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Dal DNA all’ingegneria genetica
La genetica dei virus
I virus sono piccoli agenti infettivi che invadono le cellule—> sono parassiti endocellulari obbligati perché non possono riprodursi al di fuori della cellula ospite La maggior parte delle cellule virali (virioni) è costituita da: Genoma virale —> due filamenti di DNA (virus a DNA) o di RNA (virus a RNA) Capside —> rivestimento proteico che protegge il genoma e spesso ha una forma fatta dalla ripetizione di proteine virali In alcuni casi è presente un involucro lipidico esterno detto pericapside o envelope Per completare il ciclo vitale i virus dipendono dalla cellula ospite , che si fa carico della replicazione del genoma virale e della sintesi delle proteine del capside Il ciclo replicativo ha inizio quando il virus entra nella cellula ospite e da inizio alla produzione di virioni. Questo processo si verifica in modi diversi a seconda dei virus e del tipo di cellula infettata I virus che infettano i batteri sono detti batteriofagi o fagi e alternano due fasi del ciclo vitale :
Ciclo litico
Vengono prodotti nuovi virioni che spesso attraversano la rottura (lisi) della cellula ospite , fuoriescono e vanno ad infettare altre cellule, perpetuando il ciclo replicativo del virus. È un processo rapido poiché avviene in 15 minuti ed implica regolazioni sia positive che negative che stimolano e inibiscono l’espressione genica. È diviso in tre fasi: immediata precoce, precoce e tardiva. All’inizio del ciclo, la RNA polimerasi batterica riconosce il promotore virale e trascrive geni immediati precoci del virus , i cui prodotti attivano la trascrizione dei geni precoci. Le proteine codificate da questi geni bloccano la trascrizione di DNA della cellula ospite , stimolando la replicazione del genoma virale e la trascrizione dei geni tardivi , che codificano per le proteine del capside e per gli enzimi che lisano la cellula ospite.
Ciclo lisogeno
Il virus entra in una condizione di latenza in cui il genoma virale permane senza riprodursi Nel ciclo lisogeno il DNA virale si integra nel DNA dell’ospite e diventa un profago —> i batteri che ospitano i profagi sono detti batteri lisogeni ed i virus sono definiti temperati. Il profago può rimanere inattivo per migliaia di generazioni ma in certe condizioni ciò cambia e si passa al ciclo litico—> il profago si stacca dal cromosoma ed inizia a riprodursi La capacità di passare da un ciclo all’altro permette al fago di adattarsi alle risorse della cellula ospite per trarne il massimo vantaggio NB se la cellula è stressata il profago attiva il ciclo litico Nel DNA del fago sono presenti due promotori per i geni virali , che sono regolati in modo opposto dalle proteine virali cI (reprime i geni per la fase litica e attiva i geni per la fase lisogena) e Cro , che fa il contrario.
I virus a DNA
I virus a DNA che infettano le cellule eucariote contengono un filamento doppio o singolo di DNA e compiono cicli litici o lisogeni del tutto simili a quelli dei batteriofagi. Nel ciclo lisogeno il virus integra il proprio DNA in un cromosoma dell’ospite sotto forma di provirus —> si stabilisce un’infezione latente in cui i geni virali non sono trascritti e rimangono inseriti nel genoma della cellula ospite Quando la cellula infetta si divide, trasmette alle cellule figlie anche la sequenza del pro virus questi virus entrano nelle cellule ospiti per fusione tra la membrana cellulare e il peri capside oppure per endocitosi , quando il virus viene inglobato nella cellula Il virus a DNA comprendono diversi virus patogeni per gli umani come il papilloma virus HPV
HPV
I papilloma virus sono piccoli virus privi di pericapside il cui genoma, che è un DNA a doppio filamento, è racchiuso in un capside icosaedrico. La loro famiglia comprende oltre 100 virus, la maggior parte dei quali causa malattie non gravi delle mucose della pelle (verruche). Le mucose dell'apparato genitale femminile e maschile sono al bersaglio di questi virus, tra i quali anche alcuni sottotipi potenzialmente cancerogeni infezione da virus HPV16 e HPV18 è associata allo sviluppo del carcinoma della cervice uterina Il virus penetra nell'organismo attraverso piccole lesioni della cute e delle mucose e infetta le cellule dello strato basale dell'epitelio Se le difese immunitarie dell'ospite non sono in grado di eliminare l'infezione, il genoma virale entra in fase di latenza e persiste nella cellula senza causare sintomi evidenti Quando passa alla fase applicativa attiva, il virus si moltiplica nelle cellule epiteliali e possono comparire le prime lesioni che nella maggior parte dei casi non causano sintomi ma in presenza di altri fattori predisponenti queste lesioni possono progredire verso la formazione di un carcinoma Virus a RNA il materiale genetico dei virus a RNA è costituito da una molecola di RNA a singolo o doppio filamento
SARS-CoV-
Il virus Sars-cov-2, che causa la malattia COVID-19 , appartiene alla stessa famiglia di coronavirus di cui fanno parte i virus della Sars e della mers. È dotato di un genoma RNA a singolo filamento racchiuso in un pericapside da cui sporgono le glicoproteine che Spike , responsabili del riconoscimento dei recettori ACE-2 sulla superficie della cellula ospite, grazie ai quali il virus può fondersi con la membrana cellulare per rilasciare il suo genoma nel citoplasma Qui l’RNA virale viene immediatamente tradotto in proteine dall'apparato traduzionale della cellula e si formano due poliproteine ( ppla e pplab ), che vengono poi processate mediante taglio proteolitico per rilasciare proteine più piccole. Queste proteine concorrono alla replicazione del genoma virale iniziale (chiamato anche RNA polarità positiva o RNA senso) e si forma così un RNA complementare (RNA a polarità negativa o antisenso), che funge da stampo per: generare molte copie del genoma virale originario produrre RNA di lunghezza diversa chiamati RNA subgenomici , necessari per la sintesi delle proteine di cui il virus ha bisogno per assemblare il proprio capside pericapside Le nuove copie del genoma virale vengono rivestite dal capside e i nuovi virioni abbandonano la cellula gemmando dalla membrana in questo modo acquisiscono il rivestimento per i capsidico con cui iniziano il nuovo ciclo infettivo
HIV
L’HIV è un retrovirus responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) i retrovirus sono dei virus a RNA con un complesso ciclo riproduttivo e quando infettano una cellula utilizzano una DNA polimerasi detta trascrittasi inversa , che converte il loro genoma da RNA a singolo filamento in un provirus a DNA a doppio filamento Il provirus si integra nel genoma della cellula ospite ed entra in una fase di latenza e quando si risveglia inizia il ciclo litico : la RNA polimerasi cellulare trascrive i geni virali a partire dal promotore del pro-virus e genera un unico trascritto primario che viene processato dalla splicesoma cellulare generando gli mRNA per due proteine: la Tat e la Rev sintetizzate nel citoplasma, queste due proteine entrano nel nucleo e interagiscono con gli acidi nucleici NB la tat aumenta l'efficienza della trascrizione a partire dal promotore del virus e la Rev regola la cascata trascrizionale del virus Per completare il suo ciclo vitale, l’HIV deve produrre diversi tipi di RNA: quelli privi di intorni per la sintesi di Tat e Rev, e quelli corrispondenti all'intero genoma che serviranno sia a produrre le proteine strutturali sia a costituire i genomi virali da inserire nei nuovi virioni.
Infine, il DNA dell'ospite presenta i geni introdotti dal virus, che hanno sostituito una parte del genoma originale.
Trasformazione
Oltre alla coniugazione e alla traduzione esiste un altro modo chiamato trasformazione, dove un batterio acquisisce il DNA libero dall'ambiente Questo fenomeno si manifesta in alcune specie di batteri, quando le cellule muoiono il loro DNA fuoriesce una volta che il DNA trasformante è entrato nella cellula ospite , il cromosoma di quest’ultima può incorporare nuovi geni con un processo molto simile alla ricombinazione eucariote. I processi di trasformazione, coniugazione e traduzione prendono il nome di trasferimento genico orizzontale perché permettono scambi di materiale genico tra due batteri che non discendono gli uni dagli altri NB la trasmissione di geni dai genitori alle progenie costituisce invece il trasferimento genico verticale Tecnologia del DNA ricombinante L’informazione genetica contenuta nel DNA è specifica per ogni organismo, che sia esso un batterio, una pianta o un animale. Le caratteristiche manifestate da ogni individuo, ovvero il fenotipo , sono codificate dall'informazione genetica, ovvero il genotipo, contenuta nelle sue cellule—> oggi grazie alle tecniche dell'ingegneria genetica è possibile alterare il fenotipo di un organismo modificando il suo genotipo. Ciò è stato dimostrato con un esperimento realizzato per la prima volta nel 1973 da Stanley Cohen e Hebert Boyer, che trasferirono in un batterio di E. coli una molecola di DNA contenente due geni per la resistenza agli antibiotici, ciascuno proveniente da un ceppo batterico diverso—> il nuovo batterio era in grado di resistere a entrambi gli antibiotici e quindi mostrava un fenotipo ibrido. Infatti un DNA ricombinante è una molecola di DNA che contiene l'informazione genetica proveniente da due organismi differenti e l'ingegneria genetica è l'insieme delle tecniche usate per ottenere e manipolare il DNA ricombinante (puo anche essere chiamata tecnologia del DNA ricombinante ) Le tecniche di ingegneria genetica sono figlie delle grandi scoperte che hanno riguardato le scienze biologiche tra il diciannovesimo secolo ed il ventesimo secolo e negli anni queste tecniche si sono sempre più affinate. Le biotecnologie possono essere usate in diversi modi per le applicazioni più svariate ma nella maggior parte dei casi la prima operazione da compiere è ottenere un gran numero di copie identiche del gene di interesse cioè del gene che vogliamo studiare e questa operazione è detta clonaggio genico—> consiste nella produzione di numerose copie di un gene di interesse mediante le tecniche di DNA ricombinante e per clonare un gene sono necessari dei materiali fondamentali: gene che si intende clonare, isolato dall'organismo di origine o ricavato da un archivio di DNA gli enzimi che permettono di tagliare e cucire il diagnosi per ottenere il frammento genico di interesse un vettore di clonaggio per inserire il DNA ricombinante in una cellula La creazione di una molecola di DNA ricombinante richiede due tipi di enzimi: gli enzimi di restrizione e le DNA ligasi, che catalizzano rispettivamente le reazioni di taglio e di cucitura del DNA —> questi enzimi infatti servono a tagliare e unire insieme segmenti di DNA che provengono da molecole diverse
Tagliare il DNA: Enzimi di restrizione
Il DNA è un polimero formato da nucleotidi legati da un legame fosfodiestere—> per tagliare una doppia elica di DNA occorre agire su questi legami Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che rompono in modo preciso legame fosfodiestere tra due nucleotidi adiacenti e questi enzimi sono stati scoperti nei batter i, che li usano per frammentare e inattivare il DNA dei fagi che li infettano. Gli enzimi di restrizione tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di sequenze nucleotidiche specifiche chiamate sequenze di taglio o siti di restrizione e questo è un aspetto fondamentale poiché i
tagli devono avvenire solo nei punti desiderati, altrimenti potrebbero inattivare il gene che vogliamo clonare. Ogni enzima di restrizione riconosce una specifica sequenza di taglio che in genere è palindromica e può essere letta in entrambe le direzioni. Il taglio può avvenire nello stesso punto sui due filamenti di DNA producendo estremità piatte, oppure può essere sfasato in qualche nucleotide producendo estremità coesive a singolo filamento
Separare il DNA: L'elettroforesi
Negli esperimenti di clonaggio genico è importante verificare che gli enzimi abbiano tagliato nel punto giust o per evitare di proseguire l'esperimento con il frammento sbagliato e di uno dei metodi più usati per separare e controllare la dimensione di una molecola di DNA è l'elettroforesi su gel d’agarosio, che è una tecnica analitica che permette di sparare i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato sullo scheletro carbonioso e quando i frammenti di acidi nucleici vengono sottoposti a un campo elettrico si spostano verso il polo positivo. Per l'elettroforesi delle molecole di DNA si usa generalmente il gel di agarosio, che è un polisaccarid e che viene riscaldato al punto di fusione (circa 90 °) e una volta raffreddate le miscele assumono l'aspetto di gel. Le miscele fuse di agarosio vengono colate in appositi stampi in cui un'estremità è posizionato un pettine di plastica e quando il gel si è solidificato il pettine viene rimosso, lasciando dei pozzetti nei quali vengono caricati i campioni di DNA da analizzare. Il gel è successivamente immerso in posizione orizzontale in una soluzione tampone, all'interno di una camera elettroforetica, e la struttura del gel si comporta come un setaccio così che le molecole di DNA più corte si spostino più velocemente mentre quelle più lunghe sono più lente. Al termine della corsa elettroforetica è possibile visualizzare i frammenti sotto forma di bande grazie a molecole che si legano al DNA ed è possibile dedurre la loro dimensione mediante il confronto con altre molecole di lunghezza nota La presenza nel gel del corretto numero di frammenti nelle dimensioni attese permette di verificare che il taglio degli enzimi di restrizione sia avvenuto in modo completo e corretto
Cucire il DNA: Le DNA ligasi
Grazie al taglio con gli enzimi di restrizione abbiamo ottenuto un frammento di DNA contenente il gene da studiare ma ora lo dobbiamo cucire all'interno di una seconda molecola di DNA con il vettore, che permetterà di ottenere molte copie per successive analisi. Per unire il frammento di DNA con il vettore è necessario che entrambi siano stati tagliati con lo stesso enzima di restrizione , in modo che l'estremità si possono appaiare e, dopo il taglio, per cucire il frammento di DNA all'interno del vettore è necessario ricorrere ad altri enzimi come la DNA ligasi, che catalizzano la formazione del legame fosfodiestere tra due molecole di nucleotidi adiacenti. Le reazioni ligazione si realizza in una provetta aggiungendo i frammenti di DNA ad alta concentrazione per diminuire la distanza tra l'estremità da legare e favore così le attività di cucitura delle ligasi Dopo aver cucito il DNA possiamo inserire il vettore di clonaggio , che è una molecola di DNA ricombinante che entra in una cellula e una volta al suo interno si replica generando molte copie di se stessa—> i piu usati sono i plasmidi , che sono piccole molecole di DNA circolare presenti nel citoplasma dei batteri, capaci di replicarsi in modo autonomo rispetto al cromosoma batterico. Tutti i vettori di clonaggio devono possedere alcuni elementi tra cui: un'origine di replicazione per replicare il vettore a ogni divisione cellulare un sito multiplo di colaggio, cioè una regione in cui sono raggruppate le sequenze di taglio di diversi enzimi di restrizione, dove verrà inserito il gene che vogliamo clonare marcatore di selezione, che è un gene che conferisce la resistenza a un antibiotico, che ci permette di capire se una cellula ha incorporato il vettore di un clonaggio oppure no Oltre plasmidi batterici è possibile usare come vettori di clonaggio anche i genomi virali modificati, poiché tutti i virus sono naturali trasportatori di materiale genico e sono specializzati nel trasferimento di materiale genetico da una cellula all'altra.
Un secondo trattamento permette di denaturare, ovvero di separare, i due filamenti di DNA preparandoli all'appaiamento ( l'ibridazione ) con la seconda sonda di DNA, che viene posta a contatto con il filtro permettendole di ibridarsi con il DNA complimentare. Per identificare la posizione in cui avviene l’ibridazione, la sonda è stata marcata con un isotopo radioattivo o una molecola chemiluminescente e una volta avvenuta l’ibridazione si esegue una radiografia del filtro nitrocellulosa e si trova la sonda radioattiva. Confrontando la radiografia con la piastra petri iniziale si può risalire alle colonie batterie che hanno il DNA di interesse Nel caso in cui si conosca la sequenza, anche parziale, del gene da isolare non è necessario ricorrere alla generazione di libreria di DNA ma si può isolare il gene direttamente da un campione di DNA genomico in provetta. Questo passaggio è costituito da una tecnica molto più veloce ed economica chiamata reazione a catena della polimerasi (PCR), che permette di isolare e amplificare il genere direttamente in provetta e questa tecnica venne ideata dal biochimico Kary Mullis, che ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 1993. La PCR è un sistema automatizzato per isolare e amplificare il DNA in provetta ed è basato sulla capacità dell'enzima DNA polimerasi di sintetizzare un nuovo filamento di DNA partire da un filamento stampo—> questa tecnica riproduce quello che si verifica normalmente nel nucleo cellulare durante la replicazione del DNA Per la PCR occorrono quattro tipi di reagenti: il DNA stampo che vogliamo amplificare l'enzima taq polimerasi, che è una DNA polimerasi ottenuta dal batterio termoresistente che vive in sorgenti idrotermali (questo enzima è capace di rimanere attivo anche alle alte temperature necessarie durante la procedura) una copia di oligonucleotidi detti primer, che funzionano da inneschi per la Taq polimerasi e che hanno sequenze altamente specifiche I quattro nucleosidi trifosfato La reazione si svolge in tre tappe: Denaturazione—> dato che la DNA polimerasi utilizza uno stampo a singolo filamento, per prima cosa si riscalda la miscela a 95 °, che è la temperatura alla quale i legami idrogeno tra i due filamenti del DNA stampo si rompono l'appaiamento —> si abbassa la temperatura tra i 50-65 ° in modo tale che i primer possano appaiarsi alle sequenze complementari sui filamenti di DNA stampo l'allungamento —>si alza la temperatura fino a 68-72 °, che è il valore ottimale per la Taq polimerasi che inizia a sintetizzare la prima copia di porzione di DNA compresa tra i due primer Terminata la fase di allungamento il ciclo si ripete partendo dalla fase di denaturazione per circa 30 volte NB uno dei vantaggi della PCR è la possibilità di poter partire da una quantità davvero minima di DNA—> l'unico limite della tecnica è rappresentato dalla lunghezza della sequenza di di DNA, che ha una certa percentuale di errore Il sequenziamento del DNA Il sequenziamento del DNA permette di definire il preciso ordine della sequenza di nucleotidi che formano una molecola di acido desossiribonucleico —> si tratta di una delle tecnologie più importanti a sostegno dell'ingegneria genetica e infatti conoscere la sequenza di un gene è il primo passo per comprenderne le funzioni e distinguere le regioni regolatrici da quelle codificanti La prima metodica di sequenziamento del DNA risale agli 1970 e fu messa appunto da Frederick Sanger , anche se dal punto di vista tecnologico questo metodo è stato ormai superato da altri più innovativi, i cosiddetti metodi di sequenziamento di seconda e terza generazione, che sono stati messi appunto all'inizio del XXI secolo Tuttavia, il sequenziamento di sanger rimane ancora un punto di riferimento fondamentale per la biologia molecolare
La procedura di sequenziamento messa a punto da sanger si basa su una reazione simile alla PCR, che prevede l'uso di una DNA polimerasi e l'alternarsi di cicli ripetuti di denaturazione, appaiamento E allungamento, tuttavia in questo caso viene usato solo un primer e oltre ai normali nucleotidi necessari per la sintesi di del DNA, la relazione deve contenere anche quattro dideossinucleotidi (ddNTP) modificati , che agiscono da terminatori di catena perché privi del gruppo necessario alla formazione del legame fosfodiestere con il nucleotide successivo.
Passaggi
- Si isola il frammento di DNA da sequenziare , per esempio dal genoma si un batterio
- I frammenti di DNA vengono uniti ai reagenti necessari per la sintesi dei filamenti complementari e suddivisi in quattro provette , ciascuna contenente uno dei quattro ddNTP
- In ogni provetta si genera una miscela di frammenti tutti terminanti con lo stesso nucleotide 4. Si caricano i prodotti delle quattro reazioni nei pozzetti di un gel per l’analisi elettroforetica 5. Procedendo dal frammento più piccolo verso il più grande si ricostruisce l’ordine con cui i nucleotide sono stati incorporati 6. La sequenza che emerge è complementare a quella che si intendeva sequenziare La lettura dei frammenti avviene mediante elettroforesi capillare su gel poliacrilammide , che permette di distinguere i filamenti di DNA che differiscono in lunghezza—] per identificare il ddNTP terminatore si ricorre a ddNTP marcati con una molecola fluorescente Il metodo sanger ha revoluzionato gli studi genetici ma all'inizio del ventunesimo secolo era evidente che non poteva tenere il passo con gli obiettivi più innovativi della ricerca—> in quel periodo iniziarono ad apparire nuove “ tecnologie di seconda generazione” chiamate complesso di sequenziamento di nuova generazione o NGS, che si basa sul sequenziamento massivo in parallelo di molecole di DNA e questo approccio permette di sequenziare anche interi genomi. A differenza del metodo sanger che si basa sull’elettroforesi dei frammenti ottenuti da singole reazioni di sequenziamento, le piattaforme di sequenziamento NGS permettono di sequenziare in un'unica sessione anche miliardi di paia di basi di DNA. Si tratta di un esempio di tecnologie high-throughput, cioè tecnologia ad alta resa, grazie alle quali si possono analizzare moltissime sequenze parallelo abbattendo i tempi di analisi e costi. Una delle tecniche che ha fatto da trampolino di lancio per lo sviluppo delle tecnologie NGS è il pirosequenziamento, che permette di leggere direttamente le sequenze senza bisogno della elettroforesi e, come il metodo sanger, anche il sequenziamento richiede la sintesi di nuovi filamenti di DNA a partire da un primer appaiato al filamento di stampo NB in questo caso lo stampo è copiato dalla DNA polimerasi senza l'aggiunta di ddNTP terminatori di catena —> l'ordine dei nucleotidi, e quindi la sequenza, è rilevata simultaneamente alla sintesi del filamento complementare La tecnica prende il nome dalla molecola di pirofosfato, che durante la sintesi del filamento complementare, viene rilasciata quando è aggiunto un nucleotide e attiva l'enzima luciferasi che emette chemiluminescenza Per associare l'emissione di questo segnale alla sequenza nucleotidica, i diversi nucleotidi devono essere aggiunti in modo sequenziale e ciclico secondo un ordine preciso e prima dell'aggiunta del nucleotide successivo, l’enzima nucleotidasi ripulisce la miscela deviazioni degradando i nucleotidi residui—> questa metodica permette di sequenziare i frammenti estremamente lunghi e un numero piuttosto esiguo che, tuttavia, è compensato dal fatto che l'intera procedura è facilmente automatizzabile ed è possibile sequenziare molti frammenti in in parallelo NB la versatilità di questa metodica ha aperto la strada ad altre tecnologie NGS Nonostante i progressi raggiunti, anche le tecniche NGS hanno alcuni limiti Le tecniche di terza generazione promettono di essere ancora più rapide ed efficienti ed una di queste è il sequenziamento a nanopori, basato sul fatto che un filamento singolo di DNA, quando attraversa un canale
Le prime tecniche di editing genomico erano molto costose e laboriose e la svolta arriva con la scoperta nel 1993 della sequenza CRISPR , cioè brevi sequenze ripetute e palindrome, raggruppate e separate con regolarità rinvenute nel genoma dei batteri precedentemente infettati dai batteriofagi. In seguito all'infezione, alcune porzioni del genoma fagico si integrano in specifiche regioni nel cromosoma batterico e ripetendosi nel tempo, questo processo crea un archivio di sequenze CRISPR utile a combattere infezioni future e che viene passato di generazione in generazione. Se il batterio o la sua progenie incontrano in seguito la stesso virus, le sequenze CRISPR vengono trascritte in corti RNA guida, la cui sequenza è complementare a porzioni del genoma virale. L’appaiamento tra il genoma virale e l’RNA guida richiama l'enzima cas 9, che è un endonucleasi che degrada il genoma virale bloccando l'infezione. Nel 2012 Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier hanno ideato un sistema di editing genomico mirato, basato sul CRISPR, e grazie a questa invenzione le due ricercatrici hanno ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2020. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull'abbinamento di uno specifico RNA guida all’endonucleasi Cas9 , che taglia un DNA a doppio filamento a livello di una sequenza specifica e ne permette il successivo editing. CRISPR/Cas9 è uno strumento sicuramente versatile grazie al quale è possibile, in linea teorica, intervenire e correggere qualsiasi sequenza genica e deve molta della sua versatilità al sequenziamento completo del genoma umano e di altri organismi, grazie al quale è possibile creare intere librerie di RNA guida che possono appaiarsi ipoteticamente a qualsiasi sequenza genica presente nel genoma—> grazie alla sua versatilità e semplicità di applicazione sistema CRISPR/Cas9 è oggi il sistema di editing genomico più promettente
