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Biochimica Applicata
Sistemi enzimatici implicati nella decoibilizzazione della cellulosa (fibre di betaglucani) sono multi-enzimatici (eso/endoglucanasi, betaglucosidasi) in quanto la lignocellulosa è estremamente eterogenea, composta da diversi tipi di polimeri. Polimeri della cellulosa: glucani → sisremi enzimatici: glucanasi Molte cellulasi sono enzimi multidominio e tra i domini, oltre quello catalitico, è molto frequente il CBM (Carbohydrate Binding Domains/Modules) , con fortissima affinità per la cellulosa. Probabilmente hanno la funzione di orientare il sito catalitico verso la fibra di cellulosa e quindi di farlo funzionare più correttamente oltre a molte altre (cellulasi si attacchino irreversibilmente alla cellulosa – si staccano solo con detergenti ionici e non staccandosi aumentano in numero di enzimi attaccati alla cellulosa). La capacità d’interazione è dovuta a una superficie/striscia di aa idrofobi, che si sistemano come un pettine e sembra possano denaturare le fibre della cellulosa. Nelle fibre di cellulosa questi domini hanno anche la funzione di denaturare la cellulosa separando le singole fibre e permettendo a sito catalitico di attaccare. Tutte queste funzioni non sono valide per tutti i domini CBM. I CBM sono molto diversi tra loro, possono legarsi a vari substrati (pectina, amilosio, diversi poli- saccaridi, cellulosa, ecc.), quelli che legano la cellulosa cristallina sono un tipo solo di CBM. Tra i vari domini CBM/CBD sono presenti i LINKERS , che spaziano i CD (domini catalitici) dai CBM. I linker hanno dai 20 ai 50 aa, con struttura più o meno flessibile che dà mobilità o me no al dominio catalitico. Alcuni linker sono ricchi in Pro (rigidità alla struttura proteica) oppure aa più piccoli come Gly e Ala che danno flessibilità. Le cellulasi derivanti soprattutto di funghi aerobi (organismi eucarioti) sono enzimi fortemente gli- cosilati: questa modificazione permette di aumentare rigidità (zuccheri creano ingombro sterico) e quindi il linker può anche non essere più flessibile come all'inizio.
ENZIMI ACCESSORI
Oltre alle cellulasi sono presenti altre classi di enzimi/proteine di cui fino a 10 anni fa non si sapeva l'esistenza. Le ESPANSINE MICROBICHE (swollenine – swollen= far gonfiare) sono enzimi struttural- mente simili alle espansine prodotte dalle piante, con funzione di rendere flessibile la parete cellu- lare vegetale solitamente rigida. Le swollenine sono enzimi senza attività idrolitica, specializzati nello scompaginare la parete cellu- lare, prodotte da microrganismi – saprofiti delle piante o patogeni. Le prime espansine sono state scoperte in T. reesei nel 2002. Sono poi state scoperte in ulteriori microrganismi cellulosolitici, in particolare l’espansina micro- bica di B. subtilis ha due domini, uno omologo a CBM (serie di aa idrofobi piatti) e uno che contri- buisce a fare una superficie d’attacco maggiore e più potente di CBM da solo. Quindi non avendo attività catalitica, questi enzimi non producono cellobioso se messi insieme alla cellulosa, ma allentano soltanto la struttura. In acqua la biomassa vegetale (cotone) si ringonfia/swollen perchè rendono la struttura più lassa e meno compatta. I LPMOs (lytic polysaccharide monooxygenases) sono enzimi idrolitici che rompono in maniera ossidativa i legami beta-glucosidici di cellulosa. Utilizzano l'ossigeno molecolare per rompere i legami. Non si trovano di certo nei clostridi, ma in MO (microorganismi) aerobi. In natura si sono quindi sviluppati molteplici modelli di idrolizzazione della cellulosa. Il succo del discorso è che la cellulosa è estremamente recalcitrante all’idrolisi, quindi è necessaria una cooperazione di enzimi per poterla degradare efficientemente. Per questo è fondamentale la sinergia tra enzimi (tra eso ed endoglucanasi – non saccarificazione totale a causa dell'inibizione da prodotto; dominio catalitico e CBM; glucanasi e beta-glicosidasi; esoglucanasi riducenti e ossidanti, ecc.). IMMAGINI - grafico 1 mostra il concetto di sinergia paragonando l’attività endoglucana- sica ed esoglucanasica in termini di zuccheri prodotti: l’unione delle due attività produce una quantità di zuccheri molto maggiore di quella attesa semplicemente sommando le ri- spettive attività.
Succede questo perchè gli aerobi hanno molta più energia e possono “sprecare” in termini di effi- cienza. Dal punto di vista industriale sono più interessanti i cellulosomi per quanto riguarda l'efficienza. Però, dall'altro lato i cellulosomi non sono liberi, ma adesi alla cellula e quindi meno usufruibili ri- spetto alle cellulasi libere dei MO aerobi.
CELLULOSOMI
I cellulosomi – scoperti negli anni '90 – sono sistemi di enzimi sulla membrana batterica che colla- borano tra loro formando grosse strutture, molto più efficienti degli enzimi liberi dei funghi aerobi. Quando il batterio cresce in presenza di substrati come la cellulosa non sono più sferette, ma diven- tano delle vere e proprie fibre con cui il batterio si appiccica alla cellulosa. Fanno da ponte tra la cellulosa/substrato ed il batterio. Si sono sviluppati in batteri anaerobi che possono solo fermentare (senza catena respiratoria anaero- bia) I MO si ancorano alla cellulosa tramite i cellulosomi e raccolgono ogni prodotto idrolizzato (sono infatti MO fermentanti, quindi svantaggiati perchè devono crescere uno attaccato all'altro e adesi alla superficie del substrato, devono raccogliere tutto ciò che è possibile). I cellulosomi variano da un batterio all’altro, ma hanno in comune (oltre alle cellulasi) le SCAF- FOLDINE , proteine con la funzione di impalcatura, di solito più di una. La scaffoldina ha più domini con varie funzioni e con legami covalenti o meno:
- dominio CBM che liberi gli altri enzimi da doversi appiccicare essi stessi alla cellulosa
- domini legati covalentemente alla superficie del batterio
- domini per l'ancoraggio degli enzimi cellulosolitici Nei cellulosomi l’interazione specifica fra scaffoldina ed enzimi viene assicurata da una coppia par- ticolare di domini:
- COESINA (COH), dominio presente sulla scaffoldina, necessario per legare
- DOCHERINA (DOC) presente invece nell’enzima. COH e DOC interagiscono quindi fra loro per permettere il legame scaffoldina-enzima.
In un MO possono essere presenti sia cellulasi libere che legate al cellulosoma, per distinguerle ba- sta verificare la presenza del dominio DOC.
DOMINI DOCHERINA
La struttura della DOC è simile a quella della calmodulina (EF hand/elix), ma non è presente l’elica E. I domini non sono molto grandi con ripetizione di circa 20 aa, con il legame con il Ca, fondamen- tale per la struttura e la stabilizzazione (senza si scompaginano e non legano più le COH). Le regioni delle eliche (COH binding) sono fondamentali per il legame con la coesina, se cambio la sequenza, l’affinità cambia. Di solito il legame DOC-COH è specie-specifico (soprattutto nella regione delle eliche), per cui la DOC di un clostridio non può legare la COH di un altro clostridio (probabilmente ragione di agoni- smo, perché se non funziona legame non c’è sinergia). Le DOC hanno quindi la struttura con due eliche parallele (tipo spine americane), le COH invece struttura a foglietti beta. È vero che gli enzimi liberi degli aerobi hanno struttura più flessibile e raggiungono più facilmente vari substrati rispetto ai cellulosomi e inoltre si deve ricordare che la cellu losa è un substrato solido, non solubile. Per sviluppare più flessibilità, alcune DOC possono aderire alla stessa COH in due orientamenti di- versi (come una spina elettrica, da un lato o dall'altro), quindi c’è questo “DUAL BINDING MODE” che può aumentare il raggio d’azione dell'enzima. L’ordine di legame degli enzimi alle scaffoldine è probabilmente regolato. Esistono studi che dimostrano che non c’è differenza di specificità, anche se in C. cellulovorans esi- stono diverse affinità della stessa COH a seconda dei domini della scaffoldina. Inoltre esistono linker tra COH e DOC che si adattano a vicinanza/lontananza (struttura pi legata o più compatta che variano la flessibilità) e partecipano all'affinità tra domini DOC e COH. I cellulosomi devono adattarsi a substrato solido a cui si devono avvicinare/prenderlo.
LEGAME COVALENTE
Il legame covalente (prima era ionico) con i peptidoglicano viene mediato invece dall' enzima sor- tasi. Il peptidoglicano (parte glicidica con peptidi necessari per formare la rete di peptidoglicano – crosslinking) viene sintetizzato a partire dal suo disaccaride precursore: il disaccaride ripetitivo (N- acetilglucosamina e acido N- acetilmuramico) è prodotto dentro la cellula e attaccato a un lipide, poi messo in parete e staccato per montarlo nel peptidoglicano. Se arriva una proteina con sequenza giusta, viene messa in membrana. La scaffoldina ha questa particolare sequenza di aa per essere inserita sulla membrana, così verrà riconosciuta dalla sortasi e attaccata al precursore del peptidoglicano, che se la porta dietro nella rete di peptidoglicano. La proteina rimane lì attaccata covalentemente e sarà più rigida, ma non se ne andrà Se fosse legata non-covalentemente avrebbe più libertà di movimento, ma basterebbe anche solo un cambio di pH per farla staccare.
MODELLI DI CELLULOSOMI
I cellulosomi possono variare da specie a specie. Il PRIMO riconosciuto è quello di C. thermocellum con tre scaffoldine di ancoraggio (nessuna atti- vità enzimatica, di cui una adattatore per gli enzimi), grande flessibilità di combinazioni. SECONDO modello (cellulosomi): Acetivibrio cellolyticus ha un cellulosoma ancora più compli- cato (vari adattatori, ecc.). Altro batterio nel rumine ha scaffoldine piccole, ma con legame covalente (due scaffoldine come adattatori). Diverse combinazioni, ma basta che funzionino TERZO modello evoluto dai batteri anaerobi termofili è molto più rigido, non ci sono enzimi liberi né cellulosomi: enzimi giganteschi con tanti domini diversi, anche più domini catalitici.
Nell’ambiente termofilo le interazioni non covalenti di DOC e OH non sono abbastanza forti e ser- vono legami covalenti più rigidi e vincolati. Il QUARTO modello è dei gram- (dopo peptidoglicano c’è ulteriore membrana simil-citoplasma- tica). In comune, tutti i modelli, hanno che la cellulosa dentro la cellula non ci va mai. Magari viene degradata appena al di sopra della superficie cellulare, ma dentro entrano solamente delle molecole solubili (glucosi, piccoli glicani) Uno tra i modelli più simili ai precedentemente spiegati è di un batterio marino: enzimi h anno CBM perchè niente fa da intermedio di ancoraggio (nei cellulosomi gli enzimi non hanno domini CBM perchè hanno scaffoldine) e ci sono molti enzimi con domini catalitici multipli che svolgono la fun- zione delle espansine (degradare la cellulosa e renderla meno recalcitrante). L’ancoraggio degli enzimi è mediato da LBS (lipobox sequences) , domini con lipidi attaccati che permettono di integrarsi nella membrana cellulare esterna dei gram– (sottile strati di peptidoglicani e strato di superficie esterna). Rivoluzionare invece sono ultime scoperte di un batterio del suolo e del rumine – gram negativi. Questi batteri non crescono se non sono attaccati alle fibre di cellulosa; inoltre non hanno cellulo- somi né CBM e proteine correlate. Qui non c’è più bisogno di CBM degli enzimi, perché cellulosa non è più cristallina e tal punto qualsiasi enzima può degradarla. Probabilmente usano altre proteine sulla superficie per staccare la singola fibra di cellulosa, farla passare attraverso membrana più esterna nel periplasma. Altri MO fanno entrare polisaccaridi amorfi mediante pori e poi vengono fatti entrare all’interno de- gradandoli in pezzetti. Devono essere attaccati alla cellulosa per poter vivere èperchè non hanno enzimi liberi da utilizzare per ricavare fonti di nutrimento.
METABOLISMO DELLA CELLULOSA
Visti i vari modelli, analizziamo il metabolismo della cellulosa. La metabolizzazione degli zuccheri avviene sempre nel citoplasma con le tipiche vie (ciclo dei pen- tosi-P, glicolisi, ecc.). Il trasporto però può avvenire in diverso modo (attivo/passivo): il trasportatore può trasportare sin- goli monosaccaridi di glucosio o un intero oligosaccaride (5-10 unità), alla fine si arriva sempre a glc6P.
