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MICROBIOLOGIA.
La microbiologia molecolare studia il genotipo che costituisce la molecola internazionale con propri geni e la sua variabilità dovuta all’ambiente (non è casuale) ne determina il fenotipo (come si manifesta all’esterno). Non sempre il genotipo equivale al fenotipo perché ci sono condizioni particolari come ad esempio la condensazione. Epatite C genotipo 1B è aggressiva ed evolve nel 95% dei casi in epatocarcinoma (tempo max di vita 2 anni). Viene trasmessa per via parenterale apparente e inapparente (stesso ambiente). Epatite C genotipo 1A è meno aggressivo, possibilità di conviverci anche 40 anni (2 ambienti distinti). La capacità di resistenza dipende dalle mutazioni tramite tecniche di microbiologia molecolare come PCR- realtime (reazioni a catena della polimerasi) ovvero un sistema omogeneo, in tempo reale, dei prodotti dell’amplificazione. La PCR amplifica il materiale genetico (DNA) e consente quindi di ricercare in un campione biologico il materiale genetico di un determinato microrganismo. Esiste anche la RT PCR per i virus a RNA dove si effettua prima la retrotrascrittasi da RNA in DNA attraverso la trascrittasi inversa e poi faccio diagnosi. Test ELISA: reazione antigene-anticorpo INDIRETTA, è detto anche test immunoenzimatico per la presenza di antigeni (parte costante) e anticorpi (parte variabile). Le case farmaceutiche creano medicine in grado di riconoscere la parte costante legata ad un enzima. Quindi:
- *Ancoro l’antigene
- Immetto l’anticorpo (se presente nel pz)
- Si forma l’ immunocomplesso. Se si utilizza una proteina anziché un enzima, è possibile vederlo aumentando la fluorescenza, cioè l’immunofluorescenza visibile al microscopio ottico (dove la lampada è a mercurio). ESAME DIRETTO. La microbiologia è la scienza che si occupa dello studio dei microrganismi (esseri unicellulari). Si interessa dell’origine e della diffusione di parassiti e infezioni causate nell’uomo, negli animali e nelle piante. Generalità nelle malattie da infezione. Le malattie sostenute da microrganismi, virus o parassiti, prendono il nome di malattie da infezione e si distinguono in esogene ed endogene. Le malattie da infezione endogena trovano la loro causa nell’abnorme espansione numerica di una o più specie presenti nella popolazione microbica normale di un distretto dell’organismo e nel trasferimento di questi in altre sedi o distretti diversi da quelli normalmente colonizzati. Le malattie da infezione esogena invece, ritrovano il loro momento iniziale nell’arrivo nell’organismo di un microrganismo o di un virus proveniente da una sorgente esterna che può essere rappresentata da: materiali inanimati, animali infetti (zoonosi che è un microrganismo all’interno dell’animale ed occasionalmente infetta l’uomo, es. brucella che si trova nel latte del bovino e provoca mastite) e altri esseri umani infetti. Le vie di trasmissione delle infezioni esogene sono:
- Per ingestione di alimenti o bevande contaminate; l’agente infettante, localizzato a livello dell’apparato digerente, si elimina con il materiale fecale, da dove per condizioni igieniche ambientali, riesce a raggiungere il cibo, realizzando il circuito ORO-FECALE (es: tifo, colera).
- Per via aerogena ovvero la trasmissione di microrganismi o virus immessi nell’aria da parte di soggetti infetti, a carico dell’apparato respiratorio, mediante gocce di saliva che vengono eliminate con tosse o starnuti e che rimangono sospese nell’aria, oppure attraverso la contaminazione di oggetti o delle mani di soggetti presenti nel medesimo ambiente.
- Per contagio sessuale dove vi è una trasmissione diretta di agenti infettanti, eliminati con diversi secreti da un soggetto infetto direttamente sulle mucose del partner non infetto. Sono anche definite malattie veneree o a trasmissione sessuale (es: papilloma virus, chlamydia trachomatis, candida albicans, virus dell’erpes simplex, sifilide, epatite ecc).
- Per inoculazione diretta nei tessuti o nel sangue circolante, per esempio ad opera del morso di un animale infetto, quindi per mezzo di artropodi ( batteri peste, febbre ghiandolare, tifo
esantematico; protozoi leishmaniosi cutanea e viscerale, malaria; virus febbre da zecche, febbre gialla).
- Per penetrazione traumatica direttamente nei tessuti profondi dell’organismo di materiali contaminati provenienti dall’ambiente (es: infezione tetanica per contaminazione di ferite lacero- contuse con terriccio). In questi l’infezione si esaurisce nel soggetto infetto e non ha alcuna possibilità di trasmissione. Molto importante è la via parenterale (cute, intracutanea, intramuscolare, intradermica, intravenosa):
- Apparente (quando è visibile, es. ago),
- Inapparente (es. lesione sulla cute che non conosco). *Tutte le malattie da infezione si possono trasmettere tramite via sessuale. * La trasmissibilità delle malattie infettive è definita:
- Orizzontale quando l’infezione si trasmette tra individui diversi e tra loro dipendenti (es: quelle trasmesse per via aerea o per via oro-fecale).
- Verticale quando un’infezione si trasmette dalla madre al feto per via placentare, o dalla madre al neonato durante il passaggio attraverso il canale del parto infetto, oppure ancora attraverso l’allattamento. BATTERI (cellula procariota). Una cellula procariotica è il contrario delle cellule eucariotiche perché in una cellula batterica che ha una complessità interna inferiore, quindi non è compartimentalizzata, non c’è una separazione fisica delle zone dove si svolgono le funzioni vitali della cellula. Una cellula procariotica non ha nucleo ed il materiale genetico è libero nel citoplasma. I batteri costituiscono il gruppo più grande di microrganismi e anche il più vario: sono presenti nel suolo, nell’acqua, nell’aria. Molti sono parassiti di piante e animali superiori oppure patogeni (cioè in grado di causare malattie). La maggior parte dei batteri è però rappresentata da specie commensali (o simbionti) che vivono sul corpo dell’ospite senza causare alcun danno. Molti batteri risultano estremamente utili o addirittura indispensabili all’equilibrio delle funzioni vitali dell’organismo umano. I batteri si presentano in almeno 4 forme diverse a cui corrispondono altrettante denominazioni:
- Forma sferica o ellittica da cui deriva il nome di COCCHI ;
- Forma allungata o cilindrica ovvero i BACILLI ;
- Forma allungata o ricurva ovvero i VIBRIONI ;
- Forma allungata o spirale ovvero gli SPIRILLI (il più importante è il treponema pallidum responsabile della sifilide). Tra la forma sferica e quella allungata o cilindrica esiste una forma intermedia che viene detta COCCOBACILLO e le singole cellule batteriche che lo compongono spesso si trovano raggruppate con disposizioni a coppie, a catenelle o a grappolo. I COCCHI si distinguono in:
- DIPLOCOCCHI ovvero coppie di cellule rotonde o ovoidali (nesseria meningitis e gonorrea),
- TETRADI ovvero cocchi a gruppi di 4,
- STREPTOCOCCHI raggruppamenti a catenelle (streptococco beta emolitico di gruppo A e B),
- STAFILOCOCCHI cocchi raggruppati a grappolo (stafilococco aureus),
- SARCINE aggregati di cocchi a forma cubica a gruppi di 8. Invece i BACILLI si distinguono in:
- DIPLOBACILLI cioè bacilli a coppie,
- STREPTOBACILLI cioè bacilli raggruppati a catenella. La classificazione dei batteri comprende:
- STAFILOCOCCHI che sono batteri di forma sferica, riuniti a grappoli (in ammassi irregolari), sono immobili, privi di una capsula evidente, GRAM+, aerobi-anaerobi facoltativi. Mostrano una notevole resistenza a condizioni ambientali sfavorevoli. In genere STAPHYLOCOCCUS comprende varie specie e tra queste quella più importante è rappresentata dallo “Staphylococcu Aureus”. Questo è un batterio che, una volta avviato il
Le brucelle non producono tossine di natura proteica e la loro azione patogena dipende dalla capacità di resistere alla fagocitosi (inglobare e distruggere le cellule). La cellula batterica è una cellula procariotica, di piccole dimensioni, la cui forma può essere ricondotta a quella di una sfera o un cilindro. È delimitata verso l’esterno da sistemi di rivestimento che sono la membrana plasmatica e la parete cellulare che sono a diretto contatto con il citoplasma. La membrana plasmatica è composta da un doppio strato lipidico che contiene circa il 60% di molecole proteiche che dispongono di una certa mobilità, consentendo quindi il trasporto di sostanze attraverso la membrana. Diversamente da quanto avviene per gli eucarioti, la membrana citoplasmatica dei batteri è priva di steroli e presenta diverse invaginazioni che delimitano particolari strutture dette mesosomi, i quali risultano coinvolti nei processi di divisione cellulare e di fosforilazione ossidativa, nonché nella produzione di alcuni enzimi (esoenzimi). A volte per alcune classi di batteri il materiale genetico, quindi il cromosoma ed eventualmente alcuni plasmidi, si può legare a queste zone formando il nucleosoma, cioè la regione dove è concentrato il materiale genetico (non è il nucleo). Siccome la cellula batterica non possiede i mitocondri, per il trasporto degli elettroni e quindi per la respirazione si utilizzano le invaginazioni (mentre per la cellula eucariotica la respirazione avviene nei mitocondri). La parete cellulare rappresenta l’involucro più esterno della cellula ed è dotato di 2 importanti caratteristiche:
- L’involucro è rigido e gli conferisce quindi la forma e la rigidità della cellula;
- È permeabile in modo tale da consentire il passaggio delle sostanze che, attraverso di essa, possono entrare ed uscire dalla cellula. Il citoplasma batterico è povero di organuli cellulari, è costituito per la maggior parte da acqua in cui sono disperse proteine, carboidrati, lipidi e altre sostanze organiche e inorganiche. All’interno del citoplasma sono evidenti solo i ribosomi coinvolti nel processo di sintesi proteica, granulazioni citoplasmatiche e il cromosoma batterico (DNA). Si tratta di una singola e lunga catena di DNA presente in un’unica copia (aploide), questo filamento di DNA è unito alle 2 estremità. Nei batteri l’informazione ereditaria non è contenuta esclusivamente nel cromosoma ma esistono altre piccole molecole di DNA, anch’esse a struttura circolare, chiamate plasmidi che codificano per diversi caratteri tra cui la resistenza agli antibiotici (plasmidi R). Questi plasmidi vengono definiti plasmidi della resistenza. Abbiamo anche i plasmidi sessuali (plasmidi F) perché la cellula batterica si può riprodurre senza variabilità genetica (i batteri non hanno la meiosi perché non hanno la riproduzione sessuale, ma hanno una scissione semplice cioè si replicano e formano 2 cellule identiche che hanno lo stesso corredo genetico
e fenotipico definite cloni). Affinchè ci sia la possibilità di produrre due cellule identiche è necessaria la replicazione del materiale genetico, della biosintesi della parete cellulare e della membrana. Alcuni batteri sono in grado di produrre all’esterno della parete cellulare un altro rivestimento che prende il nome di capsula. La capsula è uno strato gelatinoso di spessore e densità variabile, costituita da materiale polisaccaridico o polipeptidico (acido ialuronico: costituente fondamentale del tessuto connettivo); costituisce un’ulteriore protezione per la cellula batterica e inoltre aumenta o determina la patogenicità di un batterio esplicando anche attività antigenica evocando la risposta anticorpale. La capsula, isolando il batterio, ne ostacola la fagocitosi ed è quindi un fattore di virulenza perché maschera gli antigeni superficiali (definito anche carattere adattativo di virulenza: adattativo perché consente al microrganismo di resistere al sistema immunitario, di virulenza perché è capace di penetrare nell’ospite, di resistere alle difese immunitarie, di localizzarsi e di moltiplicarsi). La presenza della capsula si evidenzia facilmente per contrasto in preparazioni microscopiche colorate negativamente con inchiostro di china. La colorazione Negativa si allestisce sospendendo i batteri in una goccia di inchiostro di china ed osservando poi al microscopio: i batteri provvisti di capsula sono chiaramente evidenti per l’alone chiaro di cui è circondata la cellula batterica e che spicca sul fondo scuro delle particelle di inchiostro. Un fattore di virulenza è qualsiasi struttura della cellula batterica che le consente di aumentare la sua adesività, di colonizzare, di disseminare, di metabolizzare e di moltiplicarsi, di eludere i meccanismi di difesa determinando in definitiva i meccanismi patogenetici (flagelli, pili e fimbrie). Vi sono batteri che sono in grado di muoversi (colonizzazione mediante adesine che consentono al batterio di aderire) per mezzo di appendici filiformi denominati flagelli che rappresentano l’organo di locomozione. Il flagello può essere diviso in 3 parti:
- Una parte esterna alla cellula costituita da flagellina (una proteina)
- Una parte vuota che attraversa la parete cellulare
- Un corpo basale ancorato alla membrana citoplasmatica che imprime il movimento a tutto il flagello. I flagelli batterici hanno una struttura piuttosto semplice se paragonata a quella dei flagelli e delle ciglia delle cellule eucariotiche. La presenza di flagelli è una caratteristica esclusiva dei batteri di forma cilindrica i quali a seconda della zona di intersezione dei flagelli si distinguono in due gruppi: Batteri con flagelli polari, quando i flagelli sono presenti esclusivamente ad uno o a tutti e due i poli della cellula e batteri peritrichi quando la presenza di flagelli interesse tutta la periferia cellulare. I flagelli batterici sono strutture elicoidali che condizionano il movimento della cellula esclusivamente attraverso la loro rotazione in corrispondenza della struttura basale. Gli anelli hanno la funzione di ancorare Il flagello alle strutture di motore del flagello stesso. Il movimento rotatorio dei flagelli può venire in senso orario o antiorario poiché i flagelli sono strutture elicoidali. Il flagello, nei GRAM – è ancorato sia alla membrana plasmatica interna che esterna mentre nei GRAM + solo a quella interna. I cocchi non hanno flagelli. Altre appendici proteiche più sottili e corte presenti sulla superficie della cellula batterica sono le fimbrie o pili, ma non tutti i batteri ne sono provvisti. Sono presenti in alcuni GRAM-, specie enterici, non servono per muoversi e si distinguono in:
- Pili comuni consentono al batterio di aderire meglio al substrato aumentandone quindi le capacità infettive, hanno potere agglutinante, servono per aumentare la superficie, per respirare, per utilizzare i nutrienti e sono importanti per l’adattamento all’ambiente e per la patogenicità.
- Pili sessuali invece, sono pochi, più grandi, cavi e sono coinvolti nei fenomeni di coniugazione batterica e consentono il passaggio del materiale genetico da una cellula donatrice ad un’altra ricevente. In alcuni batteri soprattutto GRAM+, si ha la produzione di strutture particolari chiamate spore. La formazione della spora ha inizio quando nel terreno colturale o nell’ambiente esterno vengono meno i principi attivi essenziali alla vita del batterio. Esse assumono il significato di resistenza e vengono prodotte in condizioni ambientali sfavorevoli alla vita della cellula. Poiché le spore vengono prodotte sempre all’interno della cellula prendono il nome di endospore e i batteri che le producono vengono chiamati sporigeni. La cellula batterica in condizioni di vita normale è una cellula vegetativa, mentre quando
COLORAZIONE GRAM.
Fu messa a punto nel 1884 dal medico Gram e mette in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei microrganismi. Il dottor Gram ha preso in laboratorio una colonia (=POPOLAZIONE) batterica che nasce sui terreni di coltura, l’ha strisciato su un vetrino e ha fissato i batteri al vetrino. Fissare i batteri al vetrino significa uccidere i batteri e farli aderire al vetrino. La colorazione di Gram non la si fa mai sulle piastre. Una volta fissati i batteri sul vetrino, si procede alla colorazione di Gram. Questa colorazione prevede un primo trattamento del preparato con il cristalvioletto (un colorante basico idrofilo e quindi si lega agli strati finali di peptidoglicano) e fatto reagire per 3 minuti circa. Dopo c’è il lavaggio del vetrino con acqua e con liquido di lugol, un mordensante, ovvero una sostanza che favorisce la penetrazione del colore nella struttura che deve essere colorata e si lascia agire per circa 1 minuto. Successivamente il materiale viene lavato con una soluzione decolorante (miscela in parti uguali di alcol etilico e acetone) e si lascia agire per 30 secondi. Lavare con H 2 O. A questo punto si passa al secondo trattamento con la fucsina basica o l’ eosina che colora le altre cellule di rosso. Si osserva alla fine che, vi sono batteri colorati di viola e sono i GRAM+, mentre i rossi sono GRAM-. La differenza tra GRAM+ e GRAM- (vista attraverso il microscopio elettronico) consiste nella diversa architettura della parete cellulare che influisce sull’azione dei coloranti nei 2 gruppi batterici. I batteri GRAM + hanno uno spesso strato denso agli elettroni mentre i GRAM – hanno un sottile strato denso agli elettroni. La parete cellulare dei GRAM + è formata da zuccheri di peptidoglicano (zuccheri complessati con peptidi), al contrario della parete cellulare dei GRAM – dove ci sono lipidi che si sciolgono nell’alcol e nei solventi organici mentre gli zuccheri no. Batteri GRAM+. La parete cellulare dei GRAM+ è formata da peptidoglicani a cui sono associati acidi teicoici (polimeri di alcoli polivalenti (in genere glicerolo o ribitolo) esterificati con acido fosforico cui possono legarsi a loro volta numerosi monosaccaridi o amminoacidi diversi, come ad esempio la D-alamina) e polisaccaridi. L’insieme di questi contribuisce a determinare gli antigeni di superficie dei GRAM+, nonché la loro capacità di aderire alle mucose. La spessa parete dei GRAM+ è una struttura altamente polare. Inoltre, nei GRAM+ l’azione dell’alcol disidrata lo strato di peptidoglicano riducendone la permeabilità e impedendo l’allontanamento del cristalvioletto. Sono GRAM+ i micrococchi, gli stafilococchi, i bacilli, i clostridium, batteri propionici e icobatteri. I batteri GRAM+ sono insensibili ad alcuni farmaci antibatterici e in particolare ad alcuni farmaci che impediscono la sintesi del peptidoglicano. Sono più resistenti anche agli antibiotici perché nel periplasma sono presenti enzimi come la beta-lattamasi che distruggono l’anello beta-lattamico di alcuni antibiotici, tra cui la penicillina. P.S. gli acidi teicoici sono sostanze antigeniche, cioè vengono riconosciute dal sistema immunitario di un ospite come antigeni e vengono legati dalle immunoglobuline specifiche. Oltre a questo fungono da ancoraggio della cellula batterica ai recettori che sono posti sulla superficie delle cellule. Lo spesso strato di PEPTIDOGLICANO e gli acidi teicoici intercalati non rappresentano un particolare ostacolo al passaggio di alcune selezionate molecole di dimensione ragguardevoli. Batteri GRAM-. La parete cellulare dei GRAM- è più complessa. La membrana esterna si trova al di fuori dello strato di peptidoglicano e la proteina presente in maggiore quantità è la lipoproteina di Braun la quale si lega alla membrana esterna. La membrana esterna presenta molte e complesse molecole denominate lipopolisaccaridi (LPS) (endotossina dei GRAM - ) suddivisi in 3 complessi distinti:
- La regione del lipide A: costituita da un disaccaride, con attaccati a ciascun carboidrato, 3 acidi grassi e fosfato;
- Il nucleo polisaccaridico: costituito da una catena di 10 zuccheri ed è legato al lipide A. Forma la parte centrale o core formato da KDO (ketodiossioctomonico) + una catena di zuccheri dove c’è l’eptoso (8 carboni) ;
- La catena laterale O, o antigene O: costituita da una corta catena polisaccaridica che si proietta dal nucleo verso l’esterno. Costituita dalla successione di 4 zuccheri uguali o diversi che possono ripetersi n volte. È diversa nei batteri appartenenti a specie diverse, ma anche della stessa specie. La membrana esterna è dotata di canali speciali che consentono la diffusione passiva di numerose molecole idrofile come zuccheri, amminoacidi. Questi canali consistono di particolari molecole proteiche denominate porine, che in coppie attraversano la membrana esterna. Per l’ingresso di molecole idrofile più grandi è necessaria la presenza di sistemi di trasporto ( proteine carrier di membrana ), anche se sono presenti in numero ridotto. Al di là della membrana plasmatica esterna vi è quella interna. Lo spazio tra le 2 prende il nome di spazio periplasmico (ecco perché resistono alla penicillina: quando la penicillina giunge in questo spazio, lì ci sono degli enzimi, le penicillasi che tagliano l’anello beta lattamico della penicillina e lo degradano). Le 2 membrane sono semipermeabili. In questo spazio, inoltre, è posto un sottile strato di peptidoglicano. Questo spazio è sottile nei GRAM + mentre è più spesso in quelli -. Nello spazio periplasmatico dei batteri gram negativi ci sono le beta lattamasi: enzimi che tendono a scindere l’anello beta lattamico della pennicelina, che è il principio attivo ed è uno degli antibiotici più utilizzati. Ecco perché è importante stabilire se si tratta di batteri gram positivi o negativi, poiché significherebbe escludere una classe di antibiotici. LPS (LIPOPOLISACCARIDE). LPS è uno strato lipopolisaccaridico che si trova all’esterno dello spazio periplasmatico. È un componente essenziale della parete cellulare dei GRAM- ed ha una precisa funzione nell’azione patogena dei batteri GRAM- rappresentandone la componente endotossica. La molecola di LPS consiste in 3 porzioni:
- Una Porzione lipidica chiamata lipide A , che rappresenta l’endotossina vera e propria, costituita da un glicolipide, ovvero la glucosammina esterificata con una serie di acidi grassi saturi da 12 o 16 atomi di Carbonio;
- Una corta catena di zuccheri , che forma la parte centrale o core della molecola, con una struttura praticamente costante in tutti i batteri GRAM- e caratterizzato dalla presenza di 2 zuccheri: Acido chetodeossioctonoico ed un eptoso.
- Infine una terza porzione che consiste in una lunga catena polisaccaridica con proprietà antigeniche, il cosiddetto antigene che veicola il lipide A, formata dalla ripetizione di una serie di subunità tri, tetra o penta saccaridiche. Meccanismo d’azione dell’LPS. L’LPS viene rilasciato dai GRAM-, viene veicolato nel sangue da proteine di trasporto, ovvero le LBP , e si lega poi ai recettori presenti sulle cellule dell’ospite. Infine vengono rilasciati i fattori dell’ infiammazione sistemica che sono responsabili dei danni a organi e tessuti. AZIONE PATOGENA DEI BATTERI. Il potere patogeno dei batteri è la risultante sia della capacità di moltiplicazione in “vivo”, sia della tossigenicità. Il ruolo principale dei batteri nel determinare la loro azione patogena è svolto dalla produzione di tossine (veleni). Si tratta di sostanze macromolecolari che vengono elaborate dai microrganismi con lo scopo di provocare gravi danni all’ospite. Alcune tossine si trovano normalmente libere nei terreni di coltura, poiché il batterio le elimina man mano che le produce, in questo caso si parla di esotossine. Altre tossine invece risultano legate alle strutture batteriche e vengono liberate solo dopo la morte e prendono il nome di endotossine. Un batterio può essere definito patogeno quando esso si dimostra capace di invadere i tessuti di un organismo e di moltiplicarvisi, danneggiando in modo più o meno grave il funzionamento dell’ospite con la produzione di una o più sostante tossiche specifiche. Capacità di moltiplicazione in vivo e tossigenicità sono pertanto le due componenti fondamentali del potere patogeno. La capacità di moltiplicazione in vivo è sinonimo di virulenza termine che secondo altri deve essere usato come misura della patogenicità globale esprimendo la capacità di moltiplicazione in vivo con il termine invasività. L’attecchimento e la moltiplicazione in vivo di un batterio patogeno ed il danno che esso è in grado di provocare attraverso la sua azione tossigena, sono la conseguenza di numerose proprietà: capacità di colonizzare mucose dell’organismo e di penetrare attraverso l’epitelio mucoso nei tessuti profondi ecc.
Sul sistema nervoso agiscono invece la tossina tetanica e la tossina botulinica. Queste tossine sono definite batteri anaerobi-spenti obbligati gram+ , ciò significa che non sono presenti nell’aria perché morirebbero data la presenza di ossigeno e sono batteri che appartengono ai clostridi (clostridium tetanum e botulinum). Nell’ambiente, però, troviamo le spore che resistono alla mancanza del nutrimento e si adattano alle condizioni atmosferiche. Le cellule batteriche muoiono in presenza di ossigeno però le spore che vengono rilasciate si possono adagiare su superfici così da rientrare nell’organismo. TOSSINA TETANICA Agisce a livello del sistema nervoso centrale. Quando abbiamo una ferita è preferibile far uscire il sangue così da mantenerla pulita, mentre quando va in necrosi lo avvertiamo già dal cattivo odore. Qui la spora tende a germinare perché trova una condizione favorevole anaerobia formando la cellula vegetativa che si moltiplica e forma la tossina. La tossina si lega ai neuroni sensitivi e viene portata in direzione centripeta al livello del sistema nervoso centrale perché le terminazioni nervose giungono al midollo spinale. Qui gli assoni rilasciano delle sostanze attivando i moto neuroni da cui parte il segnale che giunge alla giunzione neuro-muscolare e consente la contrazione. I muscoli lavorano in coppie, uno si contrae e l’altro si rilassa, però la tossina tetanica impedisce la connessione tra i due muscoli, perciò avvengono due contrazioni contemporaneamente e si muore perché se questi segnali arrivano al cuore impediscono la contrazione del diaframma (paralisi spastica) e la respirazione diventa impossibile provocando il soffocamento. TOSSINA BOTULINICA Utilizzata in chirurgia plastica perché paralizza. Agisce al livello del sistema nervoso periferico, cioè al livello delle giunzioni muscolari. Nel muscolo c’è la giunzione tra l’assone e la muscolatura, in questo spazio ci sono i recettori dell’acetilcolina e dell’altro actina e miosina. Il legame dell’acetilcolina modifica il potenziale d’azione e c’è lo scorrimento dell’actina e miosina. In questo caso viene impedito, dalla tossina botulinica, il rilascio dell’acetilcolina, quindi non c’è la contrazione del muscolo e si va in contro alla morte per paralisi flaccida sempre perché il diaframma non si contrae. TOSSINA ESFOLIATIVA è una tossina prodotta da STAPHYLOCOCCUS AUREUS. Il meccanismo d’azione di questa tossina sembra riconducibile al possesso di un ‘attività serino-protoseasica atipica che viene attivata solo dopo la fissazione della tossina a livello dello strato granuloso dell’epidermide e che rende la tossina in grado di provocare la rottura delle proteine della matrice intracellulare. Soltanto la tossina botulinica e la stafilococcica resistono ai succhi gastrici. Quindi si parla di una intossicazione alimentare. ENDOTOSSINE. Le endotossine sono tossine che vengono liberate solo dopo la lisi batterica (nascita, crescita, produzione e morte) oppure quando una cellula si replica e sono identificabili con lo strato lipopolisaccaridico della parete cellulare dei batteri GRAM-. Caratteristiche delle endotossine sono: un’inferiore tossicità rispetto alle esotossine, una relativa termo resistenza e l’incapacità di formare anotossine. L’azione patogena delle endotossine è dovuta alla loro frazione lipidica (lipide A) e tra le loro attività biologiche ricordiamo:
- Pirogenicità che provoca nell’ospite una reazione febbrile;
- Attivazione del complemento e attivazione piastrinica;
- Leucopenia seguita da leucocitosi: inizialmente si assiste alla marginazione dei leucociti che aderiscono alla superficie dei vasi, successivamente si ha la leucocitosi per immissione dei globuli bianchi da parte del midollo osseo;
- Ipotensione ovvero i mediatori delle endotossine fanno abbassare la pressione causando lo shock. Si parla di shock ad alta portata perché nonostante aumenta la gittata cardiaca la pressione diminuisce lo stesso. Vengono legate alle proteine prodotte dal fegato, ovvero le LBP, perché normalmente ci sono dei batteri nel nostro organismo. Le LBP prendono le endotossine portandole ai macrofagi per far sì che le distruggano. L’LBP con LPS si legano ai recettori CD 14, che sono presenti sulle superfici dei macrofagi e sono associati ai TOOL LIKE PLR di tipo 4 (proteine che giocano un ruolo chiave nella difesa dell’organismo, in particolare nell’immunità innata). Questi PRL trasducono un segnale e inducono l’attivazione del macrofago attraverso la liberazione di citochine. Questo macrofago attivato ha la capacità di distruggere il lipopolisaccaride, però durante l’infezione abbiamo una concentrazione elevata perciò le citochine ne
attirano delle altre, quindi non è possibile distruggerle. Tutto ciò provoca l’abbassamento della pressione e l’innalzamento della temperatura corporea, quindi il soggetto va in contro allo shock settico e alla morte. Le endotossine non agiscono sulla sintesi ma sulla risposta immunitaria. METABOLISMO BATTERICO ci serve per completare il ciclo vitale. Ogni batterio ha un proprio metabolismo che viene definito inducibile. Con il termine metabolismo si indica l’insieme delle reazioni biochimiche necessarie per la produzione di energia e per l’utilizzo dell’energia prodotta, nella sintesi di materiali cellulari, a partire dalle molecole di precursori ottenute dalle fonti alimentari reperite nell’ambiente. Lo scopo finale del metabolismo di un essere unicellulare è rappresentato dalla duplicazione delle strutture necessarie per procedere alla propria divisione in 2 cellule figlie. L’energia utilizzabile dalla cellula batterica nei processi biosintetici è quella temporaneamente immagazzinata nei legami ad alto livello energetico della adenosina-trifosfato o ATP. Durante le reazioni biosintetiche (anabolismo diminuisco il disordine molecolare. Aumento l’entalpia (liberare energia chimica) utilizzo di energia), l’energia necessaria è ottenuta dall’idrolisi di ATP in ADP (adenosina- difosfato). Anabolismo significa sintesi ed è l’insieme di reazioni endoergoniche perché per avvenire hanno bisogno di energia. I batteri patogeni che sono tutti (micro)organismi chemiosintetici necessitano di composti organici, contemporaneamente, come sorgente di energia e come fonte (alimentare) di Carbonio. I batteri patogeni, quindi, sono tutti microrganismi chemiosintetici, orfanotrofi ed eterotrofi. Nei processi catabolici (catabolismo liberazione di energia e produzione di ATP che viene utilizzata per l’anabolismo molecola da complessa a semplice) a scopo “energetico”, la cellula può fosforilare ADP per produrre ATP, fondamentalmente in 2 modi:
- Mediante l’utilizzo diretto di energia per la formazione di intermedi fosforilati dai quali è energeticamente possibile il trasferimento del radicale fosforico all’ADP ( fosforilazione a livello del substrato );
- Utilizzando anche, attraverso organuli specializzati nella fosforilazione dell’ADP, presenti sulla membrana cellulare, l’energia che si libera durante il trasporto di elettroni dal substrato ad un accettore finale “esterno” ( fosforilazione mediante trasporto di elettroni ). La fosforilazione a livello del substrato è il più semplice meccanismo di fosforilazione di ADP in ATP e si verifica durante i processi di fermentazione. La fosforilazione mediante trasporto di elettroni, è un processo molto più complicato ed efficiente, che si è evoluto in epoche successive e che, negli organismi chemio sintetici, si verifica durante i processi di respirazione. In entrambi i processi l’energia utilizzabile deriva da reazioni di ossido-riduzione. Le differenze tra fermentazione e respirazione sono:
- Nella fermentazione l’energia utilizzabile per la fosforilazione di ADP in ATP è solo quella che si libera durante la rimozione di elettroni dal substrato catabolizzato a scopo energetico, mentre il NAD ridotto (NADH) che ne risulta, si riossida riducendo, a sua volta, un sottoprodotto “organico” dello stesso processo catabolico. Nella fermentazione la resa di ATP è meno redditizia rispetto alla respirazione batterica ( 2 molecole ATP fermentazione, 38 molecole ATP respirazione). I batteri sono in grado di “fermentare” numerose sostanze organiche, soprattutto carboidrati, fra questi principalmente glucosio. Il glucosio viene trasformato all’interno della cellula in glucosio- 6 - fosfato , per ottenere in seguito acido piruvico, ATP, NADH.
- Nella respirazione, invece, per la fosforilazione di ADP in ATP, è utilizzata anche l’energia che si libera dalla riossidazione del NAD, che avviene attraverso la cessione di elettroni dal NADH ad una catena di trasportatori, che li convogliano ad un accettore “inorganico” esterno. La respirazione batterica si completa con 2 tappe: a. Ciclo di Krebs: l’energia contenuta nella molecola di glucosio viene, in minima parte, liberata con la glicolisi, processo che porta alla formazione di acido piruvico. Questo è trasportato all’interno dei mitocondri, dove in presenza del Coenzima A (CoA), va incontro alla decarbossilazione ossidativa con formazione di Acetil CoA e produzione di CO 2. L’Acetil CoA inibisce il ciclo di Krebs.
RIPRODUIONE E CRESCITA BATTERICA.
I batteri si riproducono attraverso un processo di scissione o fissione binaria. Si tratta di una riproduzione asessuata che ha come risultato una popolazione composta da individui tutti uguali tra loro. La riproduzione della cellula batterica ha inizio con la duplicazione del cromosoma. Ciascuna elica fa da stampo per la sintesi di una copia e il cromosoma originario è strettamente ancorato alla membrana citoplasmatica. Inizia a questo punto l’allargamento della cellula; il citoplasma aumenta e la membrana citoplasmatica si invagina sempre di più fino a formare un setto trasversale. Una volta che si è conclusa la formazione delle 2 cellule figlie, esse possono rimanere unite o distaccarsi diventando così autonome. La riproduzione delle cellule batteriche potrebbe continuare incessantemente se fossero presenti condizioni ambientali favorevoli. In realtà però vi sono alcuni fattori limitanti, in grado di arrestare o limitare il processo di crescita, come per esempio l’esaurimento di sostanze nutritive o di H 2 O. La crescita batterica può essere valutata quantitativamente o valutando l’aumento della massa totale o l’aumento del numero di cellule e si traduce graficamente in una curva in cui possiamo distinguere diverse fasi:
- Fase di latenza che rappresenta il periodo di adattamento delle cellule batteriche al terreno in cui vengono trapiantate. In questa fase non si hanno processi riproduttivi e la popolazione non aumenta;
- Fase di accelerazione ovvero la fase di crescita. Iniziano le divisioni cellulari ed aumentano progressivamente fino a raggiungere rapidamente il ritmo massimo per quella specie e in quella condizione colturale;
- Nella fase esponenziale le cellule si riproducono attivamente e con velocità costante;
- Nella fase di decelerazione il ritmo di divisione cellulare diminuisce progressivamente;
- Nella fase stazionaria il tasso di sviluppo è nullo in quanto mortalità e natalità si equivalgono;
- Nella fase di declino o morte il tasso di mortalità supera largamente quello di natalità e la popolazione decresce. PRODUZIONE DI SPORE. La produzione di spore si realizza tramite alcuni bacilli del genere BACILLUS e CLOSTRIDIUM. La presenza di una spora all’interno di un batterio è facilmente evidenziabile dall’osservazione al microscopio ottico. Nei preparati colorati infatti, la spora appare come un corpicciolo incolore, essendo la spora difficilmente penetrabile. Nel genere Bacillus il diametro della spora, di solito, non eccede quello della cellula batterica (sporangio) quindi NON è deformata. Nei batteri del genere clostridium invece, il diametro della spora è maggiore di quello della cellula che appare ingrossata. Dall’interno verso l’esterno sono:
- Corteccia o cortex formata essenzialmente da peptidoglicani che contengono residui citoplasmatici della cellula madre;
- 2 rivestimenti o coats, denominati interno ed esterno, composto da proteine molto stabili contenenti lipidi e peptidoglicani;
- Sottile membrana detta esosporio fosfolipoproteica contenente acidi teicoici.
Un componente caratteristico della spora è l’acido dipicolinico , un acido bicarbossilico che insieme a grandi quantità di Ca+ si trova localizzato nella cortex che serve a stabilizzare la struttura. Le spore sono forme di resistenza a numerosi agenti chimici e fisici e sono prive di attività metabolica, infatti possono sopravvivere a lungo (anche anni) in questa fase di latenza. Hanno una termo resistenza elevata anche ad alte temperature, infatti sono la causa di grossi problemi epidemiologici e tecnici (preparazione di conserve alimentari, sterilizzazione di materiali chirurgici ecc.). FISIOLOGIA DELLA SPORIFICAZIONE E GERMINAZIONE. La germinazione della spora, ossia la fermentazione a partire dalla spora, di una cellula vegetativa si verifica quando le condizioni ambientali (soprattutto la concentrazione di alimenti utilizzabili) ritornano favorevoli alla crescita batterica. L’inizio del processo consiste nell’eliminazione dalla spora dell’acido dipicolinico e di grandi quantità di Ca+. Proprio l’assenza del Ca+ rende più labile la struttura degli involucri periferici, soprattutto del cortex. La cellula neoformata può tornare alla forma vegetativa o, se le condizioni lo consentono, avviarsi verso la fase logaritmica di riproduzione. La fase vegetativa e la sporificazione sono metabolicamente INATTIVE e inoltre vi è una modificazione del DNA e quindi della struttura. COLTIVAZIONE DEI BATTERI. La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di terreni o mezzi di coltura con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si vuole coltivare. Normalmente un terreno di coltura, prima della semina, dovrà essere sterile e contenuto in recipienti anch’essi sterili. Con il nome di semina si intende l’operazione attraverso la quale si immette un inoculo (poche cellule vive) di un campione contenete microrganismi a contatto con terreni di coltura allestiti in piastra e provette. I terreni di coltura possono essere liquidi o solidi e sono delle preparazioni che contengono nutrienti necessari per la crescita dei batteri. È importante avere terreni di coltura neutri (grazie agli agenti tamponanti ci consento di mantenere un valore di Ph intorno a 7) con temperatura ideale di 36,8 gradi. Quando varia il ph della soluzione del terreno di coltura? Quando produce acidi perché si liberano ioni H+ e si avrà appunto un’acidificazione. Allora si possono avere 2 casi:
- Se il batterio produce la CO2 non acidifica, non induce la variazione del ph e quindi non modifica il colore dell’indicatore del ph pertanto la colonia rimane o incolore o colorata di bianco, viceversa se il batterio metabolizzando la sostanza produce acidificazione del terreno in prossimità della colonia, io avrò che l’indicatore di ph cambia di colore e la colonia diventa gialla. Quindi riesco a capire che tipo di metabolismo ha il batterio e riesco così ad identificarlo. I terreni di coltura solidi si distinguono da quelli liquidi (definiti brodi) per la presenza di una sostanza gelificante o solidificante, l’AGAR, un polisaccaride estratto da alghe rosse. Questa sostanza è solida al di sotto dei 45°C e liquida a temperature superiori agli 85°C; non è tossica per i batteri e solo pochissimi possiedono esoenzimi in grado di depolimerizzarlo. Lo sviluppo dei batteri in un terreno di coltura liquido si evidenzia con un intorbidimento del terreno e, a seconda della specie batterica interessata, l’intorbidimento può essere diffuso in tutto il recipiente di coltura o può essere limitato agli strati superficiali. I terreni di coltura possono ancora essere classificati in:
- Naturali (patate, latte, malto);
- Sintetici composti da glucosio, NaCl e Sali minerali;
- Semisintetici generici: sono i più usati in quanto consentono la crescita di una vasta gamma di microrganismi. Vengono distinti in brodo nutriente, brodo glucosato e brodo vegetale;
- Semisintetici specifici che vengono distinti in: a. Differenziali : così chiamati perché contengono opportuni rilevatori di attività biochimiche che consentono di distinguere tra loro microrganismi differenti; b. Selettivi o di isolamento : che contengono sostanze che favoriscono la crescita solo della specie batterica in osservazione inibendo lo sviluppo degli altri microrganismi (si utilizzano se devo ricercare un singolo batterio in un campione biologico polimicrobico);
Una volta identificato il batterio si deve studiare la resistenza agli antibiotici prendendo la colonia batterica e mettendola in una soluzione di Nacl oppure acqua sterile. MICROSCOPIO (esame parassitologico). Il microscopio è quello strumento capace di fornire un’immagine ingrandita di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso. A seconda della radiazione utilizzata per illuminare il campione, si distinguono 2 tipi principali di microscopio ottico ed elettronico. Quello ottico usa una radiazione visibile (luce), nel secondo si utilizza un fascio di elettroni accelerati. Microscopio ottico: il nome completo è microscopio ottico composto, è costituito da una combinazione di 2 lenti convergenti (l’obiettivo è l’ oculare ). L’obiettivo raccoglie la luce proveniente dal campione e ne fornisce un’immagine reale, capovolta e ingrandita. L’oculare riceve questa immagine nel proprio fuoco e la trasforma nell’immagine finale che è virtuale e ingrandita rispetto all’immagine reale. Comprende inoltre il piano porta campioni e alcuni dispositivi che regolano la distanza dell’obiettivo dell’oggetto, quindi per la messa a fuoco. In genere il campione da osservare viene posto tra 2 vetrini sottili posti a loro volta su un tavolo traslatore e viene fissato al porta campioni. La luce che lo illumina può provenire da una sorgente diretta o da uno specchio che lo indirizza sul campione. Esistono diversi tipi illuminazione del campione a seconda delle sue caratteristiche di trasparenza e opacità. I sistemi più utilizzati sono quello a trasmissione (o a campo chiaro) e a diffusione (o a campo scuro). Nel primo caso la luce proviene da una lampada a incandescenza e attraversa il campione completamente; nel secondo caso la luce colpisce il campione e viene diffusa. Non si possono vedere i virus con questo. L’esame microscopico in questo caso si può fare attraverso un’osservazione microscopica a fresco oppure previa osservazione o colorazione. Nel primo caso si prende il campione biologico, lo si poggia su un vetrino, si aggiunge una goccia di soluzione fisiologica, si copre un vetrino coprioggetto e infine si osserva al microscopio la forma e la mobilità (esame allo stato vivente). Nel secondo caso si fissano i batteri al vetrino (ucciderli mediante la fiamma del becco bunzen per consentire al colorante di penetrare), si prende il campione biologico e si strisciano su un vetrino. Il microscopio a fluorescenza non è altro che un microscopio ottico a differenza della fonte luminosa che in questo caso è rappresentata da una lampada a mercurio e da un sistema di filtri. Microscopio elettronico: è analogo al microscopio ottico. Vi è una sorgente che produce la radiazione che incide sul campione e va a comporre l’immagine ingrandita. Infatti, si tratta di un fascio di elettroni accelerati nel vuoto. Le lenti convergenti non sono di tipo ottico ma elettromagnetico, sono costituite da campi elettrici e magnetici che sono in grado di modificare la traiettoria delle particelle cariche. L’immagine viene composta su uno schermo fluorescente o, in alternativa, mediante sistemi fotografici o televisivi. Esistono essenzialmente 2 tipi di microscopio elettronico, quello a trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM). L’elettronico ha un potere di risoluzione (ci consente di vedere non solo la struttura superficiale e determinate caratteristiche intracellulari, ma tutti gli organuli intracellulari) maggiore rispetto a quello ottico. L’ingrandimento invece dipende dal tipo di lenti che si utilizzano. L’esame microscopico è utile per campioni biologici sterili, il liquido cefalorachidiano, il sangue e può essere associato ad un esame colturale. ESAME COLTURALE. Il primo passo della ricerca colturale consiste nell’isolamento dei batteri presenti in un materiale in laboratorio, impiegando di volta in volta i terreni e le condizioni di incubazione più idonee allo sviluppo del batterio di cui si desidera accertarne la presenza (se la domanda è precisa) o, utilizzando un certo numero di terreni diversi e varie condizioni di incubazione quando la domanda è generica. L’esame colturale consente di sottoporre ad indagine una quantità di materiale patologico molto superiore a quella che è utilizzata per un preparato microscopico, ha sempre maggiore probabilità di successo della ricerca microscopica. In particolare abbiamo: URINOCOLTURA (esame colturale delle urine effettuata per avere una certezza di un sospetto diagnostico): l’elevata frequenza delle infezioni delle vie urinarie, anche in condizioni asintomatiche, ha imposto quasi come routine l’analisi batteriologica dell’urina che prende il nome di urinocoltura.
L’urina deve essere raccolta in un recipiente sterile e durante la raccolta deve essere rispettata l’asepsi al fine di evitare la contaminazione del campione con batteri che si trovano nell’ultimo tratto dell’uretra o nella zona pubica. Il metodo comunemente usato è quello del mitto intermedio che si effettua scartando la prima urina e raccogliendo parte della successiva nel contenitore. Normalmente l’urina (campione biologico e prodotto di escrezione dei reni dalla filtrazione del sangue) è sterile ma, se esiste una lieve infezione o contaminazione, essa rappresenta un ottimo terreno di coltura per lo sviluppo di batteri presenti (si contamina nell’ultimo tratto dell’uretra). L’esame viene eseguito su piastra usando come terreno l’AGAR sangue (terreno universale) oppure si utilizza il cled ( perché uno dei contaminanti principali è il proteus mieabilis , che tende a camminare nel terreno di coltura ). L’urina viene diluita in rapporto 1:100 e viene distribuita sulla piastra con una spatola sterile. Per l’urinocoltura non è importante solo verificare la presenza del microorganismo, ma considera anche la quantità. Si parla di infezione quando la carica microbica è superiore a 100000 cfu/ml, quindi 100 colonie su una piastra. Dopo aver determinato la carica microbica, si prosegue all’identificazione della specie batterica responsabile dell’infezione e si prosegue con l’ antibiogramma (procedimento sperimentale per saggiare la sensibilità di una specie microbica verso 1 o più antibiotici e per scegliere l’antibiotico più adatto). Dopo di che si propone l’antibiotico opportuno. Infine si stabilisce la MIC e la MBC. Nei neonati si deve usare una bustina da cambiare ogni 30 minuti dopo aver lavato il bimbo, oppure si può usare il catetere. Appena prelevata l’urina va subito portata in laboratorio per evitare che nuovi batteri si colonizzino e se non possiamo portarla tempestivamente va messo il campione nel frigorifero a 4°. COPROCOLTURA: è l’esame colturale delle feci che si esegue per la ricerca e l’identificazione di Salmonelle o Shigelle, ceppi patogeni di escherichia Coli, vibrioni del colera. Il materiale va prelevato nella fase acuta della sindrome di diarrea poiché proprio in questo periodo i patogeni sono più abbondanti e risulta più facile il loro isolamento. Si raccoglie un piccolo campione di feci in un recipiente sterile con il cucchiaino e si procede al più presto all’esame colturale, in quanto i batteri non sopravvivono a lungo. Per quanto riguarda la ricerca di salmonelle, Shigelle e ceppi patogeni di E. Coli, è opportuno procedere ad un arricchimento selettivo (terreno selettivo) seminando una piccola quantità di campione in brodo selenite che favorisce lo sviluppo di questi batteri. Dopo l’incubazione a 37°C per 24H si procede ad un trapianto in terreni selettivi. Questi terreni permettono la differenziazione delle colonie lattosio fermentanti da quelle sospette ed è proprio su queste ultime che si procede all’identificazione con le tecniche standard (antibiogramma). EMOCOLTURA: l’esame colturale del sangue (campione biologico sterile) viene praticato in presenza di febbre elevata e persistente di origine non chiara o di accessi febbrili improvvisi accompagnati da brividi (sospetto di sepsi o batteriemia). Si fa per vedere se ci sono batteri nel circolo ematico. Il prelievo di sangue venoso va effettuato durante la puntura febbrile (nelle prime fasi dove c’è il brivido) e prima di iniziare ogni terapia antibiotica in flaconi che contengono terreni di coltura. Per una diagnosi corretta è consigliabile procedere ad almeno 3 emocolture con sangue prelevato ad intervalli di tempo nell’arco di 18-24H. Il sangue prelevato viene, poi, trasferito sterilmente nelle apposite bottiglie per emocoltura che contengono un mezzo colturale liquido idoneo e un tappo-slide con terreni di coltura organizzati con i quali entra in contatto il liquido prelevato. La coltura viene eseguita ogni giorno per accertarsi di un eventuale sviluppo microbico, che può essere evidenziato da un intorbidimento. Dopo di ciò si procede con la semina di qualche goccia di brodo coltura nei terreni e quindi all’identificazione dei germi isolati. Su 8 litri di sangue preleviamo una piccola quantità e dobbiamo essere fortunati che il batterio in quel momento sia nel circolo sanguigno perché quando si ha una un’alta risposta immunitaria, il batterio cerca di nascondersi, mentre se si ha una bassa risposta immunitaria c’è più probabilità di prendere il batterio. Per capire se ha una bassa risposta immunitaria si deve misurare la temperatura corporea, se si ha il picco febbrile è inutile fare il prelievo. Questi flaconi hanno un sistema di monitoraggio per la produzione di CO 2 perché questa si produce quando il batterio metabolizza, perciò viene segnalato come positivo, cioè c’è stata una crescita batterica. La prima cosa da fare dopo la positività è un’osservazione batterica per vedere se sono batteri gram+^ o gram-, così da poter scegliere il terreno di coltura più adatto per quel batterio. Dopo che il batterio è cresciuto si deve studiare il metabolismo batterico. Dopo di questo procediamo con l’antibiogramma e arriva finalmente il referto che ci dice chi è il microorganismo, la quantità e anche a quali antibiotici è sensibile.
- IgG: che rappresentano circa l’80% di tutti gli anticorpi circolanti. Sono importanti per neutralizzare le tossine batteriche da virus extracellulare e la loro concentrazione aumenta in presenza di un’infiammazione. Si trovano nel sangue e in altri liquidi biologici e favoriscono la fagocitosi;
- IgM: sono le uniche Ig sintetizzate nel neonato nei primi giorni di vita e le prime ad essere prodotte nella reazione immunitaria. Si trovano solo nel sangue e possiedono azione agglutinante (infiammazione acuta);
- IgA: sono presenti nelle mucose e vengono prodotte dal tessuto linfoide della mucosa intestinale. Hanno una vita breve (6 giorni) e si trovano in secrezioni quali la saliva, le lacrime ecc;
- IgD: che rappresentano solo il 16% delle Ig;
- IgC: coinvolte nelle reazioni allergiche. IgM in fase iniziale di infezione (sta iniziando qualcosa), poi con l’evoluzione della malattia produciamo anche IgG (sta succedendo qualcosa) e poi successivamente scompaiono le prime e rimangono solo le seconde (è successo da un po’ qualcosa). Li andiamo a valutare con le reazioni sierologiche. REAZIONI ANTIGENE-ANTICORPO. Questa reazione è data dall’unione di un antigene con lo specifico anticorpo (es: antigene dell’epatite). La resistenza di un organismo verso uno specifico agente si svolge su 2 livelli:
- Immunità naturale o aspecifica: è quell’immunità che un individuo possiede al momento della nascita ed è costituita da barriere meccaniche, chimiche e biologiche. Fra le barriere meccaniche ricordiamo l’integrità della cute e delle mucose che rappresentano una barriera efficace contro l’ingresso di germi e autogeni. Le barriere chimiche vengono elaborate da diversi tessuti ed esercitano un’azione difensiva. È il caso dell’ interferone (una glicoproteina con azione antivirale), il lisozima (un antibatterico presente in alcune secrezioni come le lacrime) e il complemento (un complesso multi proteico ad azione enzimatica in grado di promuovere la lisi di microrganismi e cellule estranee). Le barriere biologiche sono rappresentate dalla fagocitosi, febbre e infiammazione. La fagocitosi consiste nella capacità di inglobare e distruggere le cellule estranee, ed è operata da microfagi (granulociti neutrofili del sangue) e macrofagi. La febbre può essere considerata un vero e proprio meccanismo di difesa in quanto, l’innalzamento della temperatura corporea rende l’ambiente in ospitabile per i microrganismi favorendo l’azione fagocitaria. L’ infiammazione consiste in una reazione tissutale localizzata, che ha come scopo quello di circoscrivere e limitare i danni provocati da microrganismi o corpi estranei.
- Immunità acquisita o specifica: è quell’immunità che, come dice la parola stessa, viene acquisita nel corso della vita e rappresenta il più efficace sistema di difesa nei confronti delle infezioni o delle aggressioni da parte di componenti estranei. Essa può distinguersi in: a. Attiva: rappresenta lo stato di resistenza che si sviluppa in un organismo in seguito all’incontro con antigeni, che inducono alla formazione di anticorpi specifici da parte dei linfociti B; b. Passiva: rappresenta la temporanea resistenza ad un agente infettivo conferita ad un organismo, introducendogli anticorpi già elaborati da un altro organismo umano o animale. Le reazioni immunitarie in vitro sono denominate REAZIONI SIEROLOGICHE. Esse trovano applicazione quando si vuole cercare la presenza di Ig (IgM o IgG) nel siero (parte liquida del sangue senza i fattori della coagulazione invece se ci sono si chiama plasma) di un paziente per la diagnosi di una malattia infettiva e quando si vuole identificare un microrganismo in base al proprio corredo antigenico. Esistono diversi tipi di reazione sierologica:
- Reazione di agglutinazione: quando l’antigene è o cellulare o in sospensione corpuscolata. In questo tipo di reazione, antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con un siero immune cioè contenente anticorpi specifici, tali anticorpi prendono il nome di agglutinine. Un importante campo di applicazione di tale reazione riguarda l’ematologia, infatti la determinazione dei gruppi sanguigni e del fattore RH hanno come principio questo tipo di reazione;
- Reazione di precipitazione: quando l’antigene è solubile. Tale reazione consiste nel cimentare in soluzione acquosa un antigene solubile macromolecolare con un siero immune contenete Ig dette
precipitino. Questo tipo di reazione trova applicazione nella ricerca e nella titolazione di tossine. In caso di infezione si forma un precipitato insolubile e visibile; (non parlarne all’esame)
- Reazione di neutralizzazione: quando l’antigene perde, per azione dei corrispondenti anticorpi, un’attività biologica caratteristica (tossicità-mobilità);
- Reazione di fissazione del complemento: un siero immune viene messo a contatto con un antigene in presenza del complemento, nella quale la formazione dell’immunocomplesso si evidenzia dimostrando la formazione del complemento all’immunocomplesso stesso;
- Reazione dell’immunofluorescenza: si ha leggendo una molecola fluorescente con l’anticorpo e facendo reagire questo con l’antigene. Si può utilizzare immunofluorescenza diretta o indiretta. La prima si utilizza per la ricerca di antigeni mentre la seconda si utilizza per la ricerca di anticorpi.
- Reazione immunoenzimatica: in cui gli anticorpi possono essere coniugati con alcuni enzimi senza alterare la capacità di riconoscere l’antigene. La reazione sierologica si può fare direttamente andando a cercare antigeni o indirettamente andando a cercare anticorpi. Le IgM sono la risposta primaria mentre le IgM sono la risposta secondaria (o della memoria). Se trovo IgM vuol dire che la malattia è in atto, se le trovo tutte e 2 vuol dire che la malattia sta andando avanti mentre se trovo solo IgG vuol dire che la malattia c’è stata. La reazione sierologica mi da una risposta quantitativa e qualitativa: mi dice se trovo l’anticorpo di quel microrganismo, cerco igm e igg per vedere la fase in cui mi trovo e vedo anche la quantità di anticorpo che mi dice come l’ospite sta rispondendo. Nelle reazioni sierologiche gli anticorpi sono sempre uguali mentre gli antigeni possono variare. VACCINI E SIERI. La vaccinazione consiste nell’introduzione nell’organismo di agenti microbici uccisi o inattivati o, di loro prodotti metabolici (tossine) trattati in modo tal che annullano il potere patogeno ma non quello immunogeno. Gli antigeni introdotti stimolano, nell’ospite, una risposta immunitaria che conferisce una protezione duratura. I vaccini possono essere composti da 1 solo antigene (es: colera, morbillo) oppure da più antigeni (es: difterite, pertosse). I sieri immuni sono sieri umani (omologhi) o animali (eterologhi) i quali contengono alte concentrazioni di Ig e trovano impiego quando si desidera conferire una protezione contro un rischio immediato di contagio. I sieri omologhi provengono da individui già vaccinati o che comunque hanno superato la malattia. I sieri eterologhi , invece, provengono generalmente da equini o bovini vaccinati contro determinate malattie infettive. Il loro siero trova impiego soprattutto contro le tossine difterica, tetanica, botulinica, contro virus (rabbia) oppure contro il veleno dei serpenti (siero antiofidico). La vaccinazione e la sieroterapia sono 2 strumenti fondamentali su cui si basa l’ immunità artificiale. PRINCIPI GENERALI DELLA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DELLE MALATTIE CAUSATE DA BATTERI. La diagnosi clinica non comporta necessariamente l’identificazione dell’agente eziologico e anche i dati forniti dal laboratorio non vanno oltre l’identificazione generica di un processo infettivo in atto. Comunque, anche quando dalla diagnosi derivi automaticamente l’identificazione dell’agente eziologico (sifilide, tubercolosi, pertosse, peste ecc), la certezza diagnostica può ottenersi soltanto mediante la conferma microbiologica del sospetto clinico. In un microrganismo in preda ad una malattia da infezione, gli eventi fondamentali da prendere in considerazione ai fini della diagnosi eziologica sono:
- La presenza del batterio patogeno nell’organismo, da accertarsi mediante esame batteriologico o ricerche particolari (tipo anticorpi in liquidi organici, ricerca differenziale delle IgM);
- La reazione immunitaria dell’organismo da studiare mediante idonee reazioni sierologiche. L’ESAME BATTERIOLOGICO: DAL PRELIEVO AL REFERTO. Lo scopo dell’esame batteriologico è quello di accertare la presenza di un batterio patogeno in un individuo. Può essere richiesto dal medico su materiali prelevati da individui:
- Malati: e serve a precisare l’eziologia di una malattia in atto clinicamente accertata, allo scopo di consentire una precisa diagnosi eziologica e quindi orientare la terapia.
