Preparati per la microscopia
Noi conosciamo due microscopi: ottico ed elettronico
Fra i due i passaggi di preparazione non cambiano molto, se non i reagenti che vanno usati durante la
preparazione.
Quali sono i passaggi:
microscopia ottica:
Fissazione se noi preleviamo un tessuto senza usufruire del fissante il pezzo prelevato subirà il
deterioramento non permettendo l’analisi, quindi il primo passaggio è per l’appunto preservare il
campione tramite la fissazione cioè far mantenere alla parte prelevata le stesse prestazioni come
se fosse vitale. La fissazione si può fare con l’ausilio di sostanze chimiche che bloccano l’azione dei
lisosomi (enzimi lipici) ma esiste anche una fissazione fisica attraverso il congelamento, con l’ausilio
della criogenia in questi casi si usa l’azoto liquido o i congelatori a -80. Il congelamento deve
avvenire in maniera rapida poiché più lungo è il congelamento più modo diamo all’acqua di
cristallizzare l’acqua cambiando stato cambia posizione che occupa, si rischiando il
danneggiamento delle cellule. il processo di fissazione richiede da 4-24 h, dipende dalla natura del
campione biologico trattato e dalle dimensioni del campione. Esempi di fissativichimici: liquido
di Bowen (colorato in giallo), Formalina (non pura poiché evapora facilmente), paraformaldeide.
Lavaggi occorrono per togliere ed eliminare i residui, con acqua o tamponepbs, ph fisiologico
(4-7).
Disidratazione poiché l’acqua presente fisiologicamente nel nostro campione può dare problemi
alla nostra processazione, ma soprattutto, attraverso l’eliminazione dell’acqua evitiamo la
proliferazione di batteri. La disidratazione del campione avviene tramite sostituzionesi
sostituisce l’acqua con l’alcol, tramite passaggi graduali (quando arriveremo a concentrazione 100
avverrà la totale disidratazione). Un’oretta per ogni tipo di concentrazione alcolica. Per capire se la
disidratazione è avvenuta con successo si fanno dei passaggi di xilene che ha due funzioni: è
diafanizzante il campione diventa lucido, quasi trasparente (disidratazione andata a buon fine,
se rimane opaco la disidratazione non è andata a buon fine e dobbiamo tornare indietro.) inoltre lo
xilene è miscibile con la paraffina sostanza importante per il passaggio successivo.
Il nostro obiettivo è quello di partire da un campione biologico “morbido” per poterlo tagliare c’è
un passaggio chiamato inclusione che porta un campione biologico solido che possa poi passare
al microtomo (taglio del campione). L’inclusione avviene tramite l’inclusione del campione nella
paraffina (esempio della candela, stoppino immerso nella cera). Ma la paraffina però non è
miscibile con l’alcol, ma è miscibile con un altro solvente che è lo xilene. Quindi finita la
disidratazione portata a termine (100) avviene una sostituzione di alcol con lo xilene. (piccola
parentesi: la disidratazione non avviene direttamente con lo xilene poiché agente aggressivo che
non permetterebbe successivamente la microtomia). Passaggi intermedi 50 e 50 alcol a 100 e
xilene solo xilene 50 e 50 xilene e paraffina paraffina. La paraffina deve entrare in contatto
col campione quindi anche in questo caso noi trasferiremo il nostro campione dalle provette in
delle formellina metallica e lo colmeremo con la paraffina liquida 1-2 h a quel punto potremo
finalmente includere. <<xilene va preparato sotto kappa in laboratorio>> (deve avvenire
l’indurimento del campione biologico con l’inclusione).
Dopo di che possiamo andare al taglio con l’ausilio di uno strumento che prende il nome di
microtomo paragonabile ad una affettatrice. Le nostre sezione devono essere grandi, in base al
microscopio ottico che lavora in ordine di grandezza 0,2 micron quindi le sezioni che vengono
