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IL DNA E L’ESPRESSIONE GENICA
“Fattore di trasformazione”
Nel 1928 Frederick Griffith compì delle osservazioni mentre cercava di produrre un vaccino contro la polmonite umana, causata dal batterio pneumococco, dal nome scientifico “ Streptococcus pneumoniae ”. Egli lavorava con due ceppi del batterio, uno virulento e uno non virulento , di cui il ceppo virulento S (dall’inglese smooth , “liscio”) è costituito da una superficie liscia e da batteri (cellule procariote) rivestiti da una capsula polisaccaridica che, una volta iniettati nel topo provocano un’infezione polmonare determinandone la morte. (di solito i batteri sono rivestiti da una membrana plasmatica, poi hanno una parete) Mentre, il ceppo non virulento R (dall’inglese rough , “ruvido”) è costituito da una superfice ruvida e da batteri privi di capsula : quindi, una volta iniettati nel topo non sono in grado di trasmettergli la polmonite. Inoltre, Griffith verificò anche se i topi sopravvivessero sia all’iniezione dei batteri del ceppo S uccisi con il calore , sia a quella dei batteri del ceppo R. Notò però che iniettando nel topo una miscela di batteri vivi non virulenti e batteri di ceppo S uccisi dal calore , era in grado di provocare la morte dell’animale e dal sangue di quest’ultimo era possibile ricavare batteri vivi di ceppo S capaci di dare vita a nuovi batteri virulenti. Dunque, per spiegare come ciò era possibile, Griffith ipotizzò che i batteri non virulenti di ceppo R si trasformassero in batteri S virulenti in seguito alla trasformazione batterica , cioè al passaggio di qualche sostanza dai batteri S inattivati a quelli R. Quindi, la natura chimica di questa sostanza, detta “ fattore di trasformazione ”, fu determinata nel 1944, grazie al lavoro di Avery , quando appunto si dimostrò che questo fattore di trasformazione era il DNA. Ciò fu determinato aggiungendo a batteri R vivi un estratto di batteri S uccisi, trattato con 2 enzimi specifici : uno capace di degradare le proteine e i polisaccaridi (in questo caso il topo moriva) e l’altro capace di degradare il DNA (in questo caso il topo non moriva). In seguito, Avery isolò il DNA da pneumococchi S uccisi, per verificare che avvenisse la trasformazione batterica in pneumococchi R e quindi si capì che era proprio il DNA a determinare la sintesi della capsula polisaccaridica. Dunque, il trasferimento di materiale genetico dei batteri che consente la variabilità, può essere di 3 tipi: La trasformazione batterica ; La coniugazione ; La trasduzione.
L’ESPERIMENTO DI HERSHEY E CHASE CON I BATTERIOFAGI
I virus sono fatti di un solo acido nucleico, quindi hanno o DNA o RNA e da un involucro esterno fatto di proteine, chiamato capside, e sono definiti parassiti obbligati, questo perché per poter vivere sono costretti ad inserirsi nella cellula e possono infettare sia le cellule procariote sia quelle eucariote; per distinguerli, i virus che infettano le cellule procariote sono chiamati batteriofagi (o fagi ). A volte, questi virus possono presentare in più delle particolari formazioni che gli permettono di ancorarsi alla cellula. Quando il virus viene a contatto con la cellula, si appoggia alla membrana cellulare tramite delle proteine di membrana della cellula, dette recettori. Una volta che è avvenuta l’interazione tra la proteina del virus e il recettore di membrana, l’acido nucleico del virus passa all’interno della cellula , all’interno del quale vi è l’informazione che servirà poi al virus per duplicare il suo acido nucleico che, una volta entrato nella cellula, blocca tutte le attività della cellula , quindi tutte le parti della cellula funzioneranno per il virus; in particolare i ribosomi (sede di sintesi delle proteine). Inoltre, esistono anche dei virus particolari, chiamati retrovirus (retro perché vanno al contrario) (come il virus dell’AIDS), chiamati così perché quando si trovano fuori dalla cellula sono ad RNA mentre, quando entrano nella cellula, il loro RNA si trasforma in DNA e ciò è reso possibile da un particolare enzima chiamato “trascrittrasi inversa” (perché trascrive al contrario). Nel 1952, si ebbe la conferma delle tesi di Griffith e di Avery, proprio quando i due biologi americani Alfred Hershey e Martha Chase , utilizzarono un virus capace di infettare i batteri, chiamato batteriofago (o fagi ). Appunto, i fagi sono costituiti solo da DNA e proteine e hanno una struttura costituita da una testa di natura proteica , chiamata capside , da un corpo centrale e da una coda di fibre proteiche. Una volta avvenuto l’attacco sulla superficie esterna di un batterio, il fago capace di iniettare il suo DNA all’interno della cellula ospite. Inoltre, nel loro esperimento Alfred e Chase trovarono una differenza nella composizione chimica di proteine e DNA: infatti entrambe sono delle molecole organiche (costituite da carbonio, l’idrogeno, l’ossigeno e l’azoto) ma, le proteine hanno in più lo zolfo e il DNA ha il gruppo fosfato. Successivamente, presero due fagi e, uno lo misero in contatto con lo zolfo radioattivo, l’altro invece lo misero in contatto con il fosforo radioattivo. Quindi, quando l’infezione è causata dai fagi marcati con fosforo32 , cioè con DNA radioattivo, vi è radioattività all’interno delle cellule batteriche, mentre quando i fagi sono marcati con zolfo35 , vi è radioattività all’esterno dei batteri. Dunque, con questo esperimento si dimostrò che il materiale genetico dei viventi è costituito dal DNA. Esistono 2 cicli replicativi, cioè 2 modalità con cui i virus infettano la cellula: CICLO LITICO ; CICLO LISOGENICO. CICLO LITICO : il termine “ litico ” indica proprio la rottura della cellula da parte del virus. Nel ciclo litico, inizialmente il batteriofago si fissa alla cellula batterica e inietta all’interno di questa il suo DNA, che poi si chiude ad anello, si replica e sfrutta gli organuli del batterio per la sintesi di nuove particelle fagiche. Di conseguenza, la cellula ricca di virus non riesce più a vivere, quindi si rompe la membrana e i virus si liberano. CICLO LISOGENICO : nel ciclo lisogenico, il batteriofago si fissa alla cellula e vi inietta il proprio DNA, che poi si chiude ad anello e si integra con quello batterico. Successivamente, la cellula batterica si divide e mantiene il DNA fagico integrato nel proprio DNA, quindi duplica sia il suo DNA che quello del virus. Infine, il DNA fagico può ciclizzarsi e iniziare un ciclo litico, cioè il DNA del virus si stacca da quello del battere e tutte queste molecole di DNA riformano l’involucro di
LA SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA
Tra gli anni Quaranta e Cinquanta del secolo scorso, si cercò di capire quale fosse la struttura degli acidi nucleici e, una volta stabilito che il materiale ereditario fosse il DNA, bisognava capire come esso veniva trasmesso alle altre cellule, cioè bisognava conoscere la sua struttura. Inoltre, nel 1950 il chimico Erwin Chargaff notò che in tutte le specie, la quantità di adenina è sempre uguale a quella di timina (A=T) e lo stesso vale per le quantità di guanina e citosina (G=C). Da ciò, si origina la regola di Chargaff , che appunto afferma che la somma delle purine (guanina e adenina) è uguale alla somma delle pirimidine (timina e citosina). *****purine chiamate così perché cambia la formula delle loro basi; pirimidine chiamate così perché la struttura delle basi è la stessa***** Nel 1953, l’inglese Francis Crick e il collega americano James Watson riuscirono a costruire un modello tridimensionale della molecola del DNA e, rubando i meriti alla biofisica inglese Rosalind Franklin che aveva effettivamente capito com’era fatto il DNA, grazie agli studi di c ristallografia ai raggi X , tramite cui la scienziata riuscì a capire che struttura del DNA era ad elica e formata da due filamenti.
IL MODELLO A DOPPIA ELICA
Nel modello proposto da Watson e Crick , la molecola del DNA è costituita da due catene polinucleotidiche che formano una doppia elica dotata di un diametro costante. Le basi costituiscono i collegamenti orizzontali tra le due catene e ogni base di ogni filamento è legata tramite legami idrogeno a una base complementare del filamento opposto. Dunque, il principio di complementarietà delle basi introdotto proprio da questi due scienziati, permetteva di spiegare la costanza del diametro dell’elica, proprio perché a una purina , avente struttura a doppio anello, è sempre abbinata una pirimidina , avente invece struttura ad anello singolo. Inoltre, i due filamenti sono detti antiparalleli , proprio perché sono orientati in due direzioni opposte , cioè da 5’ a 3’ e l’estremità 5’ di un filamento si lega sempre con l’estremità 3’ del filamento complementare.
LA DUPLICAZIONE DEL DNA
La duplicazione del DNA avviene durante l’ interfase , suddivisa in sottofase G1, sottofase S e sottofase G2. Nella sottofase G1, la cellula forma tutte le molecole che gli servono per crescere; la sottofase S è quella in cui avviene la duplicazione del DNA; mentre, la fase G2 è la fase che precede la mitosi, ed è qui che la cellula forma tutte le molecole che gli servono per la divisione cellulare. Se il DNA è la sede dell’informazione e il materiale genetico deve essere trasferito ai discendenti, è necessario fare delle copie identiche , quindi bisogna sintetizzare molecole identiche a quelle della cellula di partenza. Appunto, alla duplicazione (detta anche replicazione ), sono interessati diversi enzimi. Nel modello a doppia elica di Watson e Crick, ciascun filamento funge da stampo per far sì che avvenga la duplicazione dell’altro ; quindi, come scoperto dal biochimico americano Arthur Kornberg, lo stesso avviene per il DNA: ognuno di quei due filamenti fa da stampo e di il loro filamento che si andrà a formare sarà complementare. Inoltre, nella duplicazione, l’enzima più importante che consente di formare il filamento complementare, è la DNA polimerasi. Nel 1958, utilizzando due diversi isotopi dell’azoto e una tecnica per separare le molecole di DNA , venne dimostrato che la duplicazione di una doppia elica porta alla formazione di due coppie eliche con un meccanismo semiconservativo (la duplicazione si conserva solo a metà): quindi una delle due eliche formate contiene un filamento vecchio e uno nuovo complementare. La duplicazione del DNA si divide in due fasi : Nella prima fase , i due filamenti di DNA avvolti tra loro a spirale si devono despiralizzare e il DNA deve aprirsi come una cerniera , provocando la rottura dei legami idrogeno. Appunto, questa apertura è dovuta all’enzima DNA elicasi che, va a legarsi in punto specifico del DNA, chiamato punto di origine della duplicazione e despiralizza il DNA. Una differenza che troviamo in questa prima fase, sta nella despiralizzazione e l’apertura della molecola del DNA dei procarioti e quella degli eucarioti: questa differenza è data dal fatto che le cellule procarioti sono più semplici e di conseguenza lo sarà anche il loro DNA, quindi nelle cellule procarioti , l’apertura del DNA inizia da un punto e poi procede fino all’altro punto. Nelle cellule eucarioti invece, l’apertura del DNA inizia in più punti (in 20- punti contemporaneamente), in modo che la duplicazione sia più facile e più rapida. Nella seconda fase , la duplicazione avviene in due direzioni opposte , quindi si formano delle bolle di duplicazione. Appunto, in questa fase le due catene polinucleotidiche del DNA devono separarsi, quindi si forma una biforcazione a Y , chiamata forcella di duplicazione. La DNA elicasi separa le due catene e per far sì che non si uniscano di nuovo, interviene una specifica proteina, chiamata SSB ( single-strand binding , “che legano il singolo filamento”). Successivamente, per avviare la sintesi di un nuovo filamento, la DNA polimerasi cerca il filamento con la base complementare ma, dato che non è in grado di capire il punto d’inizio della duplicazione, interviene il primer , cioè un breve tratto di RNA sempre formato su un pezzo di DNA. Quindi, il primer si lega al punto di inizio della duplicazione e viene sintetizzato da un enzima detto primasi ; dopo ciò, la DNA polimerasi riesce a scegliere i nucleotidi con le basi complementari quindi, il primer si stacca e rimane un pezzo vuoto che poi sarà nuovamente duplicato. Inoltre, la sintesi del nuovo filamento avviene solo in direzione 5’-3’ e, dato che i due filamenti sono antiparalleli, si forma in modo continuo un filamento guida , mentre il filamento in ritardo è duplicato in modo discontinuo, formando sequenze di nucleotidi
IL FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA
Il gene e il DNA si trovano nel nucleo mentre le proteine sono sintetizzate nei ribosomi , che si trovano a loro volta nel citoplasma. Quindi, siccome il DNA non può muoversi dal nucleo, per far sì che l’informazione passi dal nucleo al citoplasma, agisce l’ mRNA che appunto copia l’informazione scritta nel DNA, tramite processo di trascrizione ; dopo, l’mRNA abbandona il nucleo e si sposta sui ribosomi nel citoplasma ma, siccome il codice dell’RNA è diverso da quello dei ribosomi, avviene il processo di traduzione : quindi, il flusso dell’informazione avviene dal DNA all’RNA, tranne per i retrovirus, in cui l’informazione va al contrario. Dunque, l’informazione trasmessa darà come risultato l’espressione genica , cioè quell’informazione che si esprime nelle proteine, dove la traduzione avrà dato origine alla sintesi della catena polipeptidica , che poi attraverso le tre strutture formerà una proteina funzionante. Inoltre, l’informazione del DNA è scritta in codice genetico , cioè un codice ternario in cui le terne sono formate dalla sequenza specifica di 3 basi azotate dette triplette (o codoni ), e sono 3 perché se fossero 4 non sarebbero sufficienti per riconoscere le basi. Quindi, si devono prendere sempre le 4 basi adenina, citosina e guanina e al posto della timina c’è l’uracile , proprio perché quell’informazione deve essere copiata sull’mRNA. Analizzando le triplette capiamo che nel codice genetico è importante la sequenza della prima e della seconda base per riconoscere un amminoacido e, anche se la terza base cambia , viene riconosciuto sempre lo stesso amminoacido. Inoltre, ci sono delle triplette che devono funzionare o come triplette di inizio o come triplette di fine : infatti, nella duplicazione del DNA, il primer si deve legare alla fase di inizio e alla fase di fine e riesce a riconoscere questi punti grazie a queste triplette. La tripletta iniziale è sempre AUG (amminoacido metionina) infatti, tutte le proteine iniziano con l’amminoacido della metionina ma, una volta iniziato il processo di maturazione della proteina, l’amminoacido si stacca. Le triplette di fine invece, sono UAG, UGA, UAA (amminoacido stop), che appunto indicano fin dove deve avvenire la duplicazione del DNA. Tutto ciò quindi costituisce il codice genetico del DNA, detto UNIVERSALE poiché è comune a qualsiasi essere vivente (uomo o drosophila); ci sono però delle eccezioni: ad esempio i mitocondri o i cloroplasti, questo perché il codice genetico si riferisce al DNA presente nel nucleo, quindi gli organismi geneticamente modificati esistono grazie all’universalità del DNA. Il codice genetico è invece detto RIDONDANTE , quando l’amminoacido viene riconosciuto da più triplette. Questa modalità di esprimere l’informazione dal DNA all’mRNA, si chiama DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA. Esistono però delle eccezioni riguardanti il dogma centrale: un esempio sono i prioni (proteine in cui non c’è il DNA) che provocano la “ neuropatia spongiforme ” chiamata anche “ morbo della mucca pazza ”, ed è chiamata “neuro” perché riguarda il sistema nervoso dell’animale e “spongiforme” perché la particella finisce per distruggere il tessuto nervoso e quindi si creano delle cavità e c’è una trasmissione di tipo orizzontale. Inoltre, anche i virus oncogeni funzionano con la trascrittasi inversa, la cui caratteristica è quella di dividersi di continuo non rispettando l’inibizione da contatto.
LA SINTESI DELLE PROTEINE
Il momento in cui l’informazione viene copiata dal DNA all’mRNA, interessa tutte e due le cellule e l’informazione è proprio quella corrispondente al gene: però, è ovvio che ad essere copiato è il gene le cui informazioni si tradurranno nella sintesi della proteina del citoplasma: dunque, in questo caso l’enzima che viene usato per passare dal DNA all’RNA è l’RNA POLIMERASI. Anche questo processo, si divide in tre fasi: SITO DI INIZIO ; FASE DI ALLUNGAMENTO ; SITO DI TERMINAZIONE. Nel SITO DI INIZIO la tripletta di inizio è il promotore a cui si lega l’RNA polimerasi che si mette di fronte al nucleotide con la base complementare, legando fra loro i vari nucleotidi: quindi si aprono due filamenti perché l’enzima rompe i legami idrogeno; in questo caso, il filamento orientato in direzione 3’-5’ si chiama filamento di stampo (o antisenso ), mentre il filamento orientato il direzione 5’-3’ è detto filamento codificante (o senso ). Nella FASE DI ALLUNGAMENTO l’RNA polimerasi procede sempre in direzione 5’-3’ e, man mano che avviene la trascrizione, i nucleotidi di partenza si staccano in modo che il DNA possa riavvolgersi e formare la sua doppia elica originaria. (nelle cellule eucarioti un gene viene trascritto contemporaneamente da più polimerasi). Nel SITO DI TERMINAZIONE (UAA, UAG, UGA), l’RNA polimerasi e l’ mRNA si staccano e nella sintesi sono coinvolti anche l’RNA di trasporto (tRNA) e l’RNA ribosomiale (rRNA). Quindi, l’RNA di trasporto ha il compito di trasportare gli amminoacidi che corrispondono alla tripletta , quindi l’RNA presenta una tripletta complementare all’anticodone (mRNA) a cui si va a legare l’amminoacido che corrisponde a quella tripletta: dunque, una singola molecola di RNA sarà in grado di legare l’amminoacido specifico perché l’RNA di trasporto lo porta sui ribosomi dove inizia la sintesi della proteina. Inoltre, l’RNA di trasporto è sempre a singolo filamento , tranne in alcuni punti in cui invece diventa un doppio filamento per far sì che assuma una forma a trifoglio : queste parti quindi, sono tenute insieme dai legami idrogeno che si formano tra le basi azotate complementari. Dunque, l’amminoacido si lega all’estremità 3’ dell’RNA di trasporto grazie all’enzima dell’AMMINOACIL-tRNA SINTETASI che lega l’amminoacido al tRNA per dare origine a questo legame. L’ rRNA invece, è quello che forma i ribosomi fatti di RNA di trasporto e di proteine e costituiti da due subunità : una maggiore e una minore. Inoltre, nelle cellule procariote il reticolo endoplasmatico non è presente ma, c’è un sistema di membrane che vengono ripiegate in modo da non occupare troppo spazio. Esiste però una differenza di grandezze tra i ribosomi delle cellule eucarioti e quelle procarioti; ciò è dovuto al fatto che hanno un diverso tipo di tRNA e anche proteine diverse. Quindi, l’mRNA si va a legare alla subunità minore del ribosoma mentre, la subunità maggiore presenta altre zone particolari : il SITO A è il punto della subunità maggiore a cui si lega l’RNA di trasporto legato all’amminoacido specifico; il SITO P è il punto in cui si allunga la catena polipeptidica che darà origine alle proteine; il SITO E è il punto in cui trasloca l’RNA di trasporto, che ha già scaricato il proprio amminoacido prima di poter essere rilasciato dal ribosoma.
