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Preparato a fresco: questo preparato avrà una durata nel tempo molto limitata, ad
esempio lo striscio di sangue , che in seguito all’osservazione non potrà più essere utilizzato. Questo preparato non prevede la fissazione. La colorazione avviene utilizzando i coloranti basici e acidi di May Grunwald che sono eosina un colorante rosso e metilene è un colorante blu in soluzione di metanolo che funge anche come fissante deve essere impiegato con lo stesso numero di gocce di acqua distillata rispetto a quelle di colorante in quanto deve essere in soluzione al 50% con acqua distillata.
Allestimento dei preparati per la microscopia ottica ed elettronica
I preparati da osservare al microscopio devono essere prima processati attraverso una serie di passaggi che servono ad arrestare le funzioni biologiche.
OTTICA
(Utilizziamo le miscele quando dobbiamo studiare tessuti difficili poiché un solo fissativo non riesce a penetrare) Per esaminare una parte di tessuto, devo prelevarlo, sciacquarlo e metterlo in una provetta aggiungendo sostanze. La fissazione è quel processo che mi permette di bloccare i processi di deterioramento, preservando così nel tempo la morfologia del tessuto. La fissazione può essere: -Chimica : mediante sostanze chimiche. Tra i fissativi chimici si possono distinguere i fissativi che coagulano le proteine e i fissativi che non coagulano le proteine. Il campione deve essere ridotto per facilitare la penetrazione del fissativo e garantire una fissazione omogenea. Il fissativo dà i suoi risultati dopo molto tempo dalle 4 alle 24 ore. -Fisica : mediante congelamento. Si usa un congelatore a -80° in azoto liquido. Non si usa il congelatore normale poiché una volta scongelato rilascerebbe acqua che comprometterebbe la sua reale visione. Disidratazione e diafanizzazione Dopo aver aggiunto il solvente, bisogna disidratare il tessuto eliminando acqua (disidratazione). Si toglie il fissativo e si procede a immergere il tessuto in una soluzione alcolica a concentrazione crescente (si parte da alcool al 50%... fino ad arrivare ad alcool a 100%). Questo processo deve essere graduale per non provocare il raggrinzimento delle cellule. (Il tessuto non lo si può lasciare nell'acqua poiché si creerebbero batteri che andrebbero a mangiare il tessuto.) La rimozione dell'acqua è necessaria per una buona osservazione del campione al microscopio ottico e per poter infiltrare il tessuto con la paraffina (idrofoba). A questo punto togliamo l'alcool al 100% e aggiungiamo lo xilene (che serve a capire se il campione è pronto all'inclusione). Poichè lo xilene è un solvente diafanizzante (diventa trasparente con la disidratazione), a fine infiltrazione il tessuto risulterà trasparente (diafanizzazione).
Preparazione all'Inclusione Per la microscopia ottica il mezzo d'inclusione è la paraffina (fusa). É una miscela a idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (50-60°) mentre solidifica a temperatura ambiente. A questo punto togliamo un po' di xilene e lo immergiamo nella paraffina, successivamente andremo a togliere completamente lo xilene e lasciamo solo paraffina. Se il campione è pronto avrà un colore lucido e trasparente. Se il campione è scuro significa che contiene ancora acqua per cui bisogna disidratarlo ancora. Una volta pronto il campione, siamo pronti all'inclusione e quindi a lasciarlo nella paraffina. La paraffina si andrà ad indurire intorno al campione, dando vita ad un blocchetto di paraffina. Si fa raffreddare e poi si procede alla sezione.
- Taglio o sezione: La sezione viene fatta con il microtomo (a slitta o rotativo). Il microtomo permette di fare sezioni sottili così da avere un giusto potere di risoluzione al microscopio. Ottenute le sezioni in paraffina, si mettono in bagnomaria per far distendere la sezione e poterla poggiare sul vetrino. Dopo si poggiano le sezioni su una stufa al fine di far assorbire l'acqua senza che la paraffina si sciolga (a meno di 50°). Dopo, i vetrini vanno in istoteca , cioè cassettini in cui si conserveranno in modo duraturo fino all'osservazione.
- Sparaffinatura e idratazione Una volta pronto il vetrino si procede alla colorazione , dunque si dovrà eliminare la paraffina (sparaffinatura). Per poter tagliare la paraffina si userà lo xilene: questa volta però si dovrà reidratare il campione dunque si farà il processo inverso della disidratazione (ovvero si immergerà il campione prima in alcool a concentrazione al 100%, poi 70%.. ecc fino ad arrivare all'acqua).
- Colorazione : I coloranti sfruttano le interazioni chimiche. Il campione potrà essere colorato con: - ematossilina : è un colorante basico che colora in violetto i nuclei e i ribosomi. I coloranti basici si legano a componenti acide del tessuto. Basofilia quando la struttura acida si lega con la componente basica. - Eosina è un colorante acido che colora in rosa il citoplasma. I coloranti acidi si legano a componenti basici del tessuto. Acidofilia quando la componente basica si lega a quella acida. I coloranti vitali possono essere iniettati nell’animale intero e allora si parla di colorazione vitale. Si parla di colorazione sopravitale quando un pezzo di tessuto od organo appena prelevato dall’animale viene immerso nella soluzione colorante. Terminata la colorazione, il vetrino non è pronto: disidratazione, xilene. Ultimo passaggio : montaggio vetrino coprioggetto (per conservare il vetrino si usa il copriogetto).
lascia quindi attraversare dagli elettroni, appare nero. Per preparare un buon campione da osservare al microscopio elettronico, possiamo operare un contrasto, cioè utilizzare sostanze elettrondense, metalliche (acetato di uranile e citrato di piombo) perlopiù che vanno a legare la componente che a livello cellulare è già di suo elettrondensa, ma anzichè vederla un grigio chiaro, lo si contrasta di più in modo da avere una bella immagine.
La processazione dei lipidi
Se vogliamo studiare un campione di tessuto adiposo (ricco di lipidi), non possiamo utilizzare la stessa processazione prevista per il microscopio ottico o elettronico che sia. Il tessuto adiposo non lo si può trattare con l'alcool, poiché i lipidi che compongono il tessuto adiposo si scioglierebbero a causa dell'alcool, non rimarrebbe nulla. -Prefissazione : agente chimico → Formal-Calcio. -Fissazione : Calcio bicromato. -Disidratazione : Dato che in questo caso gli alcool non si possono utilizzare, si utilizza la gelatina, capace di assorbire acqua. Nei passaggi che effettueremo utilizzeremo gelatina a percentuali diverse, per cui il nostro campione lo mettiamo a contatto con gelatina all'1%, quindi tira via un po' d'acqua, tolgo e la metto al 5%, tira via ancora più acqua, tolgo e la metto al 10%, quindi lo mettiamo a contatto con gelatina che arriva fino ad una concentrazione massima del 20%. -Inclusione : si include il campione in gelatina al 20%. Però la gelatina non è solida per effettuare la sezione, quindi lo mettiamo nel congelatore. -Taglio : dato che abbiamo congelato il blocchetto, non lo possiamo tirare fuori e metterlo a temperatura ambiente e tagliarlo al microtomo, quindi vi è un terzo tipo di microtomo: Il criostato , non è altro che un microtomo rotativo, posizionato all'interno di una camera fredda. Si imposta una temperatura bassa all'interno di questa camera fredda, la manopola è messa all'esterno per cui si fanno i tagli dall'esterno, dopodichè si alza il coperchio (è tipo un congelatore a pozzetto, con il coperchio però fatto di vetro per poter vedere dentro e questa manopola messa fuori) e recuperiamo le nostre sezioni sul vetrino. Le sezioni ottenute al criostato le andremo a conservare nelle scatole ad hoc, fino all'osservazione.
Immunoistochimica
Nelle reazioni di immunochimica sia ha l'identificazione e la localizzazione di
costituenti tissutali per mezzo di una reazione antigene-anticorpo specifica,
identificata da un tracciante visibile il marcatore. I marcatori possono essere enzimi,
sostanze fluorescenti e sostanze elettrodense. La reazione immunoistochimica può
essere condotta con due modalità differenti: metodo diretto e metodo indiretto.
-Si parla di metodo diretto nel caso in cui l'anticorpo primario è marcato e reagisce
direttamente con gli antigeni tissutali. I vantaggi di questa metodica sono la rapidità
e la limitata presenza di reazioni non specifiche.
- Il metodo indiretto prevede l'uso di due o più anticorpi poiché consente una
migliore evidenziazione delle strutture antigeniche. L’anticorpo primario non è
marcato, risulta necessario l'impiego di un anticorpo secondario, o ponte, coniugato
ad un marcatore.
Microscopi luce (ottici, 0,2 micron)
Microscopio composto
Un microscopio dal punto di vista strutturale è formato da: oculari, tubo (dove c'è il sistema di lenti), revolver porta obiettivi, tavolino porta oggetti, un diaframma e un condensatore.
- oculari : è dove l'osservatore poggia gli occhi per osservare il suo preparato; -Il tubo dove c'è il sistema di lenti che porta al revolver porta obiettivi
- revolver porta obbiettivi : monta più obbiettivi che vanno da 4x al 100x. Gli obbiettivi insieme agli oculari rappresentano i sistemi che determinano l'ingrandimento del microscopio. Le lenti che determinano l'ingrandimento del microscopio ottico sono le lenti dell'oculare e le lenti dell'obiettivo. Per sapere di quante volte il nostro preparato è ingrandito basta guardare sulla viera dell'oculare ci sarà scritto 10x (o 2x dipende dall'oculare che si monta) significa che già da solo l'oculare ingrandisce di 10 volte. Il revolver può montare più obbiettivi che vanno da 4x al 100x. Quindi noi useremo il 4x per dare un'occhiata all'insieme al vetrino; se lo voglio vedere meglio una piccola parte della sezione ma ingrandita utilizzerò l’obbiettivo 10x, 40x ecc. Se invece voglio utilizzare l’obbiettivo 100x dovrò mettere una goccia di olio tra il vetro del nostro preparato e la lente del nostro obbiettivo. L'olio serve perché l'obiettivo 100x non lavora a secco come tutti gli altri, ma lavora ad immersione in olio, un olio per microscopia che abbatte il potere di rifrazione della luce; Quindi se sto utilizzando un oculare che ingrandisce 10x di suo e un obbiettivo che è al 4x, il preparato sarà ingrandito 40 volte. Perché l'ingrandimento totale è dato dalla moltiplicazione tra il fattore di ingrandimento dell'oculare per il fattore di ingrandimento dell'obbiettivo. Se uso un revolver porta obbiettivo al 10x e l'oculare che è al 10x... 10 x 10=100x. Quando arrivo ad utilizzare l'obiettivo 100x.. 10 x 100 =1000, sto ingrandendo di 1000 volte. Decade il limite di risoluzione del microscopio ottico. Oltre quell'ingrandimento non possiamo spingerci, ecco perché se dobbiamo vedere dentro la cellula abbandoniamo il microscopio ottico e prendiamo il microscopio elettronico.
- Fonte luminosa : fascio di fotoni, luce bianca. In questo caso possiamo avere la luce che parte da giù o due fibre ottiche che partono da dietro, che possiamo portare davanti e direzionarle sul campione aggiustando la direzione della luce.
Microscopio da ricerca
Consentono non solo di osservare ma anche di acquisire le immagini di quello che si guarda. Quello che si vede all'oculare viene trasferita al pc e noi acquisiamo le immagini di interesse, che sono poi quelle che vengono utilizzate per pubblicare i libi di testo, articoli scientifici. Vi è una porzione in più rispetto al microscopio precedente:
- Filtri per la fluorescenza : Questo microscopio oltre ad essere un microscopio ottico composto, è un microscopio ad epifluorescenza, quindi potremmo guardare anche i preparati che vengono marcati con dei marcatori fluoriscenti.
- Fonte luminosa : si utilizza una lampada a fluorescenza (FluArc) la quale eccita il campione. (Non si usa il fascio di fotoni altrimenti la fluorescenza decade) Nel momento in cui la lampada va ad eccitare il campione, questo non raccoglie tutte le fluorescenze, solo quelle di nostro interesse.
- Simula la funzionalità di un microscopio confocale , il quale fa una scansione a diversi piani focali del nostro preparato, tanto le sezioni da osservare al microscopio confocale sono spesse 30-50 micron; mentre quelle per l'ottico 4-5 micron. Dunque è evidente che le sezioni del microscopio confocale siano più spesse, questo perché utilizza un fascio laser per andare ad osservare il campione. quindi va delle scansioni, riesce ad attraversare più stradi del campione e quindi ci dà un’immagine tridimensionale perché osserva tutto ciò che c'è nella profondità delle nostre sezioni. Questo motorino motorizzato gli permette. -É completamente motorizzato , questo microscopio permette di fare diverse foto sfocate che mettendole assieme crea un'immagine tridimensionale. Si imposta il punto di partenza e il punto di fine e tutte le foto che si fanno devono essere distanti ad esempio di 0, micron. Quindi si fa la prima foto e si alza il tavolino di 0,5, e così via alla fine le immagini risultano sfocate con un solo dettaglio a fuoco, ma grazie alla funzionalità Z-STACK avremo un’immagine nitida. É un microscopio che fa da microscopio ottico, ad epifluorescenza e motorizzato, quindi simula anche se non lo è un microscopio confocale.
Microscopio invertito L'obiettivo guarda il campione da sotto, anzi che da sopra. Si usa
quando si lavora con le piastre, con gli embrioni. Invertito perché e appunto invertita la posizione tra tavolino e percorso ottico, quindi la fonte luminosa sarà da sopra, gli obiettivi con il sistema di lenti e oculari, partono da sotto.
Microscopio elettronico (0,2 nanometri)
Lo useremo per osservare sezioni ultrasottili che abbiamo raccolto sulle resinelle che avevano quella struttura a mensch, che le avevamo ottenute con l'ultramicrotomo. -Per osservare il campione sia nel caso del microscopio a trasmissione che a scansione, utilizziamo un fascio di elettroni (non fotoni). Ci sarà un cannone che va a sparare questo fascio di elettroni dentro tutto il percorso ottico che c'è contenuto all'interno del microscopio elettronico. Le parti sono sempre le stesse:
- filamento di emissione del nostro fascio di elettroni; -gli elettroni passano dentro ad un condensatore che regola la direzione del fascio di elettroni che deve andare a colpire il nostro campione Condensatore -> regola il fascio di elettroni che devono passare per andare a colpire il Microscopio a trasmissione -guarda dentro la cellula, l'ultrastruttura, studia gli organuli e i sistemi membranosi
- condensatore; -c'è uno sportellino che si apre, dove c'è l’alloggiamento per la nostra reticella, sopra di essa c’è il campione da guardare, e passerà il fascio di elettroni. -A questo punto ci sarà un proiettore che proietta sullo schermo, che può impressionare una lastra fotografica oppure può restituire l’immagine all’oblò dello schermatore.
Microscopio a scansione
-guarda la superficie della cellula, guarda dall’esterno, fa una scansione della superficie; -c'è un condensatore, ma siccome fa delle scansioni, ci sarà anche lo scanner che ha il compito di shioccare questo fascio di elettroni, in modo da andare a fare diverse scansioni, diversi livelli. -Immagine tridimensionale
CRIOFRATTURA
Serve principalmente per studiare la membrana plasmatica. La membrana plasmatica ha uno spessore di 7-7,5 nanometri per cui non è osservabile nella sua organizzazione strutturale al microscopio ottico il quale ha un potere di risoluzione di 0.2 micron. La membrana va studiata al microscopio elettronico. Il preparato nel microscopio elettronico viene fissato in due step:
- Prefissazione in gluteraldeide ;
- Fissazione in tetrossido di osmio (il tetrossido di osmio ha un difetto cioè DENATURA LE PROTEINE.)
