Elettroforesi e le sue varianti, Sbobinature di Biotecnologie Mediche

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D) SE I ») DICO) Spettrofotometria L fluorimetria non D) D) Ji J 0) 9 À 3 3) sono le uniche tecniche per conoscere la SS 2 SSQ quantità e qualità del materiale estratto; anche perché, per esempio, abbiamo detto che la spettrofotometria misura l'assorbanza delle basi azotate, ma come facciamo a sapere che quelle basi azotate sono organizzate in una sequenza e che non sono state degradate? In sintesi, sia per I'RNA che per le proteine, non sappiamo se sono integre o se ci sono solo dei frammenti; pertanto sono necessarie delle tecniche che consentono di vedere il DNA. A tale scopo sono nate fe tecniche elettroforetiche. li L'elettroforesi è il movimento di particelle cariche in un campo elettrico. Quest sistema è un sistema chiuso (è una © end © cella) in cui sono presenti: Anodo | (+ - < Polo negativo +» attrae le molecole cariche positivamente CCationid + Questo polo si chiama “Catodo”; % Polo positivo » Aitrae le molecole cariche negativamente Cinionid + Questo polo si chiama “Anodo”. Le molecole cariche devono attraversare una soluzione che sia capace di condurre l'elettricità e, quindi, deve essere una soluzione tampone elettrolitica Covviamente si tratta di un tampone salino). lee SO © e L'elettroforesi viene utilizzato in laboratorio perché abbiamo la problematica di voler separare una parte della miscela dal tutto Se con la centrifugazione sfruttavamo la differente dimensione o densità delle molecole in soluzione, con l'elettroforesi possiamo sfruttare la differenza carica delle molecole in soluzione per separare le positive dalle negative, ma anche nell'ambito della stessa carica, ovvero separare quelle più PRINCIPIO Historic infuerzano la mobilità diuria molecola in un campo eletrico compren dono muove nel campo elettrico e lo fa in maniera 21 CARICA DELLA MOLECOLA (a) (Coulomb} differente da un'altra particella carica presente « il GRADIENTE DI POTENZIALE DEL CAMPO ELETTRICO (E), cato dalla differenza di potenziale (V) sitema comme ni ciro emme nello stesso campo elettrico? Chiaramente, il - la RESISTENZA DI ATTRITO cel mezzo di support (f, che ralenta il movimento della molecola primo fattore che influenza Il movimento è la ue Quindi, la velocità (v) di una molecola carica che si carica CQ, espressa in Coulomb). Inoltre, il sposta in un campo elettrico è : Parametro che dipende sia dalla mama pn cateto 5 |! srercoeatieranzis ie sia Clettrodi farà la differenza. Infatti, il gradiente Senio "SOT raamenocie dipende di potenziale del campo elettrico CE) è dato paria dalla differenza di potenziale (V) tra i due elettrodi, diviso la distanza Cd) in cm tra gli elettrodi stessi CE= V/0. Maggiore è la distanza, minore Una molecola, però, non presenta solo una carica, ma presenta una sua forma, una sua dimensione, una sua densità e una sua viscosità. Poiché questa molecola è costretta ad attraversare il campo elettrico, il quale è costituito da una soluzione tampone elettrolitica, è necessario verificare anche come queste sue caratteristiche chimico-fisiche possano modificame il movimento. Pertanto, definiamo “Resistenza” all'attrito (D come tutta una serie di parametri che, in parte, possono dipendere dalla molecola Cdimensione, densità, forma) e, in parte, dipendono dal sistema elettroforetico Cviscosità della soluzione tampone, l'utilizzo meno di un supporto sul quale andiamo ad adagiare il campione che deve essere separato) CI supporto, in alcuni casi, deve influenzare la mobilità della molecolare). Dunque, se teniamo conto di tutti questi parametri, alcuni dipendenti dalla molecola e altri dipendenti dal sistema elettrodomestico, viene fuori che la Velocità di movimento in campo ciettito è direttamente proporzionale Quando, però, vagliamo usare l'elettroforesi per separare le molecole di una miscela, dobbiamo cercare di organizzare l'esperimento in maniera tale da avere il massimo grado di separazione delle molecole che abbiamo in soluzione. Notiamo che tutti quei fenomeni o parametri che dipendono dalla cella Cindipendentemente da dimensione, forma, etc, poiché la viscosità è quella). Ne consegue che è necessario Elettroforesi Biotecnologie Cellulari pulire questa formula, ovvero dobbiamo eli e d dal sistema; assumendo che, poiché impatta in ) uguale misura su tutte e le molecole nello stesso campo elettrico, sia trascurabile Questa operazione deve essere effettuata ragionando non in termini di velocità di migrazione in campo elettrico, piuttosto in termini di mobilità elettroforetica. La mobilità non è altro che il rapporto tra [a velocità e MOBILITA' ELETTROFORETICA ilLcampo elettrico applicato, ma se andiamo a sostituire alla velocità la sua formuletta che abbiamo visto ....... p=v/E prima, viene fuori che la mobilità 1 è direttamente... veExa/f proporzionale E*q e inversamente proporzionale a_E*f p=Exq/Exf=q/f Csemplificando si ottiene che la mobilità elettroforetica è direttamente proporzionale alla carica e inversamente proporzionale alla E, dalla quale togliamo > CARICA - > MOBILITA tutto quello che non dipende dalla molecola, ovvero la > MASSA = < MOBILITA' viscosità del mezzo, la forza di attrito eccetera). Cosa rimane? a dirnenslone della molecola In sintesi, due e erenziato, perché dipenderà dalla loro specifica mobilità elettroforetica, la quale sarà direttamente proporzionale alla carica della molecola cAnersamente proporzionale ala massa l Le molecole che presentano una carica maggiore miareranno più { Ogni molecola migra in funzione della sua carica e della sua massa Pertanto, è possibile distinguere, nell'ambito della stessa miscela, le molecole tra di loro perché presenteranno delle mobilità elettroforetiche peculiari. ACIDI NUCLEICI Gli acidi nucleici, essendo molecole cariche negativamente, in campo elettrico migreranno sempre e solo verso il polo positivo. Entro certe dimensioni, possiamo dire che, per il DNA, il rapporto carica/massa è costante (=la mobilità elettroforetica è costante). Questo perché se aggiungo un'unità di carica all'acido nucleico, vuol dire che sto aggiungendo una base azotata Cun nucleotide); se volessi rimuovere un'unità di carica, lo potrei fare solo rimuovendo un nucleotide. Quando si effettua l'elettroforesi su gel di Agarosio per separare gli acidi nucleici, bisogna caricare il campione a un'estremità del gel e bisogna fare attenzione al verso con cui si posiziona il supporto all'interno della cella elettroforetica per far sì che il DNA migri verso Îl polo positivo Ce quindi attraversare il supporto in tutta fa sua lunghezza). Quando si va a verificare la presenza del DNA, si osserva la presenza di bande, fe quali rappresentano frammenti di DNA di dimensione nota. In presenza di frammenti di DNA di diverse dimensioni, si notano bande con una mobilità elettroforetica diversa molecole di dimensioni più piccole, poiché presentano una massa minore Ce la massa si trova al denominatore), presentano una mobilità maggiore. Per cui, a parità di tempo, percorreranno un percorso più lungo sul supporto rispetto alle molecole più grandi. PROTEINE Come ben sappiamo, le proteine sono costituite da aa, i quali non sono tutti uguali Cricordiamo che è acido se è carico (>) e basico se è carico (+3). La carica di un ao, però, non è stabile, infatti, dipende dal pH della soluzione in cui è immersa. A un determinato valore di pH, la carica si annulla Cpunto isoelettrico). A quel valore di pH, gli aminoacidi sono presenti in soluzione come switterioni Se mettiamo un polipeptide in una soluzione al pH del suo punto iscelettrico, quel polipeptide sarà insensibile al campo elettrico perché avrà carica netta nulla) CQuesto perché se ogni amminoacido sarà al suo punto isoelettrico, anche ogni polipeptide presente un punto isoelettrico, che sarà dipendente dalla qualità degli aminoacidi). È anche | vero, per che posslamo moditicare la carica netta degli amminoacidi e + dunque, dei polipeptidi, o. Questo perché 2 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari l'acrilammide e il metilen-bis-acrilamide. Essendo una reazione, però, è necessaria la presenza di un catalizzatore: Il TEMED. Inoltre, trattandosi di una catalisi radicalica, abbiamo bisogno del primo radicale libero che innesca la reazione Co il gruppo iniziatore); il primo radicale libero è dato dall'ammonio 1 La reazione è immediata; pertanto, a distanza di pochi minuti dall'aggiunta del TEMED, la soluzione, da liquida, diventa gel 1 Il Persolfato fornisce Il primo radicale solforico, il quale innesca la reazione di polimerizzazione Come polimerizzano i monomeri tra di loro? Di fatto sono i monomeri di acrilammide che polimerizzano tra loro e, ogni tanto, una molecola di bis-acrilamide si intercala. Ovviamente, maggiore è la percentuale di monomeri che mettiamo in soluzione, maggiori saranno, in proporzione, le molecole di bis-acrilammide che si intercaleranno ai monomeri di acrilamide. Ammonium Persuttto <.|-_|.= In quest'altra figura si vede che si genera un poro. Esso, n lr ] + ia” rr | “Insieme agli altri pori, costituisce maglie del gel, le quali ani pr TREE, possono essere rese più o meno strette giocando sulla 7 percentuale dei monomeri in soluzione aumentando la percentuale dei monomeri saranno più strette, diminuendo la percentuale dei monomeri saranno più larghe. Tutto ciò dipende da ciò che dobbiamo fare. Il gel di poliacrilamide non è posizionato in orizzontale, bensì in verticale. Inoltre, è spesso pochi millimetri C0,75 mm, massimo Imm), a differenza del gel di Agarosio che mr perni n © i è spesso anche 1 cm. Come si ottiene un gel di queste dimensioni? In laboratorio si utilizzano due vetrini che si sovrappongono, mettendo lateralmente un piccolo spaziatore di 0,75 mm. Dopodiché si sigillano tre dei quattro lati di questi vetrini, in maniera tale che da uno possiamo versare il contenuto liquido della reazione di polimerizzazione mentre questa sta avvenendo. Naturalmente, anche in questo caso useremo un pettine dentellato sulla superficie. Una volta che la soluzione avrà gelificato, si liberano fe estremità dei vetrini che, a questo punto, non si aprono più perché il gel aiuta a mantenere adese le due lastre di vetro. Togliamo il pettine dentellato e utilizziamo quei pozzetti per caricare i campioni. In questo esempio dovrebbero essere 15 pozzetti, pertanto, in uno stesso gel, è possibile effettuare una separazione elettroforetica fino a 15 campioni diversi contemporaneamente. Le proteine presentano una carica e una ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE massa, ma Ì rapporti carica/massa non sono Elettroforesi delle PROTEINE n TI ‘ Le pi E CI li lesse rispetto al DNA: costanti. Questo vuol dire che io posso separare S pretemerono masramelero o puicompistie sento ngn ; Il rapporto carie NON è costante fe molecole proteiche in funzione della loro: La carica netta di var pende cala composizione Smminoodi SH della soluzione, + Carica; +% Massa, *® Rapporto Alcune proteine sono monumeriche, altre polimeriche carica/massa. Quando effettuiamo un'elettroforesi in Elettori in condire condizioni native, conserviamo [a struttura visinene nl nea 0 gi obulare) tridimensionale della proteina Cquindi sia il '° folding che la sua carica totale). In sintesi, in iunzione bioo ca hac n condizioni native, la molecola proteica si muoverà in maniera differenziata da un'altra molecola proteica in soluzione in funzione della sua carica e della sua dimensione Questo tipo di elettroforesi viene allestita Elettroforesi in condizioni DENATURANTI Elettroforesi Biotecnologie Cellulari quando, dopo l'elettroforesi, vogliamo studiare l'attività della proteina, pertanto è necessario mantenerne integra la struttura. In altri casi, quando invece sono interessata alla quantità relativa del polipeptide tra differenti campioni, è possibile allestire un'elettroforesi in condizioni denaturanti Qual è il vantaggio? Denaturando il polipeptide, esso si svolge nella sua struttura; inoltre, se utilizziamo come agente denaturante l'SDS (detergente anionico) scopriamo che è possibile denaturare e rendere ogni molecola proteica a carica negativa Il vantaggio è che costringerò tutte le proteine Cindipendentemente dal loro assetto amminoacidico) a tnigrare verso il polo positivo. Possiamo dire che è un po' come se eliminassimo la variabile carica e ci concentrassimo solo sulla variabile massa, pertanto, i polipeptidi nella stessa miscela, in condizioni denaturati, migreranno in maniera differenziale solo in funzione della loro differente massa Questo è un grande vantaggio perché l'elettroforesi in condizioni denaturanti, chiamata anche elettroforesi su gel di poliacrilamide o SDS- Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), è è una delle Strategie di separazione più irequentemente utilizzate quando dobbiamo allestire indagini ana e SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) ! Questo gel è utilizzato in verticale perché è possibile costruire dei gel più sottilj stabilizzati in una struttura. specifica e possono essere lunghi abbastanza per sfruttare la massima capacità di separazione delle molecole. Inoltre, il sistema verticale è più compatto rispetto a uno orizzontale e utilizza camere per Î buffer che permettono una separazione ottimale con un uso efficiente dei materiali ud pe SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis: GEL . i DISCONTINUO A questo punto, quindi, abbiamo descritto quali sono i parametri che modulano la migrazione di molecole cariche in campo elettrico, abbiamo parlato anche di velocità e di mobilità Abbiamo detto che la mobilità elettroforetica è è, in effetti, la cosa che ci interessa di più rispetto alla velocità, perché descrive la capacità , tenendo in considerazione esclusivamente le sue Infatti, la mobilità è direttamente proporzionale alla carica e alla massa e alle dimensioni. Ciò significa che potrei avere molecole che hanno fa stessa carica (ma dimensione diversa) e farle separarle sfruttando questa differenza Al contrario, dovrei avere molecole di dimensioni simile (ma di carica diverso) e, quindi, sfruttare fa differente carica per_separarle in campo elettrico Data l'eterogeneità, non sempre tutte le strategie elettroforetiche garantiscono (a migliore efficienza di separazione Cin pratica è molto semplice separare elementi diversi tra loro, ma è molto più difficile separare molecole molto simili per carica e per massa). Ne consegue che bisogna un po' raffinare Il metodo di separazione. 0 sono tarata con SDS (detergente anionico) pia di Abbiamo già anticipato che possiamo allestire una separazione elettroforetica in condizioni + Native +» Conserviamo la carica netta a quei pH e la struttura tridimensionale Cowvero la conformazione termodinamicamente più stabile). Sceglieremo questo genere di separazione quando, al termine della separazione, vogliamo saggiare l'attività, per esempio, della proteina In questo caso, perché questa possa conservare la sua funzione, deve conservare la sua struttura. <> Denaturanti +» Se, invece, il nostro scopo è, per esempio, soltanto verificarne [a presenza o farne una quantizzazione Cquindi stabilire quanta proteina c'è in diversi campioni), è necessario solo il polipeptide Ce non la sua funzione in sé). In quest'ultimo caso, possiamo semplificare il procedimento allestendo un'elettroforesi in condizioni denaturanti. Questo consente di rimuovere (a variabile carica e di conservare soltanto la variabile massa. 5 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari A quel punto, si prepara lo stacking prendendo la soluzione Tris-HC! a pri=6.8, aggiungendo l'acrilammide Cin % molto più bassa), ammonio persolfato CAPS) e TEMED. Anche in questo caso, si versa la lo stacking sopra l’altro gel, posizioniamo il pettine dentellato e aspettiamo 10 minuti. Rimuoviamo il pettine e il gel è pronto per essere immerso nella cameretta elettroforetica con il tampone Tris-Glicina-SDS. In sintesi, nella SDS-PAGE si utilizza un gel discontinuo composto da: < Stacking gel + Nel quale vengono formati i pozzetti in cui vengono depositati i campioni da analizzare. Matrice fissa al 6% pH 68: + Running gel (gel di risoluzione) » È la matrice a % variabile Ctra 8 e 15%) in grado di separare le singole macromolecole, pH 8.8. | tamponi utilizzati sono: % Tampone di corsa +» Iris-glicina-SDS pH=8.3, + Tampone dello stacking +» Iris-HC1 pH=6.8; + Tampone del running » Iris-HCl pH=88. A) Il running gel viene fatto polimerizzare fra due lastre di vetro che sono mantenute parallele e separate da sottili spaziatori di A / plastica. Normalmente il gel ha uno spessore nun DI ae di 0,8-1,5 mm e le sue dimensioni dipendono | n dalla risoluzione che si vuole ottenere. Sulla superficie del running gel viene depositata una piccola quantità di una soluzione acqua / butanolo per ottenere una superficie piatta. 8) Dopo la rimozione dell’acqua / butanolo al di sopra del running gel viene colato quello che sarà lo stacking gel. Prima che il gel polimerizzi si sistema sul lato superiore un “pettine” di plastica che a gelificazione ultimata viene tolto lasciando nel gel i pozzetti di alloggio per il caricamento dei campioni. Quando carichiamo un gel per l'elettroforesi, corriamo, in parallelo, diversi campioni Ctanti quanti sono i pozzetti a nostra disposizione). Questo ci consente di studiare più campioni diversi nella stessa elettroforesi; i risultati, però, di ciascun pozzetto, devono essere paragonabili ai pozzetti laterali. Ciò significa che quando vogliamo studiare la migrazione elettroforetica di molecole nel gel, dobbiamo assicurarci che tutte queste molecole comincino la loro migrazione nello stesso istante, altrimenti una arriva prima di un'altra perché è partita prima e non perché presenta una dimensione minore e quindi viaggia più velocemente. Come possiamo assicurarci che le molecole comincino la loro separazione elettroforetica nello stesso istante? Grazie proprio allo stacking, poiché esso ha il compito di assottigliare [e proteine in una linea sottilissimo, al fine di far si che tutte quelle del diversi pozzetti arrivino contemporaneamente all'inizio del running. Quindi, durante ta loro tnigrazione nello stackina, fe proteine st impatcana ma appena entrano nel vunning, le proteine iniziano a separarsi Ì Caricamento —Corsanello Corsa nel Ma come è possibile che da una parte si impaccano e dall'altra si, ni - separano? Tutto dipende dal differente pH di queste due porzioni del gel e dal ruolo che svolgono gli ioni carichi negativamente all'interno di questo sistema. Tre sono gli anioni importanti < loni glicinato +» Derivano dalla glicino, la quale è componente del tampone di corsa; È < loni cloruro + Sono presenti non solo nel tampone di corsa, Glicina Cloruro ma anche nel tampone che abbiamo usato per fare il gel CIris- HCD; < Proteine + Avranno carico netta negativa a causa dell'SDS. All'inizio dell'elettroforesi, il glicinato non si trova all'interno nel gel, ma si trova soltanto all'esterno della soluzione tampone. All'interno del gel, sono presenti le proteine e gli toni cloruro. Non appena chiudiamo il circuito e inizia a passare la corrente, gli anioni cominceranno a muoversi verso il polo positivo, pertanto gli 7 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari ioni glicinato i inizieranno a i penetrare all'interno del gel. La caratteristica tipica è che nella porzione dello In particolare, la mobilità elettrof oretica maggiore è tipica dello ione cl cloruro seguito dalle proteine ne carlche C-), ne consegue che la mobilità minore la presenta il glicinato. Pertanto, lo ione cloruro è talmente più veloce dello ione glicinato che genera una porzione del gel a bassa conducibilità Cperché non ci sono ioni). Questa porzione spinge il glicinato a muoversi ne consegue che è come se le proteine si trovassero schiacciate dentro un sandwich Cda una parte c'è lo ione cloruro e dall'altro lo ione glicinato), poiché, appunto, ke proteine sanno una pocblttà Intermeaa (quindi le proteine si assottigliano). Tutto questo è e a 299 j ing. Nel Running, come sappiamo, cambia il LCD, pertanto cambia lo stato di ionizzazione dello ione glicinato che, a questo punto, acquisisce la massima ionizzazione e viaggia veloce, ma anche lo ione cloruro accelera Dunque, restano solo le proteine che, a questo punto, iniziano a separarsi in funzione della loro dimensione. Se non ci fosse [o stacking, le proteine entrerebbero nel running con tempistiche differenti; la disparità di ingresso nel Running la troveremmo lungo tutta la corsa, ovvero troveremmo una proteina più alta e una più bassa non perché hanno effettivamente differenti pesi molecolari, ma perché il sistema è sfalsato da un ingresso prematuro di una specie piuttosto che di un'altra 1 Assottialiare fe proteine nello stacking, vuol dire costringerle ad allinearsi sulla “linea della partenza”, in modo tale da iniziare la loro gara di corsa nello stesso momento Il DNA, prima di essere caricato sul gel, deve essere addizionato al loading due Co lemming buffer?), il quale che a occhio nudo appare biu scuro. Esso ha il compito di appesantire il campione Cne cambia la densità, in maniera tale che il campione precipiti sul fondo del pozzetto e non diluisca immediatamente nel tampone di corso; allo stesso tempo, il colorante blu Cblu di bromofenolo) ha il compito di dare una ione nel gel. Essendo anch'esse molecole cariche negativamente, si muovono verso ll polo positivo, ma non legano in nessun modo il campione, semplicemente ne tracciano il fronte di migrazione. Lo stesso problema esiste per le proteine. Come ormai sappiamo, ogni volta che facciamo l'estrazione, si utilizziamo dei tamponi a base si acqua. Se prendessimo il lisato proteico così com'è e provassimo a caricarlo nel pozzetto, diluirebbe immediatamente nel tampone. Ne consegue che, anche in questo caso, dobbiamo addizionare un estratto proteico con una soluzione di caricamento, la quale presenta: SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis i È (SDS-PAGE) < Glicerolo per appesantire il campione, MISHCI 3 pil Gb cononene: SDS, un Aiducente quale di mo € SDS densità bl item Indicatore del cena 0 "ai Agenti riducenti » DII o B-mercaptoetanolo; * Coloranti + Blu di bromofenolo o Xilene cyanol I{ blu di bromofenolo, in un gel di poliacrilammide in una percentuale di circa il 10% ( una percentuale che si usa molto frequentemente), migra come una proteina che ha peso molecolare inferiore ai 10kDa Covvero il più piccolo peso risolvibile con un gel di questo tipo). Quindi, quando [a linea del blu di bromofenolo arriva alla fine del gel, assumiamo che abbiamo ottenuto un'ottimale separazione del range di proteine separabili con quel peso molecolare, pertanto ci fermiamo. Durante la corsa elettroforetica è importante capire a che punto siamo, poiché è una tecnica tempo dipendente (non sempre è evidente quando ci dobbiamo fermare, a volte si devono fare delle prove, quindi, empiricamente, si determina qual è la percentuale di acrilammide e il tempo necessario per avere il massimo grado di separazione). Le proteine, quindi, si separeranno esclusivamente in funzione della loro dimensione le molecole di più grandi dimensioni avranno difficoltà ad attraversare le maglie; ne consegue che a parità di tempo, di voltaggio, di percentuale Elettroforesi Biotecnologie Cellulari CCoomassie Brilliant Blue), il quale è il colorante usato per il saggio di Bradford nella quantizzazione delle proteine allo spettrofotometro. Un'altra possibilità consiste nell'utilizzare il Silver Staining Cusa il Nitrato di Argento, AgNO3) o dei fiuorocromi. Nell'immagine è rappresentato un gel dopo la separazione elettroforetica ss E #0 = — colorato con Blu Coomassie. Alle due estremità è presente il marcatore — Li u —- di peso molecolare, il quale è costituito da proteine, pertanto anch'esse = 1-44 1 interagiscono con il Coomassie, che si deposita sulle proteine e (e mette in _ = ® 2 _ risalto Le proteine migrano e formano delle bande discrete In questo Up fs caso sono poche specie proteiche, con pesi molecolari distinti, pertanto le _ bande sono ben separate l'una dalle altre In un estratto proteico totale, dove sono presenti proteine di tutte le forme, specie e dimensioni, naturalmente, creerà uno smir Covvero saranno rappresentati quasi tutti i pesi molecolari). Nei casi dove c'è maggiore abbondanza di proteine che condividono la stessa dimensione, si depositerà più Coomassie; dove la rappresentanza del peso molecolare è meno evidente, se ne depositerà meno. In ogni caso, in un gel monodimensionale come questo Cabbiamo usato una sola dimensione per la separazione, ovvero la massa diversa), in ciascuna di quelle bande sì possono trovare 100-150 Canche 200) polipeptidi diversi, solo perché condividono un peso molecolare simile e la risoluzione di questo gel non consente di distinguere come differenti queste 150 specie di polipeptidi troppo simili tra di loro. Ivantaggio del Coomassie è che è una metodica di colorazione del gel molto facile si prepara una soluzione contenente Coomassie, si immerge il gel dentro questa soluzione, il gel si impregna di colorante nell'arco di 15-20 minuti e diventa tutto blu scuro A quel punto, sottoponiamo il gel a una serie di lavaggi in una soluzione di decolorazione: dove non ci sono le proteine, il gel torna trasparente, mentre dove ci sono fe proteine, resta la banda blu, la cui intensità dipende dalla quantità di polipeptidi presenti L'unico svantaggio è che non è molto sensibile come tecnica, ciò significa che per osservare la presenza di una banda, è necessario che in quel punto del gel siano presenti almeno 50 ng Cnanogrammi) di proteine. 1 Blu Coomassie si lega alle proteine attraverso legami ionici tra i aruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine, oltre che attraverso forze di van der Waals; Si aggiunge il colorante in acido acetico e metanolo, si lascia reagire finché tutto il gel è diventato blu; poi si decolora con acido acetico e metanolo. COLORAZIONE CON NITRATO D'ARGENTO Li | CAS =98= cui Una metodica più sensibile è la colorazione con il nitrato d'argento. In =® pd = questo caso, si prende il gel sempre dopo la corsa elettroforetica, si fissano } 3 dd = le proteine presenti sul gel utilizzando formaldeide e si aggiunge il nitrato “= — produ d'argento, che precipita sulle molecole proteiche, formando proprio dei Sali, = - Review che si legano alle proteine Le bande, in questo caso, appaiono colorate di marrone. Questa colorazione è fino a 100 volte più sensibile del Coomassie, perché appariranno anche le bande che contengono 1 na di polipeptidi. Questa colorazione, però, è, oltre a essere più tossica a causa della presenza di formaldeide e altri composti, è anche più difficile, dal momento che, a un certo punto, la reazione va bloccata. In particolare, bisogna fermare la reazione di deposizione dei Sali sostituendo la soluzione; altrimenti, nel tempo, diventa tutto marrone e non discriminiamo più dove sono le proteine e dove esse sono assenti. 1 Nel caso della colorazione Silver Staining, si fissano le proteine con il metanolo, si aggiunge nitrato di argento che si lega alle proteine. Si aggiunge quindi formaldeide in bicarbonato per ridurre l’Ag+ ad argento metallico. La reazione viene fermata con acido acetico Il procedimento è analogo a quello dello sviluppo fotografico. COLORAZIONE CON FLUOROCROMI | fluorocromi sono molecole fluorescenti che vanno fegate in maniera covalente ai polipeptidi Quindi, in questo caso, | polipeptidi devono essere marcati prima dell'inizio dell'elettroforesi. Possiamo scegliere fluorocromi diversi per marcare campioni diversi, in maniera tale che, nell'analisi a valle della separazione elettroforetica, possiamo risalire al segnale specifico proveniente da un campione piuttosto che da un altro. 10 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Sono molto utilizzati nell'elettroforesi bidimensionale Nell'immagine è rappresentato un tipico gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti, rappresentativo dell'ultima fase di separazione elettroforetica di un'elettroforesi bidimensionale (® în assoluto la tecnica elettroforetica più performante in termini di separazione). Notiamo che fe proteine non si distribuiscono a formare delle bande, ma formano degli spot Cdei puntini). In ognuno di quegli spot, ci sono al massimo una quindicina/ventina di polipeptidi diversi Ccontro le centinaia che avevamo nelle bande). Già da qui capiamo che è stata più efficace ed efficiente In ciascuno di quei puntini, ci sono dei nella separazione delle specie proteiche polipeptidi che st sono distribuiti in quel punto del gel in funzione della loro separazione per carica e per massa. La dimensione dello spot ovviamente, è proporzionati alla quantità di polieptidi presente 8 naturalmente, anche l'inte di a polipeptide che si è deposto in quel punto del gel In sintesi, le proteine possono essere direttamente marcate con coloranti fluorescenti Cnoti come CyDyes: Cy2, Cy3 e Cy5) prima dell'elettroforesi. | CyuDyes sono coloranti di cianina spettralmente risolvibili che trasportano un gruppo reattivo N-idrossisuccinimidil estere che lega covalentemente i gruppi e-amminici dei residui di lisina nelle proteine Le conccotnazioni i colorante sono mantenute basss in modo tale che gina. L'aspetto importante di questa strategia di colorazione è la possibilità di mnarcare due 0 più campioni con coloranti diversi e separarli sull stesso gel, eliminando la variabilità da gel a gel. | coloranti sono paragonabili i in sensibilità ai metodi di colorazione dell argento, sono IL WESTERN BLOT WESTERN BLOT Principi di base , a MFN . ‘ Dopo un'elettroforesi in condizioni denaturanti, potrei non essere interessata a tutte le proteine presenti al suo interno, ma solo a un paio di proteine specifiche Cper esempio ne voglio studiare l'espressione nel mio campione oppure nel campione di riferimento oppure prima e dopo un trattamento farmacologico, etc). Per poter studiare una proteina nello specifico, abbiamo bisogno di un anticorpo che riconosce la proteina. In questo caso, quindi, l'anticorpo diventa [a nostra esca per pescare [a nostra proteina nel totale di quelle che si sono andate a distribuire sul gel. Il problema è che l'anticorpo € il gel non possono entrare in contatto diretto; infatti, bisogna prima trasferire le proteine su un supporto che meglio si adatta a interagire con l'anticorpi. Dunque, faremo un trasferimento di proteine dai gel alla carta da filtro Cuna membrana), al fine di attuare una metodica che si chiama Western Blot TRASFERIMENTO Per trasferire le proteine dal gel alla carta da filtro RE N usiamo nuovamente il campo elettrico Le proteine s sono ben separate sul gel in funzione della loro orta massa e sono ancora cariche negativamente Cperché hanno ancora I'SDS); dunque, sfruttiamo la Tampone di trasferimento 25m Tris presenza di queste cariche negative per costringere 190mM glicina ancora le molecole a muoversi verso un polo positivo Questa volta, però, durante la loro migrazione incontreranno un foglio di carta, il quale presenta sulla sua fici ici er ti Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Questo elemento può essere anche un cromof'oro, ma, di solito, sono molto poco Prodotto dd Substrato | luminescente . sensibili; quindi, si utilizzano \ n} “tl principalmente anticorpi 2° coniugati con un enzima Cperossidasi estratta dal A Anticorpo secondario rafano). Questo è importante perché, a | N meno che non siamo degli studiosi delle Anticorpo Primario cellule di rafano, è improbabile che all'interno del nostro gel vi sia la perossidasi di rafano. Ne consegue che qualunque segnale venga fuori dalla perossidasi di rafano, è solo ed esclusivamente proveniente dall'anticorpo 2° Questo enzima, in presenza di luminolo e di perossido di idrogeno, catalizza la reazione di ossidazione. il cui prodotto secondario è l'emissione di fotoni (luce). La luce viene emessa | WIM esclusivamente in corrispondenza della presenza dell'anticorpo m= secondario, che ha legato il primario che, a sua volta, ha legato — — © la proteina di interesse. La luce può impressionare una lastra _autoradiografica; pertanto è necessario andare in una camera buia Coscura, deve ®a esserci solo una lampadina rossa) e bisogna mettere in NJ esì valutano ì minuti Co i secondi) di esposizione Dopodiché, la lastra si sviluppa come le foto Cliquido di sviluppo e liquido di fissaggio). Viene fuori che solo dove c'era l'emissione di luce, la e fastra è stata impressionato, quindi mostra un segnale scuro (È possibile che una parte de e j a proteica, pertanto si possono osservare dei piccoli rettangoli neri Dunque, dobbiamo notare fa ‘rando differenza del peso molecolare sono evidentemente proteine più piccole perché durante la separazione elettroforetica sono finite in fondo al gel, quindi sono rappresentative di un peso molecolare diverso da quello della nostra proteina di interesse. Una seconda possibilità consiste nell'usare degli apparecchi che catturano la chemiluminescenza in digitale, quindi non c'è più la lastra che si impressiona, ma c'è uno schermo che detecta la luminosità proveniente dal filtro e restituisce l'immagine sul computer. Questi apparecchi possono essere di vari tipi, ma il chemi- doc è uno dei più utilizzati. Questa, invece, è una Jastra alla vecchia Sono rappresentati campioni diversi e All'incirca del peso roolecolare di circa 135 1Da compare un segnale molto specifico, / n . il quale, però, è diverso da pozzetto a pozzetto. Notiamo come, in certi casi, la banda duet; 2 US sia molto intensa, mentre in altri molto meno. Questa è è la cassia applicazione del Western blot, ovvero l'a e 1 a e condizioni, avendo il mio campione di riferimento cl “controllo: dopodiché vedo se questa proteina aumenta o diminuisce a seconda dei trattamenti eseguiti. ISOELETTROFOCALIZZAZIONE ELETTROFORESI IN CONDIZIONE NATIVA Effettuare un'elettroforesi in condizione nativa può significare mantenere solo la carica, denaturando il polipeptide con un detergente non ionico, oppure può significare lasciare proprio le proteine intatte Csia per carica che per struttura tridimensionale). Generalmente, quando vogliamo effettuare una separazione elettroforetica in condizioni native, effettuiamo un’isoelettrofocalizzazione. 13 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari i Te e gal comesssiene Peer capire come funziona, dobbiamo ricordare che la carica netta di un polipeptide dipende dal pH nel quale Il polipeptide si trova: la carica netta sarà nulla quando il polipeptide si trova a un pi corrispondente al suo punto isoelettrico Cin questo caso avremo il massimo grado di se pu ionizzazione sia dei gruppi carbossilici che dei gruppi N (-) amminici, che si bilanciano); se, però, lo stesso polipeptide è suini un gene di ita sono von i IMMMErSO În ina soluzione con ph inferiore rispetto al punto 20 cel diferonte punto Isoelettrico isoelettrico, i gruppi amminici sono jonizzati, pertanto la proteina acquisisce carica netta positiva. AI contrario, quando il pH è superiore rispetto al punto isoelettrico, fa carica netta è negativa Per l'isoelettrofocalizzazione, il supporto è molto diverso dal gel che abbiamo descritto fino ad ora. Si tratta di una striscia sottile (sempre di materiale gel, che può essere agarosio, poliacrilammide, etc). Le maglie sono talmente farghe che, di fatto, non contribuiscono In Nessun Modo Pi Ae n alla separazione dei polipeptidi sole Irene dip La caratteristica tipica di questo gel è che vi è Gisotti possono essere accusati Et N con per diversi range di pH, sia a banca (hi immobilizzato all'interno un gradiente di pH. Quando ingrtcesiaptisa price DI abbiamo effettuato la polimerizzazione, abbiamo 7opHo) ° agglunta alla miscela dele molecole che sono dei paliclettrotti anfoteri, ovvero delle roolecole che È, A . La procedura è laboriosa e non viene effettuata i in n laboratorio; questi supporti in gradiente di pH si acquistano In ogni caso, un'estremità presenterà un pH molto basso Cacido) e, a mano a mano che ci si muove lungo il supporto, si arriva all'altro estremo, dove il pH è molto più alto o è comunque un pH basico Le nostre proteine saranno in condizioni native, ma quando entreranno in contatto con il supporto, migreranno verso il catodo 0 verso l'anodo in funzione della loro carica netta, la loro carica netta, però, dipende da dove fe abbiamo caricate [ungo il supporto. Infatti, normalmente, le molecole proteiche si caricano al centro, dove, però, è immobilizzato un certo pH. Quindi, carico le proteine e le costringo a stare a un determinato pH: per alcuni polipeptidi mi troverò al di sopra del punto isoelettrico, mentre altri si troveranno al di sotto del punto isoelettrico. Quando chiudo il circuito e faccio i i, alcuni polipeptidi migreranno verso un polo e altri migreranno verso l'altro polo L'obiettivo è far sì che, mentre migrano, le proteine vadano incontro al loro punto isoelettrico, perché quando incontreranno la porzione di gel in cui immobilizzato il pH pari al foro punto iscelettrico, assumeranno carica nulla e si fermeranno Csi dice “si focalizzeranno sul gel”, in quella porzione). Ne consegue che avrò ottenuto una separazione in funzione della carica 0 del loro punto isoelettrico. Per far sì che durante la loro migrazione vadano incontro a loro punto isoelettrico, però, bisogna dal momento che tutte le molecole che si troveranno al di sopra del loro punto iscelettrico devono muoversi lungo il gradiente di pH in senso decrescente, mentre tutte le molecole che si troveranno al di sotto del punto isoelettrico, dovranno attraversare il pH in senso crescente, mentre vanno verso Îl polo negativo. Per questa ragione, il supporto a pH acido deve essere posizionato verso il polo positivo, mentre la porzione del supporto che presenta il pli basico deve essere posizionata verso À il polo negativo. È difficile immaginare questo supporto, quindi — analizziamo le immagini. - %a 1 É possibile correre più supporti in parallelo mettendoli : aL attaccati uno vicino all'altro dl 14 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Re | In verticale è presente la distribuzione per dimensione, mentre in orizzontale è presente la distribuzione per pH. Ognuno degli spot rappresenta una manciata di polipeptide; la dimensione dello spot è proporzionale alla i net quantità Cin termini di nonogrammi) di proteine A TOTO presenti nell'ambiente. Quello che non può dire questa E immagine è come sono rappresentate le proteine dentro quello spot Esempio Se ho 5 polipeptidi, chi mi dice che ognuno di foro contribuisce per 1/5 all'intensità dello spot? Infatti, uno potrebbe rappresentare il 90% dello spot, mentre gli altri potrebbero essere tracce, perché sono proteine più espresse o meno espresse dal sistema di partenza che stiamo analizzando. In ogni caso, è possibile recuperare le proteine all'interno dello spot ritagliando il pezzo di gel ed estraendone i polipeptidi contenuti all'interno. Come dicevamo nella lezione introduttiva, l'elettroforesi bidimensionale è la tecnica ideale per degli studi di proteica differenziale, la quale studia il proteoma di due o più sistemi per paragonarli e trovare le differenze in termini di qualità e quantità di proteine espresse. Questo perché due sistemi potrebbero esprimere proteine diverse; quindi una potrebbe essere presente solo in un sistema e l'altra solo nell'altro; oppure la stessa specie proteica potrebbe essere espressa in misura diversa dai due sistemi Cin quel caso, la stessa proteina sarà più espressa in una condizione e meno espressa in un'altra). Come posso rende iva g dimensionale? Devon marcare i miei campioni ovvero 0 devo far sì che possa quantizzare una fluorescenza in maniera tale da renderla proporzionale alla quantità di proteina. Approccio pia della COTE STRNE mediante Esernpig In questo esempio abbiamo due campioni (Sample = 1 e Sample 2) CPooled internal standard è un terzo campione che ci serve soltanto a verificare che, in ogni step v » della procedura, tecnicamente stia avvenendo tutto i correttamente). Immaginiamo di un campione che proviene È da una biopsia di neoplasia, di un organo che può essere la S] rostata. Vogliamo capire che cosa c'è di differente nel =] kai n F E P 9 Pi profilo proteico delle cellule del tumore alla prostata rispetto alle cellule della prostata sana. Quindi, estraiamo le proteine totali dalla prostata sana (Sample D e le proteine totali dalla biopsia di tumore alla prostata (Sample 2) e lì marco con due fluorocromi diversi. A questo punto possiamo mischiare i campioni, perché basterà tracciare il fluorocromo per sapere ogni specie proteica a quale dei due campioni corrisponde. Tutte le proteine contenute nella provetta Cin rapporto 11), vengono separate prima per iscelettrofocalizzazione Cquindi si distribuiranno lungo il supporto in funzione della loro carica, perché si fermeranno in corrispondenza del punto iscelettrico). A questo punto, separo per massa CSDS-Pag®) e otterrò un gel in cui ciascuno spot è fluorescente Dentro questo spot, però, ci saranno 2-3 specie proteiche che possono essere espresse sia da Sample 1 che da Sample 2. Se così è, questo spot emetterà fluorescenza sia nel rosso che nell'altro canale. 1 Dalla sovrapposizione di verde e rosso si ottiene giallo. Notiamo che la stragrande maggioranza degli spot è gialla; ciò significa che le 4-5 specie proteiche che, per foro natura chimico fisica al termine dell'elettroforesi si distribuiscono all'interno del 2, poiché è presente una perfetta sovrapposizione del segnale. Gli spot non sono interessanti, dal momento che sono assenti differenze Infatti, ci interesseremo soltanto degli spot solo rossi o solo verdi, perché saranno spot contenenti proteine provenienti da uno solo dei due sistemi. 16 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Per sapere Il nome det polipeptidi differentemente espressi, si ritaglia il pezzetto di gel e si estraggono i polipeptidi dal gel Cche viene fuso nuovamente con alcune aggiunte alla soluzione). | pezzettini vengono estratti e digeriti per renderli di dimensioni più piccole, purificati e sottoposti a un'analisi di spettrofotometria di massa Questa operazione connota l'identità del polipeptide, (eggendone, di fatto, i componenti aminocidici che fo compongono. Quindi, lo spettrometro fornisce un grafico: ognuno del picchi corrisponde una sequenza amminoacidica È sufficiente prendere la stringa di aminoacidi, fare una ricerca in banca dati e analizzare quali peptidi noti in uomo, topo 0 nel sistema che sto studiando, è presente, all'interno della sua sequenza, una stringa aminoacidica come quella. Naturalmente, il database riporta tutti i possibili polipeptidi con una certa significatività. In questo modo, non solo risaliamo alla quantità di polipeptide differentemente espressa, ma anche alla qualità. Prelievo degli spot proteici e Digestione enzimatica dei peptidi dello spot Il frammento di gel viene digerito con tripsina e sonicato per ottenere piccoli frammenti peptidici. | peptidi vengono analizzati allo spettrometro di massa per ottenerne il «finger print» IS, Pepe Enichmeni een , |>] Pepi MS Analysis Extract Analisi delle proteine contenute negli spot mediante SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI-TOF-MS/MS of [4-18] VPAFLSAAEVEEHLR (m/z: 1667.8) Misura accuratamente la MASSA PROTEICA. Attraverso le sequenze peptidiche IDENTIFICA le proteine note e SEQUENZIA quelle ignote. Identifica le modifiche post-traduzionali MALDI-TOF-MS spectrum of crystallin, mu 17 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Questo tampone si chiama “tampone di È condizionamento” e, di solito, è una base di o un acido molto forte. Quindi, il primo ©" nes passaggio serve a preparare il tubo con.il ELETTROENDOSMOTICO condizionamento; in seguito un secondo tampone viene aggiunto prima dell'arrivo degli analiti. Questo tampone si chiama “elettrolita di fondo" Co background vai electrolute), che altro non è che una soluzione tampone che presenta delle cariche Cdei cationi o degli anioni). Ci interessano in particolare i cationi, dal momento che interagiscono, in maniera spontanea, con le cariche negative presenti all’interno del tubo. Ne consegue che tutte queste cariche positive rivestono l'interno del tubo e, interagendo con le cariche negative, si forma Il “doppio strato diffuso”. A questo punto gli analiti sono ancora assenti, poichè stiamo solo preparando il capillare abbiamo ionizzato i gruppi all'interno del capillare e abbiamo rivestito il tubo capillare con dei contro ioni che interagiscono con le cariche fisse. Sottolineiamo il fatto che queste cariche sono fisse, perché mentre i gruppi silanonici sono immobili Cnon si muovono), le cariche positive del tampone possono muoversi nel momento in cui innesco una differenza di potenziale Questo movimento di ioni positivi crea un flusso fisico di molecole, che si chiama * ". A questo punto carichiamo gli analiti in condizione nativa all'estremità del tubo che pesca dove è presente il polo positivo. Fiottrofarosi Canillara è Ciascuno degli analiti miarerà in funzione della sua mobilità elettroforetica e, quindi, del suo rapporto carica /massa, ma jtà la f. f . Esempio Immaginiamo i lunghi corridoi presenti negli aeroporti, dove molto spesso sono presenti dei tapiroulant. Il corridoio si può percorrere fuori dal tappeto o sul tappeto; sul tappeto, però, è possibile camminare insieme al tappeto, rimanere fermi 0, addirittura, è possibile provare a percorrere il tappeto in senso dal copia è ganiin un graîco ialattoferogramm) cc i contrario. Riusciremmo ad arrivare all'altro capo del corridoio Mi det tec leve de e soltanto se la nostra velocità di camminata supera la velocità del tappeto. Se il tappeto è più veloce di noi, non riusciremo mai ad andare nella direzione desiderata. Questa è esattamente la situazione in cui si trovano le molecole all'interno del tubo capillare. Le molecole che hanno la stessa carica del doppio strato diffuso Cdei contro ioni) migrano insieme a essi perché seguono il loro gradiente elettrochimico e si muovono, quindi, spontaneamente verso il polo negativo. Potremmo dire che sono le persone che sono sul tappeto e camminano sul tappeto verso l'altro capo del corridoio. Quindi, la mobilità, che è detta “apparente”, di queste molecole si divide in: + Mobilità effettiva » Dovuta al loro rapporto carica/massa; + Mobilità dovuta al flusso elettrico. Q rese Le molecole neutre sono come le persone che vanno sul tappeto e restano ferme e aspettano che il tappeto le conduca alla fine del corridoio; ciò significa che non opporranno resistenza al movimento dato dal flusso elettroendosmotico (perché non hanno carica), ma non si impegnano per muoversi Ne consegue che la mobilità delle molecole neutre sarà proprio Lguale alla mobilità dovuta dal flusso elettroendosmatico. Le molecole cariche negativamente, invece, sono quelle che non si muoverebbero mai verso il polo negativo In questo caso, quindi, è necessario analizza rispetto ala mobilità elettroforetica dell'anaita carico negativamente Sela rmablità del flusso è maggiore, seppur lentamente, queste molecole saranno, in ogni caso, trascinate fino al capo opposto, migrando contro gradiente elettrochimico. Se la mobilità degli anioni è, invece, superiore a quella del flusso elettroendosmotico, non si muoveranno e, di conseguenza, verranno automaticamente esclusi dalla ine elettroforatica, ingano tutti 19 Elettroforesi Biotecnologie Cellulari Quindi, per ogni analita, possiamo misurare una mobilità apparente, la quale è data dalla somma della mobilità effettiva Cdovuta alla natura chimico-fisica della molecola, quindi al suo rapporto carica/massa) più la mobilità del flusso elettroendosmotico. Nell'immagine la M deve essere sostituita dalla lettera greca mi. < Mobilità apparente > 0 + Poiché le molecole stanno già migrando secondo il loro gradiente è chiaro che la mob * Mobilità effettiva = 0 Ccome nel caso delle molecole peutre) » La mobilità apparente sarà proprio uguale alla mobilità dovuta al flusso elettroendosmotico. Nel caso degli anioni, dove la mobilità è inferiore a 0, la mobilità apparente sarà di base inferiore al flusso glettroendosmotico; naturalmente, il movimento fisico dipenderà da quanto il flusso elettroendosmotico riuscirà comunque a trascinare gli ioni, MOBILITA’ ELETTROFORETICA Dicevamo che, a mano a nell'elettroforesi capillare mano che attraversano Îl capillare, le molecole Sept. 00, è Uguale ala sora dela sua mobilia cleltrotertica rele (o , passano attraverso il Tn iaia Uve fusto demorde monto (I) cati i . i detector: in tempo reale, il Meet Neutra! Aa computer genera un SieticendosineNtO si muore verso i od ceo CTS ico in cui è K cao VE repo | grafico in cui è presente anioni 0 = uu | | | dall'analita a uscire dal in atro parole, | caoni mgreno pù velocemente del fucco EOF, gi anioni = === tubo in funzione della migrano più lentamente. Le specie neutre migrano alla stessa velocità del ù Migration time Men ‘ fuso EOF. variabile che il detector sta cationi basso m/q > cationi alto m/q > molecole neutre > anioni alto m/q > anioni bassom/g MOMENTO Cnell'esempio c'è un'assorbanza a 289). Il grafico, quindi, presenta dei picchi. Questo grafico si definisce elettroferogramma*. *Questo tipo di grafico lo incontriamo quando facciamo le analisi del sangue indica la quantità di proteine plasmatiche. Questo perché l'elettroforesi capillare è una di quelle tecniche elettroforetiche che trova la migliore applicazione in campo diagnostico. A seconda della dimensione e della natura chimica del capillare, possiamo ottenere un ottimo grado di Nip degli analiti. analisi, lo possiamo ottenere tranquillamente con un'elettroforesi capillare. Ovviamente, per quello che ci siamo detti prima, le prime specie a uscire sono i cationi, È quali sono quelli che hanno la mobilità più elevata. | cationi sono seguiti dalle specie neutre e, infine, escono gli anioni. Te RENE Con l'elettroforesi capillare è possibile anche separare tanti tipi di molecole diverse, come singoli aminoacidi, proteine, acidi nucleici 0, addirittura, intere cellule. . Il vantaggio è che è super veloce e molto riproducibile; d'altro canto, ina la quantità di materiale che è possibile caricare è molto piccola (per questo motivo si presta magnificamente a indagini di tipo diagnostico). Difficilmente si usa un'elettroforesi capillare per fare indagini di tipo preparativo 0, comunque, quando le miscele sono particolarmente complesse. Dunque, la chiave per capire come funziona un’elettroforesi capillare è capire che cos'è il flusso al elettroendosmotico. Ricapitolando, ricordiamo che le tecniche elettroforetiche sono una serie di tecniche che ci consentono di separare le componenti di una miscela sfruttando la loro carica e il loro rapporto carica/massa. Vantaggi dell'elettroforesi capillare 20