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STAFILOCOCCHI
Batteri di forma sferica (cocchi), riuniti in genere in ammassi irregolari, spesso dall'aspetto di “grappolo”, del diametro di 0,8- 1μm; Immobili; Privi di una capsula evidente; Asporigeni ; Gram-positivi (+); Crescono bene su normali terreni di coltura ; su terreni solidi producono colonie di 2-3mm, rotonde, a margini netti, convesse, opache e con pigmentazione aurea (S. aureus), bianca (S. epidermidis), o più raramente citrea. Il loro sviluppo ha luogo fra i 10° e 45°C,con un optimum di temperatura compreso tra i 30° e i 37° C, e per quanto riguarda il pH, fra 4 e 9 con un optimum tra 7,0 e 7,5. Aerobi-anaerobi facoltativi , che utilizzano il sistema completo dei citocromi quando crescono in presenza di O 2 , mentre in ambiente anaerobio utilizzano il metabolismo energetico fermentativo. Pur non essendo sporigeni, gli Stafilococchi mostrano una notevole resistenza a condizioni ambientali sfavorevoli: in particolare sono dotati di una notevole alofilia che li rende capaci di svilupparsi anche in presenza di concentrazioni elevate di NaCl (7,5%) tali da inibire lo sviluppo della maggior parte degli altri batteri. Proprietà sfruttata nell'allestimento dei terreni di coltura selettivi e differenziali ai fini di facilitare l'esame diagnostico. FERMENTA ZIONE GLUCOSIO
FERMENTAZIONE
MANNITE
COAGU
LASI
MICROCOCCU
S
MICROCOCCA
CEAE
(catalasi + ) STAPHYLOCO CCUS (più di 30 specie)
- Aureus CONS (epidermidis, saprophiticu
s..) Il genere Staphylococcus comprende varie specie (almeno 32). Fra di esse la specie certamente più importante è Staphylococcus aureus, universalmente riconosciuta ed alla quale è riportabile la maggior parte degli stafilococchi patogeni per l'uomo. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Il nome di questa specie deriva da un caratteristico pigmento giallo-oro che essa sovente presenta sulle colture in terreno solido. Lo sviluppo di tale pigmento, del tipo dei carotenoidi, dipende però da svariati fattori ed il riconoscimento della specie è pertanto legato ad altre caratteristiche.
S.aureus è largamente diffuso in molte specie animali. L’uomo
continuamente è esposto al rischio di infezione
stafilococcica, poiché la maggior parte degli individui adulti
ospita stafilococchi potenzialmente patogeni sulla cute e,
soprattutto, a livello del naso-faringe. Lo stato di portatore può
essere: transitorio o comunque intermittente benché sia stato dimostrato che vi sono degli individui che ospitano questi microrganismi continuamente o per periodi assai lunghi (portatore sano).
Le infezioni stafilococciche sono alla base di diversi quadri patologici che
si differenziano a seconda della sede del processo infettivo e delle sue modalità di diffusione (continuità, diffusione metastatica ematogena..). In particolare: Cute e tessuti molli Foruncoli, favi, impetigine (più frequentemente sostenuta da S. Pyogenes), infezione di ferite (traumatiche o chirurgiche, infezione di zone ustionate. Necrosi epidermica acuta (solo gli stipiti produttori di tossina epidermolitica) Apparato scheletrico Osteomielite Apparato respiratorio Polmonite(embolica, da aspirazione)
STRUTTUTA SUPERFICIALE e CARATTERI ANTIGENICI. MECCANISMO D’AZIONE PATOGENA
S. aureus è quindi un parassita dell'uomo e di varie specie animali. Può essere presente
nell'uomo, in assenza di manifestazioni morbose, a livello cutaneo e naso-faringeo (portatori
sani).
Avviato il processo di infezione, lo S.Aureus si moltiplica normalmente negli spazi intercellulari e può essere causa di focolai di infezione piogena (suppurativa) acuta (agente eziologico di più dell'80%) a diversa localizzazione (cute, tessuti molli, apparato scheletrico, apparato respiratorio, SNC, alte e basse vie urinarie) e , in alcune circostanze (osteomieliti, ascessi cerebrali o renali) ed in assenza di adeguati interventi terapeutici (farmaci antibatterici, drenaggio chirurgico) di infezioni ad andamento subacuto, progressivamente ingravescente. N.B. Per quanto attiene le infezioni piogene, è utile ricordare che la delta- emolisina insieme ad almeno due altre piccole proteine (di circa 20 aa) forma il complesso denominato modulina fenolo- solubile (PSM) proprio perché le piccole dimensioni delle rispettive catene peptidiche ne consentono la estrazione dalle colture batteriche mediante fenolo che denatura, precipitandole, le proteine di maggiori dimensioni. Le proteine della PSM interagiscono con neutrofili e macrofagi inducendovi la iper-produzione di numerose citochine pro-infiammatorie e si comportano da agenti chemiotattici positivi per neutrofili e monociti. La produzione di PSM è frequente in Stafilococchi aurei meticillino resistenti ed è stata repertata anche in S. epidermidis. La virulenza degli Stafilococchi è un fenomeno multifattoriale che comprende molti fattori che intervengono sequenzialmente per determinare l'infezione e/o la malattia. I. Staphylococcus aureus deve innanzitutto sopravvivere su cute e mucose (produce quindi fattori coinvolti nell'aderenza alle superfici ed enzimi che ne permettono la sopravvivenza- adesine + lipasi). II. Deve penetrare nei tessuti (produce enzimi di diffusione – invasine). III. Deve sfuggire alla fagocitosi (capsula + proteina A; produce fattori e tossine con attività anti-fagocitaria =catalasi, super-ossido-dismutasi che garantiscono protezione dai meccanismi di killling intrafagocitari ossigeno- dipendenti: H 2 O 2 → H 2 O + O 2 ) IV. Produce tossine che provocano il danno tissutale nel sito di infezione, favoriscono l'estensione di essa ai tessuti limitrofi o, metastaticamente, anche ai tessuti distanti dal sito d'infezione primaria che il batterio può raggiungere diffondendo per via ematica. I determinanti di patogenicità (fattori di virulenza) di S. aureus si possono suddividere in: A. COMPONENTI CELLULARI B. COMPONENTI EXTRACELLULARI a. ESO-ENZIMI O ENZIMI EXTRACELLULARI b. TOSSINE A.COMPONENTI CELLULARI
S. Aureus è provvisto di una capsula di natura polisaccaridica, formata
essenzialmente da un polimero di acidi uronici (acido
glucosaminuronico) ,di cui si distinguono almeno 11 diversi tipi antigenici.
È dotata di potere anti-fagocitario che però è neutralizzato dagli specifici anticorpi. La capsula è normalmente di modesto spessore e non è evidente nelle preparazioni colorate negativamente con inchiostro di china (microcapsula), tranne che nei tipi capsulari 1 e 2 dove è spesso abbondante (stipiti mucosi). La maggioranza degli stipiti isolati da processi patogeni nell'uomo (e nei ruminanti: mastite bovina) possiedono il polisaccaride capsulare di tipo 5 o di tipo 8. Sulla cellula di S.A sono presenti, con collocazione superficiale che consente loro l'interazione con molecole dell'ambiente extracellulare, alcune proteine che svolgono un ruolo biologico di rilievo. Si tratta in particolare, di alcune proteine in grado di interagire con altre (fibronectina, vitronectina, laminina, fibrinogeno..) presenti nella matrice
intercellulare, svolgendo il ruolo di adesine.
Tra queste è compresa una proteina denominata “clumbing factor” o
“coagulasi legata alla cellula ” che può legarsi al fibrinogeno
causandone la precipitazione intorno alla cellula batterica e che, in vitro, si mette in evidenza facilmente per la formazione di grossi aggregati (clump) di cellule batteriche (tenute insieme dalla interazione reciproca tra clumping factor e fibrinogeno che le avvolge), visibili ad occhio nudo semplicemente mescolando su un vetrino una goccia di una densa sospensione di batteri con una goccia di plasma. Poiché il clumping factor è presente nella quasi totalità degli stipiti di S. aureus (mentre è assente, salvo rare eccezioni, nelle altre specie di stafilococchi) la sua rilevazione rappresenta una prova di identificazione routinaria di semplice e rapida esecuzione e di valore predittivo elevato.
Della enterotossina stafilococcica (SE) si conoscono numerosi ( almeno sette ) tipi antigenicamente diversi, ovviamente non tutti prodotti dallo stesso stipite microbico: SE-A: Codificata da un fago temperato SE-B: Codificata da un fago defettivo o da un plasmide integrato nel cromosoma SE-C: Distinta a sua volta 3 nei sottotipi C1, C2, C3. Codificazione cromosomica o plasmidica SE-D: Codificazione plasmidica SE-E: Codificazione cromosomica, probabilmente a opera di un fago defettivo integrato SE-G: Codificazione cromosomica SE-H: Codificazione cromosomica La gastroenterite da stafilococchi enterotossinogeni è la conseguenza della ingestione di cibi (i più pericolosi sono i cibi con elevato contenuto di lipidi – dolciumi ricchi di panna..- dove la crescita del batterio è favorita dalla capacità del germe di produrre lipasi che gli consentono un'efficace utilizzazione di lipidi a scopo nutrizionale) nei quali si siano prodotte sufficienti quantità di enterotossina a causa della presenza di stipiti di S.aureus enterotossinogeni contaminanti e della conservazione del cibo per periodi sufficienti e in condizioni (di temperatura soprattutto) idonee a consentirne un'adeguata moltiplicazione batterica. Le enterotossine stafilococciche, sono resistenti ai succhi gastrici , relativamente termoresistenti (il loro potere tossico resiste, almeno parzialmente, anche alla ebollizione ed è distrutto solo dalle temperature più elevate impiegate per la sterilizzazione dei cibi conservati in scatola) e presentano caratteri di PIROGENICITA' e SUPERANTIGENICITA'. Introdotte con gli alimenti e pervenute nell'intestino, interagiscono con i macrofagi ed i linfociti degli organi linfoidi sottomucosi-MALT- (che probabilmente raggiungono passivamente per mezzo delle cellule M) stimolando l'attivazione policlonale dei linfociti T, con la conseguente liberazione locale di citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6, TNF-α), cui segue la comparsa di lesioni flogistiche a carico della mucosa che si accompagnano a sintomi enterici (diarrea per inibizione dell'assorbimento di acqua). Le manifestazioni morbose più consistenti e più immediate (insorgono poche ore dopo l'ingestione del cibo contaminato) sono comunque rappresentate dall'aumento della temperatura corporea (per l'azione pirogena dovuta soprattutto alla liberazione di IL-1 da parte dei macrofagi), dalla frequente comparsa di lesioni eritematose per azioni, dirette o mediate dalla liberazione di varie citochine, sugli endoteli capillari ( nel caso di stafilococchi produttori di SE-G e SE-I hanno un aspetto sovrapponibile a quello dell'eritema presente nella scarlattina causata più frequentemente dalle tossine pirogene di Streptococcus pyogenes) e, in particolare, dalla comparsa di vomito incoercibile dovuto al fatto che le SE sono anche in grado di stimolare recettori della mucosa gastrointestinale che generano, a loro volta, impulsi nervosi che raggiungono i centri sottocorticali del vomito attraverso afferenti vagali (sotto questo profilo le SE si comportano da veri e
propri emetici centrali). 3.Gli stipiti di S. aureus che producono la Tossina epidermolitica o "esfoliatina" stafilococcica A (codifica cromosomica) o B (codifica plasmidica), sono in grado di provocare la cosiddetta "sindrome della cute ustionata da stafilococco" o "necrolisi epidermica acuta" quando colonizzano soggetti suscettibili (bambini nella primissima infanzia o adulti con deficit immunitari) nei quali, indipendentemente dalla sede della colonizzazione, la tossina, diffondendo per via ematica, raggiunge lo strato granuloso dell'epidermide , dove si attiva (probabilmente una serino–proteasi) provocando la rottura dei legami (desmosomi) intercellulari, consentendo così il distacco di ampie zone di epidermide al minimo insulto meccanico ( un'impetigine bollosa o la sola presenza di eritema possono rappresentare gli unici sintomi morbosi nei casi più lievi o nei soggetti con una migliore e più pronta risposta immunitaria alla tossina ). 4.Gli stipiti produttori di tossina dello shock tossico (TSST-1, toxic shock syndrome toxin-1) , codificata da un gene a localizzazione cromosomica, sono la causa dello shock tossico da stafilococco, una patologia descritta inizialmente nel 1978 in donne durante il periodo mestruale, e rappresentata dalla insorgenza di subitanei segni generali di tossiemia con manifestazioni cutanee eritematose, seguita dal malfunzionamento di numerosi organi, gravi sintomi di shock emodinamico e con un'elevatissima mortalità. Si vide successivamente che la sindrome era riconducibile ad una elevata colonizzazione vaginale ad opera di stipiti "tossigeni" di S. aureus, favorita dall'ambiente creato dalla presenza del liquido mestruale e dal contemporaneo uso di particolari tamponi assorbenti a collocazione intravaginale. In epoca susseguente, casi di shock tossico stafilococcico sono stati descritti anche in soggetti di sesso maschile (es. Colonizzazione stafilococcica di ustioni, infezioni da stafilococchi tossigeni in soggetti immnuodepressi..). La tossina coinvolta nella patologia è la TSST-1, simile per vari motivi alle SE ed alle tossine pirogeniche streptococciche (inizialmente denominata tossina pirogena stafilococcica C o SE-F) con le quali divide i caratteri di pirogenicità e superantigenicità che sono alla base della patologia, ma che ha anche dei caratteri peculiari come la capacità di diffondere in circolo attraverso
le mucose senza necessità della preventiva colonizzazione
batterica e della conseguente lesione dell'epitelio mucoso.
SINDROME DA SHOCK TOSSICO: MALATTIA MULTI-SISTEMICA
CARATTERIZZATA DA FEBBRE, FORTE IPOTENSIONE, DIARREA, CONGIUTIVITE,
MIALGIA, RASH SCARLATTINIFORME, MODERATA DESQUAMAZIONE.
Oltre alle tossine, svolgono un ruolo importante nella patogenesi vari esoenzimi prodotti dallo stafilococco e riversati nello spazio extracellulare. Due eso-enzimi in grado di agire, alternativamente, sul fibrinogeno provocandone la trasformazione in fibrina, o sul plasminogeno attivandone la conversione in plasmina capace di dissolvere i coaguli di fibrina, sono rappresentati rispettivamente dalla coagulasi stafilococcica (stafilocoagulasi) che, reagendo con un fattore plasmatico (CRF =coagulase reacting factore) è capace di trasformare il fibrinogeno in fibrina in assenza di
Quando si ricerca lo stafilococco in materiali contaminanti da una ricca popolazione batterica accessoria (es. materiale fecale), si utilizzano piastre di agar addizionate del 7,5% di NaCl (ben tollerato a questa concentrazione da S.aureus mentre inibisce la maggior parte degli altri batteri) eventualmente con l'aggiunta di mannite (uno zucchero costantemente fermentato da S.Aureus mentre lo è raramente da S.epidermidis). Viene aggiunto inoltre un indicatore di pH come il
rosso fenolo. Si ottengono piastre del così detto terreno di
Chapman (agar sale mannite) dove le colonie di Stafilococco
sono circondate da un alone giallo causato dal viraggio dell'indicatore nella zona di terreno dove sono diffusi gli acidi prodotti dalla fermentazione dello zucchero. Le colture esaminate dopo 24-48 h di incubazione a 37°C e le colonie sospette sono facilmente individuate per la presenza della pigmentazione giallo-oro (S.Aureus) [bianca (S.Epidermidis)], per l’alone di emolisi o di acidificazione a seconda del terreno impiegato per l'isolamento.
Dalle colonie sospette si allestisce un preparato microscopico colorato
con metodo di Gram, per controllare che le colonie siano formate
effettivamente da cocchi Gram+ con disposizione a grappolo.
Si procede dunque alla definitiva IDENTIFICAZIONE del batterio. I batteri dai quali lo stafilococco patogeno deve essere differenziato sono rappresentati da: I. STREPTOCOCCHI II. ALTRE SPECIE DI STAFILOCOCCHI GENERALMENTE APATOGENI III. MICROCOCCHI POSSIBILI COMMENSALI DELL'ORGANISMO UMANO
Dagli streptococchi e dai pneumococchi, a parte il diverso aspetto delle colonie e le differenze rilevabili nei caratteri morfologici all'esame microscopico, S. aureus può essere facilmente differenziato per la produzione di catalasi. Per dimostrare la produzione di catalasi da parte di un batterio è sufficiente versare una soluzione al 3% di perossido di idrogeno sulla coltura. I batteri produttori di catalasi causano la liberazione di ossigeno che svolgendosi in forma gassosa provoca la formazione di una schiuma evidente intorno e sulla patina batterica. CATALASI H 2 O 2 --> H 2 O + O 2 La differenziazione di S. aureus dai micrococchi e dalle altre specie di stafilococchi non è possibile sulla scorta dei caratteri rilevabili al microscopio ed è necessario ricorrere allo studio della capacità di produrre acidi dal glucosio in anaerobiosi (assente nei micrococchi) ed altre prove tra le quali è particolarmente sensibile e dotata di elevato potere diagnostico, anche se non di rapida lettura (richiede dalle 3-5 h di incubazione a 37°C), la ricerca della stafilocoagulasi, presente solo in S. aureus. L'aggiunta di una piccola quantità di una brodocoltura di S. aureus a plasma citratato di coniglio provoca la comparsa di un coagulo molto evidente rispetto al controllo (plasma citratato da solo).
Di analogo valore, anche se forse dotata di minore sensibilità, è la ricerca del
"clumping factor " o "coagulasi legata alla cellula" che si esegue e con
risultati immediatamente leggibili, sulla falsariga del test della coagulasi.
Prove rapide di agglutinazione passiva con micro particelle di latice
o con globuli rossi tannati, ricoperti di fibrinogeno ed Ig, che mescolati su vetrino porta-oggetti insieme ad una sospensione di S.aureus si agglutinano per la combinazione, rispettivamente, con il "clumping factor" e la proteina A, possono essere utilmente impiegate nella routine diagnostica.
indica la sensibilità dello stipite batterico a quel determinato batteriofago. Questo consente di ricostruire il "tipo" fagico del batterio in esame. Suddivisione in 3 gruppi litici (I, II, III) , che talvolta sono associati al tipo si patologia indotta nell'ospite. A questi si aggiungono ceppi non tipizzabili. o I ceppi del gruppo litico II danno frequentemente infezioni cutanee nel neonato e producono le tossine epidermolitiche. o I ceppi del gruppo III producono enterotossine (SE). REAZIONE SIEROLOGICA Il notevole numero di antigeni tipo specifici presenti alla superficie degli Stafilococchi e la notevole diffusione degli anticorpi relativi nei sieri di soggetti normali, in conseguenza delle numerose occasioni di esposizione al batterio, NON permettono di utilizzare ai fini diagnostici la ricerca di anticorpi nei confronti di antigeni batterici (agglutinazione). Anche la ricerca di anticorpi nei confronti di varie esotossine ormai ben caratterizzate dal punto di vista antigenico ( α-emolisina, ¥-emolisina, leucocidina), non ha grande significato ai fini diagnostici data la loro diffusione indipendentemente da un'infezione stafilococcica in atto. NON ESISTE IN PRATICA ALCUNA REAZIONE SIEROLOGICA UTILIZZABILE PER LA DIAGNOSI DI UN'INFEZIONE STAFILOCOCCICA, CHE RIMANE PERTANTO AFFIDATA ALLA DIMOSTRAZIONE DI S.AUREUS NEL CAMPIONE IN ESAME. TERAPIA S.Aureus è uno dei batteri che più spesso presenta il fenomeno dell’antibiotico-resistenza che si manifesta molto fra i ceppi diffusi in ambiente ospedaliero e responsabili delle “stafilococcie nosocomiali”. Il fenomeno si manifesta in più del 90% dei ceppi patogeni nosocomiali e in circa il 20-30% dei ceppi extra-nosocomiali. Gli stafilococchi meticillino-resistenti (MRSA), rappresentano oramai una vera e propria emergenza sanitaria sia nella patologia nosocomiale, sia nella patologia comunitaria, anche perché tra di essi cominciano ad emergere stipiti resistenti agli antibiotici glicopeptidici (vancomicina) che rappresentano, se non l'unico, certo il principale presidio terapeutico efficace. I determinanti genetici della resistenza verso i vari agenti antimicrobici sono in genere da riportare sia a componenti del cromosoma batterico sia ad elementi plasmidici. Tale farmaco resistenza è dovuta: RESISTENZA AI β-LATTAMICI (produzione di β-lattamasi trasformati) PBP-2a A BASSA AFFINITA' PER I β-LATTAMICI a. Il gene mec-A è un gene presente in cellule batteriche alle quali conferisce la farmaco resistenza, soprattutto ai β- lattamici (penicilline, meticillina, antibiotici penicillina – like). Questo gene codifica per la PBP-2a la quale ha bassa affinità per gli antibiotici lattamici. Ciò consente la trans- peptidazione in presenza di beta-lattamine, impedendo loro
la inibizione della sintesi della parete cellulare. Il gene mec- A è regolato dal repressore mecI e da un transduttore del segnale di membrana, mecRI, sensibile ai β-lattamici. ASSENZA DI β-LATTAMICI -MEC I reprime la trascrizione di tutti i geni del complesso mec (mec A, mec RI) PRESENZA DI β-LATTAMICI MEC-RI, sensibile ai β-lattamici, attiva, mediante taglio autocatalitico, il suo dominio metallo-proteasi citpolasmatico, il quale scinde il legame tra mec I e la regione dell'operatore del gene mecA, consentendone la sua trascrizione (produzione di PBP-2a). La scelta del mezzo terapeutico deve essere sempre guidata dall’ antibiogramma. METODI DI IMMUNIZZAZIONE Gli stessi motivi che rendono di scarso o nullo significato l'utilizzo della ricerca di anticorpi nei confronti di antigeni stafilococcici a scopo diagnostico, sono alla base della pratica impossibilità di allestire vaccini efficaci , e sia pure di impiego limitato a categorie di soggetti a rischio, anche se vaccini allestiti con il polisaccaride capsulare purificato da stipiti di tipo 5 e 8, coniugato (aumentare antigenicità) con l'esotossina A di Pseudomonas aeruginosa resa atossica mediante tecniche di ingegneria genetica, sono in fase di sperimentazione, soprattutto per la prevenzione di infezioni nosocomiali nei soggetti a rischio. Una ragionevole efficacia terapeutica si basa sull' AUTOVACCINO, utilizzato soprattutto come adiuvante nella terapia delle infezioni stafilococciche ad andamento torpido o cronico (soggetti immunodepressi). Allestito con lo stipite di S.Aureus isolato dalla lesione di un singolo paziente ed eventualmente addizionato di preparazioni anatossiniche di α-emolisina. Si fa in caso di foruncolosi disseminata.
- Si isola lo S.A dalla lesione del paziente, si purifica e si uccide con formalina.
- Si effettuano prove biologiche su animali (inoculazione per via intraperitoneale e registrazione della T°).
- Se non compaiono brividi dopo inoculo e l’animale vive per 1 settimana, allora si esegue una micro-iniezione al paziente.
- Se al controllo dopo 24h e dopo 48h, è tutto nella norma, si esegue il vaccino per via intramuscolare, dose maggiore a 3miliardi/ml di cellule per ogni inoculazione. Questo autovaccino è usato per le persone che non hanno avuto successo con il vaccino normale.
STAFILOCOCCHI COAGULASI- NEGATIVI
Gli stafilococchi coagulasi-negativi (CONS: coagulase-
negative staphylococci) comprendono un gruppo di batteri che negli
ultimi decenni sono andati assumendo un crescente rilievo nella patologia umana.
Essi rappresentano soprattutto agenti di infezioni nosocomiali (di norma
di causa iatrogena) e sono frequentemente isolati dal sangue (emocoltura) di soggetti con impianti intravascolari (es. Catetere venoso centrale) o come causa di infezioni di impianti protesici
