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8.1 Trasferimento genico e ricombinazione genetica nei batteri
over, in modo molto simile alla ricombinazione
genetica che avviene nella coniugazione. La ricom-
binazione introduce l’allele normale, che controlla
la formazione della capsula, nel DNA delle cellule
non infettive; l’espressione di questo allele nor-
male genera una capsula intorno alla cellula e alle
sue discendenti, rendendole infettive.
Solo alcune specie di batteri possono assumere
DNA dal mezzo circostante attraverso meccani-
smi naturali. Tali batteri tipicamente hanno una
proteina che lega il DNA sulla superficie esterna
della parete cellulare. Quando il DNA dall’am-
biente circostante lega la proteina, un enzima de-
sossiribonucleasico rompe il DNA in piccoli pezzi,
che passano attraverso la parete della cellula e la
membrana plasmatica fino al citoplasma. Il DNA
che entra può quindi ricombinare con il cromo-
soma della cellula ricevente se questo contiene le
regioni omologhe.
Le cellule di E. coli in condizioni normali non
assumono il DNA dall’ambiente circostante, ma
possono essere indotte ad assumerlo tramite tra-
sformazione artificiale. Un modo in cui questo è
realizzato è esponendo le cellule di E. coli a ioni
calcio e al DNA di interesse, incubando il tutto in
ghiaccio e dando quindi un rapido shock termico.
Questo trattamento altera la membrana plasmatica
in modo tale che il DNA possa attraversarla ed
entrare. Il DNA entrante va incontro a ricombi-
nazione se contiene regioni omologhe a parte del
DNA cromosomico.
Un’altra tecnica per la trasformazione artifi-
ciale, chiamata elettroporazione, espone brevemente
le cellule ad un rapido impulso elettrico. Lo shock
elettrico altera la membrana plasmatica in modo
tale che il DNA possa entrare. Il metodo funziona
bene con la maggior parte delle specie batteriche
che di per sé sono incapaci di assumere DNA e
anche con molti tipi di cellule eucariotiche.
La trasformazione artificiale è spesso utilizzata
per introdurre plasmidi contenenti sequenze di
DNA d’interesse nelle cellule di E. coli, come parte
delle tecniche di clonaggio. Quando le cellule sono
state trasformate, i cloni di cellule sono cresciuti in
grande numero per aumentare la quantità di DNA
inserito, fino a raggiungere la quantità necessaria
per il sequenziamento o la modificazione genetica.
(Il clonaggio del DNA e l’ingegneria genetica sono
discussi in dettaglio nel Capitolo 9).
Trasduzione. Nella trasduzione il DNA è tra-
sferito alla cellula batterica ricevente da un fago
infettante (vedi Sezione 1.1). Quando nuove
particelle fagiche sono assemblate in una cellula
batterica, può capitare che i capsidi incorporino
un frammento del DNA dell’ospite insieme o al
posto del DNA virale. Quando poi i fagi sono ri-
lasciati dalla cellula ospite, si attaccano ad un’al-
tra cellula e iniettano in essa il DNA batterico (e
il DNA virale, se presente). Come nella coniu-
gazione e nella trasformazione, l’introduzione di
questo DNA rende la cellula parzialmente diploide
e permette la realizzazione della ricombinazione.
Joshua Lederberg e il suo studente Norton Zin-
der, allora all’Università del Wisconsin a Madison,
scoprirono la trasduzione nel 1952, nel corso di
esperimenti con il batterio Salmonella typhimurium
e il fago P22. Lederberg ricevette il premio Nobel
nel 1958 per la sua scoperta della coniugazione e
della trasduzione nei batteri.
La procedura di replica plating permette
di identifi care e contare i ricombinanti
Come fanno i ricercatori a identificare e contare
i ricombinanti ottenuti negli esperimenti di co-
niugazione, trasformazione e trasduzione? Joshua
Lederberg ed Esther Lederberg svilupparono a
questo scopo una nuova tecnica, ora largamente
usata, chiamata replica plating (piastramento di
repliche). Nel replica plating, una piastra con
mezzo di coltura solido su cui siano cresciute le
colonie – chiamata piastra madre – viene premuta
lievemente su del velluto sterile (Figura 8.5).
Questo determina il trasferimento di un po’ di
ciascuna colonia sul velluto, mantenendo la stessa
distribuzione delle colonie presente sulla piastra.
Il velluto è quindi premuto gentilmente su nuove
piastre di terreno di coltura solido – le piastre co-
pia – e in questo modo alcune delle cellule di cia-
scuna colonia originale sono trasferite sulle nuove
piastre. In tal modo le nuove piastre sono seminate
ciascuna con una “replica” dell’originale collezione
di colonie presente sulla piastra di partenza. Le
nuove piastre sono quindi incubate per permet-
tere la crescita delle colonie. Pertanto, un ricer-
catore può determinare le mutazioni che ciascun
ceppo porta, effettuando un replica plating della
piastra originale su piastre contenenti terreni di
coltura con diversa composizione. In altre parole,
la composizione del terreno di coltura sulle piastre
è modificata per consentire la crescita di colonie
con specifiche caratteristiche. Il terreno com-
pleto contiene l’intero complemento di sostanze
nutritive, inclusi aminoacidi e altre sostanze che i
