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GENETICA
RICAMBIO: Processo con il quale i viventi prendono dal mondo esterno le sostanze con cui costruiscono il loro corpo e da cui traggono energia per le loro funzioni. EREDITARIETA’: è la caratteristica per la quale il vivente genera discendenze simili sia nelle forme che nelle funzioni. Questi sono i due caratteri che distinguono gli esseri viventi da quelli non viventi. La teoria cellulare dice che la materia vivente è organizzata in cellule, anche se la scoperta dei virus che sono una struttura acellulare basata su una capsula proteica ed un filamento di ac. Nucleico non ha inficiato le basi di questa teoria. Il virus possiede solo un carattere della materia vivente ed è quello di riprodursi e si comporta da vivente solo quando è all’interno della cellula dato che fuori è una sostanza inerte. La cellula è l’unico essere in grado di autoregolarsi e riprodursi e quindi possiede i caratteri del vivente. Qui avvengono tutti i processi capaci di convertire le sostanze inerti in materia vivente. La riproduzione assicura la continuità della vita. Da una generazione ad un’altra si osservano due fattori e cioè eredità perché i figli sono somiglianti ai genitori e tra loro e variabilità perché mostrano differenze più o meno marcate dai genitori e dai fratelli. EREDITA’: negli organismi pluricellulari alcune cellule si staccano dai genitori per creare i nuovi individui.
- Nella riproduzione asessuata la singola cellula o cellule provengono da un unico genitore ed i nuovi individui sono uguali tra loro e uguali al genitore Clone o stirpe clonale.
- Nella riproduzione sessuata due cellule riproduttive, i gameti (singole cellule aploidi, l’ovulo e lo spermatozoo, contengono solo metà delle informazioni necessarie per formare un nuovo organismo) si uniscono con la fecondazione per dare origine allo zigote (risultato diploide, ovvero contiene l’intera informazione data dalla fecondazione tra ovulo e spermatozoo). Siccome i figli assomigliano ai genitori, l’informazione ereditaria deve essere contenuta sia nel gamete maschile sia in quello femminile e localizzata nel nucleo perché il gamete maschile contribuisce alla formazione dello zigote solo con esso. I nuclei contengono delle molecole organizzate in modo da consentire la trasmissione tramite di codice delle strutture ereditarie dai genitori ai figli e queste informazioni non devono essere alterate fisicamente e chimicamente e solo una mutazione può cambiare il messaggio genetico. Le caratteristiche possono essere modificate anche dall’ambiente, ma non sono mutazioni ereditarie. GENOTIPO: Informazioni in codice contenute nei nuclei di un individuo FENOTIPO: Espressione somatica del genotipo. Risultato dell’interazione tra genotipo e ambiente. Es. coniglio imalaiano: colore bianco causa temperatura che inibisce la formazione del pigmento nero che si trova alle estremità perché sono le parti più fredde. Il coniglio eredita il sistema di formazione del pigmento reagisce alla temperatura in un determinato modo. Es. grasso dei conigli: i conigli selvatici hanno il grasso bianco, mentre quelli allevati hanno il grasso giallo questo perché i conigli selvatici producono un enzima nel fegato capace di scomporre la xantofilla, un pigmento giallo che si trova negli alimenti. I conigli allevati non sono in grado di produrre questo enzima. Il grasso bianco può essere prodotto però anche da animali che non sono in grado di scomporre la xantofilla, basta fornire alimenti privi di essa quindi il carattere grasso bianco non è dovuto alla genetica, ma all’ambiente fenocopie: fenotipo indotto dall’ambiente uguale al fenotipo indotto dalla mutazione. VARIABILITA’: Gli individui di una popolazione non sono uguali, ma differenti a causa di fattori genetici ed ambientali. Il clone che deriva da parti somatiche di un individuo iniziale non presenza variabilità genetica dovuta al mancato intervento dei gameti nella propagazione, ma ambientale. L’effetto della sessualità sulla variabilità cambia a seconda della frequenza con cui viene scambiato il materiale genetico all’interno della popolazione. Negli animali e piante allogame in cui avviene l’incrocio, la fecondazione del gamete maschile avviene ad opera del gamete maschile proveniente da un altro individuo (sia effetti genici sia ambientali). Nelle piante autogame, il gamete femminile viene fecondato da un gamete maschile dello stesso individuo e perciò non sono diversi dalla pianta madre e tra di loro linea pura: variabilità di origine ambientale. La variabilità è un mezzo che consente agli individui ed alle popolazioni l’adattamento alle mutevoli condizioni ambientali. Specie: insieme di individui che possono fecondarsi liberamente e produrre progenie illimitata. ALLA RICERCA DEL MATERIALE EREDITARIO: Le informazioni sono contenute in codice nel nucleo sottoforma di sostanze. Le sostanze organiche presenti sono: proteine, grassi, zuccheri ed acidi. Gli acidi vengono chiamati nucleine e poi successivamente acidi nucleici che vennero scoperti grazie alla divisione
del nucleo dal citoplasma. Successivamente si scoprì che essi sono associati a delle proteine e vanno a costituire le nucleoproteine. Queste proteine possono essere sia basiche che acide. Una sostanza chimica, per assolvere il compito di materiale ereditario deve:
- replicarsi durante la divisione cellulare e crescita
- possedere una struttura stabile in modo che le mutazioni avvengano raramente
- portare l’informazione biologica
- trasferire tale l’informazione a tutte le cellule. Le proteine sono formate da AA legati insieme a formare, tramite legami peptidici, una catena polipeptidica. I legami si stabiliscono tra il gr. COOH di un AA e il gruppo NH2 del successivo. La struttura primaria consiste nella sequenza di AA. La catena polipeptidica non è completamente distesa, ma può assumere varie formazioni che ne determinano la struttura secondaria che può essere caratterizzata da un andamento a spirale α elica sostenuta da ponti idrogeno che si stabiliscono tra gr. amminici e carbossilici, oppure c’è la configurazione a foglietto β. Dalla struttura secondaria si può formare una struttura terziaria che è tridimensionale con legami di Van der Waals, legami idrogeno e legami disolfuro. Le proteine si dividono in proteine semplici costituite solo da AA, mentre le coniugate contengono legami non peptidici che sono essenziali per la funzione specifica della proteina es. fosfoproteine contengono H2PO3, nucleoproteine contengono acidi nucleici ecc… Le due strutture dipendono dalla primaria e insieme conferiscono caratteristiche alle diverse proteine. ESPERIMENTI DI GRIFFITH: esperimenti condotti su due ceppi del batterio Diplococcus pneumoniae agente patogeno della polmonite dei topi. Un ceppo ha superficie liscia (S) ed è virulento perché hanno una capsula di polisaccaridi che impedisce ai globuli bianchi di fagocitarli, l’altro ha superficie rugosa ( R) e non è virulento perché non ha la capsula. 1°- inietto i due ceppi in topi diversi: alcuni muoiono altri no (prevedibile). 2°- inietto in topi il ceppo S virulento ucciso con il calore: i topi rimangono vivi. 3°- inietto in topi cellule R non virulente con cellule S virulente, ma uccise con calore aspettativa: topi vivi e invece i topi muoiono e nel sangue ci sono tracce del ceppo virulento… perché? C’è stato uno spostamento di materiale genetico dal ceppo virulento al non virulento. ESPERIMENTI DI AVERY, McLEOD E McCARTY: cellule del ceppo R insieme ad un estratto acellulare (pestare i batteri in un mortaio insieme ad una sostanza abrasiva es. Al2O3) del ceppo S messe a sviluppare su un terreno di coltura idoneo. Dopo un po’: cellule R si sono riprodotte, si esamina la progenie e si nota che sono quasi tutte simili ai genitori e che alcune di esse circa 1/1.000.000 erano di tipo S. Trasformazione. Ipotesi: l’estratto originario ottenuto dalle cellule S contenesse un principio trasformante capace di trasformare delle cellule R in S. Saggiarono diversi estratti acellulari dai quali vengono rimosse di volta in volta specifiche sostanze chimiche e trovarono che l’acido deossiribonucleico induceva la trasformazione e lo capirono grazie al trattamento con la deossiribonucleasi, enzima che degrada l’acido nucleico e il ceppo S perdeva la capacità di indurre la trasformazione. ESPERIMENTI DI HERSHEY E CHASE: dimostrarono che anche nel batteriofago (costituito da un rivestimento proteico [assumono zolfo che manca]e da ac. Nucleici [è presente fosforo che manca nella proteina]), il materiale ereditario è rappresentato dall’ac. Nucleico e non dalla proteina: I due scienziati prepararono in parallelo 2 colture di E.coli dove in un terreno di coltura introdussero 32P e nell’altro 35S i batteri metabolizzano da una parte P e da una parte S radioattivi. Il fosforo si troverà soprattutto nei nucleotidi ed ac. Nucleici. Lo zolfo invece nelle proteine infettarono le due colture con il fago T2 che usa l’app. biosintetico di E.coli per replicare il DNA. i fagi avranno DNA marcato radio attivamente quelli che attaccano batteri P ed i fagi che hanno rivestimento proteico marcato radio attivamente attaccano batteri S. separare i fagi ed infettare altre 2 colonie di E.coli messe in terreni standard:
- radioattività misurata all’interno delle cellule con DNA marcato
- radioattività misurata all’esterno delle cellule con rivestimento proteico marcato. ESPERIMENTI DI FRAENKEL-CONRAT: Dimostrò che l’ereditabilità dei virus dipende dal loro ac. Nucleico. Prese il virus del mosaico del tabacco nei suoi componenti chimici: proteina ed ac. Nucleico e riuscì poi a riunirli ricostituendo le particelle infettive. Se si ponevano le proteine di un virus e l’ac. Nucleico di un altro virus, l’alterazione delle foglie del tabacco aveva sempre le caratteristiche volute dal virus erano sempre quelle caratteristiche dovute all’ac.nucleico. ELEMENTI COSTITUTIVI DEGLI AC. NUCLEICI: gli ac. Nucleici sono costituiti da molecole giganti che possono essere rotte in una serie di unità chimiche dette nucleotidi che è costituito da un gr.fosforico, uno zucchero pentoso ed una base azotata. L’ac.fosforico con radicali liberi sarebbe corrosivo e si trova legato a ioni metallici.
Ogni nastro è un polinucleotide e cioè il gr. Fosforico di un nucleotide si lega al carbonio 3’ dello zucchero del nucleotide precedente. Le basi sono situate perpendicolarmente all’asse dell’elica e unite con legami ad idrogeno. I legami tra le basi azotate è specifico: adenina con timina (due legami idrogeno) e guanina con citosina (tre legami ad idrogeno). Lo scheletro è la parte della molecola in cui i legami interessano sempre le stesse parti. Non contiene nessuna informazione genetica. Le dimensioni del DNA vengono espresse come n° di paia di basi (bp) o in multipli di di bp. Il multiplo più usato è il kb. REPLICAZIONE: in realtà i nucleotidi si appaiano per mezzo delle loro basi dando origine ad una molecola di DNA che si presenta come un sistema a due filamenti che sono fra loro complementari come una cerniera a lampo. Si ipotizzò che fosse possibile aprire la molecola di DNA con la rottura dei legami ad idrogeno e poi ciascun nastro può servire da stampo. Con la replicazione si ha un’esatta replicazione del DNA e quindi anche una replicazione dell’informazione. Durante la replicazione il DNA assume forme ad Y. Ci sono tre tipi di replicazione:
- semiconservativa: ogni filamento funge da stampo quindi i filamenti che si formano hanno un filamento vecchio ed uno nuovo.
- Conservativo: i due vecchi filamenti rimangono insieme
- Dispersiva: i nastri dell’elica si romperebbero in più punti duplicandosi e quindi si formano filamenti con porzioni nuovo e vecchie. Esperimento: tecnica della centrifugazione del DNA in gradiente di densità su E.coli. centrifugando ad alta velocità per molte ore una soluzione concentrata di cloruro di cesio. Per effetto della forza centrifuga la densità è maggiore sul fondo della provetta e minore in superficie. Con il cloruro di cesio ed il DNA, in questa provetta si forma una banda che sarebbe il punto in cui le densità dei due si equivalgono. Allevarono cellule batteriche in un terreno di coltura contenente 15N per un tempo abbastanza lungo, in modo tale che 15N si ritrovi nel DNA. Le cellule poi vengono spostate in un terreno con 14N ed ad intervalli di 20 min così che si formi una nuova generazione, vengono prelevati campioni a cui veniva estratto il DNAcentrifugazione con cloruro di cesio e si osservano le seguenti variazioni:
- DNA denso e basta perché in terreno con 15N
- DNA semidenso e basta perché in terreno con 14N
- DNA semidenso e DNA leggero o normale. Terreno di coltura 14N
- DNA semidenso e costante e DNA leggero o normale in aumento. Tutto ciò conferma che il DNA si replica per semiconservazione perché se fosse stata conservativa il DNA denso non sarebbe scomparso e con la dispersiva si sarebbe osservata una banda che si spostava in direzione leggero. BIOCHIMICA DELLA REPLICAZIONE: comporta la duplicazione di tutto il corredo cellulare sia se possiede un solo cromosoma (procarioti) o più cromosomi (eucarioti). La replicazione avviene per comparti che costituiscono unità di replicazione o repliconi che possiedono un’origine di replicazione. Nei procarioti il replicone è formato dal DNA ed i cromosomi hanno solo un’origine di replicazione. Gli eucarioti invece hanno cromosomi con molte origini di replicazione ed hanno molti repliconi. La replicazione del DNA avviene in corrispondenza della forcella replicativa, dove la doppia elica si svolge e i due filamenti si separano. La replicazione procede un modo continuo lungo il filamento principale seguendo la direzione di spostamento della forcella replicativa. Lungo il filamento ritardato la sintesi avviene per brevi segmenti in direzione opposta al movimento della forcella. Per poter iniziare la sintesi, la DNA polimerasi ha bisogno di un primer che sia già presente sul posto. Dopo l’inizio si origina una forcella di replicazione che può rendere la replicazione unidirezionale o bidirezionale e qui si formano due forcelle che interessano repliconi contigui, uno a dx ed uno a sx dell’origine. LA DNA POLIMERASI: esperimento: un estratto proteico di E.coli veniva incubato con 4 deossiribonucleici trifosfati marcati con C14, ioni Mg++ (per attivare i sistemi enzimatici) e DNA batterico (funzione di stampo per la sintesi di nuove molecole). I 4 dNTP forniscono sia i 4 nucleotidi, sia l’energia necessaria per la sintesi delle catene polinucleotidiche. Dopo un periodo d’incubazione, isolò dalla miscela un po’ di DNA radioattivo. Concentrando l’estratto proteico nel sistema, la radioattività aumentava di 4000 volte, indicando che la sintesi del DNA era catabolizzata da un enzima dell’estratto proteicoDNA polimerasi che presenta rapporto A+G/T+C=1 e A+T/C+G= a quello del DNA usato come stampo. Le DNA polimerasi catalizzano la formazione di legami fosfodiesterici tra il gruppo fosfato più interno del deossinucleoside trifosfato libero, il gruppo 3’-OH dello zucchero del deossinucleotide precedente.
In questo processo vengono rilasciati due gruppi fosfato del nucleotide che è stato aggiunto nella forma di pirofosfato. CARATTERISTICHE INSOLITE: Non può iniziare la sintesi del DNA problema che viene superato con la sintesi di primer di RNA da parte della primasi. Può legare nucleotidi nella sola direzione 5’ 3’ problema che viene superato sintetizzando il filamento 3’ 5’ in brevi frammenti. REPLICAZIONE DEL DNA: 1) denaturazione: proteine specifiche si associano in modo sequenziale e formano il complesso di pre-innesco che determina la denaturazione di una piccola porzione di DNA.
- i filamenti singoli ottenuti vengono stabilizzati da proteine particolari (SSB) mentre una proteina enzimatica elicasi srotola il DNA e forma la forcella di replicazione.
- in associazione con l’elicasi agisce la primasi che è capace di sintetizzare un corto RNA d’innesco che ha un OH libero in posizione 3’. La primasi può iniziare la sintesi di RNA ex-novo direttamente su uno stampo di DNA a filamento singolo mentre la DNA polimerasi ha bisogno dell’innesco.
- la presenza dell’OH libero in posizione 3’ nell’RNA primer rende possibile l’entrata della replicasi con seguente sintesi di DNA. La replicasi è quindi una DNA polimerasi III oloenzima costituito da diverse sub unità: α attività catalitica, ε attività di correzione degli errori che assicura la fedeltà della replicazione. La DNA polimerasi I ha prevalente azione di controllo della replicazione e non di sintesi. La DNA polimerasi II ha azione di riparazione delle lesioni sul DNA come la polimerasi IV e v. La formazione dell’innesco si verifica una sola volta per la sintesi continua del filamento leader mentre si verifica molte volte nel corso della sintesi discontinua del filamento tardivo. La replicasi operante sul filamento tardivo si muove con elicasi e primasi sintetizzando una serie di frammenti di Okazaky. La sintesi si ferma quando la replicasi incontra un RNA-primer del frammento precedente. I frammenti di Okazaky vengono privati degli RNA primer che vengono sostituiti da DNA tutto ciò grazie all’azione della RNA-asi H che degrada gli RNA primer dalla loro estremità 5’ lasciando l’ultimo ribonucleotide; sostituendolo con il deossiribonucleotide. Infine il DNA ligasi provvede a saldare i frammenti e forma il filamento tardivo. L’avanzamento della forcella crea un problema se la doppia elica venisse semplicemente aperta e srotolata, la velocità del processo determinerebbe a monte una tensione in progressivo aumento che produrrebbe un superavvolgimento della molecola che blocca la replicazionetopoisomerasi: enzimi capaci di rompere i legami fosfodiesterici su un’elica del DNA permettendo alle 2 sezioni a monte ed a valle di ruotare liberamente attorno al proprio asse e poi saldarsi. Enzimi della replicazione TOPOISOMERASI; riduce i superavvolgimenti e permette alle due sezioni dell’elica di ruotare liberamente. COMPLESSO DI PRE-INNESCO: determina apertura della doppia elica (denaturazione). PROTEINE SSB: stabilizzano i filamenti singoli impedendo di riassociarsi ELICASI: srotola le eliche del DNA PRIMASI: sintetizza ex novo gli inneschi di RNA (circa 10 basi) DNA polimerasi III (replicasi): allungamento della catena di nuova sintesi Dna ligasi: sutura del DNA DNA polimerasi I (RNA-asi): rimuove gli inneschi e riempie i gaps. I due filamenti figli sono sintetizzati in modo diverso: Il filamento guida ( leading ) Un primer di RNA viene sintetizzato all’estremità La DNA polimerasi III lega i nucleotidi in direzione 5’ à 3’ mentre scorre verso la forca replicativa. Il filamento in ritardo ( lagging ) Anche in questo caso la sintesi avviene in direzione 5’ à 3’ Tuttavia avviene allontanandosi dalla forca replicativa Sono necessari molti primer di RNA Che sono utilizzati dalla DNA polimerasi III per sintetizzare brevi frammenti di 1000-2000 nucleotidi ciascuno I frammenti di Okazaki. REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI: La replicazione del DNA negli eucarioti non è compresa così bene come quella dei procarioti. I due processi presentano molte somiglianze. Tuttavia, negli eucarioti la replicazione del DNA è più complessa perché legato a proteine. I cromosomi sono grandi e lineari. Sono strettamente impacchettati nei nucleosomi. La regolazione del ciclo cellulare è molto più complessa. Gli eucarioti hanno cromosomi lunghi e lineari perciò sono necessarie numerose origini di replicazione. Esistenza di origini di replicazione multiple: La replicazione del DNA procede in modo bidirezionale da queste origini. Le cellule di mammifero possiedono almeno una dozzina di DNA polimerasi diverse. Quattro di esse: α, δ, ε e γ hanno il ruolo fondamentale di replicare il DNA α, δ e ε DNA nucleare γ DNA mitocondriale Le DNA polimerasi svolgono un ruolo anche nella riparazione del DNA. La DNA polimerasi β non è implicata nella replicazione del DNA,ma ha un ruolo nella riparazione per escissione delle basi.
copie denaturate, di una sequenza marcata, detta sonda. Se tra i frammenti sono presenti pezzi identici alle sonde, i due filamenti potranno ibridarsi. PCR: Permette di copiare un gran numero di volte, tramite l’enzima polimerasi I, uno specifico frammento di DNA (target). La reazione viene innescata da due oligonucleotidi(primer) di lunghezza compresa tra 10 e 25 nucleotidi che hanno, una sequenza identica all’estremità 5’ di uno dei due filamenti che costituiscono il frammento target. Per rendere possibile l’appaiamento dei primer nei siti complementari è necessario denaturare i filamenti del DNA mediante riscaldamento a 95°C; la temperatura viene quindi ridotta per consentire l’ibridazione, infine ha luogo la reazione di polimerizzazione ad opera del DNA polimerasi che aggiungendo il nucleotide complementare all’estremità 3’ di ciascun primer, porta il suo allungamento con la formazione del filamento complementare allo stampo. Cicli ripetuti di 1)denaturazione 2)appaiamento dei primer con le sequenze complementari 3) estensione dei primer ad opera della DNA polimerasi. Tutti i nuovi frammenti che si formano da esso nei cicli successivi di PCR riprodurranno esattamente la sequenza target. Anche se ad ogni ciclo si formano filamenti che iniziano con il target e con lunghezza maggiore del target, la loro proporzione diminuirà rapidamente. Il prodotto della reazione di PCR viene espresso come amplicone. SEQUENZIAMENTO DNA: significa determinare l’esatta successione delle basi azotate tramite metodo Sanger o metodo dei dideossiribonucleotidi perché richiede l’impiego di nucleotidi che contengono di deossiribosio (mancano due atomi di ossigeno) anziché deossiribosio. Il punto di partenza per il sequenziamento è un frammento di DNA di sequenza nota al quale è legato il frammento di cui si vuole conoscere la sequenza. Il frammento di sequenza nota consente di mettere a punto un primer per copiare, grazie alla polimerasi I, la parte incognita. Quando il metodo è stato inventato, prevedeva quattro differenti reazioni di polimerizzazione che impiegano, oltre al DNA stampo ed al primer, i deossiribonucleosidi trifosfati e la DNA polimerasi. IL GENE E LA SUA ESPRESSIONE: RNA E SINTESI PROTEICA (CAPITOLO 3) 4 conclusioni fondamentali:
- il DNA contiene l’informazione genetica;
- l’informazione genetica contenuta nel DNA determina la formazione delle proteine;
- tale informazione deve essere contenuta nella sequenza delle basi essendo quella dello zucchero e del gruppo fosforico una ripetizione lineare e monotona degli stessi zuccheri.
- l’altro acido nucleico, l’RNA, a differenza del DNA, si trova prevalentemente nel citoplasma in corrispondenza dei ribosomi, corpi formati sia da RNA che da proteine in cui ha luogo la sintesi proteica. GLI ACIDI RIBONUCLEICI: le proteine si formano senza il diretto intervento del DNA. La sintesi proteica avviene nel citoplasma mentre il DNA si trova nel nucleo, quindi deve esistere una molecola che funzioni da mediatore e prenda l’informazione dal DNA e la porti ai siti citoplasmatici per la sintesi. Per dimostrare ciò sono stati usati sistemi acellulari che addizionati con AA e composti che forniscono energia si nota attività di sintesi proteica. Se si aggiunge DNAasi che degrada il DNA, la sintesi si arresta il DNA controlla in qualche modo la sintesi. Se poi gli viene aggiunto RNA, la sintesi riprende l’RNA è coinvolto nella sintesi proteica e la formazione dell’RNA dipende dal DNA. La sintesi dell’ RNA che avviene nel nucleo (e che successivamente si trasferisce al citoplasma) in presenza di DNA si è scoperta così: si somministra citidina H3 per 15 min ad una coltura del protozoo ciliato in interfase, si fissa il preparato, si fa un’autoradiografia e si vede che la radioattività è nel nucleo. Se poi vengono posti in un mezzo di coltura contenente citidina non marcata per 88 minuti e si fa un’altra autoradiografia, si osserva che la maggior parte della radioattività si è trasferita soprattutto nel citoplasma. considerazioni: essendo la citidina usata sia da DNA che da RNA, quando era nel nucleo era richiesta per la sintesi di nuovi acidi nucleici e poi il trasferimento dal nucleo al citoplasma dimostra che l’RNA sintetizzato nel nucleo si trasferisce nel citoplasma. La sintesi dell’RNA è catalizzata da un enzima, la RNA polimerasi ed agisce solo in presenza di DNA. CARATTERISTICHE DELL’RNA E TRASCRIZIONE: non possiede struttura a doppia elica dato che le basi non sono in rapporti uguali. Ha una struttura a filamento singolo, è ripiegato su se stesso e può formare dei tratti a doppia elica quando le condizioni di complementarietà tra le basi si verificano. La sintesi di RNA richiede l’intervento della RNA polimerasi che lega i ribonucleosidi trifosfati in catene poliribonucleotidiche tramite legami fosfodiesterici in direzione 5’3’. E’ da presumere che il DNA funge da stampo per l’RNA. Il DNA denaturato possa ibridarsi con l’RNA complementare. La dimostrazione che delle due eliche del DNA una sola viene trascritta è stata ottenuta lavorando sul fago SP8.
Il filamento di DNA che viene trascritto nel corrispondente RNA è detto filamento stampo. Quello complementare viene detto filamento senso perché la sua sequenza è quella che si ritrova nell’RNA messaggero che codifica la proteina. TIPI DI RNA: ci sono vari tipi di RNA che vengono sintetizzati sullo stampo del DNA. L’RNA di trasferimento ed il ribosomale rappresentano il 98% dell’RNA presente in una cellula e per la loro sintesi viene usato meno dell’1% di DNA totale. Viene trascritta anche quella parte di DNA non contenenti geni codificanti proteine e definito “DNA spazzatura”. RNA ribosomale: la maggior parte dell’RNA presente va a costituire i ribosomi che sono costituiti da 2 subunità di cui la sub unità più grossa è circa il doppio della più piccola ed entrambe contengono RNA e proteine nel rapporto 2:1 con coefficiente di sedimentazione di 50S (costituita da due molecole con coefficiente di sedimentazione 5S e 23S e 31 proteine specifiche)e di 30S (costituita da una molecola 16S e 21 proteine specifiche). Il ribosoma è il sito della sintesi proteica. Un gene – un ribosoma – una proteina sbagliato perché:
- l’RNA ribosomale è molto uniforme sia per dimensione che per composizione nucleotidica.
- Anche in presenza di ribosomi, una particolare proteina non si forma se non è presente un gene specifico. RNA messaggero: questo RNA è il responsabile del trasporto del messaggio genetico dal nucleo al citoplasma. Nell’mRNA la parte iniziale non viene tradotta e prende il nome di leader o regione 5’ non tradotta, così accade anche per la parte finale che viene indicata con il termine di trailer o regione 3’ non tradotta. Nelle cellule eucarioti alle due estremità si aggiungono altre molecole. Ai leader si aggiungono il cap cioè una molecola di 7-metil guanilato mentre al trailer si aggiunge la coda poli A cioè 150- nucleotidi contenenti adenina. Nei procarioti, una molecola di mRNA può essere tradotta in una sola catena polipeptidica o in una serie di catene polipeptidiche differenti dove ogni catena è in relazione con una frazione della molecola di mRNA. L’ mRNA è dotato di un rapido ricambio. RNA di trasferimento: l’informazione genetica trascritta nell’ mRNA deve essere tradotta in sequenze di AA. Dobbiamo decidere come gli AA si possono allineare uno di seguito all’altro in base a quanto stabilito dalla sequenza di basi di un RNA stampo, tenendo conto che per molti AA non è chimicamente possibile stabilire legami specifici con le basi azotate dell’RNA. Esiste un tRNA specifico per ogni AA. È costituito da circa 80 nucleotidi ed ha un peso molecolare di circa 25.000 dalton. E’ costituita per la maggior parte da una doppia elica che si crea per ripiegamento del singolo filamento iniziale su se stesso con la formazione di legami ad idrogeno tra basi complementari. Ne risulta una struttura bidimensionale detta a “trifoglio” dove sono presenti 3 lobi ed una gobba. All’estremità 3’ c’è la sequenza –CCA mentre all’estremità 5’ c’è sempre la guanina. Prima reazione, L’AA più l’ATP tramite l’aminoacilsintetasi si forma AA~AMP +P ~ P (aminoaciladenilato) con un legame di alta energia (~). La seconda reazione, l’aminoacilsintetasi porta la formazione di un legame tra AA~AMP e tRNA: AA~AMP + tRNA con aminoacilsintetasi AA~tRNA + AMP. Essendo reazioni specifiche e gli AA sono 20 devono esistere almeno 20 aminoacilsintetasi diverse. E’ formato da 3 lobi con diverse funzioni: uno realizza l’unione con la superficie del ribosoma, il secondo (centrale) contiene 3 basi adiacenti che insieme contengono l’anticodone le quali possono stabilire legami ad idrogeno con altrettante basi complementari presenti nell’RNA stampo, il terzo è quello responsabile dell’unione con l’enzima attivante aminoacilsintetasi. PICCOLI RNA: Quasi tutti gli eucarioti producono piccole molecole di RNA lunghe 20-30 nucleotidi. Intervengono nel regolare un gran numero di processi cellulari impedendo spesso la traduzione di mRNA. Le due classi principali di RNA sono gli small interfiling RNA che possono essere prodotti nel corso di infezioni virali perché il genoma del virus prevede a volte la trascrizione di entrambi i filamenti che possono appaiarsi formando dsRNA (da cui derivano le due classi principali di RNA; può formarsi anche per l’azione dell’enzima RNA polimerasi RNA dipendente, capace di polimerizzare RNA sullo stampo di un RNA. I microRNA derivano dalla trascrizione di geni specifici che producono molecole di RNA contenenti ripetizioni invertite. Le molecole di dsRNA vengono frammentate ed elaborate da un insieme specializzato di enzimi e proteine che portano alla formazione di miRNA o siRNA che si legano a ribonucleasi dando origine ad un complesso
dal poli-U è la fenilalanina. Una tripletta perché se inserivamo uno o due nucleotidi c’era uno sfasamento del messaggio, mentre se ne inseriamo tre, allora consente il ritorno in fase. IL GENE: il segmento della molecola del DNA che codifica per una catena polipeptidica completa o per una molecola di RNA prende il nome di gene. Alle triplette del DNA chiamate codogeni, corrispondono codoni nell’mRNA, anticodoni nel tRNA e amminoacidi specifici nella catena polipeptidica. Per potersi esprimere, il gene, deve essere prima trascritto nel corrispondente mRNA il quale va poi tradotto nel polipeptide. I PROMOTORI:il promotore dirige la RNA polimerasi sul punto esatto per l’inizio della trascrizione. Differiscono per la capacità di legame con la polimerasi. A valle del promotore si trova il sito di legame della RNA polimerasi. Il segnale d’inizio è dato da una corta sequenza di basi che si trova nella regione del promotore. Nei procarioti è formata da 6 nucleotidi. Negli eucarioti troviamo invece la sequenza TATA detta TATA box. Nei batteri, la possibilità che la RNA polimerasi riconosce specifiche sequenze del promotore è conferita dal fattore σ che è una sub unità della RNA polimerasi. Negli eucarioti sono necessari i fattori di trascrizione, proteine che riconoscono sequenze specifiche del promotore e attivano la trascrizione. Al termine della trascrizione, l’informazione codificata, risulta trasferita in una sequenza complementare di nucleotidi nell’mRNA. Il segmento nella regione codificante inizia sempre con la tripletta AUG e termina con una delle triplette UAA, UAG, UGA. Ha un codone “start” fino a quando non è interrotta da un codone “STOP”. Il processo di trascrizione avviene sul filamento stampo. GENI DISCONTINUI:La maggior parte del DNA presente nella cellula non viene espresso in proteine. Nei procarioti, trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente e nello stesso luogo, mentre negli eucarioti sono separati spazialmente e temporalmente il DNA viene trascritto nel nucleo dove dà origine a molecole di mRNA dove viene ulteriormente elaborato nel nucleo, in modo da ridurre le molecole più primitive; si forma mRNA “maturo” che viene portato nel citoplasma e tradotto in proteine. Le parti del gene che trovavano un corrispettivo nell’RNA messaggero vennero chiamate esoni (porzione di un gene che viene trascritto dalle RNA polimerasi durante la trascrizione. Si ritrovano negli RNA maturi.) le atre introni (porzione di gene che viene trascritto dalle RNA polimerasi. Vengono rimossi per formare mRNA.). durante la fase di maturazione, l’RNA subisce dei tagli; le parti trascritte sugli introni vengono perse e le estremità delle parti trascritte sugli esoni vengono legate insieme splicing. Lo splicing può avvenire in modo diverso (splicing alternativo) che consiste nella variazione della lunghezza delle regioni rimosse o la mancata rimozione di introni che porta ad ottenere da uno stesso gene, messaggeri e proteine diverse. Gli introni non sono solo negli mRNA nucleari degli eucarioti, ma anche nei geni dei mitocondri e plastidi ecc… sono di natura diversa: il loro splicing non richiede l’intervento dello spliceosoma (apparato costituito da proteine ed RNA) perché hanno capacità di escissione autonomaRNA catalitici. Hanno struttura tridimensionale. Vengono classificati come introni di gruppo I, II, III a seconda del tipo di organismo e/o organulo, della struttura e di differenze nel meccanismo di splicing. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA: Gli organismi pluricellulari derivano da un’unica cellula che per successive divisioni mitotiche dà luogo ad un individuo le cui cellule contengono tutte lo stesso patrimonio genetico. Nel caso di organismi unicellulari da una cellula singola si può ottenere una colonia di individui con lo stesso patrimonio genetico. Una certa proteina viene prodotta solo quando è necessaria per la vita della cellula. La sintesi di questa proteina dipende sia dal controllo genetico che dai fattori ambientali. Negli organismi pluricellulari, per successive divisioni mitotiche si formano cellule nervose ecc… gruppi di cellule che possiedono un alto grado di specializzazione certi geni sono attivi ed altri no. REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI: E.coli può moltiplicarsi in un terreno di coltura pur avendo pochi Sali inorganici ed uno zucchero come fonte di energia e carbonio (es lattosio). Quando cresce in presenza di lattosio, il batterio cresce più velocemente rispetto alla presenza di glucosio. I substrati come il lattosio vengono chiamati induttori e gli enzimi corrispondenti sono detti inducibili. Gli enzimi vengono detti enzimi reprimibili ed i metaboliti terminali corepressori. La produzione di mRNA relativo ad enzimi inducibili e reprimibili è sotto il controllo di un gruppo di molecole proteiche che agiscono da repressori. I geni che codificano le proteine sono chiamati geni regolatori gene che codifica per un prodotto la cui funzione è quella di esercitare un controllo sull’attività di sintesi proteica di altri geni. I repressori arrestano la sintesi dell’mRNA perché sono in grado di legarsi a specifiche sequenze nucleotidiche del DNA che costituiscono l’operatore. I repressori possono esistere sia in forma attiva che inattiva a seconda che siano o meno combinati con molecole specifiche di induttori e corepressori. Nel caso di enzimi reprimibili, il repressore è sempre inattivo, solo l’aggiunta del corepressore dà luogo alla formazione di un complesso attivo repressore-corepressore in grado di legarsi all’operatore e di impedire la
sintesi dell’mRNA. l’unione avviene tramite legami deboli in modo che si possono formare e rompere rapidamente. Il repressore può impedire la sintesi di una proteina o di più proteine contemporaneamente. REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI: E’ controllata a livello trascrizionale, post-trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale. Stato della cromatina: Il DNA è organizzato in modo per garantire il suo funzionamento, integrità e trasmissione alle progenie. Si realizza attraverso il complesso DNA-proteine detto cromatina. La trascrizione è influenzata dalla capacità di RNA polimerasi di legarsi al promotore. Un altro fattore in gioco è la metilazione del DNA legami di gruppo metile alle citosine ed è regolata da enzimi specifici: il legame del DNA alle proteine che attivano la trascrizione può essere impedito dalla presenza di citosine metilate. Può essere riprodotto nelle molecole figlie nel momento della replicazione del DNA e può essere trasmesso via mitosi/meiosi. epigenetica di cui parleremo solo di:1) paramaturazione che non è un fenomeno di mutazione anche se ha effetti simili, ma è l’interazione tra due forme diverse di uno stesso gene che porta ad un cambiamento di espressione ereditabile. L’allele che induce il cambiamento è detto paramutagenico, mentre quello che cambia è detto paramutabile.
- imprinting genomico o parentale: è un tipo di regolazione in cui l’espressione di un gene dipende dal gamete di origine: soltanto uno dei due alleli viene espresso. I geni soggetti ad imprinting controllano lo sviluppo dei tessuti che trasferiscono nutrienti dalla madre all’embrione che si sviluppaplacenta nei mammiferi e endosperma nelle piante. Regolazione trascrizionale: dipende da proteine regolatrici capaci di legarsi a specifiche sequenze di DNA presenti nella regione del promotore e di esercitare un controllo positivo o negativo (attivazione o disattivazione) sui geni corrispondenti. L’azione dei fattori di trascrizione permette all’espressione genica di rispondere ad un gran numero di segnali, sia interni che esterni, come luce, T°, attacchi patogeni, stato osmotico e molti altri. Regolazione post-trascrizionale: si realizza in modi diversi:
- il fenomeno dello splicing alternativo dell’mRNA, è anch’esso un sistema per regolare l’espressione del gene es. per produzione di molecole di mRNA divere e quindi di proteine diverse.
- Recentemente è stato scoperto un raffinato meccanismo di regolazione mediato dai piccoli RNA. Alcuni piccoli RNA si legano a molecole di mRNA tagliandole in due risultato: silenzia mento dell’espressione genica. a) silenziamento dell’RNA; b) quando coinvolge miRNA RNA interference; c) quando coinvolge siRNA si parla di silenziamento genico post-trascrizionale ogni piccolo RNA si lega ad un solo messaggero o a gruppi di messaggeri che contengono la sequenza complementare.
- Il silenziamento può avvenire attraverso la modificazione dello stato della cromatina.
- Il silenziamento può avvenire attraverso un blocco della trascrizione, mediato dell’interazione tra il piccolo RNA ed il promotore del gene.
- Modificazione post-trascrizionale dell’RNA con la trasformazione di una base azotata in un’altraRNA editing. Regolazione traduzionale: si basa sulla presenza di specifici fattori d’inizio, di allungamento e terminazione per la sintesi proteica, sulla capacità dei ribosomi di legarsi alle molecole di mRNA, sulla vita media delle molecole di mRNA, sulle concentrazioni delle molecole di tRNA sull’azione di piccoli RNA specifici. Regolazione post-traduzionale: Molte proteine devono essere modificate dopo la traduzione per diventare funzionali. Nel taglio di una estremità della catena polipeptidi cadetta peptide segnale, ha la funzione di permettere il trasporto della proteina in uno specifico comparto cellulare; quando la proteina è giunta a destinazione, il peptide segnale viene rimosso da proteasi specializzate. Catabolismo delle proteine: uno dei modi per regolare l’attività delle proteine è il controllo della degradazione per via ubiquitina-proteasoma. Il proteasoma è un grande complesso proteico di 700kDa, presente sia nel nucleo che nel citoplasma. Si compone di due parti, un nucleo protesico ed una parte regolatoria che ha la funzione di riconoscere il substrato proteico che sarà poi degradato a piccoli peptidi dalla parte proteasica. L’ubiquitina è una proteina di 76 AA e peso molecolare di 8.5 kDa altamente conservata. Il suo legame alle proteine le indirizza alla degradazione da parte del proteasoma. Meccanismo d’azione: 1- attivazione da parte di un enzima specifico; 2- trasferimento nel sito attivo di una proteina detta E1; 3- trasferimento ad una proteina detta E2; 4- legame isopeptidico tra la glicina C-terminale e una lisina della proteina target per azione di una ubiquitina ligasi detta E3.
4- La lunghezza del cromosoma metafasico è circa 1/10.000 della lunghezza della molecola di DNA. Questo livello di compattamento è avvenuto mediante avvolgimenti e ripiegamenti delle fibre di cromatina attraverso meccanismo non noto. Struttura e morfologia del cromosoma eucariotico: E’ possibile contare i cromosomi. Il n° e la morfologiacariotipo sono costanti. Il cariogramma si costruisce fotografando i cromosomi metafasici e raggruppandoli poi in tante coppie di cromosomi omologhi. Il n° cromosomico si indica con 2n che indica il n° somatico n° di cromosomi che sono contenuti nelle cellule somatiche di un organismo. Contiene n materna ed n paterna; n n° gametico: numero di cromosomi presenti negli spermi e nelle uova. I cromosomi omologhi hanno le stesse dimensioni, la stessa morfologia e gli stessi geni nella stessa posizionelocus. Il cromosoma è un’entità indipendente dal punto di vista strutturale ma non funzionale. E’ parte integrante di un complesso di cromosomi che costituisce il genoma nucleare in cui sono presenti tutti i geni responsabili e indispensabili per la vita e lo sviluppo. Complemento di base insieme dei cromosomi che forma un genoma. Le caratteristiche strutturali del cromosoma sono: Centromero : detto anche costrizione primaria, svolge la funzione importante durante le divisioni mitotiche e meiotiche dato che interagisce con i microtubuli del fuso così da formare un allineamento metafasico e regolare separazione dei cromosomi durante l’anafase. Viene indicato anche come cinetocoro. I frammenti centrici e cioè con il centromero, si comportano come cromosomi interi, mentre i frammenti acentrici e cioè senza centromero, vengono eliminati dalla cellula durante la divisione. Quando i cromosomi vengono colorati si presenta come zona chiara ed è ricca di eterocromatina. Il centromero divide il cromosoma in due bracci ed in base alla posizione possiamo trovare: cromosomi metacentrici: centromero in posizione mediana con bracci lunghi uguali. Cromosomi sub-metacentrici: centromero spostato verso un’estremità, quindi un braccio più lungo ed uno più corto. Cromosomi acrocentrici : centromero in posizione sub-terminale, quindi uno dei due bracci ha dimensioni ridotte. Cromosomi telocentrici: centromero in posizione terminale, quindi sembra che uno dei due bracci non ci siano anche se in realtà c’è ed è ridottissimo. Organizzatore nucleolare: in tutti i genomi esiste almeno un cromosoma dotato di organizzatore nucleolare il cui compito è quello di provvedere alla formazione del nucleolo ed alla sintesi dell’RNA ribosomale. Il DNA di questa regione è detto rDNA ed è formato da sequenze ripetute in serie centinaia di volte. Costrizione secondaria, Satellite: il segmento cromosomico che segue la costrizione secondaria prende il nome di satellite. Cromomeri: ispessimento delle zone del filamento cromosomico che nei primi stadi della divisione cellulare non è uniforme e presenta zone più e meno ispessite. Si possono osservare nella profase meiotica, ma se i cromosomi sono molto grandi anche nella profase mitotica. Telomeri: sono le parti terminali del cromosoma ed impediscono che le estremità cromosomiche si saldino tra di loro o che si unisca ad un segmento cromosomico prodotto a seguito di una rottura. Questo viene mantenuto dall’enzima telomerasi ad ogni ciclo di replicazione del DNA. Eterocromatina: Nel cromosoma si succedono zone in cui la compattazione della cromatina è limitata alle fasi di divisione cellulareeucromatiche. Ci sono zone in cui la cromatina resta condensata anche durante l’interfaseeterocromiche si divide in costitutiva e cioè si trova sempre allo stato condensato o facoltativa se la condensazione ha carattere transitorio. La differenza tra eucromatiche ed eterocromatiche dipende dal carattere fisico (≠ grado di spiralizzazione e condensazione) carattere chimico e genetico. Cromosomi particolari : ci sono casi particolari in cui il DNA va incontro a diversi cicli di replicazione senza che ci sia divisione cellulare. Politenia catene di DNA neoformate che non si staccano dalla catena originale e vanno a formare i cromosomi politenici che sono di grosse dimensioni ed i più conosciuti sono i cromosomi giganti con un volume di circa 1000 volte più grande dei cromosomi normali, dimensioni raggiunta dopo 9/10 cicli di replicazione. Sono molto despiralizzati e distesi. In certe bande si ha l’insorgenza di rigonfiamenti “puffs” dove viene sintetizzato mRNA di geni attivi nella trascrizione. Quando non sono più utili, i puffs regrediscono fino a sparire; cromosomi spazzola: nome dato in base alla forma che assumono. L’asse del cromosoma è costituito da una serie di cromomeri strettamente avvolti ad elica ed uniti da un sottile filamento. Dall’asse dipartono delle espansioni laterali sotto forma di anse dove avviene la sintesi di mRNA presenti a coppia costituite da un filamento di DNA ricoperto da uno strato di RNA e di proteina sottoforma di granuli. Le anse non sono permanenti in quanto degenerano finita la trascrizione di RNA.
LE COMPONENTI NON NUCLEARI DEL GENOMA EUCARIOTICO: oltre al DNA nucleare esiste anche il DNA ubicato nei mitocondri e nei plastidi raggiungendo insieme, il 30%. Il genoma mitocondriale: ha una dimensione inferiore a 20 kb negli animali e nelle piante arriva a 2500 kb e non esiste alcuna correlazione tra grandezza mitocondrio e genoma. Può essere organizzato in una sola molecola o in più molecole circolari. Il n° di prodotti è pari a 20 proteine sia negli animali che nelle piante. Alcune proteine codificate sono importanti per la cellula che alcune mutazioni possono essere letali per essa. Il DNA mitocondriale codifica RNA ribosomale e tRNA. Il sistema genetico è procariotico. Un carattere dovuto alle mutazioni è la maschiosterilità. Il genoma plastidiale: la dimensione del genoma plastidiale oscilla tra i 50 ed i 400 kb ma più spesso tra i 120 ed i 150 kb. E’ organizzato in molecole circolari di dimensioni che variano per la ricombinazione spontanea. Il plastoma è stato sequenziato in un gran numero di specie, contiene 120-140 geni e codifica per 60 proteine rRNA e tRNA. I plastidi derivano da un ciano batterio che ha stabilito una endosimbiosi. Il genoma è molto più piccolo. Molte proteine vengono prodotte da geni nucleari e poi trasferite dentro i plastidi. Le proteine prodotte dai plastidi rimangono al loro interno. LA TRASMISSIONE DEL MATERIALE EREDITARIO NEGLI EUCARIOTI: Lo zigote (2n) è formato dalla fusione di due cellule aploidi (n). lo zigote poi andrà incontro a divisioni cellulari in modo da ottenere un nuovo individuo perché le cellule contengono lo stesso patrimonio genetico. mitosi Meiosi: formazione dei gameti dagli individui diploidi maschili e femminili. MITOSI: Interfase: dove si ha la duplicazione del DNA e dei cromosomi che passano da 2n a 4n. questa duplicazione avviene a metà interfase, nel corso della fase S. prima di questa fase abbiamo la fase G1 dove la cellula si accresce e si prepara alla sintesi di DNA e dopo la fase S abbiamo la fase G2 dove la cellula continua ad accrescersi e si prepara ad entrare in mitosi. Profase: i cromosomi si rendono visibili all’interno della membrana nucleare. Si divide in profase iniziale dove ciascun cromosoma consiste di due filamenti adiacenticromatidi fratelli con strozzatura al centro detta centromero. I cromosomi sono fortemente despiralizzati e sono distribuiti senza ordine apparente nel nucleo. Poi abbiamo la profase intermedia dove i cromosomi si accorciano e si ispessiscono per un processo di spiralizzazione e poi abbiamo la profase terminale dove i cromosomi hanno una lunghezza che è circa 1/10 di quella iniziale. Nella prometafase il nucleo scompare. Metafase: i centrioli si sdoppiano e migrano in direzione opposta, formando un fascio di fibre che assume la forma di un “fuso”fuso mitotico. Le coppie di cromatidi si muovono su un piano immaginario che taglia a metà la cellulapiano equatoriale. Anafase: i due cromatidi di ciascun cromosoma si separano e si spostano uno verso un polo della cellula e l’altro verso il polo opposto. In questo modo ciascuna metà cellula riceve un numero uguale di cromatidi. Telofase: ciascun gruppo di cromatidi viene circondato da una membrana nucleare, quindi i cromatidi iniziano a de condensarsi ed a formare i nuclei figli. Ciascuna cellula figlia avrà una copia di ciascun cromosoma ed un patrimonio cromosomico completo. Citodieresi: il citoplasma si divide ed il contenuto della cellula viene suddiviso in due cellule separate. MEIOSI: E’ un processo caratteristico delle cellule eucarioti, riguarda la produzione delle cellule sessuali o gameti degli organismi pluricellulari. Profase I: Si divide in 5 sottofasi: leptotene dove i cromosomi appaiono come filamenti più lunghi e sottili. Ogni cromosoma è costituito da due cromatidi. Zigotene appaiamento dei cromosomi omologhi sinapsi. I due cromosomi vengono a stretto contatto grazie al complesso sinaptimetico. A sinapsi avvenuta, i due omologhi risultano appaiati. Pachitene in questa fase, ogni coppia di omologhi è costituita da 4 filamenti (tetrade). Si verifica il crossing-over. Diplotene I filamenti cominciano a separarsi e si osservano le formazioni a croce dette chiasmi. Nel chiasma, i due cromatidi interessati, si toccano in un punto mentre per il resto risultano separati. Alla fine di questa fase, i cromosomi sono più corti ed ispessiti. Diacinesi i nucleoli e la membrana nucleare scompaiono. Metafase I :le coppie di cromosomi si muovono verso la zona mediana del fuso e come avviene nella mitosi, si dispongono sul piano equatoriale. Nella metafase della mitosi i centromeri sono disposti nel piano equatoriale, mentre nella meiosi, le coppie di omologhi sono disposte sul piano equatoriale in modo che le coppie siano fronteggiate sul piano. Anafase I: i due centromeri si allontano ed ogni cromosoma si separa dall’omologo: i membri di ogni coppia migrano verso poli opposti. A questo punto si ha la separazione del centromero materno da quello paterno (assortiti). Centromeri e non cromosomi perché nella metafase I con il crossing over c’è stata mescolanza.
informazioni per produrre proteine. Questi possono assumere forme alternative o forme alleliche o alleli forme alternative dello stesso gene che si trovano nella stessa porzione di cromosoma. Questi sono responsabili di un particolare carattere. I gameti possiedono per ciascun carattere un solo allele, mentre per le cellule somatiche che derivano dallo zigote ne contengono due. Gli individui che hanno cellule somatiche con alleli uguali sono detti omozigoti mentre se hanno alleli diversi allora sono detti eterozigoti. Per indicare un gene si una la lettera maiuscola se l’allele è dominante, la lettera minuscola se l’allele è recessivo. 3°LEGGE: segregazione indipendente: Mendel fece incrociare linee pure che differivano per due coppie alleliche, cioè per due caratteri: forma e colore del seme. Es. liscio-giallo (doppio dominante) X rugoso- verde (doppio recessivo) LLGG X llgg, ottenne una F1 con semi lisci e gialli (LlGg) per effetto della dominanza. L’autofecondazione del diibrido da il seguente risultato: semi lisci-gialli 315; semi lisci-verdi 101; semi rugosi-gialli 108; semi rugosi-verdi 32 in modo tale da avere per il carattere liscio-rugoso 3:1 e per il carattere giallo-verde 3:1. Quando si effettua la classifica in base al colore ed alla forma, si ha un rapporto di 9:3:3:1. 9/16 sono dominanti; i due gruppi formati da 3/16 manifestano un dominante ed un recessivo e 1/16 è recessivo. LE BASI CROMOSOMICHE DELLA SEGREGAZIONE INDIPENDENTE: i geni sono ubicati nei cromosomi. Supponiamo che le due coppie alleliche abbiano i locus in due diverse coppie di cromosomi omologhi. I diversi orientamenti delle coppie di cromosomi omologhi alla metafase I consentono di ottenere 4 tipi di gameti in proporzioni uguali. Se tra i centromeri ed i loci non è avvenuto nessun crossing over i gameti che si ottengono da ciascuna meiosi sono due. Se invece tra un centromero ed il locus è avvenuto un crossing over si avranno 4 tipi di gameti con proporzioni uguali. Ciò è valido solo quando i geni che si considerano sono ubicati su coppie diverse di cromosomi omologhi. Gli stessi risultati si otterrebbero anche quando l’incrocio iniziale è GGll X ggLL che formerebbero una F1 GgLl che formerebbero 4 tipi di gameti in proporzioni uguali. La segregazione che si osserva nella F2 di ibridi è indipendente dai genotipi dei genitori dell’ibrido F1. Anche la segregazione indipendente può essere verificata mediante re incrocio tra il diibrido ed il doppio recessivo omozigote e si ottiene una F1 con gameti in proporzioni tutti uguali 1:1:1:1. SEGREGAZIONE E RICOMBINAZIONE DI GENI INDIPENDENTI: Ricombinazione formazione di combinazioni geniche nuove rispetto ai parentali o il fenomeno per il quale i geni presenti nei gameti dei figli sono in parte di origine paterna e di origine materna. Dall’incrocio LLGG X llgg si ottiene F1 LlGg che produce 4 tipi di gameti (LG, lg, Lg, lG) in proporzioni uguali LG e lg sono detti parentali perché uguali alle linee pure mentre Lg e lG sono detti ricombinanti. Questi termini non indicano una caratteristica intrinseca del gamete, ma acquistano significato solo quando posti in relazione con i tipi di gameti prodotti dai genitori dell’ibrido. Infatti LlGg può essere ottenuto da llGG X LLgg dove in questo caso i parentali sono lG ed Lg ed i ricombinati LG ed lg. In metafase I non è più possibile parlare di cromosomi materni e paterni, ma di centromeri materni e paterni perché in profase I è avvenuto il crossing over, quindi i cromatidi che costituiscono i cromosomi sono in parte materni ed in parte paterni, mentre i centromeri rimangono materni e paterni. LA SEGREGAZIONE DEL DIIBRIDO IN ASSENZA DI DOMINANZA: In assenza di dominanza, i rapporti di segregazione del diibrido diventano più complessi, infatti gli F2 possono essere raggruppati in 9 classi fenotipiche corrispondenti alle combinazioni genotipiche previste per il diibrido. Quindi da 9:3:3:1 si passa a 1:2:1:2:4:2:1:2:1. POLIIBRIDI: Prendendo come esempio il triibrido AaBbCc si ha:
- tipi di gameti possibili in F1= 8 con proporzioni uguali del 12,5%. In assenza di crossing over ci sono 4 tipi di metafase I che portano alla formazione di 8 tipi di gameti in proporzioni uguali.
- Genotipi possibili in F2 = 27. A ciascuno dei tre loci si possono verificare tre situazioni (omozigote dominante, omozigote recessivo, eterozigote) che combinandosi tra di loro danno 27 genotipi differenti.
- Fenotipi possibili in F2= 8. le situazioni che possono verificarsi sono: a) dominanza a tre loci: un fenotipo ABC (genotipi AABBCC, AABBCc, AABbCC, AABbCc, AaBBCC, AaBBCc, AaBbCC, AaBbCc) b) dominanza a due loci: tre fenotipi Abc (genotipi AABBcc, AABbcc, AaBBcc, AaBbcc), AbC (genotipi AAbbCC, AAbbCc, AabbCC, AabbCc) aBC (genotipi aaBBCC, aaBBCc, aaBbCC, aaBbCc) c) dominanza ad un locus: tre fenotipi Abc (AAbbcc, Aabbcc) aBc (aaBBcc, aaBbcc) abC (aabbCC, aabbCc) d) recessività a tutti i loci: un fenotipo abc (genotipi aabbcc).
- Numero minimo di individui richiesto per osservare tutti i genotipi F2=64.
- Rapporti fenotipici in F2.
- N° di omozigoti in F2 con combinazioni nuove =6. AUTOFECONDAZIONE ED OMOZIGOSI: riduzione dell’eterozigosi quando si passa da una generazione segregante alla successiva mediante autofecondazione. Nelle popolazioni ibride di piante autogame, l’eterozigosi diminuisce nelle generazioni successive, mentre la frazione di omozigoti agli n loci inizialmente ibridi aumenta in base a questa espressione: Dove : x = percentuale di omozigoti a tutti i loci. m = numero di generazioni segreganti n = numero di coppie alleliche in condizione eterozigote nell’ibrido iniziale. Es. vedi libro. IL SAGGIO DEL χ2 (CHI QUADRATO) : E’ un test statistico che consente di calcolare con precisione la probabilità in favore dell’ipotesi che le differenze tra dati osservati e dati attesi siano dovuti unicamente al caso (ipotesi nulla). Formula: Xoss = valori osservati sperimentalmente Xatt = valori attesi sulla base dell’ipotesi n = numero di classi di valori esaminati. L’elevazione al quadrato serve a portare allo stesso segno tutti gli scostamenti, altrimenti, se i segni fossero contrari, si annullerebbero e la formula non avrebbe valore. Quando i valori osservati coincidono con quelli attesi allora il chi quadrato è 0; all’aumentare della differenza tra i valori osservati ed i valori attesi, aumenta anche il valore di chi quadrato. La tabella indica dei valori del chi quadrato che possono verificarsi per effetto del caso con una certa probabilità. Esiste quindi una probabilità del 5% di ottenere per effetto del caso un valore uguale o superiore ed una probabilità del 1% di ottenere sempre un valore uguale o superiore. Le probabilità del 5 ed 1% sono quelle che si hanno di sbagliare. I valori dell’1% sono più grandi dei valori del 5% questo perché la probabilità di avere scostamenti grandi tra valori osservati e valori attesi è molto più piccola della probabilità di ottenere, sempre per effetto del caso, scostamenti piccoli. Per servirsi della tabella bisogna conoscere il grado di libertà. Il numero di gradi di libertà è pertanto pari al numero di confronti indipendenti che si possono effettuare. ALLELI MULTIPLI E POLIMORFISMO GENETICO: Segregazione di geni ciascuno dei quali presenta soltanto due forme alternative (alleli). In un determinato locus possiamo trovare più di due alleli alternativi o varianti del gene e si parla in questo caso di alleli multipli. La diversità allelica nel suo complesso viene indicata col termine di polimorfismo genetico. Il polimorfismo genetico ha assunto così un’importanza molto significativa nella moderna genetica es. incompatibilità delle piante. Incompatibilità nelle piante: esistono specie che sono del tutto autoincompatibili e producono seme solo se impollinate da un altro individuo della stessa specie. Se un granulo pollinico possiede l’allele S1, non è capace di penetrare nello stilo di una pianta con lo stesso allele. Il sistema di tipo gametofitico perché la reazione di incompatibilità dipende dalla costituzione genetica del polline, mentre invece il tipo sporofitico, il comportamento del polline è determinato non dal suo genotipo, ma da quello della pianta che lo ha prodotto. L’incompatibilità impedisce l’autofecondazione e mantiene alta l’eterozigosi e la variabilità genetica nelle specie vegetali. Essa ha importanza pratica nel miglioramento genetico delle piante perché consente di evitare l’emasculazione quando si vogliono fare incroci controllati. INTERAZIONI GENICHE: l’atipicità dei rapporti di segregazione può essere legata anche a fenomeni di interazione genica. si parla di interazione quando l’azione di un gene è influenzata da un altro gene, allelico o non. I casi di dominanza sono manifestazioni di interazione allelica, infatti il gene dominante, quando non presente insieme al recessivo, interagisce con questo e lo maschera. Più complessi sono i casi di interazione non allelica che si hanno quando la situazione ad un locus influenza l’espressione del carattere in modo differente a seconda della situazione ad altro locus. Il rapporto 9:3:3:1 è deviato. EPISTASIA: E’ il mascheramento di un gene ad opera di un altro gene situato in un locus diverso. Mentre nella dominanza compaiono due forme fenotipiche (dominante e recessiva) nell’epistasia ne compaiono tre. Si parla di epistasia dominante e recessiva. Nella dominante, compaiono i fenotipi epistatico, ipostatico e
Se diagnosticata precocemente, gli individui possono essere nutriti con una dieta priva di fenilalanina e non presentare i sintomi della malattia. Dominanza incompleta: Nel caso della dominanza incompleta l’eterozigote mostra un fenotipo intermedio a quello dei due omozigoti. Esempio di dominanza incompleta ↓ Per esempio: Il colore del fiore nella bella di notte ( Mirabilis jalapa ) Due alleli CR = allele per il colore rosso; CW = allele per il colore bianco Sovradominanza: La sovradominanza è il fenomeno che conferisce un maggiore vigore all’eterozigote rispetto ai due omozigoti di solito determinata dalla presenza di due alleli che producono proteine con piccole differenze nelle loro sequenze aminoacidiche. Viene definita anche vantaggio dell’eterozigote. La sovradominanza è correlata a una strategia comunemente usata da agricoltori e allevatori: Incrociando due varietà differenti e altamente inincrociate, Gli ibridi possono mostrare caratteristiche superiori a quelle di entrambe le linee parentali. Questo fenomeno si definisce vigore dell’ibrido o eterosi. L’eterosi serve a migliorare caratteri quantitativi come la dimensione, il peso e il tasso di crescita. L’eterosi tipicamente coinvolge molti geni. I suoi effetti vantaggiosi possono essere attribuiti alla sovradominanza in uno o più loci eterozigoti. Può però essere anche il risultato del mascheramento di alleli recessivi dannosi che tendono ad accumularsi nelle linee caratterizzate da alta consanguineità. ASSOCIAZIONE, SCAMBIO E MAPPE GENETICHE (CAPITOLO 6) ASSOCIAZIONE: Es. incrocio tra piante di pisello a fiore violaceo e polline allungato (CCRR) con piante di pisello a fiore rosso e polline rotondo (ccrr) F1 CcRr auto fecondate e si ottenne una F2 che presentava fenotipi troppi fenotipi uguali ai genitori dell’ibrido dell’F1 e troppo pochi ricombinanti rispetto ai rapporti attesi con la segregazione indipendente del diibrido e videro che la proporzione dei due tipi parentali è superiore all’attesa osservati: 296 fiori violacei e polline allungato, 19 fiori violacei e polline rotondo, 27 fiori rossi e polline allungato, 85 a fiore rosso e polline rotondo in percentuale 69,32%, 4,44%, 6,32% e 19,90% con degli attesi che dovrebbero essere: 240 fiori violacei e polline allungato, 80 fiori violacei e polline rotondo, 80 fiori rossi e polline allungato, 27 a fiore rosso e polline rotondo. I fenotipi doppi recessivi con frequenza del 19,90% è prodotto da gameti maschili e femminili che hanno le stesse frequenze ed il loro prodotto vale come il quadrato della frequenza dei gameti maschili e femminili; la frequenza cr sarà quindi √0,1990= 0,446= 44,6%. I gameti GR si formano allo stesso modo quindi hanno la stessa percentuale. I gameti Cr e cR si trovano per differenza da 100 44,6+44,6 = 89,2%-->100%-89,2% = 10,8/2 = 5,4%. Si rileva un eccesso di gameti parentali e un deficit di gameti ricombinati. Eseguirono l’esperimento con gli stessi caratteri, ma in combinazioni diverse: piante omozigoti con fiore violaceo e polline rotondo (CCrr) con fiore rosso e polline allungato (ccRR)F1 (CcRr) ed autofecondate si ottenne una generazione F2 in cui le combinazioni parentali erano ancora in eccesso, mentre i ricombinanti erano in proporzioni più basse rispetto alle attese. Coupling situazione in cui tendono a rimanere insieme, in un gamete, i due dominanti e nell’altro gamete, i due recessivi (CR e cr) Repulsion per indicare il caso in cui il dominante tende a rimanere insieme ad un recessivo dell’altro carattere nello stesso gamete e viceversa. (Cr e cR). Questi due termini sono ancora in uso anche se si preferisce usare il termine cis per coupling e trans per il termine repulsion. LA RICOMBINAZIONE DEI GENI ASSOCIATI: Si pensava che i geni da loro considerati si trovassero sullo stesso cromosoma e che la loro tendenza a rimanere insieme nello stesso cromosoma non fosse assoluta perché altrimenti in F1 si sarebbero prodotti solo gameti parentalie invece in F2 si sono prodotte 46 (19+27) piante su 427 da gameti ricombinati. La ricombinazione si spiega con il crossing-over. Quando i geni appartengono allo stesso linkage i cromosomi tra i due loci che si hanno alla meiosi delle piante F1, fanno ottenere cromosomi di tipo parentale
e di tipo ricombinato (che si sono scambiati parti paterne e materne). I cromosomi non interessati da crossing over vengono detti non crossover, mentre quelli interessati da crossing over vengono detti crossover. In I vediamo i due cromosomi omologhi appaiati; uno con una linea rossa che porta gli alleli a e b, l’altro con una linea nera che porta A e B. i cerchietti rappresentano i centromeri. In II sono duplicati, in III si nota che si è formato un chiasma tra A e B con conseguente scambio materiale di segmenti equivalenti tra due cromatidi dei due cromosomi omologhi. IV le diadi dopo la prima divisione meiotica. Il cromatidio in alto contiene AB senza crossing over ed un cromatidio Ab crossover, il nucleo in basso contiene un cromatidio crossover in alto aB e quello più in basso non crossover ab. In V notiamo 4 nuclei aploidi formatisi dopo la seconda divisione meiotica che ha comportato la duplicazione dei centromeri 50% gameti parentali e 50% gameti ricombinati. Nel caso dell’associazione però la percentuale dei gameti ricombinati è inferiore al 50% perché il crossing over non avviene in tutte le meiosi. E’ bene chiarire che il termine “ricombinazione”, non è sinonimo di crossing over. Il meccanismo chiave della ricombinazione è la disposizione casuale dei centromeri materni e paterni rispetto al piano equatoriale alla metafase I. ricombinazione significa produzione di combinazioni di alleli nuove rispetto a quelle parentali sia nei gameti che nelle progenie di un individuo eterozigote. CROSSING OVER E MAPPE GENETICHE NEGLI ORGANISMI DIPLOIDI: IL TEST A 2 PUNTI: Se i geni sono disposti linearmente lungo il cromosoma, la frequenza con cui il crossing over si verifica tra due geni dovrebbe essere funzione della loro distanza. Per calcolare la loro distanza relativa, i rapporti fenotipici che si ottengono nel reincrocio esprimono fedelmente i rapporti tra i gameti prodotti dall’ibrido. Nel reincrocio del diibrido si ottengono due fenotipi parentali e due ricombinanti, questi ultimi, quando ci si trova in presenza di associazione, sono riconoscibili perché sempre presenti in una misura complessiva inferiore al 50%. La percentuale di gameti ricombinati viene utilizzata per misurare la distanza tra geni lungo il cromosoma. La distanza tra i geni si esprime in unità di ricombinazione o centrimorgan o unità di mappa. La relazione tra distanza fisica e distanza espressa in unità di mappa è analoga a quella che esiste, per esempio, tra i km che separano due stazioni ferroviarie ed il tempo necessario per percorrere con il treno la distanza. Una serie numerosa di test a due punti consente di individuare i gruppi di associazione e di assegnare a ciascun gene la sua posizione in relazione agli altri geni dello stesso gruppo: la rappresentazione schematica di un gruppo di associazione con i geni nella loro posizione relativa prende il nome di mappa genetica o mappa di associazione. EFFETTO DI CROSSING OVER MULTIPLI SUL CALCOLO DELLE DISTANZE DI MAPPA:TEST A 3 PUNTI: I cromatidi di un cromosoma possono subire più crossing over nello stesso tempo ed è evidente che tale situazione influenza profondamente i tipi di gameti che si formano. Nel caso del crossing over doppio a due filamenti, che si ha quando il crossing over interessa gli stessi due cromatidi, si hanno due non crossover e due crossover doppi. Nei crossover doppi i due geni estremi che si considerano, non manifestano ricombinazione. Varia soltanto la posizione del gene centrale rispetto ai geni laterali. ANALISI DELLE TETRADI E COSTRUZIONE DELLE MAPPE GENETICHE NEGLI APLOIDI: L’analisi delle tetradi viene condotta in modo differente a seconda che si tratti di tetradi non ordinate o di tetradi ordinate. Analisi di tetradi non ordinate: il metodo che consente di calcolare la distanza di mappa tra due o più geni si basa sugli stessi principi descritti per i diploidi. Troviamo i ditipi parentali (DP), i ditipi non parentali (DNP) ed i tetratipi (T). per stabilire se due geni segregano indipendentemente o sono associati è necessario anzitutto confrontare la frequenza dei ditipi parentali con la frequenza dei ditipi non parentali. Nel caso di segregazione indipendente, i DP e i DNP , formandosi come conseguenza della disposizione casuale dei cromosomi alla metafase I della meiosi sono attesi essere in numero uguale. Nel caso di associazione i DP sono frutto di meiosi senza crossing over mentre i DNP sono frutto di meiosi con doppio crossing over a quattro filamenti per cui i DP sono attesi con una frequenza molto superiore alla frequenza dei DNP. Analisi di tetradi ordinate: può essere fatta anche seguendo i procedimenti visti per le tetradi non ordinate; le tetradi ordinate possono servire per calcolare la distanza tra un gene ed il centromero e calcolare la distanza tra due geni. Quando un gene è tanto distante dal centromero che in tutte le meiosi si verifica un crossing over tra il centromero ed il locus ci si aspetta di osservare il 100% di aschi con segregazione in seconda divisione: in tal caso però diventa molto probabile che in alcune meiosi si verifichino anche dei doppi crossing over. Per questo motivo quando le distanze di mappa determinate sulla base della % di aschi che mostrano segregazione in seconda divisione, risultano notevoli. In questo caso, la distanza può essere calcolata con grande precisione.
