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Appunti presi a lezione della parte C del corso
Tipologia: Appunti
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Far crescere i batteri in un ambiente artificiale attraverso l ‘utilizzo di terreni di cultura che sono miscele di sostanze che vengono utilizzati per consentire la crescita dei batteri. Si coltivano per molte ragioni come per sapere il numero o il tipo di batteri nel campione come i controlli dell’acqua per vedere se sono microbiologicamente sicuri per l’utilizzo umano. Per crescere un batterio in laboratorio bisogna conoscere i nutrienti che servono al batterio o l’energia, l’ossigeno, acqua, ph, t... quindi ci sono diversità di richieste per la crescita del batterio in laboratorio. -nutrienti: cosa serve al batterio per formare le sue macromolecole, i nutrienti si classificano in macronutrienti (c serve perché tutte le macromolecole lo contengono, n serve perché è presente in proteine e acidi nucleici) sono nutrienti che servono in grande quantità al batterio e micronutrienti (fattori di crescita come le vitamine alcuni amminoacidi) sono comunque indispensabili ma servono in quantità ridotte addirittura in tracce. Le vitamine sono i fattori di crescita più comunemente richieste dai batteri soprattutto servono per attività di alcuni enzimi e servono da coenzimi cioè componente non proteica dell’enzima. Batteri diversi hanno diverse necessità di quantitativo di vitamine alcuni non necessitano proprio di vitamine. -energia: dobbiamo sapere da dove ricava l’energia cioè se è chemiotrofo necessitano sostanze chimiche per ricavare energia quindi chemiorganotrofi o chemioliotrofi oppure fototrofi quindi necessitano di luce. Al batterio per crescere servono tutti gli elementi di cui ha bisogno, se ha optimum (valore associato a velocità di crescita più veloce) di 7.4 è a quel ph che si duplica più velocemente.
Terreni di cultura Sono miscele di composti che possono essere organici e minerali che contengono componenti che servono ai batteri per crescere. I batteri cresciuti in laboratorio sono chiamate COLTURE che possono essere miste o pure. Culture miste: composta da specie batteriche differenti che si ottiene da tutti i campioni naturali. Culture pure: si ottengono in laboratorio partendo da una cultura mista è costituita da una sola specie, essa rappresenta una coltivazione artificiale.
In terreni agarizzati si possono formare patine (per striscio) quando ci sono molti batteri raggruppati oppure le colonie (per spatolamento) che sono unità isolata ogni colonia deriva da una cellula madre che si chiama unità formante colonia. Queste colonie si osservano come unità isolate:
esempio mannitol salt agar: è un terreno di selezione e differenziale, è un terreno che discrimina i batteri degli stafilococchi che fermentano in mannitolo che sono patogeni mentre quelli che non fermentano non sono patogeni, è un terreno complesso e solido , contiene nacl in quantità elevate che è un fattore di selezione che inibisce la crescita di molti organismi, possono crescere gli stafilococchi per distinguere ho il rosso fenolo quindi il terreno è rosso quando si acidifica il terreno diventa giallo quindi quando ci sono batteri che fermentano in mannitolo se non sanno fermentare il mannitolo non c’è viraggio del colore. Coltivazione in agar sangue: è un terreno arricchito, il sangue è un fattore differenziale. l’alfa emolisi è verde, la beta provoca una zona chiara intorno alle colonie. TECNICHE DI COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI Per poter coltivare un batterio in lab serve avere un terreno di coltura adatto e sterile, deve essere sterile tutto quello che verrà in contatto con il campione e la coltura. quindi tutti i materiali. Per mantenere la sterilità si deve lavorare in modo asettico quindi in modo da evitare contaminazioni. Ora possiamo inoculare il campione cioè l’aggiunta del campione che può essere solido e liquido ad un terreno liquido o solido. Dopo aver inoculato il campione passerà del tempo per crescere in questo tempo il campione deve essere incubato a delle condizioni ambientali che favoriscano la crescita del batterio come la temperatura, la concentrazione di ossigeno. Dopo osserveremo la crescita delle colture che possono essere pure se contengono solo 1 specie batteriche o miste se contengono più specie. La sterilizzazione avviene solitamente con autoclave che arriva a t tale che uccide tutte le forme di vita anche le spore che sono le più resistenti. Prima di aprirlo lo porto in un ambiente che eviti le contaminazioni. I contenitori che possono contenere il terreno solo le beute, tubi e piastre Petri e devono essere sterili e si possono sterilizzare. Gli
terreno liquido così come posso prendere un volume della coltura liquida e trasferirla nella coltura liquida. METODI DI CONTA Contare ai batteri serve perché ci sono molte norme da seguire che stabiliscono la quantità massima di alcuni batteri. Conta batterica: è il numero di batteri per unità di misura, peso, superficie. La conta si fa anche per vedere la curva di crescita. I metodi di conta si dividono in: -Metodi di misurazione diretta che sono la conta totale e vitale -Metodi di misurazione indiretta che sono la turbidometria e mpm Conta totale : abbiamo il campione in sospensione liquida e metto un volume noto in una camera di conta andiamo al microscopio e contiamo i batteri che vediamo. Utilizzo un fattore di conversione che è fisso e risalgo a quanti batteri ci sono in partenza. Ha dei limiti perché se i batteri sono pochi non riesco a contarli, non consente di discriminare le cellule vive da quelle morte e le cellule piccole non si distinguono dai detriti presenti. Conta vitale : consente di contare le colonie in grado di crescere su terreno agarizzato, si effettuata per piastramento di superficie o di inclusione, nel primo caso con la spatola distribuiscono il campione uniformemente e metto ad incubare, dopo aspetto e mi metto a contare le colonie. In quello di inclusione abbiamo la piastra vuota e facciamo tutto il procedimento e notiamo le colonie che sono incluse nel terreno e anche queste vanno contate. Con la conta totale si contano tutti i batteri sia vivi che morti e quelli che sono in grado o no di crescere in laboratorio mentre con quella vitale si possono contare solo le cellule batteriche vive ma solo quelli in grado di crescere in laboratorio. Non sappiamo quanti batteri ci sono nel campione di partenza ma bisogna contarli comunque, una piastra è contabile se le colonie sulla piastra sono tra le 30 e 300 unità formanti colonia sotto le 30 possiamo contarle però la conta può non essere considerata applicabile sopra le 300 la piastra è troppo piena quindi si formano patine e non si capisce bene quante sono oppure possono non crescere tutte perché c’è mancanza di spazio e anche competizione e mancanza di nutrienti. Una conta è affidabile solo se contiene tra le 30 e 300 unità formanti colonia. Campioni troppo concentrati se inoculati direttamente possono dare conte maggiori di 300 unità quindi in lab si lavora con riduzioni seriali in base 10, ogni diluzione è 10 volte meno concentrata della precedente. Nella prima diluzione metto 9 ml di terreno senza cellule o di diluente e 1 ml di un campione quindi il volume finale è di 10 ml, questa diluizione è 10 volte meno concentrata del campione quindi se partivo da 1000 ora ho 100. Nella seconda diluizione metto 9 ml di diluente e 1 ml della prima diluzione quindi se partivo da 1000 unità formanti colonia ora ne avrò 10 unità formanti colonia e così via continuo con le diluizioni. Dobbiamo seminare tutte le diluizioni seriali perché non sappiamo quale sarà la piastra contabile e le incubiamo tutte e dopo il tempo di incubazione le contiamo tutte e prendiamo in considerazione quella contabile cioè tra 30 e
300 colonie che è una perché la precedente sarà 10 volte di più e quella successiva 10 volte di meno. Queste vengono chiamate diluizioni seriali. Campioni poco concentrati ad esempio e.coli in acqua potabile deve essere assente in 100 ml. Faccio la concentrazione del campione con dei filtri con dei pori abbastanza piccoli da trattenere i batteri e poggio il filtro che ho usato in un terreno di coltura agarizzato e lo metto ad incubare e poi conto i batteri che si sono formati sul filtro. Utilizzo cfu cioè unità contante colonia perché sono quelle che crescono. La grande anomalia della conta su piastra: ho due campioni e li conto con i due metodi diversi sia vitale che totale e generalmente danno due conte molto diverse, il numero di batteri contati con quella totale possono essere 100 o 1000 volte maggiore della conta fatta con conta vitale. Deriva dal fatto che nella conta totale conto anche le cellule morte mentre nella vitale solo i vivi ma la ragione principale è che nella conta totale i batteri che si contano sono tutti i batteri sia coltivabili che non coltivabili e quelli non coltivabili sono la maggior parte dei batteri presenti invece la conta vitale fa crescere solo i batteri coltivabili in laboratorio. Turbidometria : risaliamo indirettamente al numero di cellule nel campione tramite la torbidità quindi abbiamo coltura liquida, più è torbido minore luce ci passa attraverso è più materiale sarà all’interno. Più il mezzo è torbido più batteri ci sono e meno luce passa attraverso il mezzo. Per misurare la torbidità si utilizza lo spettrofotometro che ha una lampada, una postazione dove mettere il campione e una fotocellula che misura quanta luce passa. Quando ci sono batteri nel campione la luce viene assorbita o riflessa quindi più batteri ci sono meno luce passa per il mezzo. Quindi la luce che passa è solo una frazione della luce inviata al campione e viene calcolata in densità ottica che è il rapporto tra luce incidente cioè quella inviata e quella non riflessa quindi la luce che è passata nel campione. Esiste una relazione tra la densità ottica e la quantità di cellule, all’aumentare della quantità di cellule aumenta la densità ottica che misuro con lo spettrofotometro fino ad un certo valore sono proporzionali la densità e il numero delle cellule poi arrivo a saturazione. Viene creata una curva di crescita. All’aumentare della torbidità aumenta la crescita dei batteri. MPN : Conta del numero più probabile, utilizza dei terreni in cui la crescita si può osservare perché avvengono reazioni visibili come torbidità o cambia il colore del terreno. Devo seminare almeno 3 provette per diluizione seriale, in ogni serie di 3 provette c’è una concentrazione diversa del campione iniziale dopo incubiamo e dopo il tempo di incubazione devo contare le provette positive come, ad esempio, quelle con presenza di torbidità o di cambiamento di colore. In alcuni casi nessuna provetta è positiva oppure tutte lo sono oppure in alcune alcuni sono positivi e altri negativi. Dobbiamo individuare la diluizione limite dove tutti i tubi sono positivi e dopo individuare il numero caratteristico cioè una successione di 3 numeri costituito dal numero di tubi positivi nella diluizione limite, dal numero di tubi positivi in quella successiva e poi ancora nella successiva. Questo numero serve nelle tabelle di conversione cioè tabelle per ogni tipo di test che faccio dicono che se il numero caratteristico x allora avrò x microrganismi
-temperatura