiestereo con il gruppo fosfato al 5’ del nucleotide aggiuntivo. I nucleotidi entrano come nucleosidi trifosfati, apportando l’energia necessaria per la polimerizzazione, fornita dall’idrolisi di un legame fosfoanidride, con liberazione di pirofosfato. Il pirofosfato viene poi idrolizzato ulteriormente a fosfato inorganico, rendendo la reazione del tutto irreversibile. Le diverse isoforme di DNA polimerasi condividono le seguenti caratteristiche: • Le DNA polimerasi non sono in grado di rompere i legami idrogeno per separare i due filamenti di una doppia elica di DNA. • Tutte le DNA polimerasi necessitano di uno stampo da copiare, fornito dai filamenti di un’elica pre-esistente. • Tutte le DNA polimerasi sono in grado di allungare un filamento di DNA o RNA che funge da innesco, ma non possono iniziare la sintesi di una catena ex novo. • I due filamenti di una elica di DNA sono antiparalleli (5'— 3' e 3' — 5') e tutte le DNA polimerasi catalizzano solo l’aggiunta di un nucleotide all’estremità 3' di una catena nascente: in questo modo le catene possono crescere solo in direzione 5' — 3'. • Tutte le DNA polimerasi utilizzano come substrato solo i quattro nucleotidi trifosfato. DNA Polimerasi III (enzima che opera la formazione del filamento di DNA in E.coli), è parte di un complesso chiamato oloenzima DNA. Contiene 10 subunità differenti organizzate in diversi componenti: • Due polimerasi centrali che replicano il DNA • Due o più pinze β che permettono alla polimerasi di rimanere associata al DNA • Complesso caricatore della pinza (γ) che carica ogni pinza sul DNA. Ogni caricatore contiene due subunità τ, che fissano la polimerasi centrale al complesso e che legano anche le elicasi. Le DNA Polimerasi richiedono un’estremità 3’-OH di una sequenza innesco (primer) per iniziare la sintesi del DNA. La DNA primasi è una speciale RNA Polimerasi che produce corti primers di RNA che servono da innesco per la DNA polimerasi. Al contrario della DNA polimerasi, la DNA primasi è in grado di iniziare una nuova catena unendo due ribonucleotidi trifosfati. Il primer e’ eliminato dall’enzima di riparazione RNAsiH1, che elimina il frammento di RNA sostituendolo con una sequenza di DNA, estesa a partire dall’estremo 3’-OH del frammento di Okazaki successivo. L’intervallo viene riempito dalla DNA polimerasi e il filamento congiunto dalla DNA ligasi (La DNA ligasi catalizza la formazione di legami fosfodiesterici tra frammenti di Okazaki). La sintesi di ogni frammento di Okazaki necessita di una DNA primasi e di un primer. DNA Elicasi La DNA elicasi si lega al DNA a singolo filamento e scorre (in una direzione definita, polarità) separando i due filamenti della molecola (1000 nucleotidi/secondo) rompendone i legami idrogeno. Il movimento della DNA elicasi richiede l’idrolisi di ATP. Lo svolgimento della doppia elica a partire da ogni forca replicativa prevede l’intervento di due elicasi, una associata al filamento leading, l’altra associata al filamento lagging. (es. DnaB). Proteine SSB Sono proteine che legano selettivamente il DNA a singolo filamento, mantenendolo in uno stato disteso e impedendogli di riavvolgersi o danneggiarsi. La presenza di una SSB facilita il legame di un’altra SSB sul tratto di DNA adiacente (legame cooperativo). Topoisomerasi In E. coli esistono almeno 4 diverse topoisomerasi, identificate con numeri romani da I a IV. b.11. Topoisomerasi I: Le topoisomerasi I e III sono di tipo I, formano un nick transiente su un singolo filamento permettendo alle due parti dell’elica di ruotare liberamente l’una rispetto all’altra. b.12. Topoisomerasi II: Le topoisomerasi II e IV sono di tipo II, La topoisomerasi II batterica è detta anche DNA girasi. Formano un nick transiente su entrambi i filamenti di una doppia elica permettendo all’altra doppia elica di passare nella breccia creata dal taglio, dopodiché saldano il taglio. Proofreading Vari meccanismi di correzione delle bozze intervengono a vari livelli, determinando l’elevata fedeltà di copiatura del DNA (1 errore ogni 109 nucleotidi copiati). Questi possono avvenire: 1. Dopo l’appaiamento del nuovo nucleotide allo stampo, ma prima del legame covalente alla catena crescente: La DNA polimerasi controlla se quello precedente è appaiato correttamente, altrimenti lo rimuove. Dopo che un nucleotide e’ entrato nel sito catalitico dell’enzima, ma prima che si crei il legame fosfodiesterico, la DNA Polimerasi va incontro ad un cambiamento conformazionale. Qualora il nucleotide non si appai in maniera corretta al filamento stampo, un cambio conformazionale ne determina il distacco dall’enzima. 2. Dopo il legame covalente del nuovo nucleotide alla catena crescente: La DNA polimerasi possiede due attivita’ enzimatiche distinte, espletate da due domini diversi: • attivita’ polimerasica in direzione 5’-3’ • attivita’ esonucleasica in direzione 3’-5’ Quando la polimerasi rileva un errore di appaiamento tra le basi, dopo che il legame fosfodiesterico è stato creato, il complesso stampo-innesco si avvicina al dominio con attività esonucleasica, dove viene eliminato il nucleotide errato, permettendo alla polimerasi di riprendere la sintesi, senza provocare la dissociazione dell’intero complesso. Questa attività proofreading riduce la frequenza di errore ad uno ogni 107 nucleotidi. 3. Sul DNA già replicato: Esiste un sistema di riparazione degli appaiamenti sbagliati (Strand-directed mismatch repair system). Un sistema di enzimi che: ■ Riconosce la distorsione dell’elica dovuta al mismatch (distinguendo il filamento nuovo da quello parentale); ■ Taglia il segmento di DNA contenente il mismatch; ■ Risintetizza il segmento tagliato usando il filamento vecchio come stampo. Nei batteri: • MutS scorre lungo il DNA e riconosce il mismatch. MutH e MutL vengono reclutate • MutL distende il filamento • MutH agisce da endonucleasi: taglia un segmento di filamento neo sintetizzato (riconosciuto grazie alla metilazione del DNA), il gap viene riempito dalla DNA polimerasi e le estremità saldate dalla DNA ligasi. Replicazione DNA (eucarioti) I cromosomi eucariotici vengono replicati una sola volta ogni ciclo cellulare (fase S) e la replicazione del DNA origina in punti specifici detti origini di replicazione, attivati una volta per ciclo cellulare. Le cellule eucariotiche replicano il loro genoma in piccole porzioni chiamate repliconi, ciascuno dei quali possiede la propria orgine di replicazione. (cellula umana, da 10.000 a 100.000 differenti origini di replicazione). I due filamenti parentali vengono separati da enzimi, detti elicasi, formando una bolla di replicazione. Il caricamento dell’elicasi avviene su tutti i replicatori nella fase G1. L’attivazione dell’elicasi e l’assemblaggio del replisoma avviene in fase S. L’enzima DNA polimerasi catalizza la sintesi dei nuovi filamenti di DNA utilizzando come precursori nucleotidici i quattro desossinucleotidi trifosfati (dATP, dGTP, dCTP e dTTP). La DNA polimerasi catalizza l’allungamento delle catene esclusivamente in direzione 5’-3’, si avranno due filamenti che differiscono per velocità e modalità di replicazione: • Filamento veloce (leading strand): la sintesi procede direttamente nel senso 5’-3’ • Filamento lento (lagging strand): la sintesi 5’-3’ procede in direzione opposta a quella in cui si muove la forcella di replicazione. La sintesi del filamento lento avviene sintetizzando una serie progressiva di piccoli frammenti di circa 100-1000 nucleotidi detti “frammenti di Okazaki”, uniti successivamente per mezzo dell’enzima DNA ligasi. La sintesi del nuovo filamento è un processo semidiscontinuo: solo sul filamento veloce si avrà la sintesi continua. Le forcelle di replicazione sono localizzate in punti precisi, in quantità variabile da 50 a 250, detti foci di replicazione. ARS: sequenze di replicazione autonoma, hanno la capacità di promuovere la sequenza di DNA in cui sono contenute. L’elemento centrale è una sequenza conservata di 11 bp e funziona come sito specifico di legame per l’ORC ORC: complesso multi proteico detto complesso di riconoscimento dell’origine. 1. ARS lega il complesso multi proteico ORC. La presenza di ORC è necessaria all’inizio della replicazione del DNA. È legato al punto di origine della replicazione per tutto il ciclo cellulare. 6. Legame delle estremità (DNA ligasi I) Riparazione per escissione di base (BER) Riparazione per escissione di base (BER), rimozione dei nucleotidi alterati. 1. DNA glicosilasi riconosce l’alterazione 2. Rimozione della base tramite rottura del legame glicosidico che unisce la base alla molecola di zucchero desossiribosio (da parte della DNA glicolasi) Sono stati identificati vari tipi di DNA glicosilasi, ognuna più o meno specifica per un particolare tipo di base alterata (es. uracile, formato per la rimozione idrolitica del gruppo amminico della citosina, 8- ossiguanina, derivante dal danno indotto dai radicali liberi dell’ossigeno, 3-metil-adenina, formata dopo il trasferimento di un gruppo metile da un donatore). Riparazione degli appaiamenti errati (MMR, Mismatch repair) Correzione di errori di replicazione e di ricombinazione genetica che determinano la formazione di nucleotidi male appaiati in seguito alla replicazione del DNA. Similmente ai procarioti, negli eucarioti: MutS riconosce e lega il mismatch reclutando MutL. Il complesso MutS/Mut interagisce con le proteine re plicative (RFC/PCNA) e questa interazione permette il riconoscimento del filamento discontinuo. MutL si attiva e incide il filamento neo sintetizzato in 5’ al mismatch. Ciò permette all’esonucleasi di dirigere il filamento in direzione 5’-3’ con l’aiuto di RPA che lega i filamenti singoli di DNA: Il meccanismo di risintesi può avvenire sia prima che dopo l’azione dell’endonucleasi. La Dna ligasi salda i filamento e termina la riparazione del danno. Funzione molecolare E.coli e batteri Eucarioti Riconoscimento del mismatch MutS MutSα (MSH2/MSH6) MutSβ (MSH2/MSH3) Stabilizzatore del riconoscimento MutL MutLα (MLH1/PMS2) MutLβ (MLH1/PMS1) MutLγ (MLH1/MLH3) Regolazione dell’incisione del filamento - PCNA RFC Attività endonucleasica MutH MutL Rimozione del filamento SSB (lega il filamento singolo) RecJ (esonucleasi) Exol (esonucleasi) ExoVII (esonucleasi) ExoX(esonucleasi) RPA (lega il filamento singolo) EXO1 (esonucleasi) UvrD (elicasi) Risintesi del filamento DNA polimerasi III DNA polimerasi δ Tipologie di danni al DNA, classificati in: • Danni alle basi: • Errori di replicazione (incorporazione di un nucleotide scorretto, mismatch) • Idrolisi del legame β-N-glicosidico (idrolisi delle basi) • Ossidazione • Deamminazione • Alchilazione • Fotoattivazione • Danni allo scheletro zucchero fosfato • Rotture a singolo o doppio filamento Ricombinazione DNA Processo enzimatico con cui l’organizzazione lineare del DNA in un cromosoma viene modificata mediante unioni e rotture. Le tipologie di ricombinazione genica si dividono in: • Ricombinazione genetica omologa: riguarda scambi di materale genetico tra due molecole di qualsiasi DNA (o segmenti della stessa molecola) che possiedono ampie regioni omologhe • Ricombinazione sito-specifica: gli scambi si verificano solo in corrispondenza di una determinata sequenza. • Trasposizioni del DNA: riguarda solitamente un breve segmento di DNA con capacità da una posizione in un cromosoma a un’altra. Ricombinazione genetica omologa • Procarioti: è principalmente un processo di riparazione del DNA. Viene definita riparazione ricombinativa del DNA. È comunemente diretta alla ricostruzione della forcella replicativa, quando questa si blocca nei pressi di un danneggiamento del DNA. • Eucarioti: è strettamente legata alla divisione cellulare ed al meccanismo di riparazione del DNA. SI verifica con maggior frequenza in meiosi. Il crossing over determina uno scambio di materiale genico. La frequenza di ricombinazione in una rregione che separa due punti di un cromosoma è proporzionale alla distanza che separa i due punti, permettendo la determinazione della posizione relativa e della distanza tra differenti geni. Si stabilisce la connessione fra due duplex di DNA. Quando due filamenti omologhi si rompono in punti corrispondenti, ciascun filamento lascia il suo partner e si appaia con il complementare nell'altro duplex. Lo scambio reciproco crea una connessione fra i due duplex di DNA, generando una molecola congiunta. Il punto in cui il singolo filamento di DNA passa da un duplex all'altro prende il nome di giunzione ricombinante. Nel sito di ricombinazione ciascun duplex ha una regione in cui ciascuno dei filamenti deriva da un diverso DNA parentale; tale regione è definita DNA ibrido o DNA eteroduplex. La giunzione ricombinante ha la sua capacità di spostarsi lungo il duplex, in un processo che è detto migrazione della ramificazione. Il punto di ramificazione può migrare in entrambe le direzioni, mano a mano che un filamento viene spostato sull'altro. Ciò consente al punto di crossing-over nell'intermedio di ricombinazione di muoversi in entrambe le direzioni. Ricombinazione durante la meiosi • La rottura della doppia elica in uno dei due omologhi è convertita in un interruzione (gap) per azione di una endonucleasi. • Le estremità 3’ libera si appaia con la sequenza complementare sull’omologo intatto. L’altra catena del duplex viene spostata. • L’estremità 3’ viene estesa per intervento della DNA polimerasi e della migrazione della ramificazione, (quando una catena stampo si appaia con due diverse cateene complementari, nel punto in cui le tre catene complementari si incontrano si forma una ramificazione, che migra nel momento in cui una coppia di basi di una delle due catene complementari viene staccata e sostituita da una coppia della seconda catena) generando una molecola di DNA con due incroci (intermedi di Holliday) • La replicazione del DNA sostituisce il segmento di DNA mancante dal punto in cui ha avuto origine la rottura della doppia elica. • Il taglio degli intermedi di collida da parte di nucleasi specializzare genera un prodotto ricombinante. Ricombinazione omologa (procarioti) Il sistema Ruv In E. coli, le proteine che stabilizzano e risolvono le giunzioni di Holliday (giunzione di Holliday: struttura mobile a croce composta da quattro filamenti di DNA. La mobilità è dovuta alla loro formazione tra sequenze omologhe, permettendo lo scorrimento del DNA. La risoluzione delle giunzioni consiste nella generazione di almeno due tagli nella struttura per riottenere due duplex lineari): • RuvA: riconosce la struttura della giunzione di Holliday legandosi a tutti e quattro i filamenti di DNA nel punto di crossing-over, sul quale la proteina forma due tetrameri che chiudono il DNA ai due lati. • RuvB: è una elicasi esamerica con attività ATPasica, che costituisce il motore per la migrazione della ramificazione. Gli anelli esamerici di RuvB si legano intorno a ciascun duplex di DNA a monte del punto di crossing-over. • Ruv C: è una endonucleasi che taglia le giunzioni di Holliday, risolvendo gli intermedi della ricombinazione. Una sequenza tetranucleotidica asimmetrica (ATTG) costituisce un punto caldo per RuvC, che può dirigere la risoluzione verso una coppia particolare di filamenti. È possibile che le proteine Ruv facciano parte di un resolvasoma, un complesso formato da enzimi che catalizzano sia la migrazione della ramificazione sia la risoluzione della giunzione. Modello mediato proteina RecA 2. SINE: (Short Interspersed Non-LTR Element) hanno un promotore per la polimerasi III e non codificano proteine, dipendono dall’attività dei LINE, non sono autonomi. Un esempio di SINE sono le sequenze Alu (circa 300 bp). Ne sono presenti fino a 1 milione di copie nel genoma umano (11%). Derivano da un piccolo RNA 7SL e sono dotate di coda poli(A). Sono più ricche in G+C di L1 e si localizzano prevalentemente nelle regioni a maggior densità genica. (corrispondenti alle bande cromosomiche G-negative). Un altro retrotrasposone non autonomo che usa l’apparato di L1 per trasporsi nel genoma è “SVA”: un elemento ripetuto composito (SINE+VNTR+ALU, VNTR sono DNA minisatellite). • Trasposoni a DNA: traspongono mediante un intermedio a DNA ed una trasposasi e si muovono con un meccanismo di “ taglia e incolla”. [In Drosophila i telomeri sono costituiti da elementi trasponibili (TART, HetA e TAHRE), TART è un elemento autonomo di 10654 bp, HetA è un elemento non autonomo di 6083 bp, è localizzato solo nell’eterocromatina, TAHRE (Telomeric Autonomous HetA-Related Element) è un elemento autonomo di 10463 bp] Trascrizione Trascrizione è la sintesi di un RNA a partire da uno stampo costituito da un filamento di DNA Il dogma centrale della biologia molecolare stabilisce che il flusso dell’informazione genetica consiste nel passaggio da: DNA (replicazione, riparazione, ricombinazione)→Sintesi RNA (trascrizione)→Sintesi proteica (traduzione) Il DNA è il depositario dell’informazione genetica, tramite la trascrizione l’informazione viene codificata in mRNA. La sequenza contenuta nell’mRNA viene tradotta in proteine grazie al processo di traduzione. • Siti selezionati di DNA vengono trascritti nei pre-mRNA • Il pre-mRNA subisce processo di maturazione in mRNA • mRNA vengono trasportati nel citoplasma • mRNA vengono tradotti in proteine dai ribosomi • Il polipeptide subisce processi di riarrangiamento RNA polimerasi Enzimi responsabili della trascrizione.(RNA polimerasi-DNA dipendenti, o RNA polimerai) Sono in grado di utilizzare un filamento di DNA come stampo sul quale sintetizzare una molecola di RNA (complementare) Procariotiche: I procarioti hanno un'unica RNA-polimerasi che sintetizza tutte le forme di RNA (rRNA, tRNA, mRNA). È composta da ciqnue subinità associate a formare un core enzimatico: • ααββ’ω = core • ααββ’ωσ = oloenzima della RNA polimerasi (enzima completo) il fattore σ è un polipeptide accessorio che permette il riconoscimento e legare le regione promotrice del DNA e iniziare la trascrizione nei siti appropriati. Aumenta l’affinità per i promotori e diminuisce l’’affinità per il DNA in generale. È detto anche “fattore σ housekeeping” perché inizia la trascrizione della maggio parte dei geni, fattori σ alternativi permettono il riconoscimento di promotori di geni specifici. Le subinità della RNA polimerasi batterica formano un canale interno carico positivamente a cui si lega al suo interno il DNA. L’enzima denatura il DNA separando i due filamenti in corrispondenza del sito di inizio, rendendo accessibile il filamento allo stampo di DNA. Inizia la sintesi in direzione 5’-3’, non richiedono un primer per iniziare la sintesi dell’RNA, non possiedono capacità di proofreading. Eucariotiche: RNA polimerasi nucleari eucariotiche • RNA polimerasi I: Sintesi RNA ribosomiali (28S, 18S, 5,8S) • RNA polimerasi II: Sinteri mRNA, RNA nucleari (snRNA, snoRNA), miRNA, RNA della telomerasi • RNA polimerasi III: Sintesi tRNA, rRNA 5S e snRNA U6 La RNA polimerasi eucariotica è costituita da 12 subunità (7 in più rispetto a quella procariotica). Sia quelle procariotiche che quelle eucariotiche condividono la stessa struttura fondamentale del core catalitico. Inizia la sintesi in direzione 5’-3’, non richiedono un primer per iniziare la sintesi dell’RNA, non possiedono capacità di proofreading. Promotore L’apparato promotore è l’insieme delle sequenze che permettono di avviare la trascrizione. I promotori si suddividono in due categorie, quelli contenenti e quelli non-contenenti le isole CpG (C citosina, p fosfato, G guanina: sequenze nucleotidiche, da 20-50 bp, ricche di coppie C-G). • Promotori con isole GpG: frequenti nei geni “housekeeping”, espressi in tutte le cellule • Promotori senza isole CpG: frequenti nei geni altamente regolati (che subiscono l’influenza di molti regolatori). In genere sono geni che gestiscono funzioni complesse. Le RNA polimerasi riconoscono promotori specifici: 1. La RNA-polimerasi I riconosce un apparato promotore formato da: • Nucleo promotore (core): ricco in GC, si estende da -45 a +20. A questo sito vi si lega un complesso formato da 4 subunità, la TBP (TATA binding protein) + 3 TAF (TBP-activating factor 1, 2, 3) • Elemento a monte del promotore (UCE, upstream control element): ricco in GC, che si estende da -180 a -107. Ad esso si lega la proteina UBF (upstream binding factor) responsabile del ripiegamento del DNA , è necessaria a portare l’UCE a contatto col gruppo promotore per attivare la RNA polimerasi I 2. La RNA-polimerasi II riconosce un apparato promotore formato da: • Nucleo promotore (core promoter), rappresentato da solo 2 o 3 dei seguenti 5 elementi: ■ BRE: sequenza situata a -35 dal punto di inizio; rappresenta l’elemento riconosciuto dal TFIID. ■ TATA box: sequenza posta a -25 dal punto di inizio. ■ Inr (Elemento iniziatore) : sequenza situata a ridosso del sito d’inizio ella trascrizione, tra le posizioni –3 e +5. ■ DPE (downstream promotor element): sequenza a valle del sito d’inizio, a +30. ■ MTE (motif ten element) situato tra +18 e +27. Interagisce con l’Inr per l’attivazione del TFIID. • Elementi regolatori prossimali: posti tra -50 e -200 dal sito di inizio della trascrizione. Vengono riconosciuti e legati dagli attivatori ed hanno la funzione di stabilizzare l’apparato di inizio della trascrizione e di modulare la reazione di inizio. Es: ■ CCAAT-box (generalmente localizzata a -80/-100) ■ GC-box (GGGCGG, generalmente a -40/-70) • Elementi regolatori distali: sono posti ad oltre -100.000 dal sito di inizio della trascrizione. Quando sono attivati, si portano sempre in prossimità del gene, grazie all’attività dei TF. Gli elementi più noti sono: ■ Enhancers e silencers: sequenze di circa 500 bp che attivano o reprimono il promotore, mediante l’interazione dei TF(transcription factors). Solitamente sono dislocati a notevole distanza dal promotore (a monte o a valle di esso), a volte possono anche situarsi all’interno del gene da trascrivere. ■ Insulators: sequenze molto grandi di DNA (da 300 a 2000 bp) che hanno la funzione di: • Confinare ed isolare le varie regioni dell’eucromatina • Impedire eventuali cross-reazioni attivanti da parte di geni vicini (mediante il blocco dei silencers e degli enhancers). ■ Locus di controllo delle regioni (LCR, Locus control regions): sito regolatore situato molto lontano dal promotore ed indipendente dagli enhancers. Ha la funzione di attivare un promotore aprendo i nucleosomi del promotore (modificazione epigenetica), in modo da renderlo accessibile ai TF. Spesso gli LCR sono tessuto- specifici. ■ Regioni di attacco alla matrice (MAR, Matrix attachment regions), sequenze di DNA alle quali si lega la matrice nucleare (una fitta rete proteica che fa parte del nucleo-scheletro e che regola la disposizione della cromatina all'interno del nucleo). Servono per organizzare la cromatina in domini (regioni) e giocano un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. I geni attivi sono associati alle MAR nelle cellule dove sono espressi, mentre non sono associati alle MAR nelle cellule dove non sono espressi. 3. La RNA-polimerasi III può avere 4 tipi di apparato promotore: • Geni strutturali: codificano per enzimi. Sono trascritti in un unico mRNA dalla RNA polimerasi. (l’mRNA contiene l’informazione per più di un polipeptide: policistronico). • Promotore: sito di legame per la RNA polimerasi. • Operatore: sequenza di regolazione. Funge da sito di legame per una proteina regolatrice (generalmente un repressore). È localizzata accanto o in sovrapposizione al promotore. • Gene regolatore: codifica per la proteina con funzione di repressore. I tipi di operone: • Operone inducibile: la presenza del metabolita chiave induce la trascrizione dei geni strutturali. Regolati da una proteina repressore che, in assenza del metabolita, agisce come induttore. • Operone reprimibile: il repressore è attivato e si lega al DNA in presenza di un fattore specifico, corepressore. Il complesso proteina repressore e corepressore reprima la trascrizione del’operone. • Operoni regolati da una proteina attivatore Operone lac Gruppo di geni che regola la produzione degli enzimi necessari per metabolizzare il lattosio nelle cellule batteriche: • Permeasi, codificata dal gene lacY • β-galattosidasi, codificata dal gene lacZ • tiogalattoside acetiltransferasi, codificata dal gene lacA In condizioni normali, i batteri (es. E.coli) ricavano energia dal metabolismo del glucosio. L’operatore sull’operone si trova legato a una proteina repressore che impedisce alla RNA polimerasi di effettuare la trascrizione. Quando il lattosio diventa presente, viene trasformato in allolattosio che è in grado di legare il repressore lac. Tramite il legame con l’induttore (l’allolattosio), il repressore si stacca dall’’operatore e la RNA polimerasi trascrive i tre geni strutturali. La trascrizione degli enzimi permette il metabolismo del lattosio. Repressione da catabolita. L’operone lac è anche regolato da un controllo positivo. (livelli di glucosio) Se sono presenti sia lattosio che glucosio, la quantità di trascritti dell’operone lac sarà a bassa efficienza. La concentrazione di cAMP è correlata alla presenza di glucosio. A scarsa presenza di glucosio, sarà presente un alta concentrazione di cAMP che permette alla proteina CRP (proteina recettore del cAMP) di formare un complesso con il cAMP che si lega a una regione vicino al promotore aumentando l’efficienza della trascrizione. Operone trp Operone reprimibile generalmente attivo. Il repressore non è capace di legare il DNA da solo ma necessita di un corepressore (triptonfano). In assenza di triptofano, la RNA polimerasi può trascrivere i geni strutturali dell’operone trp, consentendo la produzione di enzimi che sintetizzano il triptofano. L’aumento della concentrazione del triptofano determina la formazione del complesso triptofano repressore che si lega all’operatore e blocca la trascrizione. L’ operone trp è costituito da una regione leader (che codifica per un piccolo peptide ricco in triptofano di 14aa) e da trpE che codifica per un enzima della sintesi del triptofano. Le due regioni sono separate da un attenuatore, un terminatore intrinseco che costituisce una barriera per Ia RNA polimerasi solo in caso di abbondanza di trp. La traduzione della sequenza leader rappresenta il sensore della presenza del triptofano. In sua assenza, il ribosoma si ferma sui codoni che richiedono il tRNA per il triptofano, questo impedisce il folding dell’attenuatore e di formare la forcina del terminatore intrinseco. In sua presenza, il ribosoma puo’ procedere e questo consente la formazione della forcina che funge da terminatore intrinseco. Come conseguenza, l’RNA polimerasi si stacca e la trascrizione dell’operone si interrompe. Trascrizione negli eucarioti Sintesi mRNA Complesso molecolare per la trascrizione dell’mRNA: (in vivo, il complesso pre-inizio consta di: RNA-Pol II + GTF + attivatori trascrizionali + complesso del Mediatore + complessi modificatori e di rimodellamento della cromatina) Inizio della trascrizione • Fattori generali di trascrizione (General Transcription Factors, GTF o TF). Gruppo di 6 proteine (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH) Funzione di facilitare l’assemblaggio del macchinario basale di trascrizione sul promotore essenziale (core) (TFII, Transcription Factor of RNA-polymerase II). Fattori di trascrizione: Vengono classificati in: • Generali (o ubiquitari): si legano al core del promotore • Tessuto-specifici: si legano a a siti regolativi di specifici geni e possono essere attivatori o inibitori della trascrizione. I fattori di trascrizione contengono almeno due domini: • Dominio di legame al DNA • Motivo zinc-finger: lo ione zinco di ciascun finger interagisce con due cisteine e due istidine. I residui di cisteina fanno parte di un foglietto β mentre i due residui di istidina fanno parte di un α elica. In genere contengono dita distanziate e indipendenti tra loro in modo da estendersi all’interno dei solchi maggiori di DNA. • Motivo helix-loop-helix: costituitoo da due segmenti ad α elica separati da un ansa interposta. Il dominio HLH è spesso preceduto da amminoacidi fortemente basici le cui catene positive prendono contatto con il DNA. In genere sono presenti in forma dimerica (es MyoD, avvia il differenziamento delle cellule muscolari). • Motivo leucine zipper:i residui di leucina sono ogni sette amminoacidi lungo un tratto ad α elica. Due α eliche sono in grado di unirsi a formare una struttura avvolta a spirale. • Dominio di attivazione Assemblaggio pre-initiation complex (PIC) • TFIID, grosso complesso proteico formato da 12 subunità (tra i quali la subunità TBP (TATA binding protein), che si lega a livello del TATA-box), piega di circa 80° la sequenza TATA esponendo alcune sue regioni ai fattori TFIIA e TFIIB. • TFIIA e TFIIB si legano e stabilizzano il legame di TFIID. • La RNA-polimarasi II si lega assieme a TFIIF • TFIIE, TFIIJ (che è una subunità del TFIIA) e TFIIH si legano per ultimi. TFIIH ha tre (di 10) subunità ad attività enzimatica: • 2 con attività ATPasica (attività elicasica, rende accessibile il filament stampo) • Una ad attività chinasica (separazione e rilascio del promotore) L’inizio della trascrizione è associato con la fosforilazione da parte di TFIIH dei residui di serina in posizione 5 di ciascuna ripetizione eptapeptidica del CTD (dominio carbossi-terminale della subunità maggiore della RNA Polimerasi II, Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser, 52 nell’uomo) La fosforilazione promuove la separazione dell’apparato trascrizionale dai fattori di trascrizione generali e/o dal promotore del DNA. Allungamento • Rilascio GTF • Richiamo dei fattori di allungamento: ■ TFIIS: aiuta a mantenere la processività della RNA polimerasi, riduce le pause, aiuta nella correzione degli errori attuata dalla polimerasi, stimolandone l’attività ribonucleasica intrinseca ■ Proteine famiglia ELL: eliminano le soste temporanee della Pol II ■ P-TEFb: Chinasi P-TEFb: favorisce l’allungamento fosforilando: • la serina in posizione 2 del CTD • SPT5 (fattore di allungamento) • TATT-SF1 (fa.ore di allungamento) • Richiamo di enzimi da parte della coda CTD fosforilata della RNA Pol II Terminazione I meccanismi di terminazione dipendono dalla RNA Polimerasi in analisi 1. RNA Polimerasi I: Richiede una sequenza di 18bp e una DNA-binding protein 2. RNA Polimerasi II: non ha terminatori, la terminazione e’ strettamente correlata ai processi di maturazione dell’mRNA e puo’ avvenire 0.5-2 Kb a valle del sito di poliadenilazione • riconoscono il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione • Avvinano i siti quando occorre • catalizzano il taglio e la giunzione dell'RNA. Per tali funzioni sono essenziali le interazioni RNA-RNA, proteina-RNA e proteina-proteina. Proteine ausiliari dello splicing: proteine non complessate con i snRNA • fattore ausiliario U2 (U2AF): riconosce il segmento polipirimidinico e il sito di splicing 3', nella fase iniziale dello splicing aiuta il legame di BBP al punto di ramificazione. • BBP (BBP, branch-point binding protein): proteina che si lega al punto di ramificazione che viene sostituita da snRNP U2. Splicing 1. Splicing normale: interviene un complesso macromolecolare detto spliceosoma composto da proteine e particelle ribonucleiche snRNA. Ciascuno degli snRNA si lega a diverse proteine formando gli snRNP (ribonucleoproteine nucleari). Gli snRNP, si legano al pre-mRNA in 3 punti: •.d. Zona di confine introne-esone prossimale (sito di splicing 5’) •.e. Zona di confine esone-introne distale (sito di splicing 3’) •.f. Sito branch (punto di ramificazione, intermedio tra i due). Processo di splicing: assemblaggio spliceosoma • snRNP U1 riconosce il sito di splicing 5’ • Una delle subunità di U2AF si lega al segmento polipirimidinico, l'altra si lega al sito di splicing 3'. • La prima subunità interagisce con BBP e la aiuta a legarsi al punto di ramificazione. (Questo arrangiamento di proteine e RNA è chiamato complesso precoce E). • A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione, con l'aiuto di U2AF, e sostituisce BBP. (Questo arrangiamento è chiamato complesso A) • snRNP U2 si lega al pre-mRNA in modo da far sporgere dalla regione circostante un residuo di adenosina. Questa A non è più accoppiata e diventa disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'. • Riarrangiamento del complesso A, per l'avvicinamento di tutti e tre i siti di splicing, con l'ingresso della tripla snRNP U4\U6*U5 il complesso A diventa complesso B. snRNP U4 e U6, assieme a snRNP U5, si uniscono al complesso. (tripla snRNP U4\U6*U5), le snRNP U4 e U6 sono tenute insieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro corrispettivi snRNA, la snRNP U5 è legata attraverso interazioni proteina-proteina. • U1 lascia il complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Processo di splicing: catalisi • U4 viene rilasciato dal complesso permettendo ad U6 di interagire con U2 (complesso C), ciò produce il sito attivo (il riarrangiamento avvicina all'interno dello spliceosoma i componenti che assieme formano il sito attivo, assicurando che l'RNA substrato sia posizionato correttamente, rendendo il sito attivo disponibile solo nei siti di splicing corretto). • Sono messi in prossimità il sito di splicing 5' del pre-mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione di transesterificazione. • La reazione tra i siti di splicing 5' e 3', è supportata dalla snRNP U5, che permette di avvicinare i due esoni. • Avviene rilascio dell'mRNA e delle snRNP. 2. Splicing alternativo: processo attraverso il quale un gene può produrre mRNA differenti per ottenere diversi prodotti proteici derivanti lo stesso gene. (isoforme) Nell’uomo, lo splicing alternativo interessa circa il 60% dei geni ed è basato sulla possibilità di includere o meno determinati esoni/introni nel trascritto finale • Self-splicing: l’introne stesso è dotato della capacità di compiere lo splicing viene. Rappresenta una forma primitiva di splicing, non richiede l’intervento di altri RNA (come gli snRNA) e/o proteine (es. spliceosoma), • Trans-splicing: il processo di può avvenire tra due molecole diverse di pre-mRNA. È poco frequente negli eucarioti superiori. Traduzione La sintesi proteica o traduzione è il processo mediante il quale l’informazione trascritta in mRNA viene tradotta per la codifica di polipeptidi. Nel processo di sintesi proteica sono necessari: • Ribosomi • RNA messaggero: ■ L'mRNA monocistronico: (eucarioti) porta l'informazione per un solo gene. • sequenza di Kozak: corta sequenza interna dell'mRNA (ACC AUG G) riconosciuta dal complesso di pre-inizio della traduzione (comprendente la subunità ribosomale minore 40S) mentre questo scansiona l'mRNA a partire dal cappuccio al 5', dopo che è avvenuto il legame fra la subunità ribosomale 40S e tale sequenza, la subunità ribosomiale maggiore può completare il complesso d'inizio consentendo l'avvio della sintesi proteica. All'interno della sequenza di Kozak è contenuto il codone d'inizio AUG, codificante per la metionina. ■ l'mRNA policistronico: (procarioti) porta l'informazione per più geni (il trascritto di mRNA corrispondente è in grado di tradurre per più catene polipeptidiche diverse, in sequenza). • sequenza di Shine-Dalgarno: regione di ogni mRNA procariotico grazie alla quale un ribosoma riesce ad ancorarsi ad esso in modo da iniziare la traduzione nel corretto reading frame. Ricca in purine, contiene sempre la sequenza AGGAGG, sita fra i 3 e i 10 nucleotidi a monte del codone di inizio della traduzione, che per appaiamento fra basi complementari, riconosce una regione ricca in pirimidine al terminale 3' dell'rRNA 16S della subunità ribosomale minore (la 30S), la sequenza UCCUCC, sequenza anti- Shine-Dalgarno. Dopo che le due sequenze sono appaiate può formarsi il complesso d'inizio completo 70S (con il legame al complesso d'inizio incompleto 30S da parte della subunità ribosomale maggiore 50S). • RNA transfer Inizio (procarioti) 1. La traduzione inizia con l’associazione della subunità ribosomiale 30S con l’mRNA a livello del codone di inizio AUG, che richiede l’intervento dei fattori di inizio IF1 e IF3: 1.a. IF1 (fattori di inizio) promuuove l’attacco della subunità 30S e può impedire che l’aa-tRNA si inserisca nel sito errato del ribosoma 1.b.IF3 impedisce che la subunità maggiore (50S) si leghi prematuramente alla subunità 30S, facilitando l’entrata dell’aa-tRNA iniziale. La subunità ribosomiale 30S si lega all’mRNA a livello del codone di inizio AUG per l’interazione tra sequenze nucleotidiche complementari dell’rRNA e dell’mRNA. 2. Il formilmetionil-tRNAfMet si associa on il complesso mRNA-subunità ribosomiale 30S, legandosi all’IF2-GTP (IF2 è una proteina che lega il GTP che è richiesta per legare il primo amminoacil- tRNA). 3. La subunità 50S si lega al complesso, il GTP viene idrolizzato e l’IF2-GDP viene rilasciato. Il tRNA iniziatore entra nel sito P del ribosoma, mentre i tRNA successivi entrano nel sito A. Inizio (eucarioti) La sintesi proteica inizia sempre dall'N-terminale di una proteina in formazione verso il suo C-terminale. 1. La fase di inzio della traduzione avviene con l’unione di due complessi: 1.a.Compesso pre-inizio 43S: contenente la subunità 40S legata a vari fattori di inizio (nell’uomo sono presenti 12 fattori di inizio eIF) e al tRNA iniziatore (legato alla metionina, interagisce prima con la subunità 40S che con l’mRNA, si inserisce nel sito P della subunità minore in associazione con eIF2-GTP). 1.b.Complesso dell’mRNA: mRNA legato a un altro gruppo di eIF Il legame è mediato da un’interazione tra eIF3 sul complesso 43S e eIF4G sul complesso dell’mRNA. 2. Il complesso 43S viene indirizzato verso l’mRNA con l’aiuto di eIF legati al complesse dell’mRNA 1.c.eIF4E si lega al cap all’estremità 5’ dell’mRNA 1.d.eIF4A si muove lungo l’estremità 5’ dell’mRNA rimuovendo le regioni a doppio filamento 1.e.eIF4G collega l’estremità 5’ con il cap e la coda di poli(A) all’estremità 3’ 3. Il complesso 43S è legato all’estremità 5’ dell’mRNA, scorre fino a raggiungere l’appropriato codone di inizio AUG. 4. Idrolisi del GTP legato a eIF2, e la subunità maggiore (60S) si lega al complesso 5. La formazione del ribosoma 80S richieste l’idrolisi del GTP legato a eIF5B. 6. L’idrolisi del GTP e la formazione del ribosoma completo porta al rilascio di tutti gli eIF. 7. L’aa-tRNA rimane legato al codone di inizio AUG nel sito P del ribosoma Allungamento (procarioti ed eucarioti) Selezione dell’amminoacido • Metafase • Anafase • Telofase ■ Citocinesi (o citodieresi ): divisione del citoplasma del nucleo e degli organelli cellulari. In base alla capacità di dividersi, le cellule possono essere suddivise in: • Labili: elementi cellulari con forte attività proliferativa che compiono il ciclo cellulare in modo continuo. • Stabili: cellule che non si dividono in condizioni normali ma che in presenza di determinati stimoli possono uscire dalla fase G0 e rientrare nel ciclo (es. epatociti) • Perenni: elementi cellulari che entrano definitivamente in fase G0 e che non possono più dividersi (es. neuroni). Regolazione del ciclo cellulare Il passaggio da una fase all’altra del ciclo cellulare controllato attraverso dei punti di controllo (checkpoint), che impediscono l’avanzamento del ciclo cellulare se i requisiti necessari non vengono soddisfatti. I tre punti di controllo principali: • G1/S: (punto di restrizione) è il primo punto di controllo del ciclo cellulare, collocato alla fine della fase G1. Superandolo, la cellula inizia a duplicare il proprio DNA entrando nella fase S. Per il superamento del controllo è essenziale un ambiente extracellulare ed intracellulare favorevole. Nel lievito a fissione è detto punto di START, nei mammiferi è indicato come punto di restrizione, passato tale checkpoint la cellula è irreversibilmente indirizzata alla replicazione del proprio DNA. e, passato questo, la cellula è obbligata a duplicare il DNA. • G2/M: viene verificato che la cellula abbia raggiunto le dimensioni idonee e vi siano le componenti cellulari necessarie per completare la divisione. È posto alla fine di G2. Il suo superamento permette l'entrata nella fase M ed è permesso da un ambiente favorevole e dall'avvenuta replicazione del DNA. • M (metafase): (transizione metafase-anafase) è il terzo punto di controllo viene controllato il corretto allineamento dei cromosomi al fuso mitotico e la loro corretta connessione con il fuso mitotico prima di procedere con la segregazione in anafase. Cdk e cicline Le chinasi dipendenti da ciclina (Cdk, Cyclin-dependent kinase) e le cicline sono le due classi di proteine che costituiscono il sistema di controllo del ciclo cellulare. Le cicline sono proteine regolatorie (subunità regolatorie) che legano le Cdks (subunità catalitiche) per formare un complesso attivo ciclina-Cdk. L'attività delle Cdk è ulteriormente regolata grazie all’attivazione o all'inibizione mediata da fosforilazione e da piccole proteine (p15, p18, p19, p21, e p27), chiamati inibitori dell'attività delle Cdk (inhibitors of cdk activity, CKI). Sono in grado di legarsi alle cicline, alle Cdks oppure al complesso Cdks-cicline. Le Cdk sono proteine serina-treonina chinasi, attivate in modo specifico da un tipo corrispondente di ciclina, mentre quando non sono coniugate a questa restano inattive e non possono fosforilare proteine a valle. Fosforilano substrati coinvolti nelle varie fasi del ciclo: ■ tra G1 ed S: fosforilano gli istoni e permettono la compattazione dei cromosomi. ■ Fosforilano la lamina nucleare, disassemblandola e rompendo l’involucro nucleare. ■ Fosforilano le proteine del citoscheletro, che servono al macchinario della divisione. Le cicline sono le principali proteine regolatrici delle Cdk e la loro sintesi varia in base alla fase del ciclo cellulare. Esistono quattro classi di cicline: le cicline G1, G1/S, S e G2/M. Le ultime tre sono presenti in tutte le cellule eucariotiche. I complessi derivanti dall'unione delle cicline con le Cdk corrispondenti prendono lo stesso nome (G1-Cdk, G1/S-Cdk, S-Cdk e G2/M-Cdk). • Le cicline G1: sono normalmente trascritte durante la fase G1 del ciclo cellulare, sono anche chiamate cicline D e nei mammiferi ne esistono tre diversi tipi: ciclina D1, D2 e D3. Le proteine Cdk partner a cui si uniscono sono Cdk4 e Cdk6. La loro funzione è quella di controllare l'attività delle cicline G1/S. • Le cicline G1/S: sono ampiamente trascritte nella fase G1 tardiva e in questa fase si legano alle Cdk potendo così oltrepassare il punto di controllo. In fase S i livelli di questa ciclina crollano. Nei vertebrati questa ciclina è la E e si lega a Cdk2. • Le cicline S: vengono trascritte già nella fase G1 tardiva ma raggiungono la massima concentrazione non appena la cellula ha oltrepassato il punto di controllo. Perdurano sino alla transizione da metafase ad anafase della fase M del ciclo, dopodiché i livelli crollano bruscamente. Nei vertebrati il tipo di ciclina è la A e si lega a Cdk1 e Cdk2. Queste cicline stimolano la duplicazione dei cromosomi e partecipano alla regolazione delle prime fasi della mitosi. • Le cicline G2/M: vengono trascritte a partire dall'inizio della fase G2 sino all'anafase della fase M, dopodiché crollano in favore delle cicline G1. La ciclina di questo tipo nei vertebrati è la B e si lega a Cdk1. Queste cicline stimolano l'ingresso nella mitosi. Una Cdk può esistere in tre stati, uno inattivo, uno parzialmente attivo e uno completamente attivo. • Nello stato inattivo la Cdk ha legato ATP in un dominio della proteina, mentre il suo sito attivo è bloccato da una regione specifica della proteina stessa detta ansa T. • La ciclina specifica per la Cdk si lega, l'ansa T viene spostata e il sito attivo viene esposto, così la ciclina si lega a Cdk, attivandola parzialmente. • Interviene una protein chinasi CAK (Cdk-activating kinase) che fosforila la Cdk su un residuo di treonina dell'ansa T e le fa cambiare conformazione, attivandola completamente e permettendole di fosforilare proteine a valle (diverse per ciascun complesso Cdk-ciclina). In questo compito sembra essere aiutata dalla stessa ciclina che lega. L'attività di un complesso Cdk-ciclina può essere inibita da una chinasi detta Wee1, questo tipo di regolazione è particolarmente attivo nei confronti dei complessi M-Cdk.: • Wee1 fosforila due residui posti nel sito attivo della Cdk, inibendola. • I fosfati aggiunti possono essere rimossi dalla fosfatasi Cdc25, riattivando la Cdk. Un complesso Cdk-ciclina può essere inibito da una classe di otto proteine nota come CKI (Cdk-dependent kinase inhibitor proteins), in particolare i complessi Cdk G1/S e Cdk-S. • Una delle CKI si lega al complesso Cdk-ciclina (si legano in particolare: a Cdk, alla ciclina, al dominio legante ATP di Cdk) modificando la conformazione del sito attivo così da inattivarlo. I complessi SCF e APC/C Per poter oltrepassare il terzo punto di restrizione, posto nella transizione tra metafase ed anafase della mitosi, è necessaria la proteolisi di alcune proteine precedentemente attive. Ci sono due complessi che aiutano a regolare i sistemi di controllo e sono: • il complesso SCF : è un'ubiquitina-ligasi particolarmente attiva durante la fase G1 tardiva del ciclo cellulare, ma è attiva in tutte le sue fasi. ■ SCF si lega ad alcune CKI precedentemente fosforilate da chinasi in siti specifici ■ Ubiquitina le CKI con l'aiuto degli enzimi ubiquitinanti E1 ed E2. (Una proteina F- box si lega al complesso SCF, riconosce la CKI fosforilata, vi si lega e mediante il legame segnala a SCF la necessità di ubiquitinarla). ■ Aggiunta una catena di ubiquitina, che è un segnale di degradazione, la CKI viene trasportata nel proteosoma dove viene demolita. (SCF non è in grado di ubiquitinare CKI non fosforilate). • il complesso APC/C: detto anche ciclosoma, è anch'esso un'ubiquitina ligasi, ma è attiva in particolare durante la fase M del ciclo cellulare, regola il terzo punto di controllo del ciclo cellulare. È detto fattore di promozione dell’anafase e può legare rispettivamente Cdc20 o Cdh1 permettendo la selezione del substrato. APC resta attivo anche durante l'inizio di G1 per poi essere inattivato nella fase G1 tardiva. ■ APC/C ubiquitina la securina (destinandola al proteosoma), una proteina che collabora nel tenere unite le coppie di cromatidi fratelli durante la metafase ■ APC/C, attivato dalla subunità Cdc20 che vi si lega (o da Cdh1 verso la fine della mitosi), con l'aiuto degli enzimi ubiquitinanti E1 ed E2 agisce sulle cicline S e sulle cicline M (ciclina A e ciclina B), ubiquitinandole e destinandole alla distruzione, (vengono inattivati i complessi S-Cdk e M-Cdk, e ne deriva il crollo della loro attività tra metafase e anafase). ■ Le proteine che erano state fosforilate da S-Cdk, vengono defosforilate da fosfatasi e cessano la loro attività. Regolazione della fase S Durante la fase S il genoma della cellula viene replicato al fine di ottenerne due copie identiche. La preparazione della cellula per la replicazione avviene prima dell'inizio della fase S, già nella fase G1 tardiva, per fare in modo che la duplicazione dei cromosomi avvenga una sola volta. Un complesso di proteine iniziatrici, nell'insieme, complesso prereplicativo (pre-RC, pre-Replication Complex) si lega alle origini di replicazione, che sono in numero variabile in ciascun cromosoma. (Solo le origini di replicazione in cui in fase G1 è legato un complesso prereplicativo possono poi essere funzionali.) • Fase G1 tardiva: modificare l’avvolgimento del DNA e la sua attività è promossa dalla fosforilazione delle subunità costituenti da parte di M-Cdk. Media i legami incrociati intramolecolari per creare delle anse nel DNA nel processo di condensazione dei cromosomi. • Coesine: formano legami incrociati tra due cromatidi fratelli. I cromosomi sono l’ordine più elevato di condensazione della cromatina (1.400 nm di spessore), sono depositari del DNA genomico totale e contengono sia regioni a DNA ripetitivo, trascrizionalmente silenti, sia unità funzionali trascrivibili, i geni. La condensazione della cromatina avviene in profase. Apparato mitotico Il corretto funzionamento della mitosi è garantito da un complesso costituito da microtubuli, detto apparato mitotico: si forma nella prima fase della mitosi (e della meiosi) (profase). è una struttura del citoscheletro degli eucarioti la cui funzione è quella di separare i cromosomi e tutto il materiale della cellula madre durante la divisione cellulare per dar origine alle cellule figlie. È costituito da: • Microtubuli: • Si formano a partire da centri di organizzazione microtubulare (MTOC) • Strutture tubulari dal diametro di 25nm • Sono assemblati da proteine di tubulina • La tubulina costituente è di due tipi: α e β tubulina, che si organizzano in eterodimeri formando i protofilamenti • Hanno un’estremità più e una meno. • Generalmente, l’estremità meno serve all’ancoraggio e quella più per la crescita del microtubulo • Centrosoma: piccola struttura costituita da tubuli proteici situata vicino al nucleo in interfase, formata da due centrioli. La duplicazione del centrosoma precede la mitosi, èè avviata da G1/S‐Cdk e S-Cdk. Lo sviluppo del centrosoma segue un ciclo a sé stante. • Centriolo: struttura cilindrica cava (lunga circa 0,5 micron e larga 0,2) la cui parete è formata da nove triplette di microtubuli, detti microtubulo A (13 protofilamenti), B (10 protofilamenti) e C (10 protofilamenti) incastrati uno nell'altro, è dotato di appendici all'estremità distale. I centrioli si trovano in coppia e solitamente sono disposti tra di loro a formare un angolo retto. Assieme ad un materiale elettrondenso che li circonda, chiamato materiale pericentriolare (PCM), costituiscono il centro organizzatore dei microtubuli (MTOC). Sono coinvolti nell'assemblaggio del fuso mitotico, (senza enucleare direttamente i microtubuli). I microtubuli si sviluppano dalla γ-tubulina presente nella struttura proteica denominata γ-TuRC (γ-Tubulin Ring Complex) situata nei centrosomi. Il fuso mitotico è costituito da tre tipi di microtubuli che rivolgono tutti l’estremità – verso il centrosoma e l’estremità + sul versante opposto. Il ciclo del centrosoma • In fase G1: il centrosoma contiene una singola coppia di centrioli . • In fase S: si formano dei procentrioli adiacenti ai centrioli parentali, così diventano visibili due coppie di centrioli entro il centrosoma. • In fase G2: i centrioli figli continuano a crescere fino alla mitosi • Durante la mitosi: il centrosoma si divide e ciascuna coppia di centrioli diventa parte del proprio centrosoma. Fasi della mitosi 1. Profase: la cromatina si condensa formando i cromosomi mitotici compatti. I cromosomi sono costituiti da due cromatidi fratelli uniti a livello del centromero. Il citoscheletro si disassembla e si forma il fuso mitotico. Il complesso del Golgi e il RE si frammentano e l’involucro nucleare si disperde. 2. Prometafase: i cinetocori vengono attaccati dai microtubuli del fuso che li spostano. Lo spostamento è determinato da un processo chiamato congressione. 3. Metafase: i cromosomi si allineano sul piano equatoriale della cellula dando origine alla piastra metafasica. Tale disposizione permette ai cromosomi di essere separati nei due cromatidi di cui sono costituiti. 3.a.Checkpoint: transizione metafase-anafase 4. Anafase: i cromatidi si separano a livello dei cinetocori e si muovono verso i poli opposti della cellula grazie all’azione combinata di cinetocoro e dei microtubuli del fuso. 5. Telofase: i cromatidi arrivano ai poli opposti della cellula. Si riforma la membrana nucleare e i cromosomi tornano alla forma despiralizzata tipica dell’interfase. Il fuso mitotico si disassembla. Conclusione della fase M: 6. Citocinesi (o citodieresi) : un anello di fibre actiniche, intorno all’equatore della cellula, si contrae fino a provocare una strozzatura che dividerà la cellula in due cellule figlie, ciascuna con un nucleo proprio. Meiosi Ogni cellula contiene due copie di ogni cromosoma, definiti cromosomi omologhi, uno di origine paterna e uno di orgine materna. Per preservare lo stato di diploidia è necessario che le cellule germinali possiedano un corredo cromosomico aploide. Il significato funzionale della meiosi consiste nella riduzione del corredo cromosomico producendo gameti aploidi. La meiosi consta di due successivi divisioni dette meiosi I e meiosi II: • Meiosi I: è detta riduzionale in quanto dimezza la quantità di cromosomi • Meiosi II: è detta equazionale perché mantiene inalterato il numero di cromosomi ottenuti dopo la prima divisione. Entrambe le devizioni meiotiche presentano le fasi descritte per la mitosi. Meiosi I •.1. Profase I: la cromatina si condensa e i cromosomi omologhi si appaiano in un processo detto sinapsi. Sono coinvolti quattro cromatidi (due per ogni omologo) che formano una struttura bivalente, le tetradi. Lo scambio di tratti di DNA viene dettoo crossing-over (o ricombinazione omolog). Avviene grazie all’appaiamento dei cromosomi omologhi, i punti di contatto in cui avviene la ricombinazione sono detti chiasmi. Presi due geni, la ricombinazione non può essere sempre rilevata perché questa può venire all’esterno dei due loci considerati. La profase I è suddivisa in varie sottofasi: •.a. Leptotene: il materiale genetico si condensa a formare strutture bastoncellari in forma di filamenti sottili, allungati, non scissi longitudinalmente. •.b. Zigotene: avviene la sinapsi dei cromosomi omologhi a formare una struttura denominata bivalente (o tetrade o duplex). L'appaiamento dei cromosomi omologhi avviene grazie ad una struttura submicroscopica proteica, il complesso sinaptinemale. •.c. Pachitene: precoce, in cui si completa l'appaiamento degli omologhi, e avanzato, in cui i cromosomi si accorciano, si inspessiscono e avviene il crossing-over. •.d. Diplotene: i cromosomi omologhi di ciascuna tetrada cominciano a separarsi (desinapsi), soprattutto a livello del centromero, per la progressiva scomparsa del complesso sinaptinemale. I due cromatidi di ciascuna coppia di omologhi restano ancora in contatto a livello dei chiasmi chiasmi. •.e. Diacinesi: i cromosomi continuano a condensarsi e gli omologhi a separarsi tra loro. •.2. Prometafase I: scompaiono il nucleolo e l’involucro nucleare, si sviluppa il fuso. Tali fibre agganciano i cromosomi mediante il cinetocore. •.3. Metafase I: i microtubuli del fuso agganciano i cinetocori e le coppie di omologhi si allineano lungo il piano equatoriale. •.4. Anafase I: i cromosomi oomologhi si separano ma ognuno resta costituito da due cromatidi (a differenza della mitosi) e migrano versoo i poli della cellula. •.5. Telofase I: analoga alla telofase mitotica, i due nuclei ricevono un contenuto dimezzato di cromosomi rispetto alla cellula parentale che si trovano in forma di due cromatidi fratelli. Segue la citodieresi. Meiosi II 1. Profase II: l’involucro nucleare scompare e si forma il fuso. 2. Metafase II: i cromosomi si dispongono sul piano equatoriale della cellula. 3. Anafase II: separazione dei due cromatidi, vengono spostati verso i poli della cellula. 4. Telofase II: de spiralizzazione dei cromosomi e riformazione dell’involucro nucleare.