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Lezione 1
Microbiologia
La Farmacopea evidenza che i farmaci hanno una precisa entità microbiologica prima di essere messi in commercio e per arrivare a quella precisa entità microbiologica è necessario un microbiologo che controlli e monitori le diverse fasi di produzione e la fase finale (prima dell’emissione sul mercato).
Qualità microbiologica dei farmaci:
Farmaci sterili: non devono avere tracce microbiche. Farmaci non obbligatoriamente sterili
Trattamenti antimicrobici: agenti fisici e agenti chimici.
Infezioni nosocomiali : infezioni prese in ospedale (infezioni ospedaliere); infezioni che si sviluppa/manifesta 24- ore dopo il ricovero oppure anche dopo qualche settimana dalla dimissione dall’ospedale (a volte l’infezione può manifestarsi anche dopo mesi, per esempio dopo un trapianto, magari causati da batteri a lenta crescita).
Biofilm batterico/microbico (biocenosi microbica) : è una biocenosi microbico multistratificato; è un consorzio di microorganismi che parte da una prima fase costituita da microrganismi di una determinata specie che colonizzano la superficie, ma che può successivamente incamerare anche microrganismi di altre specie; questa specie di condominio microbico permette ai microrganismi di rimanere a lungo in un ambiente e succede che a volte i microrganismi d questo biofilm riescono a scambiarsi non solo principi nutritivi ma anche geni (cioè corredo cromosomico) e quindi così possono evolversi e diventare insensibili ai farmaci. Quando si vuole impedire questo biofilm a volte si blocca/bisogna impedire la riproduzione dei batteri (impedisco quindi la colonizzazione di un ambiente). Si può utilizzare per esempio l’argento: l’argento è una sostanza antimicrobica molto efficace, quindi si lega su queste superfici le nano particelle di argento (si possono utilizzare anche faramci) che attaccano i batteri e si legano ad essi (in maniera diversa a seconda della struttura dei microrganismi – se uno è Gram + oppure Gram - per esempio). Microrganismi responsabili (a livello ospedaliero): Staphylococcus aureus (Gram +), Escherichia coli (Gram -), Pseudomonas aeruginosa (Gram -) – vedi su slide l’immagine di E. coli e di S. aureus dopo l’effetto dell’argento: negli E. coli si nota subito l’effetto che hanno le nano particelle d’argento all’interno di questo batterio (hanno spaccato i vari involucri della cellula – parete e membrana – e il contenuto cellulare è fuoriuscito il batterio è andato incontro a morte cellulare), mentre degli S. aureus sembra tutto normale (l’argento si lega all’esterno), le cellule sembrano ancora integre ma in realtà è stato bloccato il metabolismo di questo microrganismo perché le nano particelle di argento hanno bloccato la riproduzione cellulare, quindi questo porta a morte cellulare (il risultato è lo stesso è solo più lento il processo, ha una morte cellulare più lenta.
Bioaerosol: è una diffusione di microrganismi nell’aria e sulle superfici (in un ambiente che poi si andranno a radicare); quali sono i componenti tipici che posso incontrare? Microrganismi metabolicamente attivi (microrganismi vivi coltivabili e microrganismi vitali ma non coltivabili), frammenti microbici, prodotti metabolici (tossine), microrganismi morti ecc.
Conoscere porta ad un migliore e più consapevole prevenzione e protezione durante lo svolgimento dell’attività lavorativa e: Tutela:
Famigliari Comunità Ambiente
Evita:
Malattie Infortuni Assenze dal lavoro Costi per l’azienda e per la società
Agenti biologici: qualsiasi microrganismo, naturale ma anche geneticamente modificato, coltura cellulare, endoparassita umano capace di provocare infezioni, intossicazioni o allergie all’uomo (batteri, funghi, parassiti, protozoi, virus – anche tossine e allergeni derivati dagli stessi microrganismi o da altri organismi (piante o animali)). L’agente biologico può anche essere un frammento biologico oppure un suo prodotto metabolico (tossine).
Definizioni:
Microrganismo : qualsiasi entità microbiologica in grado di riprodursi e trasferire materiale genetico.
Microrganismo geneticamente modificato : entità il cui materiale genetico è stato modificato in un modo che non avviene in natura, mediante incrocio e/o ricombinazione naturale.
Coltura cellulare : risultato della crescita in vitro di cellule derivate da organismi pluricellulari.
Campo di applicazione: qualsiasi ambiente di lavoro in cui vengono svolte attività per la quale si possa individuare una potenziale presenza di agenti biologici, deve essere studiato al fine di definire un eventuale rischio di esposizione del personale presente. Gli ambienti e/o attività che comportano emissioni di polveri organiche ed in cui si può prevedere la presenza incognita di microrganismi sono ambienti con presenza di impianti di condizionamento.
Modalità di trasmissione: diretta (malato o portatore soggetto sano) o indiretta (malato o portatore ambiente soggetto sano). I veicoli sono mezzi inanimati che trasportano i microrganismi all’uomo (aria, acqua, alimenti, suolo, superfici); i vettori sono i mezzi animati/esseri viventi (insetti o anche animali più grandi, anche il cane e gatto per esempio).
Il portatore può essere: sano (non manifesteranno mai i sintomi – magari possiedono delle proteine che si legano subito al microrganismo e lo blocca immediatamente, e quindi non ha sintomi), cronico (è un portatore che può diffondere per tanti anni), precoce (diffonde ma non ha i sintomi chiari), convalescente (non ha più i sintomi, ma può diffondere ancora).
Vie di trasmissione : ingestione, inalazione, contatto, inoculazione, accoppiamento, trasmissione iatrogena (cioè la via dovuta a manipolazioni mediche fatte in modo sbagliato che possono compromettere la salute di una persona sana).
Associazioni biologiche : simbiosi mutualistica (microrganismo e ospite sono entrambi in un rapporto paritario), il commensalismo (solo quando uno dei due ha un beneficio con l’interazione con l’ospite – es: E. coli) e il parassitismo di microrganismi (danneggiano l’ospite). Un’associazione microbica può trasformarsi in un’altra, per esempio un rapporto di commensalismo può diventare parassitismo.
Rapporto ospite-parassita: fattori che possono influenzare le caratteristiche di suscettibilità dell’ospite; possono essere fattori microbici (patogenicità, virulenza, via di ingresso, dose infettante/dose letale microbica, flora microbica normale), fattori costituzionali (età, nutrizione, equilibrio ormonale), fattori fisiologici (malattie costituzionali, stress), storia immunologica (immunità acquisita naturalmente e quella artificialmente). L’equilibrio tra resistenza e sensibilità significa “buona salute”.
Lezione 2
CLASSIFICAZIONE DI PERICOLOSITÀ DEGLI AGENTI BIOLOGICI:
Gruppo di rischio 1 agenti biologici che difficilmente causano malattie all’uomo, cioè microrganismi che non sono un pericolo per l’uomo (come singolo individuo) e per la comunità (es: Bacillus subtilis (Gram +) , Staphylococcus epidermidis, Eschericchia coli e Saccharomyces cerevisiae ). Tutti questi microrganismi possono dare delle interazioni biologiche, più precisamente sono dei commensali; dal punto di vista pratico hanno una certa importanza: vengono definiti “ microrganismi traccianti ”, vuol dire che è un microrganismo
Nel secolo successivo Edward Jenner (il padre dell’immunologia) aveva scoperto che si poteva immunizzare le persone contro il vaiolo: si era accorto che i mungitori di vacche non si ammalavano di vaiolo umano nonostante erano a contatto con il vaiolo delle vacche/vaiolo bovino (il Cow Pox) e così prese un giovano come cavia e prima gli somministrò una dose del vaiolo bovino (senza che lui lo sapesse) e, dopo che il ragazzo guarì dai sintomi provocati dal vaiolo bovino, gli somministrò il vaiolo umano e il ragazzino non si ammalò. Nel 1798 si parlò per la prima volta di “virus”.
Nell’800 ci fu Ignac Semmelwels, il padre dei protocolli di disinfezione a livello nosocomiale, che notò che le partorienti in ospedale si ammalavano di una febbre anche mortale molto più elevatamente rispetto che a casa (l’incidenza di morte a casa era molto più bassa che in ospedale) e allora iniziò a riflettere sulle procedure mediche: notò che tutti i suoi assistenti quando passavano da paziente a paziente non si lavavano le mani (modalità di trasmissione indiretta).
Ci fu anche Joseph Lister, il padre della disinfezione delle sale operatorie, lui prima di operare disinfettava il campo operatorio, gli strumenti e tutto il resto della sala per ridurre l’incidenza delle infezioni post-operatorie.
Sempre nell’800 ci fu John Tyndall (fisico) scoprì che alcuni batteri riuscivano a resistere ad ambienti ostili per altri microrganismi perché producevano spore e così mise appunto un protocollo per eliminare le spore sugli alimenti e anche sugli strumenti chirurgici: la tindalizzazione , cioè un processo che prevede riscaldamenti successivi nel tempo (shock termico per mezz’ora (circa 80 °C), poi lo stesso materiale viene messo a una T di 37 °C – così per tre giorni); la spora resiste al calore, per far sì che la spora venivano attivate e liberando il microrganismo, e poi successivamente, con una successiva riscaldata, il microrganismo moriva.
Sempre nell’800 ci fu anche uno dei padri della microbiologia moderna (e padre delle vaccinazione di massa e trattamenti antimicrobici, il re della prevenzione microbica); in più con lui finì la storia della teoria della generazione spontanea: Louis Pasteur capì che i microrganismi non si generavano dall’aria ma semplicemente capì che essa era solo un veicolo per i microrganismi (spore o granelli di polvere contaminati da batteri) e per dimostrarlo prese due contenitori con un becco incurvato (che permetteva il passaggio dell’aria ma non il completo passaggio dei microrganismi), li riempì di terreno di coltura, li portò entrambi a temperatura (per sterilizzare, cioè per uccidere qualsiasi sostanza microbica) e ad uno dei due contenitori gli ruppe il collo; li lasciò lì e notò che solo quello con il collo rotto, quindi quello esposto direttamente all’aria, Presentò microrganismi al suo interno e quindi dimostrò che non era l’aria in sé a provocare la crescita microbica (perché anche nel contenitore intatto c’era passaggio di aria eppure non erano presenti microrganismi), ma era l’eventuale arrivo di spore o altro attraverso l’aria che portava alla crescita microbica. Inoltre Pasteur dimostrò che si poteva fare una vaccinazione di massa sugli animali e dimostrò anche che le vaccinazioni funzionano anche sull’uomo (es: virus della rabbia).
Pesce crudo Epatite A, Colera, Salmonellosi.
Robert Koch , un altro padre della microbiologia moderna, lui tentava di isolare i microrganismi/gli agenti eziologici di una determinata malattia e riuscì ad isolare un microrganismo che prese il suo nome (il bacillo di Koch ) che è il batterio della Tubercolosi; lui riuscì ad isolare i micobatteri grazie a due invenzioni: una è la piastra di Petri e il terreno di coltura all’interno di queste capsule, ovvero l’Agar, in questo modo poteva far crescere le colonie dei singoli batteri specifici su piastra (un solo tipo di batterio per coltura); da questo Koch poté stilare i suoi celebri postulati:
- Il microrganismo, che causa la malattia, deve essere presente nell’ospite ammalato ma deve essere assente negli organismi sani.
- Il microrganismo patogeno deve essere isolato e fatto crescere in coltura pura (come singola specie microbica), quindi deve essere identificato tramite coltura pura.
- La stessa malattia deve riprodursi ogni volta che il microrganismo isolato viene inoculato in un ospite sano.
- Lo stesso microrganismo deve essere isolato nuovamente dall’ospite infettato.
Il punto 1 può essere messo in discussione perché un individuo può anche solo essere un portatore sano della malattia (quindi non presenta sintomi) e anche il punto 3 può essere criticato perché ognuno di noi, come ha dimostrato Max Von Pettenkofer, può avere una reazione differente alla malattia ( suscettibilità individuale ).
Dimitri Ivanowsky fu il primo ad intuire che esistono microrganismi più piccoli dei batteri, cioè i virus , attraverso un esperimento: studiando una tipica patologia dei vegetali (causato dal virus a mosaico del tabacco), prese le foglie malate, le tritò, le mise in una sospensione acquosa sterile e filtrò il contenuto (il macerato) utilizzando filtri capaci di trattenere le forme batteriche; dopodiché inoculò il liquido in foglie sane che si ammalarono, quindi dimostrò che c’erano microrganismi più piccoli che riuscivano a passare (non si riuscì a stabilire la presenza vera e propria dei virus fino al 1930 dopo che Ruska inventò il microscopio elettronico).
Nel 1929 Alexander Fleming scoprì la Penicillina (anche se 30 anni prima fu scoperta da un italiano, ma nessuno lo calcolò): coltivando un batterio, lo Staphylococcus aureus , questa si era contaminata con una muffa e stranamente dove era cresciuta la muffa non si erano sviluppate colonie di stafilococchi (lontano dalla muffa invece sì), quindi lui aveva dedotto che questa muffa avesse un potere antimicrobico contro gli stafilococchi, da lì poi fece alcuni studi, estrasse il prodotto metabolico (che è appunto la Penicillina, un antibiotico).
Nel 1950 Jonas Salk e Albert Sabin furono i microbiologi che misero appunto il vaccino contro la Poliomielite (malattie a trasmissione oro-fecale e colpisce i neuroni motori del midollo spinale e può portare alla paralisi); inventarono due vaccini un po’ diversi anche se aventi lo stesso scopo.
Nel 1973 Bruce Ames mise a punto un test per valutare la genotossicità delle sostanze chimiche/dei prodotti utilizzando dei batteri (batteri auxotrofi).
Takahashi: padre del vaccino contro la varicella (1974).
1979 OMS: eradicazione del Vaiolo.
1981: AIDS nel 1983 Francoise Barrè-Sinoussi riuscì a individuare l’agente eziologico, cioè il virus HIV , nei linfonodi di un paziente malato.
Cellula batterica
La cellula batterica può essere definita come una regione dello spazio delimitata da una parete e da una membrana in cui avvengono processi metabolici costruttivi (processi anabolici) e processi distruttivi (processi catabolici) e l’ambiente condiziona tantissimo i processi metabolici del batterio, come la riproduzione, la sporogenesi, il quorum sensing e la chemiotassi.
La riproduzione è un processo fondamentale ed è un segno di “benessere”, ovvero se il batterio si trova in un ambiente o comunque in condizioni ideali questo microrganismo si riproduce in tempi brevi e con facilità. Ci sono alcuni batteri che producono la spora batterica, è una sorta di difesa da un ambiente avverso e che permette al batterio di sopravvivere in un blocco metabolico (poi se le condizioni ambientali tornano idonee queste spore tornano cellule metabolicamente attive).
Il quorum sensing è definito come un sistema di regolazione trascrizionale/sistema di comunicazione chimico attuato da batteri della stessa specie attuato quando si arriva ad un certo livello di unità (processo di trascrizione) che si basa sulla densità delle cellule ed è usato dalle cellule per comunicare tra loro attraverso molecole-segnale. Il quorum sensing si vede nella produzione di un biofilm.
Lezione 3
Dal punto di vista ambientale ci sono altri fenomeni che vengono caratterizzati dall’ambiente stesso verso un microrganismo e uno di questi è la chemiotassi : è un particolare fenomeno che fa sì che i batteri dotati di appendici (i flagelli – non tutti i batteri hanno i flagelli) possano muoversi verso la fonte ricca di una determinata sostanza chimica (se questa è favorevole, ad esempio un principio nutritivo utile al batterio) oppure di allontanarsi da essa (se fosse una sostanza tossica).
Un altro fenomeno che rende importante l’interazione con l’ambiente, o meglio un fenomeno che determina la pressione ambientale, è la capacità di trasformarsi, cioè si è visto che l’ambiente può determinare modificazioni
in ambienti molto freddi ecc.); in sostanza gli Archaea hanno una struttura che gli consente di vivere in condizioni/ambienti estreme/rigidi, infatti vengono definiti microrganismi estremofili.
Eukarya sono tutti gli altri organismi: animali, piante, funghi, protozoi e alghe; hanno tante differenze rispetto agli altri e sono anche loro ubiquitari.
Come si è passati dal Dominio dei Bacteria, piuttosto che da quello degli Archaea, a quello degli Eukarya? Ci sono diversi fattori che si possono considerare validi:
- Spinta genetica verticale: la pressione ambientale può aver determinato un’accelerazione alla riproduzione delle cellule e che ha portato a delle mutazioni a livello genetico, questi errori non sono stati dannosi per le cellule e sono state trasferite dalla cellula madre alle cellule figlie (trasferimento verticale di geni da una generazione all'altra).
- Trasferimento di porzioni genomiche: alcuni organismi hanno imparato a scambiarsi sequenze genetiche, forse per necessità nutritiva e hanno quindi iniziato ad incorporare genoma estraneo forza orizzontale. In questo modo se questi pezzi i genoma venivano integrati nel genoma della cellula ricevente potevano trasformarla, rendendola più stabile ed efficace.
Teorie simbiotiche: (vedi slide)
Il passaggio dai batteri Archaea agli Eukarya è stato dettato dalla fame: alcuni batteri anaerobi eterotrofi si sono evoluti per diventare autotrofi, sia per quanto riguarda alle sostanze organiche sia per quanto riguarda l’energia diventarono batteri fotosintetici.
I batteri fotosintetici liberano Ossigeno e questo determinò un ulteriore specializzazione di alcuni batteri che divennero aerobi.
In un dato momento della vita sulla terra c’erano tre tipologie batteriche: batteri eterotrofi anaerobi, batteri fotosintetici e batteri aerobi; questo complicava di più le cose (lotta per la vita) e questo portò al fatto che i batteri più aggressivi inglobassero gli altri (i batteri più aggressivi erano i batteri anaerobi eterotrofi, iniziarono ad inglobare i batteri aerobi e da lì derivò una nuova tipologia di cellule, le cellule eucariote – i batteri aerobi si trasformarono in mitocondri – di tipo animale; poi dopo vengono incamerati anche i batteri fotosintetici derivarono così le cellule vegetali – batteri fotosintetici si trasformarono in cloroplasti).
Ordine gerarchico: Dominio, Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere, Specie.
I microbiologi vanno a studiare soprattutto 2 aspetti del microrganismo: aspetti fenotipici e aspetti genotipici.
Tassonomia convenzionale (detta anche “tassonomia fenotipica”): tassonomia basata su aspetti fenotipici
Studiare i microrganismi dal punto di vista fenotipico vuol dire andare rilevare diversi aspetti dell’organismo stesso, quindi si vanno a studiare:
Aspetti morfologici: a livello microscopico: andrò a guardare al microscopio la forma della singola cellula (se è rotonda, bastoncellare ecc.) poi vado a vedere quando si riproducono e come si aggregano nello spazio (distinzione tra stafilococchi e streptococchi per esempio); poi l’aspetto morfologico può essere anche la presenza di appendici cellulari, poi posso vedere le caratteristiche tintoriali (quale colorazioni prendono: differenza tra batteri Gram + o Gram -), poi un altro aspetto morfologico è quello di produrre spore. A livello macroscopico invece andrò a guardare le colonie.
Aspetti fisiologici: vado a vedere l’interazione diretta con l’ambiente, cioè valutare la risposta della cellula ad una determinata temperatura ad esempio; l’esigenza gassosa (batteri che si riproducono in presenza di ossigeno e batteri che invece non usano l’ossigeno).
Aspetti biochimico: vado a vedere l’attività enzimatiche, cioè ad esempio che alcuni organismi sono capaci di metabolizzare determinati zuccheri mentre altri non sono capaci; interazioni con altri substrati (capacità di metabolizzare sostanze grasse oppure no – le lipasi); la capacità di produrre tossine (se si tratta di organismi patogeni).
Aspetti immunologici: vado a studiare gli antigeni di superficie di un microrganismo, cioè vado a studiare quelle macromolecole presenti nella struttura della cellule che inducono una risposta di tipo immunitario (es: la proteina Spike).
Due categorie tassonomiche tipiche: la Specie (categoria tassonomica che contiene un insieme coerente di organismi che presentano un elevato grado di immunologia, cioè di somiglianze a livello fenotipico – nelle varie sottoclassi) e il Genere (specie differenti tra di loro correlate sempre su base fenotipica).
Esisto anche le sottospecie, le cosiddette Sierotipo (o ceppo) e sono ad esempio batteri di una determinata specie ma che presentano variazioni a livello cromosomico o extracromosomico (ad esempio nei plasmidi), parliamo sempre di DNA. Perciò mentre il Genere e la Specie le posso valutare con uno studio di Tassonomia convenzionale, quindi basata su aspetti fenotipici, il Sierotipo no, bisogna applicare la tassonomia genotipica.
Identificazione: vedi schema su slide e magari anche la lezione
Escherichia coli è un commensale (batterio che vive all’interno del nostro organismo, non ci creano danno ma ne traggono beneficio), ma è comunque un batterio molto diffuso nell’ambiente.
Come faccio a identificarlo se lo sospetto come agente contaminante di un substrato?
Coltura del substrato e isolamento del batterio in coltura pura Colorazione di Gram (vado a vedere le caratteristiche tintoriali) Se mi da una risposta positiva, cioè che la colorazione mi informa che si tratta di un batterio Gram -, allora valuterò la forma Dopo gli aspetti morfologici si valutano gli aspetti fisiologici (esigenze gassose: anaerobio o aerobio) Valutazione di tipo biochimico (es: se è capace di fermentare particolari zuccheri – cosa che sa fare solo l’E. coli a differenza degli altri enterobatteri, fermenta il lattosio) Applico altri test biochimici
Si procede quindi per verifiche dicotomiche, cioè positivo o negativo.
Questa è la normale prassi di laboratorio, se non fosse sufficiente allora posso andare a fare l’analisi chimica dei componenti strutturali della cellula (e i componenti strutturali sono riferibili ad una specie piuttosto che un’altra).
Sempre a livello fenotipico posso far un ulteriore passo per essere più certi della specie microbica ed è la valutazione della GC ratio , cioè che si va a valutare a livello di diversi organismi la percentuale di Guanina e Citosina (le basi azotate), rispetto ad un organismo noto (quindi anche questa è un analisi di tipo chimica): si è visto che batteri o microrganismi che hanno un’ugual percentuale di Guanina e Citosina sono batteri della stessa specie, in realtà non è sempre così:
Fenotipi simili e % simile di GC Organismi con fenotipo correlabile non sempre hanno uguale contenuto di GC Stessa % di GC classificazione
Quindi questa valutazione è un’informazione aggiuntiva ma non sicuramente univoca.
Esempio: vedi immagini e lezione (batteri dello stesso Genere ma di diversa Specie: sono entrambi batteri sporigeni, batteri che producono tossine, solo che hanno effetti completamente diversi se ingeriti, il primo ha effetto emetico e diarroico, il secondo non provoca intossicazione nell’uomo).
Tassonomia Genotipica:
o Analisi del RNA
o Ibridazione DNA/DNA: si va a confrontare il genoma, cioè le sequenze nucleotidiche del genoma di un batterio ignoto con un altro batterio già studiato e sequenziato (un batterio comparatore) e se, grazie alla reazione di ibridazione, presentano un grado di omologia (un grado di corrispondenza diciamo) pari o superiore al 70% allora questi batteri apparterranno alla stessa specie.
Osservazione microscopica:
si partirà dall’osservazione da un microscopio ottico che ci permette di valutare aspetti di tipo morfologico:
Forma (bacilli ecc.), dimensione (i lieviti sono più grossi dei batteri per esempio), aggregazione cellulare (in base a come si aggregano le cellule posso avere un’indicazione del genere batterico). Caratteristiche tintoriali (significa applicare una determinata colorazione che mi permette di valutare i microrganismi, in particolare i batteri, dal punto di vista delle classi – potrei avere un Gram + piuttosto che un Gram - o addirittura i micobatteri, va a colorarsi la parete delle cellule). Appendice (es: flagelli), motilità , capsula (è un ulteriore fattore di protezioni che non tutti i batteri possono produrla) ecc. Conteggio (quello che si valuta sulla piastra è il conteggio vitale – cioè i microrganismi che sono ancora attivi a livello metabolico, che di conseguenza messi in una piastra danno alla riproduzione cellulare. Con il microscopio ottico vedo sì le cellule, ma il conteggio a livello microscopico è un conteggio totale – sia vivi che morti/stressati). Purezza della coltura microbica (Postulati di Kock: ogni agente patogeno dev’essere isolabile in coltura pura, cioè che se individuassi una malattia di origine microbica – batterica ad esempio – devo poter capire quale sia l’agente eziologico, cioè la causa vera e propria, se vedo più tipi di cellule allora vuol dire che la coltura non è pura).
Due tipologie principali di microscopio ottico: i microscopi semplici e i microscopi composti ; i primi hanno solo
un ordine di lenti che ingrandivano il campione, i secondi hanno più ordini di lenti ( vedi immagine su slide : possiedono un revolver, cioè una sorta di porta obbiettivi, e questi obbiettivi hanno ingrandimento differente, e hanno due oculari (che già loro hanno un ingrandimento di 10x); l’ingrandimento finale quindi sarà dato dall’interazione tra l’obbiettivo che scelgo e l’oculare). La distanza tra l’obbiettivo e il vetrino è inversamente proporzionale all’ingrandimento (più mi avvicino più sarà grande quello che vedo). Nel microscopio ottico abbiamo un condensatore ottico e la parte sottostante una lampada alogena che produce un fascio di fotoni in un range pari a 400-500 nm. L’obiettivo da 100x si usa di solito per le colorazioni.
Fare osservazione in:
Campo chiaro : il fascio luminoso attraversa direttamente il vetrino con la mia sospensione microbica (si utilizza per preparati che vanno colorati, quindi per osservare il campione dopo colorazione) condensatore aperto, quindi la luce colpirà perpendicolarmente il campione. Campo scuro : la luce non attraversa direttamente il vetrino, ma grazie al condensatore colpirà lateralmente il vetrino, quindi le cellule appaiono luminose e quindi visibili. Questo tipo di osservazione permette la visualizzazione di quei microrganismi, tipicamente batteri, che sono molto piccoli dimensionalmente (diametro molto piccolo), difficilmente colorabili e che quindi non riuscirei a vederli bene in campo chiaro ( Leptospira interrogans - la leptospirosi, la malattia dei porcai o febbre delle 7 notti che si trasmette con la saliva o urina degli animali – domestici e selvatici – arriva all’uomo se l’uomo ha delle abrasioni/graffi in cui possono penetrare e andare in circolo; gli effetti tipici sono febbre e dolori articolari, ma può dare anche problema al fegato, esantema, polmonite gravi e meningiti l’intensità della malattia e dei sintomi dipende da quanti microrganismi sono passati all’ospite). Contrasto di fase : (forse la più utilizzata nella prassi di laboratorio se non si deve utilizzare la colorazione) si vedono i microrganismi scuri su un fondo chiaro, perché il condensatore agisce sul fascio luminoso scindendo i raggi diretti dai raggi difratti, con un ritardo di circa un quarto di lunghezza d’onda (utile per vedere le dimensioni dei microrganismi e se i microrganismi hanno delle spore).
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA: differisce dal microscopio ottico per la fonte luminosa (no lampada alogena ma lampada a raggi ultravioletti + filtro colorato per non danneggiare gli occhi) e si usano sostanze/coloranti fluorescenti sul campione prima di analizzarlo (per indentificare patogeni) e ha una grande valenza nell’immunologia (perché riesco a vedere il legame tra l’anticorpo e l’antigene (reazione antigene-anticorpo) di un determinato microrganismo – l’antigene è quella parte della macromolecola del microrganismo che stimola l’azione del sistema immunitario).
STEREOMICROSCOPIO: (si usa nella micologia applicata = micologia è quella parte della microbiologia che studia i funghi) differisce per il fatto che gli oculari e gli obiettivi sono indipendenti (mi permette di vedere i campioni in maniera tridimensionale).
Colorazioni microbiche:
Prima cosa devo depositare una goccia della mia sospensione microbica (derivante ad esempio da una coltura o da un campione di pus prelevato da un paziente) su un vetrino, poi devo “fissare” il campione sul vetrino, ovvero prendere il vetrino e metterlo a contatto con dell’aria calda oppure portarlo su una fiamma (tenendo però il vetrino non troppo vicino alla fiamma, se no il vetrino esplode) così facendo evapora l’acqua nella quale sono sospesi i microrganismi e così si fissano/incollano, poi metto il colorante e lo lascio agire, allontano l’eccesso di colorante e poi effettua un’ osservazione per immersione (cioè che prendo l’obbiettivo del microscopio ottico a più alto grado di risoluzione, quello da 100x, e lo immergo in una goccia di olio di paraffina che mi permette di ridurre i disturbi durante la visione del campione e migliora la risoluzione - riduce la dispersione della luce e quindi migliora la qualità visiva).
La colorazione è importante perché mi permette di evidenziare un agente microbico dal resto del campione o di intuire e di classificare i microrganismi in base alla parete cellulare.
Tipi di colorazione:
Colorazioni semplici (utilizzo un approccio monocromatico, utilizzo un solo colorante perché voglio distinguere i miei microrganismi dal campione organico). Coloranti differenziali (usare in sequenza più coloranti, che mi aiutano a distinguere e studiare batteri con aggregazioni o forma simili, oppure mi permettono di evidenziare le caratteristiche strutturali - della parete cellulare).
Tipi di coloranti:
Coloranti basici: il blu di metilene, cristal violetto e la safranina (sono molto utilizzati in batteriologia perché i coloranti basici hanno una grande affinità con gli acidi nucleici ). Coloranti acidi: interagiscono meglio con il citoplasma il rosso congo, la fuxina acida. Coloranti neutri: è un mix tra i due.
A seconda del microrganismo posso utilizzare (colorazioni principali):
Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Colorazione di Schaeffer-Fulton Colorazione di Loeffler Colorazione di Gimenez
Colorazione di Gram:
Importante sia nel processo di identificazione, quindi nel processo tassonomico, che a livello diagnostico: posso distinguere i batteri Gram positivi o Gram negativi.
Come funziona: prendo il campione e lo fisso su vetrino fase 1: uso un colorante basico (blu di metilene o cristal violetto), perché i coloranti basici sono molto affini agli acidi nucleici (il DNA dei batteri è sparso nel citoplasma, quindi è facile legarsi ad esso) aspetto qualche secondo/minuto e poi allontano l’eccesso, una volta colorato aggiungo una particolare soluzione colorata che si chiama “ soluzione di Lugol ”, è una soluzione iodio iodurata (è iodio e ioduro di potassio): lo iodio contenuto nella soluzione si complessi con il colorante primario (cioè il colorante basico) nella struttura della cellula batterica, in poche parole serve per fissare meglio il colorante primario, infatti la soluzione di Lugol viene detta anche “mordenzante” (che significa “far legar meglio i componenti”). Una volta utilizzata la soluzione di Lugol e dopo aver allontanato l’eccesso di soluzione, procedo con la fase di decolorazione (fase 3) e decoloro con un solvente organico (alcol etilico – etanolo – oppure l’acetone), lo deposito sul vetrino, lo lascio agire per qualche secondo e poi lavo con acqua distillata; dopo questa fase di lavaggio succede che, se nel mio campione sono presenti batteri con struttura della parete differente (quindi gram + e gram -) alcune cellule rimarranno colorate del colore del colorante primario (di blu – Gram +) altre cellule (i Gram -) rimangono decolorate. Per evidenziare le cellule rimaste decolorate (se sono presenti) dovrò procedere con la fase 4 e trattare con un colorante di contrasto, la safranina, e i Gram - saranno colorati di rosso/rosa, mentre i Gram + rimarranno colorati di blu.
Questo batterio si dice che è Gram variabile (si fa fatica ad identificarlo con la colorazione di Gram perché a volte risulta Gram + e a volte no), perciò a Loeffler gli venne in mente prima di tutto di mettere a punto un substrato di crescita in modo che acquisisse una particolare acidità: nella tecnica di Loeffler quindi prima di tutto si deve coltivare l’agente patogeno in un terreno contenente brodo glucosato (cioè contenente zuccheri) che determina un metabolismo fermentativo di questi batteri e che quindi liberano acidi (la parete cellulare/la superficie del batterio si acidificava); liberando acidi queste cellule sono facilmente trattabili con un colorante basico (semplicemente il blu di metilene). Dopo questa procedura si riconosce facilmente l’agente eziologico della Difterite perché hanno una distribuzione “a ideogrammi cinesi” (come se fossero lettere cinesi dell’alfabeto) e in più si nota che le singole cellule hanno un’estremità più grossa rispetto all’altra ( struttura clavata ).
Colorazione di Gimenez:
Le zecche sono vettori di un batterio che appartengono al genere delle Rickettsiae (trasmissione indiretta): dal punto di vista evolutivo si possono considerare il punto di collegamento tra batteri e virus sono di dimensione più piccole rispetto ai batteri classici, sono dei parassiti intracellulari (hanno bisogno di entrare nella cellula ospite per riprodursi) e poi dopo essersi riprodotte all’interno della cellula ospite possono sopravvivere nell’ambiente esterno; causano la febbre bottonosa del Mediterraneo o febbre delle montagne rocciose (in America), gli effetti sono: esantema puntiforme che si allarga (intorno alla zone dove il soggetto è stato punto dalla zecca), forma febbrile e dolori articolari. Per identificare questi batteri utilizzo questa colorazione che consiste nell’utilizzo prima il colorante fucsina fenicata , che colora di rosso il batterio all’interno della cellula, allontano l’eccesso di colorante e poi utilizzo il verde di malachite , per evidenziare la presenza all’interno delle cellule (se il verde di malachite si lascia esposto all’aria per qualche secondo dal verde vira al blu); quindi alla fine il risultato sarà che si vedrà cellule rosse batteriche all’interno di cellule eucariote blu.
Microscopio elettronico:
Speso però la colorazione non è sufficiente per studiare alcune particolarità dei microrganismi (batteri compresi), quindi se voglio attuare un’indagine “ultrastrutturale” delle componenti batteriche e studiare microrganismi più piccoli dei batteri (virus) dovrò utilizzare il microscopio elettronico.
Differenze tra microscopio ottico e quello elettronico: classica domanda che fa all’esame
Lenti ottico sono in vetro mentre in quello elettronico sono lenti elettromagnetiche. Fascio luminoso nell’ottico il fascio luminoso che illumina il campione sono fotoni (prodotti dalla lampada alogena), nell’elettronico è un fascio di elettroni (i fotoni hanno lunghezza d’onda più alta rispetto agli elettroni, e di conseguenza la capacità di risoluzione è più bassa – inversamente proporzionale). L’ingrandimento il microscopio elettronico ingrandisce di più, perché il fascio luminoso è un fascio di elettroni, che ha lunghezza d’onda minore rispetto al fascio di fotoni, e quindi ha una maggior risoluzione. Fissazione del campione nell’ottico si mette una goccia sul vetrino e si fissa su fiamma, nell’elettronico invece il campione deve essere intrappolato in un aresina sintetica e poi bisogna tagliare delle sottili sezioni e si tratta il campione impregnandolo di Sali di metalli pesanti: Sali di piombo, di uranio ecc. oppure in alcuni casi si usa ricoprire il campione con metalli nobili, come l’oro o il platino – questo perché si ha una miglior interazione degli elettroni con le strutture biologiche del microrganismo).
Due tipi di microscopi elettronici: TEM e SEM
Microscopio Elettronico a Trasmissione:
Una volta fissato il campione, il fascio di elettroni va a colpire il campione: il fascio di elettroni, interagendo con il campione biologico intrappolato nei Sali di metallo pesante viene deviato dalle strutture biologiche stesse; il fascio deviato viene poi raccolto su uno schermo fluorescente o su una lastra fotografica; l’immagine sarà un’immagine ingrandita del campione bidimensionale.
Microscopio Elettronico a Scansione:
Utilizza sempre un fascio di elettroni, ma quando si bombarda il campione biologico ricoperto ad esempio da oro o platino, fa sì che si scansioni il campione (il fascio va avanti e indietro, fascio ad intermittenza) e determina sul campione biologico l’emissione di elettroni secondari, quest’ultimi vengono raccolti su un sistema collettore che poi
verrà proiettata l’immagine; il microscopio SEM permette una miglior interazione con il campione, nel senso che si ha un’immagine tridimensionale.
STEM: Microcopio Elettronico a Trasmissione e Scansione (unisce le caratteristiche migliori dei due microscopi, si può arrivare ad ingrandimenti maggiori).
La classificazione più semplice si basa sulla forma (morfologia cellulare) e si distinguono:
Cocchi se le singole cellule sono di forma sferica. Bacilli se sono a forma bastoncellare lineari (es: E. coli). Spirilli e Spirochete se sono rispettivamente a forma di bastoncello incurvato o spirularizzato. Vibrioni bastoncelli a forma di virgola.
Diverse tipologie di aggregazione: i cocchi sono di forma sferica e possono trovarsi isolati, a coppie ( diplococchi ),
a catena ( streptococchi ), a grappolo ( stafilococchi ) o a gruppi di otto cellule in uno spaio cubico ( sarcine ) tutto questo dipende dall’asse di riproduzione (es: se ho a che fare con gli streptococchi, le cellule si riproducono su un solo piano, in maniera lineare, e quindi avrò una serie di catenelle).
Gli streptococchi hanno diverse proprietà metaboliche che possono essere evidenziate facilmente utilizzando un particolare terreno di coltura che si chiama “ Agar sangue ”, un terreno agarizzato in cui si aggiunge del sangue che può essere di pecora o di cavallo; con questo terreno posso identificare caratteristiche di specie differenti di streptococchi, si dividono in 3 gruppi principali:
- α emolitici (streptococchi viridanti) sono verdognoli e con un margine regolare (quindi parziale emolisi).
- β emolitici attorno alle colonie si ha una totale rottura degli eritrociti e questo provoca la formazione di un alone più chiaro attorno alla colonia e sono a margini netti (quindi totale emolisi).
- non emolitici ( emolitici) streptococchi che interagendo con il terreno di Agar sangue non provocano la rottura totale degli eritrociti attorno alle colonie che si sviluppano sul terreno, ma su una parziale emolisi perché liberano acqua ossigenata (non hanno azione emolitica sull’agar sangue).
Dal punto di vista della visione più tipica, gli streptococchi sono batteri gram positivi a forma sferica, distribuzione a catenella, sono anaerobi facoltativi (la presenza o l’assenza di ossigeno per il loro metabolismo è indifferente, perchè hanno un metabolismo fermentativo – non utilizzano ossigeno), sono batteri immobili (no flagelli) e asporigeni, però producono spesso la capsula sono suddivisi in 8 gruppi ( vedi slide: i primi cinque contengono streptococchi α emolitici, i gruppi 6 e 7 sono β emolitici).
S. pyogenes:
Patogeno che provoca pus, ha caratteristica importante a livello tassonomico perchè sono presenti più di 100 sierotipi differenti (quindi vuol dire che ci sono più di 100 sottospecie), questo rende difficile mettere appunto un vaccino completamente efficacie (la malattia tipica di questo batterio è la Scarlattina).
Dal punto di vista pratico, la variabile sierotipizzante è una proteina di superficie che si chiama proteina M : si trova sulla superficie della parete cellulare e ha patogenicità importante perché questa proteina impedisce il processo di fagocitosi (o comunque lo riduce) da parte dei fagociti; in più la proteina forma un particolare componente della parete cellulare, che sono gli acidi telcoici, una sorta di intreccio che da origine a delle microfibrille (una sorte di peluria) e sono importanti perché permettono una migliori adesione alle cellule batteriche alle mucose dell’ospite o alle cellule epiteliali. Un altro fattore di patogenicità importante, oltre la proteina M, è il fatto che produce la capsula fatta di acido ialuronico (molto importante perché questo aggiunge un fattore mimetico per queste cellule perché l’acido ialuronico, a livello del nostro organismo, è un componente del nostro tessuto connettivo).
Lezione 5
Questi tipi di batteri, gli streptococchi, si chiamano così perché le singole cellule (i cocchi) si riproducono stando sul medesimo piano (formano delle catenelle), se però i batteri di morfologia sferica danno luogo a riproduzione su più direzioni dello spazio allora avrò altri generi batterici: i cocchi più importanti che si riproducono su più piani, in
maniera irregolare, sono gli Stafilococchi.
Stafilococchi
Gli stafilococchi si riproducono su diversi piani (ricordano dei grappoli d’uva – perché “stafilo” deriva da una parola in greco che vuol dire “grappolo”).
Gli stafilococchi sono stati individuati e studiati per la prima volta da un medico scozzese, Alexander Ogston (1881): notò che questi batteri erano molto contagiosi e notò anche che questi stafilococchi possono essere presentarsi sulla pelle senza dare alcuni problemi all’apparenza.
Caratteristiche degli Stafilococchi:
Batteri con morfologia sferica delle singole cellule, si distribuiscono in maniera irregolare in un terreno di coltura (di solito danno degli aggregati che assomigliano a grappoli d’uva). Gram + Le singole cellule hanno una dimensione intorno al m (micrometro) Sono asporigeni Sono batteri immobili (no flagelli) come gli Streptococchi Possono produrre la capsula Sono batteri che possono crescere in ambiente ricco di ossigeno (e quindi utilizzarlo metabolismo ossidativo e verranno detti “batteri aerobi”) oppure possono anche farne a meno (verranno detti “anaerobi facoltativi”) gli Streptococchi invece sono solo anaerobi facoltativi.
Ad oggi sono state isolate 40 specie di Stafilococchi Staphylococcus aureus (la specie più aggressiva e pericolosa, patogeno obbligato ; ha una caratteristica tipica che si evidenzia nei terreni di coltura: sviluppa delle colonie, visibili ad occhio nudo, giallo dorate/giallo arancione perché produce la zeaxantina, un carotenoide, che ha un importante ruolo fisiologico, cioè è un fattore che può danneggiare i nostri neutrofili fattore di virulenza – solo lo S. aureus fa così, gli altri stafilococchi sono incolore); Staphylococcus epidermidis (vedi poi tabellina su slide).
Mannitol salt-agar: oltre a contenere sale (di cui gli stafilococchi sono ghiotti), contiene mannitolo (zucchero che riesce a fermentare solo stafilococco aureus).
Favo/favi: fusione di più foruncoli insieme che poi formano un nodulo che si deve togliere per forza chirurgicamente.
Fattori di virulenza/patogenicita dello S. aureus (si chiama “aureus” perché produce una sostanza colorata che serve per
proteggersi dagli attacchi dei globuli bianchi)
Coagulasi o Clumping factor fattore aggregante del sangue, è un enzima (proteina di superficie) che coagula il sangue, cioè la capacità di trasformare il fibrinogeno in fibrina e quindi di formare dei micro- coaguli intorno alle cellule batteriche (è un fattore mimetico dal sistema immunitario di questo batterio; è un modo per potersi riprodurre più tranquillamente). Stafilochinasi enzimi che sciolgono il coagulo: una volta che il batterio si è rivestito con il coagulo, si riproduce e poi avanza nell’organismo e per farlo il coagulo deve sciogliersi, grazie appunto a questi enzimi. Catalasi viene liberata quando gli stafilococchi vengono fagocitati: quando un microrganismo viene fagocitato si produce acqua ossigenata per eliminarlo, per cui viene liberata la catalasi proprio perché è in grado di scindere l’acqua ossigenata in acqua e ossigeno (quindi è un fattore che permette al batterio di vivere all’interno dei fagociti). Lipasi sono enzimi che sciolgono/demoliscono i grassi/lipidi: consente di colonizzare le ghiandole sebacee, permettono di sciogliere i grassi anche in altre parti del corpo, quindi è un fattore di diffusione di questi microrganismi. Ialuronidasi altro fattore di diffusione, perché demolisce l’acido ialuronico presente nel tessuto connettivo. Capsula fattore importante di patogenicità: esistono 11 sierotipi differenti proprio in base alla composizione della capsula; con essa possono aderire meglio ad un tessuto (anche a superficie inerti e quindi formare un biofilm) e poi permette protezione contro l’aggressione esterna o dalla fagocitosi.
Proteina A proteina di superficie (è quindi presente sulla superficie del batterio): ha la capacità di legare una parte dell’immunoglobuline G (che hanno un ruolo molto importante nell’eliminazione dei microrganismi), il cosiddetto “frammento cristallizzabile”, acchiappa quindi gli anticorpi (fanno questo per mascherarsi e quindi ricoprendosi di anticorpi non viene riconosciuto dal sistema immunitario, si mimetizza). Peptidoglicano caratteristico dei tuti i Gram +; può dar luogo a fenomeni di infiammazione nell’ospite (rialzo febbrile). Tossina esfoliativa è quella tossina liberata dallo stafilococco che provoca la “sindrome da cute ustionata”, provoca uno scollamento degli strati superficiali dell’epidermide (demolisce i desmosomi, cioè le giunzioni dell’epidermide). Tossina 1 (TSST-1) causano una sindrome da shock tossico, deriva da una penetrazione di una ferita o scarsa igiene (ad esempio quella vaginale). Antibiotico resistenza (vale per tutti gli Stafilococchi)
Alcuni effetti dello S. aureus:
- Impetigine bollosa infezione della cute, si formano vescicole piene di pus/siero e con un elevato contenuto di batteri.
- La follicolite (orziolo)
- Tossifezioni alimentari (con conseguente attività peristaltica)
Cocchi (STD) vedi immagine su slide: cocchi “a chicco di caffè”, il batterio in questione è un Gram - e una specie
appartenente a questa specie batterica è classificata come “STD” (= sta per “malattie a trasmissione sessuale” (acronimo in inglese)); utilizzo dell’Agar cioccolato: contiene sangue cotto (è un terreno che viene prima scaldato perché servono per quei batteri che non riescono a spaccare la membrana degli eritrociti, perciò l’agar sangue viene “cotto” così già da spaccare la membrana degli eritrociti – l’agar sangue fresco viene usato per quei batteri che riescono a rompere le pareti degli eritrociti) il batterio in questione è Neisseria gonorree (agente eziologico della Gonorrea).
L’altra specie ancora più pericolosa perché è mortale è la Neisseria meningitidis :
Agente eziologico principale, insieme a Streptococco pneumonie e Emofilus enfluenze, della Meningite cerebrale epidemica. Ha due fattori di virulenza importanti: essendo un Gram -, possiede una componente strutturale che è l’ endotossina batterica , componente della parte più esterna della parete cellulare (può danneggiare a livello dei vasi sanguigni); in più possiede delle appendici cellulari molto forti, pili di tipo 4 (forza enorme di tensione e torsione alle cellule a cui si attaccano). Oltre a questi due possiede un altro fattore di virulenza, che è anche un fattore sierotipizzante, che è la capsula (permette di suddividere questo batterio patogeno in diversi sierotipi: sierotipo A, B , C , Y e W135 – su questi sierotipi sono stati derivati dei vaccini efficaci).
Bacilli
La morfologia bastoncellare è la forma più diffusa nei batteri; i bacilli possono essere singoli (lineari) o anche aggregati (a coppie: diplobacilli ; a catena: streptobacilli ) possono essere dei bacilli un po’ più tozzi che vengono chiamati coccobacilli (sembrano dei semini), possono essere a forma di virgola e vengono chiamati vibrioni , oppure si hanno più incurvature della cellula batterica: se sono poche si parla di spirilli , se la spiralizzazione è più importante si parla di spirochete.
Una delle famiglie batteriche più numerose, quindi quella con il maggior numero di specie nel mondo dei bacilli, è la famiglia delle Enterobacteriaceae sono batteri mobili (a differenza dei cocchi) di forma bastoncellare e hanno poche esigenze nutrizionali, sono dei Gram - e asporigeni, dal punto di vista metabolico gli enterobatteri sono aerobi e anaerobi facoltativi (duplice metabolismo, a seconda che ci sia o meno l’ossigeno dell’ambiente), sono ghiotti di zuccheri, quindi facili da coltivare e sono molto diffusi a livello ambientale (proprio perché non hanno particolari esigenze a livello nutrizionale). Dal punto di vista della tassonomia ci sono 40 Generi diversi, 20 specie importanti dal punto di vista clinico perché gli enterobatteri in generali possono essere dei commensali del nostro intestino, però possono creare alcuni problemi di salute a seconda proprio del fatto che inducano sempre una malattia oppure no, vengono suddivisi in 2 gruppi:
E. coli enteroaggreganti (EAEC) liberato particolari tipi di tossine hanno una funzione infettiva per l’organismo sempre a livello intestinali; liberano tossine LT e le ST (gli effetti sono gli stessi ma la differenza tra i due è che le tossine LT hanno un meccanismo siile alla tossina colerica – un po’ meno potente – le ST hanno un’azione simile alla salmonella). E. coli enteroinvasivi (EIEC) sono sottospecie di Escherichia coli (cioè sierotipi di E. coli) che causano fenomeni differenti (vanno dalle gastroenteriti piuttosto che dissenteria o diarree profuse); hanno a livello dell’appendici, delle adesine , che le consentono di aderire/colonizzare bene l’intestino tenue e in questo modo alterano/bloccano le funzionalità dell’organo. E. coli enterotossigeni classici vengono suddivisi in 2 tipologie principali: o ETEC vengono chiamati così perché liberano 2 tipologia di tossine: tossine LT (acronimo inglese che sta per “tossine instabili al calore” – quindi se del cibo è contaminato basta scaldarlo per eliminarle) e le tossine ST (che sta per “tossine stabili al calore”); gli effetti di queste 2 tossine sono gli stessi (provocano gastroenteriti pesanti e la cosiddetta “diarrea del viaggiatore”), ma la differenza di questi due, oltre al fatto della termoresistenza, è che le tossine LT hanno un meccanismo simile alla tossina colerica per quanto riguarda all’effetto sull’ospite (sono un po’ meno potenti) e le tossine ST hanno un effetto simile alle tossine della salmonella: semplicemente nel corso degli anni questi microrganismi hanno acquisito geni codificanti per queste due tossine, la LT e la ST, venendo a contatto ravvicinato con questi batteri, quindi con vibrocolere e salmonella. o E. coli enteroemorragici ( EHEC ) ceppo tipico dei paesi industrializzati che provoca colite emorragica e la sindrome SEU (euremico-emolitica); questo ceppo produce una tossina particolare che si chiama SLT (sono tossine con meccanismo simile ad una tossina prodotta da un altro enterobatterio, la Dissigella dissenteri , patogeno franco/obbligato, provoca emorragie intestinali e danni a livello renale nel caso della sindrome SEU) Sono sierotipi di E. coli che non sono dei commensali (come anche gli altri), ma liberando particolari tipi di tossine hanno un’azione infettiva nei confronti dell’organismo (sempre a livello intestinale).
Quindi ricapitolando : questi patogeni intestinali possono agire o grazie a particolari adesine, cioè sostanze proteiche sulle appendici che gli permetto di colonizzare tratti dell’intestino (tenue), e questo si tratta dei primi 3 ceppi nominati, che danno problemi gastroenterici e diarrea molto marcata; oppure ci sono dei ceppi che producono tossine derivanti da altri microrganismi.
Ci sono anche dei ceppi extraintestinali , cioè sono patogeni non classici commensali ma derivanti per esempio da un’alimentazione non corretta o cibi contaminati che possono dar luogo a sindrome infiammatoria e infettiva a livello dell’apparato urinario e possono causare Pielonefriti (infezioni a carico dei reni, pericolose perché i batteri possono entrare in circolo). Poi ci sono ceppi denominati con l’acronimo NMEC (quelli che causano le meningiti anche a livello infantile).
Quindi per chiudere il cerchio dei patogeni possiamo dire che ci sono:
- Quelli classici intestinali (i 5 iniziali)
- Quelli extraintestinali (a livello dell’apparato urinario piuttosto che a livello cerebrale, cioè che causano meningiti).
Pseudomonas aeruginosa
“Pseudomonas” dovrebbe dire “falsa singola unità”; è un bacillo Gram - , dal punto di vista fisiologico è un aerobio e anaerobio facoltativo ed è un batterio mobile ( bacillo monotrico , cioè che ha un flagello e grazie a questo si muove rapidamente); si può osservare al microscopio ottico e al microscopio elettronico (SEM) oppure su un terreno di coltura dove produce un pigmento verdastro. Si chiama “aeruginosa” per indicare il colore verdastro che produce quando cresce in un terreno di coltura, un pigmento che produce questa determinata specie che si chiama piocianina , o certe volte anche pioverdina , e ha un’importante funzione a livello della colonizzazione di un substrato perché questa piocianina funziona come una sostanza antibiotica (cioè antimicrobica) perché in questo modo riesce a prevalere sulla crescita degli altri microrganismi e ricevere più facilmente il nutrimento che gli serve. È un patogeno opportunista che in genere porta poche infezioni urinarie, però ha molta capacità invasiva. Batterio ubiquitario
(acqua, aria e suolo), è un batterio che ha una grande capacità di adattamento, gli servono poche cose per nutrirsi (sostanze organiche) e può produrre la capsula.
I fattori di patogenicità/virulenza:
A livello strutturale: lipopolisaccaride (è un componente strutturale della parte più esterna della parete cellulare dei Gram - ed ha un’azione tossica: la parte tossica è la parte bassa che prende il nome di “lipide A” ed è infatti un’endotossina, è molto infiammatoria, cioè che porta febbre, ma se è molto concentratat può portare a shock settico) o le fimbrie (sono delle appendici/delle adesine che permettono l’adesione al batterio in determinati substrati dell’ospite; nel caso appunto di P. aeruginosa permettono di colonizzare in maniera efficace, oltre che a livello urinario, soprattutto nel substrato polmonare (fibrosi cistica ceppo mucoide, un sierotipo di P. aeruginosa)). A livello metabolico: Esotossina due tipi: esotossina Eta (azione pantropa = quando queste tossine arrivano alle nostre cellule bloccano la loro sintesi proteica, che quindi porta alla necrosi e morte cellulare; bersagli tipici: cellule epatiche, endoteliali ed epiteliali) ed esotossina S (agisce a livello del sistema immunitario contro i macrofagi: può danneggiare alcune proteine del citoscheletro di queste cellule con una proteina particolare che si chiama vimentina , quindi ne altera la struttura). A livello metabolico: Enzimi (fosfolipasi, proteasi ecc.) fosfolipasi hanno un ruolo importante nelle infezioni respiratorie (es: fibrosi cistica) perché demoliscono/metabolizzano una particolare sostanza liberata a livello alveolare che si chiama fosfatidilcolina (che mantiene elastici e tonici gli alveoli, è una sostanza che li protegge), di conseguenza si danneggiano gli alveoli perché questi batteri coì riescono a riprodursi a livello delle vie respiratorie; le proteasi sono un sistema di difesa contro effettori tipici di natura proteica del sistema immunitario, cioè gli anticorpi e le proteine del complemento. Cheratinasi (distrugge la cheratina) Quorum sensing (= potenzia la produzione di sostanze per indurre la patogenicità nell’ospite oppure per potenziare il biofilm. È quindi un sistema di comunicazione tra le cellule che , quando arrivano in un determinato sito di colonizzazione, grazie a piccoli peptidi possono decidere di iperprodurre una sostanza e produrre il biofilm questo si vede nella fibrosi cistica).
È un patogeno opportunista ed è un grosso problema a livello ospedaliero perché, come tutti i patogeni opportunisti, approfitta di momenti di debolezza fisiologica (ma anche strutturale) del nostro organismo.
Tra i vari enzimi che produce questo batterio, c’è anche la cheratinasi che ha la capacità di demolire la cheratina e di colonizzare anche le unghie.
Pseudomonas aeruginosa: infezioni respiratorie, infezioni opportunistiche (sito chirurgico ecc.); dà luogo a biofilm all’interno del sistema respiratorio.
Batteri spirilli:
Sono bacilli particolari perché sono leggermente spiralizzate, cellule rigide; sono batteri aerobi o microaerofili (serve comunque un po’ di ossigeno per riprodursi), amano gli ambienti umidi/acquatici e sono dotati di un ciuffo di flagelli a livello di uno dei due poli della cellula che permette di muoversi rapidamente in un liquido. L’unica specie patogena è Spirillum minor (tipicamente agente della “rat bite fever”: l’immissione di questi batteri nel sangue nella ferita e la loro diffusione provocano febbre molto alta e dolori articolari).
Spirochete:
Sono bacilli di aspetto spiraliforme con volute più numerose e ravvicinate (rispetto ai spirilli); sono cellule flessibili e mobili (senza apparato locomotore esterno, cioè flagelli; hanno l’impianto flagellare, ma all’interno della cellula, hanno un endoflagello ), dal punto di vista metabolico sono batteri aerobi stretti , Gram - , sono fragili e quindi hanno sempre bisogno del contatto con l’uomo ad esempio (nell’ambiente sopravvivono per pochissimo tempo); sono batteri molto lunghi e sottili e possono essere trasmessi per via diretta o attraverso artopodi.
Dal punto di vista tassonomico sono 2 le famiglie principali della classe delle spirochete: leptospiracee e spirochetacee.
Generi importanti dal punto di vista della patogenicità sono 3: leptospire , le borreglie e le treponema (sono i generi micobatterici importanti nell’ambito delle spirochete).
