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Cellule e il loro rinnovo
Nell'organismo ci sono tipologie di cellule diverse, derivanti dal differenziamento cellulare.
Il differenziamento cellulare avviene durante la vita adulta. Infatti i tessuti sono delle strutture dinamiche.
L'istogenesi
Lo sviluppo è il processo attraverso il quale da una singola cellula ha origine un organismo pluricellulare.
A livello della blastocisti si ha il primo differenziamento e da lì si sviluppa l'embrione bilaminare.
Le cellule acquisiscono caratteri di specificità diversi da tessuto a tessuto. Con l’istogenesi si formano popolazioni cellulari apparentemente non correlate fra loro (epitelio e tessuto nervoso) ma che hanno un'origine comune. Questo avviene attraverso una relazione dell'espressione genica che si attua attraverso scelte successive (espressione selettiva di alcuni geni).
Nei tessuti esiste un turnover = equilibrio fra cellule morte e vive
Vengono eliminate a causa di una perdita di funzione, di danno, di eliminazione attiva e questo avviene attraverso la necrosi (morte accidentale a causa della rottura della membrana plasmatica), l’apoptosi, l’autofagia.
Negli esseri viventi c'è la possibilità di rigenerare ciò che è stato perduto, come nelle lucertole. Alcune parti del nostro corpo si possono rigenerare: pelle, globuli rossi, capelli, unghie, fegato, ossa, polmone.
Turnover cellulare avviene a velocità diverse a seconda del tipo di tessuto: ● popolazioni cellulari perenne: non si dividono più (cellule del tessuto nervoso, epitelio uditivo, cristallino) ● popolazioni cellulari stabili: si rigenerano solo a seguito di particolari condizioni (epatociti, cellule muscolari cardiaci con pochi danni) ● popolazioni cellulari labili: si rinnovano continuamente (epitelio di rivestimento e cellule del sangue)
Oggi si ritiene che non esistano tessuti internamente perenni.
Turnover cellulare avviene per: ● duplicazione semplice di cellule di tessuto già differenziate ● cellule staminali per tessuti che si rinnovano costantemente e di differenziarsi ○ cellula non differenziata terminalmente ○ illimitata capacità di proliferare (ma hanno bassa capacità di replicazione) ○ generano altre cellule staminali o cellule differenziate
Le cellule staminali : ● si classificano secondo la loro provenienza: ○ embrionale (massa cellulare interna della blastocisti) ○ fetali (dall'ottava settimana) ○ emopoietiche fetali (cordone ombelicale alla nascita) ○ adulte (si trovano in tutti i tessuti mammiferi) → rinnovamento tissutale (omeostasi) e rigenerazione in seguito a danno ● si classificano in base al potenziamento differenziativo: ○ totipotenti (fino alla morula) → sono in grado di creare anche tessuti extra-embrionali ○ pluripotenti (massa cellulare interna) →danno origine a tutte le cellule di un organismo ■ (IPS): cellule adulte indotte a tornare staminali attraverso la riprogrammazione genetica. Si devono ancora studiare bene per predire come si potrebbero comportare nel corpo. ○ multipotenti → cellule del midollo osseo che dà origine alle cellule del sangue ○ oligopotenti → intestinale ○ unipotenti → epidermide, spermatozoi
I compartimenti staminali possono usare differenti tipi di divisione come le divisioni simmetriche (due cellule differenziate o due cellule staminali) asimmetriche (cellula differenziata e cellula staminale). Si generano le cellule differenziate quando la cellula viene esposta in un ambiente diverso → se non si è a contatto con il fuso mitotico si generano le cellule specifiche
Il differenziamento è un processo graduale. In alcuni tessuti con un alto tasso di rinnovamento esistono delle cellule intermedie fra le staminali e le differenziate → progenitori → hanno un commitment = programma che li induce a differenziarsi in un determinato tipo cellulare + hanno una capacità rigenerativa inferiore
Le cellule differenziate terminalmente non sono più in grado di proliferare.
La staminalità non è uno stato assoluto ma viene mantenuto dal microambiente della cellula = nicchia staminale ● favorisce il mantenimento dello stato staminale ● regola il differenziamento
L'allontanamento dalla nicchia è un primo passo verso il differenziamento.
La medicina rigenerativa si occupa della ricostruzione di tessuti danneggiati mediante la coltura e il differenziamento delle cellule.
Esiste la terapia rigenerativa del sangue (trapianto del midollo osseo o infusione di cellule) e dei tessuti corneali.
Membrane
Le membrane cellulari sono costituite da una combinazione di proteine, lipidi e carboidrati. Il rapporto tra lipidi e proteine dipende dal tipo di membrana. Organelli diversi della stessa cellula hanno una composizione di lipidi diversa.
Lipidi di membrana : ● fosfolipidi ma ci sono anche sfingolipidi e glicolipidi ● steroli: limitano il movimento dei fosfolipidi adiacenti ○ colesterolo è un componente delle membrane degli animali → presenta un gruppo polare idrossilico e rende la membrana più rigida ● glicolipidi: solo sulla faccia esterna del doppio strato
Membrana Plasmatica
È formata da glicocalici (glucidi), che conferisce protezione alle cellule.
Le membrane sono specializzate. Possono avere sulla superficie ciglia, flagelli, microvilli, stereociglia, lamellipodi, filopodi, giunzioni.
Il doppio strato lipidico permette la diffusione delle proteine e la fusione delle membrane tra loro (per divisione cellulare o secrezione ma questo avviene in condizioni specifiche). Il grado di fluidità della membrana cellulare è determinato dal tipo di lipidi, dalla temperatura (è la temperatura di fusione) e dalla quantità di colesterolo presente.
Le membrane sono polarizzate perché c'è una composizione diversa nei due strati. Il doppio strato quindi è asimmetrico, in quanto i due versanti hanno composizioni lipidiche diverse. Lo strato interno ha cariche negative, invece nella faccia esterna si trovano le componenti glucidiche.
● controlla la composizione chimica del citoplasma → permeabilità selettiva ● esistenza del potenziale di membrana → alcuni tessuti sono eccitabili perché hanno un potenziale d’azione ● interconnessione con l’ambiente extracellulare attraverso le proteine ● l’adesione tra le cellule avviene attraverso le giunzioni cellulari ● riconoscimento tra cellule e ricezione dei segnali ● nelle cellule procariote nella membrana plasmatica avviene la respirazione cellulare e la fosforilazione ossidativa
Zattere lipidiche → formazione spontanee di isole lipidiche forte da colesterolo e acidi grassi saturi → costituiscono delle zone che permettono il trasporto di proteine + regolano la fluidità della membrana + regolano processi metabolici (omeostasi del colesterolo) + regolano vie di segnalazione
Subito sotto la membrana plasmatica è presente una porzione di citoscheletro (formata da microfilamenti di actina) che serve per modificare la forma della cellula a seconda del ciclo vitale in cui si trova + resistenza
Proprietà delle membrane
É semipermeabile per cui solo le molecole idrofobiche possono passare attraverso la membrana. Inoltre passano anche gas neutri (O 2 e CO 2 ) e acqua. Invece gli zuccheri, gli ioni e le proteine devono usare dei trasportatori.
Le concentrazioni dei principali ioni (Na+, K+, Ca+2) sono diverse fra l'interno e l'esterno della cellula. L'ambiente intracellulare è più elettronegativo dell'ambiente extracellulare, stabilendo un gradiente elettrochimico.
Le proteine di membrana
Molte funzioni (trasporto, recettore, riconoscimenti, adesione e enzima) della membrana dipendono dalle sue proteine.
Tipologie di proteine ● integrali ● transmembrana: monopasso, multipasso, multimerica ● ancorate covalentemente ai lipidi (ancora di acido grasso o di GPI fosfatidil-inositolo) ● periferiche
Le modificazioni allosteriche possono attivare o inibire l'attività proteica ● chinasi SRC è una tirosin-chinasi → le tirosine possono essere fosforilate ● proteine G : possiedono una porzione di RNA + subiscono delle modifiche in risposta al legame a GTP (è una molecola simile all’ATP) che GDP
I virus sono dotati di una capsula proteica, formata da diverse unità proteiche, che li protegge.
Sono in grado di attraversare completamente la membrana. I domini transmembrana sono alfa-elici perché hanno residui idrofobici. Alcune proteine però hanno dei domini a foglietto beta che formano strutture a barile (nel caso dei batteri formano le porine che lasciano passare nutrienti idrofilici).
Generalmente hanno residui idrofilici all’esterno della cellula, all’interno invece ci sono i residui idrofobici; questo serve per creare un canale che attraversa la membrana.
Alcune proteine si legano alle membrane indirettamente.
Molte proteine di membrana sono glicoproteine, il legame che si instaura è: ● O-glicosidico: per serina o treonina ● N-glicosidico: per asparagina (dopo ha X-serina o X-treonina)
Trasportatori
Le proteine transmembrana fungono da trasportatori. ● trasportatori: trasportano le molecole seguendo il gradiente oppure andando contro gradiente ○ sono proteine integrali di membrana con molte alfa-eliche ○ è presente un sito di legame che si lega solo con una molecola specifica ○ la proteina va incontro a una modificazione di conformazione in seguito alla formazione del legame con la molecola ● canali idrofili fra esterno e interno della cellula secondo il gradiente
Tipologie di trasporto:
● trasporto passivo mediato da trasportatori o canali → funziona seguendo il gradiente di concentrazione o elettrochimico
compartimento all'altro. La cellula parietale (presente all'interno dello stomaco) produce HCl. Gli ioni Cl- entrano nella cellula facendo uscire gli ioni K+. Inoltre si generano gli ioni H+^ all'interno della cellula attraverso lo ione bicarbonato, che viene scisso in CO 2 e H 2 O. Infine gli ioni H+^ si combinano con gli ioni Cl-^ per formare HCl, che abbassa il pH dello stomaco.
Trasportatori di glucosio:
Nella superficie delle cellule epiteliali di rivestimento, che si trovano nell’intestino, ci sono dei microvilli che permettono maggiore assorbimento dei nutrienti. Le cellule si avvalgono di trasportatori uniporto e passivo per immagazzinare glucosio, ciò avviene secondo il gradiente per cui non c'è bisogno di energia.
Nel trasporto facilitato (trasporto attivo spinto da ioni) glucosio entra in simporto con due ioni Na+, a volte per andare contro gradiente di concentrazione, ciò serve per immagazzinare grandi quantità di glucosio all'interno del citosol.
L'assorbimento del glucosio dipenda da: ● motore del sistema (pompa sodio-potassio) → mantiene grande la concentrazione di Na+^ fuori della cellula per mantenere il sistema di trasporto facilitato del glucosio ● localizzazione ristretta dei trasportatori del glucosio
È un esempio di trasporto attivo indiretto = una sostanza attraversa la membrana contro il proprio gradiente di concentrazione usando come forma di energia il gradiente di concentrazione di uno ione che attraversa anch’esso la membrana
Il trasporto nei globuli rossi
A livello dei tessuti la CO 2 è altamente concentrata e entra nella cellula dove in aggiunta dell'acqua viene trasformata in bicarbonato. Questo libera H+^ che interagiscono con l'emoglobina, che a sua volta libera O 2. É essenziale che lo ione HCO3-^ non si accumuli nel citosol per questo viene scambiato in antiporto con lo ione Cl-
(entra all'interno della cellula). Inoltre esistono le pompe Na+/K+^ ATPasi che servono per mantenere l’equilibrio osmotico all’interno della cellula
A livello dei polmoni l’O 2 è altamente concentrato e si lega all'emoglobina (formando l’ossiemoglobina = HbO 2 ), che cede H+. Questi vengono usati per trasformare HCO3-^ in CO 2 e H 2 O. La CO 2 esce dalla cellula. In questo caso è essenziale c'è lo ione HCO3-^ entri nella cellula, in antiporto con lo ione Cl-.
Sfruttano l'energia derivata dal gradiente di concentrazione e elettrochimico del cloro tra l'interno ed esterno della cellula.
Trasportatori attivi
Richiede la presenza di proteine specifiche. Il passaggio delle sostanze è contro il loro gradiente di concentrazione o elettrochimico ed è unidirezionale. Richiede la disponibilità di una fonte di energia (chimica, luce o gradiente di concentrazione di uno ione diverso da quello trasportato).
● tipo F : trasportano O 2 formando un legame tra ADP e fosforo per generare ATP → la loro funzione fisiologica è di produrre ATP ○ ATP sintetasi nella matrice mitocondriale ○ quando si legano alle molecole ruotano ● tipo V : usano l'energia che deriva dal gradiente elettrochimico dello ione H+^ (che attraversano la membrana per generare ATP) ○ per mantenere il pH acido all'interno del lisosoma ○ in generale acidificano l’ambiente ● trasportatori ABC : trasportano piccole molecole organiche ○ sono costituite da diverse subunità (NBD) che legano l’ATP in modo non covalente ○ si aprono o all'esterno o all'interno in base alle necessità ○ hanno una funzione di detossificazione (espellono sostanze, es: MDR) oppure possono concentrare le sostanze ● tipo P : funzione in antiporto ○ ATP usato per fosforilare una delle subunità per cambiare la conformazione della pompa → per permettere l’apertura e la chiusura della pompa ○ si presentano come tetrameri, dove la subunità alfa presenta il sito di legame ○ presenta due siti di legame: uno con bassa affinità e uno con alta affinità → il cambiamento della conformazione avviene attraverso la fosforilazione
Acquaporina
L'acqua ha una bassa permeabilità e si sposta secondo il gradiente chimico attraverso l’acquaporina, che è un canale. È formata da quattro subunità. Consente il passaggio dell'acqua in modo analogo a quello del potassio. Si forma un specie di canale grazie ai residui aminoacidici idrofili. L'acqua viene spinta da una stazione all'altra attraverso la repulsione elettrostatica.
Vescicole ● di trasporto di grosse molecole tra RER, Golgi, Lisosomi e vescicole di secrezione ● endocitiche: consentono l'introduzione di molecole dall’esterno ● di secrezione
Gli endosomi e i lisosomi sono organelli vescicolari che sono circondati da una membrana. Sono coinvolti nella degradazione e digestione di materiale inglobato dall'esterno.
Ribosomi
Il loro numero è variabile all’interno della cellula.
Formati da rRNA e proteine. Sono considerati organelli senza una membrana. Si trovano nel reticolo endoplasmatico e nell'involucro nucleare. Inoltre c’è una specie specifica nel mitocondrio.
Sono formate da due subunità, quella più piccola si lega al mRNA e quella più grande al tRNA. Rimane un piccolo solco che permette il passaggio dell’mRNA durante la traduzione. I ribosomi leggono il mRNA e catalizzano la formazione del legame peptidico.
Il ribosoma procariote è più piccolo di quella eucariota. Si usa un'unità di misura (S) diversa per indicare la dimensione attraverso la velocità di sedimentazione quando vengono messe in una centrifuga.
Il codice genetico è l'insieme di tutte le possibili combinazioni delle 4 basi, è degenerato e ridondante.
tRNA interagisce con: ● mRNA → si forma un legame fra l’anticodone del tRNA e il codone dell’mRNA ● aminoacido attraverso l'amminoacil tRNA sintetasi
La traduzione proteica inizia sempre a livello dei ribosomi citoplasmatici. È formata da varie fasi: inizio, allungamento e terminazione. Il ripiegamento dei domini proteici avviene durante la traduzione, dove prima si ripiegano i domini ammino-terminali. Sono aiutate dalle molecole chaperonine. Tuttavia ce ne sono alcune che impediscono il ripiegamento (famiglia HSP70) e ciò permette alla proteina di non essere attiva fino a che non giunge alla sua destinazione.
La quantità di REL cambia in base allo stato della cellula.
Smistamento delle proteine
É garantito dai peptidi segnali: corte sequenze aminoacidiche delle proteine stesse. Quando avviene il ripiegamento queste sequenze sono sempre visibili.
Ci sono delle sequenze con senso: si trovano spesso.
Mitocondri
Hanno due membrane e dentro la membrana interna sono situate molecole di DNA mitocondriale circolare.
funzioni: ● metabolismo energetico ● sintesi degli steroidi ● produzione di ROS e radicali liberi ● deposito di Ca2+ ● apoptosi
Il modello adottato è quello di Palade ma può essere rivisto. ● Le membrane interne e esterne sono separate da uno spazio consistente ● la membrana interna è formata da creste, che sono aperte alla base e sono in continuazione ● la matrice non occupa uno spazio consistente ● ogni cellula ha più di un mitocondrio
In realtà le membrane sono molto vicine, la matrice mitocondriale occupa uno spazio maggiore, le creste sono lunghe e attraversano il mitocondrio, inoltre si trovano delle strozzature che permettono di dividere lo spazio in compartimenti per separare le proteine.
Inoltre i mitocondri formano delle reti. Con il fenomeno della fissione possono rigenerare organelli singoli. Hanno un ciclo vitale : si uniscono insieme (fusione) e poi si separano (fissione) per poi essere eliminati (vengono recuperati le sostanze utili).
Le funzioni metaboliche dei mitocondri (dopo la glicolisi): ● ciclo di Krebs ● fosforilazione ossidativa
Il NADH viene usato da una serie di complessi presenti sulla membrana interna del mitocondrio per pompare H all’interno delle creste mitocondriali e nello spazio intermembrana. Gli H confluiscono tra le due membrane generando una ddp tra la matrice e lo spazio tra le creste, che genera l’energia intrappolata nell’ATP. Ciò porta un cambiamento del pH.
La NADH deidrogenasi è un enzima che si trova nella membrana interna, serve per catturare gli elettroni che vengono trasmessi al citocromo.
ATP sintetasi
É una pompa di tipo F, localizzata nelle creste mitocondriali.
Il flusso di H avviene spontaneamente e vengono catturate per trasformare ADP e fosforo in ATP.
● ADP entra attraverso la membrana esterna che è ricca di porine; dopodiché entra in antiporto con ATP nella membrana interna ● Il piruvato entra in simporto con H ● Lo ione fosfato entra in simporto con H
Apoptosi
(morte cellulare programmata)
Sotto stimoli adeguati si forma un canale di proteine presenti nella membrana esterna, che permette la fuoriuscita del citocromo C che interagisce con i complessi proteici ad attività proteolitica (tagliano proteine bersaglio) che porta alla degradazione delle strutture cellulari.
Proteine necessarie al funzionamento del mitocondrio: ● matrice: piruvato deidrogenasi ● membrana mitocondriale interna: ATP sintetasi ● spazio intermembrana: citocromo C ● membrane mitocondriale esterna: porine
Genoma mitocondriale
É circolare e ha origine all'eredità materna. É fondamentale per la sintesi dell'RNA mitocondriale. Molte malattie sono dovute anche alla mutazione di questo genoma.
Si pensa che i mitocondri derivino da batteri simbionti. Durante l’evoluzione hanno perso gran parte dei geni che possedevano, tranne quelli necessari per i processi di generazione di energia per la sintesi di proteine.
Proteine nel mitocondrio
Le proteine destinate al mitocondrio hanno all’estremità N-terminale un peptide segnale (formato da aminoacidi anfipatici) alla matrice hanno lo stesso segnale, inoltre contengono regioni idrofiliche e idrofobiche.
Destinato alla matrice
La proteina è legata a delle chaperonine Hsp70, che ne impediscono il ripiegamento finché non entra nel mitocondrio. Vengono riconosciute dal complesso recettoriale TOM (formato da due subunità) che si trova nella superficie della membrana mitocondriale esterna. Il peptide segnale viene riconosciuto da una delle due subunità e si lega ad esso. Tra Tom 20 e Tom 22 c’è Tom 40, che è strettamente legato a TIM (si trova a livello della membrana mitocondriale interna). Il legame del peptide con una parte del complesso Tom attiva il traslocone Tom 40: il polipeptide passa all’interno e le chaperonine si staccano.
Tecniche per l'osservazione dei tessuti
Le dimensioni delle cellule vanno quindi generalmente da 0,2 a 0,3μm, nel caso di alcuni batteri, fino ad alcuni cm, o addirittura metri, come visto per i neuroni.
Il microscopio non è in grado di percepire le cellule molto piccole.
Osservazione dei tessuti al microscopio ottico
Per poter osservare al microscopio i preparati istologici, è necessario fare degli opportuni trattamenti.
Osservazione diretta, a fresco, di cellule e di tessuti viventi: non introduce artefatti ma da scarso contrasto e ridotta visualizzazione delle strutture per alto spessore, durata limitata dei preparati per autolisi. Per aumentare il contrasto le strutture possono essere colorate con coloranti vitali, assorbiti dalle cellule
Osservazione di cellule e del loro contenuto sottoposti a “trattamenti” quali fissazione (per bloccare l’autolisi), inclusione, taglio e colorazione di sezioni sottili, finalizzati sia a stabilizzare e conservare le strutture, sia a contrastarle per migliorarne la visualizzazione. Non si osservano strutture troppo trasparenti o troppo spesse.
È difficile creare sezioni abbastanza sottili dei tessuti molli,, tali da poter essere attraversate dalla luce di un microscopio a transilluminazione. Inoltre, nelle cellule dei campioni sono presenti degli enzimi che possono far degenerare per autolisi i preparati, impedendo la corrispondenza tra ciò che è osservabile al microscopio e ciò che invece è presente in vivo.
Preparati istologici → sezione di tessuto trattato
Fissazione
È un trattamento chimico utilizzato per preservare le varie componenti delle cellule e dei tessuti. Questo procedimento produce dei cross-link tra le varie molecole, i quali mantengono le molecole al loro posto, come se fossero plastificate.
Il fissativo che viene usato maggiormente è la formalina, cioè il 4% di formaldeide in soluzione acquosa, anche se a volte si possono usare invece dei trattamenti fisici, come il congelamento rapido, che impedisce l’autolisi.
La formalina viene utilizzata principalmente nella microscopia ottica.
Anche in microscopia elettronica, però, è importante bloccare le molecole nella giusta posizione: in questo caso come fissativo si usa la glutanaldeide.
Inclusione e taglio delle sezioni al microscopio
Per poter tagliare il campione, dopo che è stato fissato, è necessario praticare l’inclusione. Per svolgere quest’operazione di solito si usa la paraffina, visto che a temperatura ambiente si trova allo stato solido, ma a 60°C è già liquida. Nell’inclusione, la paraffina viene riscaldata fino a fondere: al suo interno viene quindi inserito il campione da studiare, e il tutto viene lasciato raffreddare fino a raggiungere la temperatura ambiente, formando un blocchetto.
Visto che la paraffina, come le cere in generale, non è miscibile con i liquidi perché idrofobica, è necessario che il campione, fissato nella soluzione acquosa di formaldeide, venga disidratato. Per fare ciò, è necessario farlo passare attraverso una serie crescente di soluzioni alcoliche, fino ad arrivare allo xilolo, che è una forma di alcol completamente idrofobica.
Quando non si avrà più acqua, sarà possibile inserire il campione nella paraffina fusa e, quando il blocchetto sarà solidificato, verrà posto su un supporto e da esso con un microtomo verranno prodotte fette sottilissime, dello spessore di 5-10μm, che si potranno posizionare su un vetrino portaoggetti.
Se per il fissaggio viene invece usato il congelamento rapido, le fette verranno ottenute con un criostato, perché il campione deve essere contenuto in una box a -20°C, per mantenere il congelamento.
Colorazione
Solitamente si utilizzano delle miscele di coloranti per distinguere e riconoscere i vari componenti del tessuto, caratterizzato da componenti acide (come il DNA nel nucleo) e basiche (come le proteine nel citoplasma e la matrice extracellulare). Si può utilizzare una miscela di un colorante acido e uno basico per contrastare le varie parti del tessuto.
Coloranti basici (colorano strutture acide) sono l’Ematossilina (colorante rapido che colora di blu-violetto parti acide come il nucleo), il Blu di Toluidina, il Blu di Metilene, il Rosso Carminio (Azocarminio).
Coloranti acidi (colorano strutture basiche) sono l’Eosina (colorante rapido, colora il citoplasma, usato nella pratica chirurgica), l’Orange G, il Blu di Anilina, il Verde Luce.
Ematossilina (nucleo) - Eosina (citoplasma e matrice)
L’Ematossilina è un colorante basico, che colora di blu-violetto le strutture acide come il DNA, quindi colora i nuclei. L’Eosina è un colorante acido, che colora di rosa le strutture basiche come il citoplasma delle cellule.
Il citoplasma delle cellule è colorato in modo diverso in quanto le cellule dell’epidermide producono cheratine, per questo sviluppano molto i ribosomi, i quali essendo costituiti da proteine e RNA, presentano anche componenti acide. Il citoplasma dell’epidermide risulta più scuro in quanto presenta maggior componente acida e per questo viene colorato anche dall’Ematossilina.
Colorazione tricromica Azan – Mallory
Tecnica di colorazione basata sull’utilizzo di tre coloranti: l’Azocarminio che colora di rosso i nuclei, l’Orange G che colora di arancione il citoplasma, il Blu di Anilina che colora di blu la matrice extracellulare. Nell’immagine un preparato di ghiandola salivare costituita da cellule epiteliali adese le une alle altre che appoggiano sul tessuto connettivo.
Colorazioni istochimiche
I metodi permettono di ottenere informazioni sulla localizzazione di macro-molecole nei tessuti. Tali dettagli si ottengono sottoponendo le sezioni a reazioni chimiche che, senza arrecare danno alle strutture cellulari, portano alla formazione di prodotti colorati.
Le reazioni visto chimiche sono specifiche e sensibili.
Reazione di Pas – dimostrazione dei carboidrati
Piani di taglio
I piani di taglio possono essere longitudinali, trasversali oppure obliqui.
In figura è rappresentato un follicolo tiroideo, con all’interno il colloide. Si possono fare varie sezioni trasversali a diverse altezze. In base alla sezione scelta la struttura potrebbe sembrare piena come riportato nella sezione superiore o cava come riportato nella sezione inferiore. Per questo è importante stabilire il piano di taglio.
Le cellule muscolari lisce sono delle cellule allungate; è possibile realizzare la sezione longitudinale (si vede il nucleo allungato e posizione del nuclei sono sfasati) oppure la sezione trasversale (non sempre si vede il nucleo).
Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche
Danno delle informazioni sui componenti molecolari delle cellule. Si usano dei reagenti che danno luogo a reazioni chimiche sul preparato, senza danneggiare le strutture. Servono a localizzare in modo semplice le strutture. La reazione è una reazione specifica che fornisce informazioni sulla natura delle sostanze chimiche che compongono i tessuti. Il Picrosirius che colora di rosso il collagene è un esempio di colorazione istochimica, in quanto si va a legare ad una struttura specifica, non a tutte le strutture basiche indistintamente.
L’immunoistochimica e l’immunofluorescenza
Per ottenere delle colorazioni molto dettagliate per osservare una specifica molecola o struttura all’interno della cellula si utilizza la tecnica dell’immunoistochimica.
Nei tessuti ci sono molte molecole proteiche che possono essere considerate degli antigeni, contro i quali vengono prodotti degli anticorpi, rappresentati in verde nell’immagine. Si intuba il preparato che si vuole analizzare con l’anticorpo specifico che riconosce la molecola che si vuole identificare. Si utilizza poi un anticorpo secondario che si lega al primo anticorpo. L’anticorpo secondario può essere a sua volta legato a una molecola fluorescente oppure a un enzima (es. una perossidasi), il quale lega un substrato e catalizza una reazione chimica che porta a dei prodotti colorati.
Microscopio a fluorescenza e fluorofori ● il campione viene marcato con il fluoroforo che è fluorescente ● i filtri e gli specchi dicroici sono scelti in base alle caratteristiche di l'eccitazione ed emissione del fluoroforo utilizzato
Il microscopio confocale
Questo microscopio fornisce delle migliori immagini in fluorescenza poiché usa i laser come sorgenti luminose e sfrutta inoltre degli specchi oscillanti che fanno muovere il laser lungo tutto il campione. In questo modo è possibile ottenere tante sezioni del campione a intervalli regolari in cui il segnale non viene disturbato da quello delle altre sezioni. Tali sezioni, realizzate separatamente sui piani x, y e z, possono poi essere riunite grazie a un software che restituisce un’immagine tridimensionale.
Si possono utilizzare degli anticorpi contro varie proteine e colorare ciascuna proteina con un colorante diverso, in modo da poter osservare la posizione relativa di una proteina rispetto ad un’altra.
Il microscopio confocale permette inoltre di seguire l’espressione di alcune molecole nel tempo. Ciò si rivela molto utile nell’osservazione della divisione cellulare di una cellula, poiché permette di capire quando una cellula si divide e quanto materiale proteico viene destinato a ciascuna delle due cellule figlie. Si possono rendere fluorescenti i cromosomi e gli elementi del fuso mitotico in modo da osservare con più precisione le varie fasi della divisione cellulare.
Il microscopio elettronico
Alcuni microscopi ottici arrivano ad una risoluzione di 0,1 micron. Se si desidera avere una risoluzione ancora più alta bisogna utilizzare il microscopio elettronico, con cui si può ottenere una risoluzione di 0,2 o persino 0, nanometri.
Esistono due tipologie di microscopio elettronico: ● il microscopio a trasmissione (TEM): permette di vedere la struttura del campione (0,1 nm); ● il microscopio a scansione (SEM): permette di vedere la forma tridimensionale del campione (10 nm).
Nel microscopio elettronico viene utilizzato un fascio di elettroni che colpisce certe strutture permettendo di ottenere una colorazione più scura nelle zone elettroniche.
Il microscopio elettronico è uno strumento molto grande e complesso, in quanto deve originare un fascio di elettroni, accelerare gli elettroni nel tubo catodico, indirizzarli verso il campione e avere delle lenti elettromagnetiche per permettere la visione del campione.
Anche nell’utilizzo del microscopio elettronico i campioni vanno fissati utilizzando la gliceraldeide o altri fissativi; successivamente i campioni devono essere trattati con alcuni sali di metalli pesanti (di solito si usa il tetrossido di osmio). Questi sali agiscono come bloccanti per gli elettroni e bloccano il fascio di elettroni, determinando una colorazione scura nelle zone ricche di elettroni.
Le sezioni del campione, prima di essere osservate, devono essere tagliate in strati ultrasottili, spessi 1- elettroni, utilizzando un apposito strumento.
Il fascio di elettroni viene direzionato grazie a dei condensatori in modo da passare attraverso la fettina di campione desiderata. Le immagini ottenute vengono poi proiettate su uno schermo e sono principalmente immagini in bianco e nero, in cui le zone più scure corrispondono alle zone elettrondense. Con strumenti informatici è poi possibile colorare le varie parti in modo da distinguere meglio le diverse strutture cellulari.
L’alto potere risolutivo del TEM consente di distinguere molte componenti subcellulari, quali i ribosomi, il nucleo, la cromatina e i mitocondri.
