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Dott. Riccardo Nescatelli
ANALISI DI SOSTANZE BIOLOGICAMENTE ATTIVE
IN MATRICI COMPLESSE
E’ sempre più richiesto, sia in ambito accademico sia nel privato, l’analisi di matrici complesse, ossia la determinazione qualitativa e/o quantitativa di uno o più analiti presenti in campioni reali.
Perciò sono necessari:
- CAMPIONAMENTO
- PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
- DETERMINAZIONE QUALITATIVA E/O QUANTITATIVA, MEDIANTE ANALISI
STRUMENTALE
CAMPIONAMENTO
E’ una fase importante e delicata, perché se non ben condotta, nonostante l’analisi strumentale sia stata ben eseguita, il risultato che si ottiene è falsato. La qualità dei dati riflette la qualità del campione prelevato, infatti è stato dimostrato che la maggiore fonte di errore è il campionamento.
Il campione deve essere:
Rappresentativo di tutta la massa, perché il dato che si ottiene alla fine dell’analisi deve essere esteso a tutta la massa del campione e non solo alla minima parte analizzata; omogeneo o omogeneizzato, perchè le caratteristiche chimico-fisiche rimangano costanti nello spazio.
ESEMPIO DI CAMPIONAMENTO DI FARMACI IN COMPRESSE IN INDUSTRIA FARMACEUTICA:
- Si prelevano capsule con frequenza fissa in base alla produzione giornaliera (CAMPIONE ELEMENTARE)
- Le compresse vengono omogeneizzate; in seguito gli omogeneizzati saranno uniti (CAMPIONE MEDIO DI PRELEVAMENTO)
- Il campione medio di prelevamento viene suddiviso per ottenere il CAMPIONE DI LAVORO
- Prelevando un’aliquota del campione (generalmente mg o mL) di lavoro, si ottiene il CAMPIONE D’ANALISI, il quale verrà poi analizzato.
Il campione, fino al momento d’analisi deve essere STABILIZZATO e CONSERVATO in maniera idonea.
PRIMA DI LAVORARE ALLA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L’ANALISI E’ NECESSARIO
PROCEDERE ALLA SUA STABILIZZAZIONE
Problemi:
DEGRADAZIONE DEL CAMPIONE
PROCESSI DI OSSIDAZIONE aggiunta di un antiossidante
REAZIONI DI IDROLISI La presenza di acqua può accelerare reazioni di decomposizione Liofilizzazione permette l’allontanamento dell’acqua
INSTABILITA’ AL pH variazione del pH al momento della raccolta del campione e’ sufficiente aggiungere un tampone
REATTIVITA’ CON COMPONENTI ENDOGENI se vi e’ la possibilità che avvengano queste reazioni, si rende necessaria l’aggiunta di uno stabilizzante
INSTABILITA’ TERMICA l’esposizione a fonti di calore o alla luce può facilitare reazioni chimiche di degradazione la maggior parte delle volte i campioni vengono conservati a basse temperature, da +4 a - gradi centigradi
INSTABILITA’ ENZIMATICA gli enzimi interferenti possono essere resi inattivi con inibitori enzimatici specifici, (o con dell’acetonitrile) o più semplicemente con le basse T
La conoscenza di questi fenomeni permette di mettere a punto il metodo di raccolta e conservazione del campione in maniera adeguata.
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE D’ANALISI
Preparare il campione significa rendere tale campione presentabile per la tecnica analitica scelta. E’ necessario dunque, creare le condizioni affinché i vari analiti siano pronti per la loro analisi quali- quantitativa con un dato strumento di misura.
Per scegliere il metodo d’analisi migliore:
- a) PRECISIONE ED ACCURATEZZA RICHIESTA
- b) QUANTITA’ DI CAMPIONE A DISPOSIZIONE
- c) INTERVALLO DI CONCENTRAZIONE DELL’ANALITA
- d) QUALI SONO GLI INTERFERENTI
- e) QUALI SONO LE CARATTERESTICHE CHIMICO FISICHE DELL’ANALITA
- f) TIPO DI MATRICE IN CUI E’ PRESENTE L’ANALITA
Condizioni necessarie:
- Il composto da estrarre deve essere solubile nei due solventi, ma non deve reagire con essi
- I due solventi devono essere immiscibili fra loro
- Il solvente estraente deve essere puro
- Mescolando i due solventi non si devono creare emulsioni
Coefficiente di ripartizione Kd = [A]ORG / [A]ACQ per analiti che non dissociano
Rapporto di distribuzione D = ∑[Ai]ORG /∑ [Ai]ACQ per analiti che dissociano
Nota: D=Kd per analiti che non dissociano
Più è grande il Kd, o D, e più soluto passa dalla fase acquosa al solvente organico.
%E = (D/(1+D))*
VARIANDO IL pH SI POSSONO SELETTIVAMENTE ESTRARRE COMPOSTI ACIDI O BASICI
ESTRAZIONE DI ACIDO ACETICO (ACIDI)
L’acido acetico (HA) presente in soluzione acquosa può essere estratto aggiungendo a questa etere etilico:
in etere l’acido acetico non si dissocia, ma in acqua sì
In etere [HA]
In acqua [HA]+ [A-]
D= [HA]org / ([HA]acq + [A-]acq) sostituendo Kd = [HA]org / [HA]acq e Ka=[H+]ac[A-]ac/[HA]ac
D= Kd/(1+(Ka/[H+])) aumenta se aumentano gli H+^ ( abbassando il pH si facilita l’estrazione )
ESTRAZIONE DI ANFETAMINE (BASI)
Le anfetamine (R-NH 2 ) presenti nelle urine possono essere estratte facilmente con un’estrazione liquido- liquido utilizzando cloroformio, etere etilico o anche miscele di solventi.
In etere [RNH 2 ]
In acqua [RNH 2 ]+ [RNH 3 +]
D= [RNH 2 ]org / ([RNH 2 ]acq + [RNH 3 +]acq)
sostituendo Kd = [RNH 2 ]org / [RNH 2 ]acq e Kb=[ RNH 3 +]ac[OH-]ac/[ RNH 2 ]ac
D= Kd/(1+(Kb/[OH-])) aumenta se aumentano gli OH-^ ( alzando il pH si facilita l’estrazione )
Dopo l’estrazione con solvente organico ed una base come NaOH, all’estratto si aggiunge solfato di sodio anidro.
PREGI E DIFETTI DELLA LLE
- Semplice
- Alta % di soluto estratto
- Grande quantità di solvente
- Richiede una successiva concentrazione dell’analita (evaporando il solvente con N 2 o con rotavapor)
- Poco selettiva
LO SVILUPPO DI STRUMENTI SEMPRE PIÙ SENSIBILI E CON LIMITI DI RILEVABILITÀ
SEMPRE PIÙ BASSI HA PERMESSO LO SVILUPPO DI MICRO ESTRAZIONI LIQUIDO-LIQUIDO
Condizione necessaria :
MATRICE-ANALITA < ANALITA-ADSORBENTE < ANALITA-ELUENTE
Interazioni : legame H, ioniche, dipolo-dipolo, dipolo permanente-dipolo indotto, dipolo indotto-dipolo indotto (forze di Van Der Waals)
Fasi SPE : derivano dalla silice modificata
STABILI DA pH 2 AD 8 In ambiente basico la silice diventa silicato e si scioglie; in ambiente fortemente acido avviene l’idrolisi del ponte silossano (Si-O-Si)
STABILI IN QUASI TUTTI I SOLVENTI ORGANICI
- C18ec: Silice modificata con gruppi alchilici a catena corta (trimetil cloro silano)
È la fase meno polare
Interazioni di tipo idrofobico
- C18: Hanno più gruppi silanolici liberi
Interazioni di tipo secondario tra i gruppi silanolici e composti polari
- C8: Leggermente più polari delle precedenti
Interazioni secondarie con composti polari perché la catena alchilica è più corta
- Phenyl: Silice modificata con fenili
Polarità simile a C
Interazioni idrofobiche e π-π dovute alla densità elettronica dell’anello aromatico
- SiOH: Silice non modificata
Leggermente acida
Molto polare
Adsorbe facilmente umidità dall’aria
Deve essere conservata ben chiusa prima di essere utilizzata
- CN: Silice modificata con ciano propile
Alta polarità del mezzo
Oltre ad interazioni idrofobiche possono avvenire interazioni secondarie selettive dovute all’alta densità elettronica del gruppo CN
- NH2: Silice modificata con amino propile
Polare
Debole scambiatore ionico
- OH: Silice modificata con dioli
Polare
Proprietà simili a SiOH
- SA (strongly acid): silice modificata con acido benzensolfonico
Forte scambiatore cationico acido
Scambiatore ionico di composti organici da matrice acquosa
- SB: Silice modificata con sali di ammonio quaternari
Forte scambiatore anionico basico
Non adatto ad anioni forti perché difficili da fluire
- DRUG: Speciale silice modificata per concentrare farmaci da urine e plasma.
CARTUCCIA OASIS: a differenza delle normali C18 possono essere portate a secco; lavorano da pH 1 a 12
CARTUCCIA STRATA X: con supporti di stirene divinil benzene non hanno problemi di pH
- Usare un debole adsorbente:
In questo modo il solvente di eluizione non deve essere troppo forte
SEPARAZIONE DELL’ALBUTEROLO DAL PLASMA
HO
OH
N
H
HO
Broncodilatatore (usato per l’asma)
Caratteristiche:
due funzioni ionizzabili: 1 fenolica
2 amminica secondaria
In acqua è presente in uno stato ionico: solubile in acqua, si ripartisce poco in un solvente organico
Tecniche per la preparazione del campione:
LLE
estratto con acido dietilfosforico elevata concentrazione nel solvente organico, ma molto sporco perché contaminato da materiale endogeno plasmatico. Impossibile da analizzare in HPLC
SPE
varie funzioni: differenti modi di operare fase stazionaria C18, ciano o diolica
in questi casi si prova in tutti i modi e si vede quale tecnica fornisce i recuperi migliori.
cartucce ciano propile
↓
alta polarità
eluente: Acetato di ammonio/metanolo
10% 90%
fornisce i migliori risultati.
ESTRAZIONE POLIFENOLI DA OLI
I polifenoli hanno una notevole importanza per l’uomo, poiché sono in grado di ridurre i radicali liberi
altamente ossidanti formando composti meno reattivi e impedendo così processi quali la perossidazione dei lipidi, fenomeno che provoca un danno alla membrana cellulare ed apoptosi.
Alcuni polifenoli interagisco con enzimi, come la cicloossigenasi1 e le telomerasi, che nell’85% dei tumori umani sono sovraespresse.
LLE
6gr di olio in 6ml di esano. L’esano serve per evitare emulsioni quando si aggiunge il solvente estraente all’olio.
Solvente estraente: 5ml di H 2 O:MeOH=20:
Estrazione ripetuta per 3 volte; i 3 estratti uniti e portati a secco con evaporatore rotante; si ridissolvono gli analiti con 1mL di MeOH e si inietta in HPLC-DAD o HPLC-MS.
moderne tecniche strumentali con bassi limiti di rilevabilità minori quantitativi di solventi evaporazione con azoto
spme
HS-SPME: per analiti volatili ago a contatto con la fase gassosa e non immerso nella soluzione
hs-spme
VANTAGGI e SVANTAGGI SPME
- Possibilità di automatizzare l’estrazione
- Non servono solventi per l’eluizione si concentra molto
- Selettiva
- Scarsa riproducibilità analisi qualitative ma non quantitative
- Estrazione non quantitativa
In questo modo possono essere analizzati: testosterone, metil-testosterone, testosterone propionato e trenbolone acetato; estrogeni :estradiolo, dietilstilbestrolo, dietilsilbestrolo dipropionato, α- e β-zeranolo; progestinici: progesterone, melengestrolo acetato.
ESTRAZIONE CPTH6 DAL PLASMA
Per i farmaci solubili in MeOH, H 2 O, CH 3 CN, EtOH si può utilizzare una cromatografia in fase inversa e il plasma o siero vengono trattati come segue:
Deproteinizzazione trattando il plasma o siero con MeOH in proporzione 1:2 o 1:3 o 1:4 di plasma:MeOH
Dopo l’aggiunta di MeOH, precipitano le proteine e si centrifuga a 10k giri/minuto per 15 minuti
Il surnatante si preleva e si filtra con filtri in ptfe e iniettato in HPLC-MS.
Per deproteinizzare si può usare anche HClO 4 o acido tricloro acetico.
Dopo la deproteinizzazione a volte è necessario purificare il campione con SPE
ANALISI STRUMENTALE
Preparato il campione d’analisi con la tecnica più opportuna, è pronto per essere analizzato con un dato strumento:
Strumenti più utilizzati :
GAS CROMATOGRAFO accoppiato con diversi rivelatori, tra cui lo spettrometro di massa (MS)
HPLC accoppiato con diversi rivelatori, tra i quali DAD e MS
SPETTROFOTOMETRO (IR, NIR, UV-VIS)
