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Ingrandimento e Potere Risolutivo del microscopio
Ingrandimento (Quanto è 'grande' l'immagine)
È il rapporto tra la dimensione apparente dell'immagine osservata al microscopio e la dimensione reale dell’oggetto. Si calcola come: Ingrandimento totale = Ingrandimento dell’obiettivo × Ingrandimento dell’oculare Esempio: un obiettivo da 40x combinato con un oculare da 10x produce un ingrandimento totale di 400x. Nota: ingrandire un’immagine non significa necessariamente vederla con più dettaglio. Questo dipende dal potere risolutivo.
Potere Risolutivo (Quanto è 'dettagliata' l'immagine)
È la capacità del microscopio di distinguere due punti molto vicini tra loro come separati. Si esprime in nanometri (nm) o micrometri (μm). Il limite teorico del microscopio ottico è di circa 200 nanometri (0,2 μm), a causa della lunghezza d'onda della luce visibile. Approssimativamente il potere risolutivo d, inteso come distanza minima tra due punti che un microscopio riesce a distinguere, si calcola come: d = (0,61 × λ) / NA (1)
- λ è la lunghezza d’onda della luce usata (es. 550 nm per la luce verde)
- NA è l’apertura numerica dell’obiettivo Perciò per migliorare la risoluzione, ossia per minimizzare la distanza tra due punti distinti, è necessario utilizzare luce con valori piccoli di λ. L’occhio umano riesce a distinguere due punti (non li vede, cioè, come un punto solo) distanti tra loro almeno 0,1 mm (più esattamente, 0,075 mm); ha, cioè, un potere di risoluzione di circa 0,1 mm. Se per illuminare un dato campione si utilizza luce visibile il microscopio è detto OTTICO o A LUCE, mentre è detto ELETRONICO se utilizza un fascio di elettroni accelerati.
MICROSCOPIO OTTICO
È costituito da una parte meccanica e da una parte ottica. La parte meccanica è composta da:
- uno stativo, che costituisce un sostegno centrale metallico su cui sono inseriti gli altri pezzi; lo stativo poggia su una pesante base;
- un tavolino porta oggetti, con apertura al centro per consentire alla luce di passare e attraversare il vetrino;
- il tubo ottico: in cui sono inseriti i due sistemi di lenti (oculare e obiettivo). La messa a fuoco dell'immagine viene effettuata mediante:
- una vite macrometrica che consente gli spostamenti verticali del tubo ottico;
- una vite micrometrica che consente solo minimi movimenti verticali del tubo ottico. La parte ottica è costituita da:
- 2 sistemi di lenti ossia l’obiettivo e l’oculare. L'oculare è alla sommità del tubo ottico (gli oculari possono essere anche due), l'obiettivo è inserito nella parte più bassa del tubo ottico, in prossimità del preparato e possono essere presenti vari obiettivi, inseriti in un supporto che può essere ruotato.
- L’ apparato di illuminazione che può essere costituito da una semplice lampada inserita direttamente alla base, o da uno specchietto a due facce, orientabile, per convogliare i raggi luminosi verso il preparato da osservare che deve essere sottile per poter essere attraversato dalla luce.
- Un condensatore di luce, regolabile in altezza, che concentra la luce sul preparato;
- un diaframma ad iride (tra condensatore e fonte luminosa), che regola l'intensità di luce a seconda delle esigenze;
- un'eventuale lente che funge da filtro.
Microscopio a luce polarizzata
(La luce bianca è un'onda elettromagnetica formata dalla sovrapposizione di un campo elettrico e di un campo magnetico che oscillano su piani perpendicolari tra loro e perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda. La luce polarizzata, invece, è luce le cui onde vibrano in una sola direzione e si ottiene facendo passare la luce attraverso un filtro polarizzatore ossia una sostanza che blocca tutte le vibrazioni tranne quelle orientate in una specifica direzione). È una variante del microscopio ottico che utilizza luce polarizzata per studiare materiali anisotropi (cioè materiali che presentano proprietà ottiche diverse a seconda della direzione da cui vengono osservati) o birifrangenti (cioè in grado di modificare la direzione della luce). È particolarmente utile per osservare strutture con organizzazione regolare o cristallina, come fibre muscolari, fibre collagene (presenti nei tessuti connettivi), amiloide (depositi patologici), cristalli (ad esempio quelli di acido urico nelle urine o nei calcoli renali), tessuti mineralizzati (osso, dentina, cemento e smalto). La luce, fatta passare attraverso un polarizzatore, illumina il campione. Se esso è birifrangente le onde emergenti cambiano orientamento. Un secondo filtro, detto analizzatore (posto perpendicolare al primo), permette di rilevare questa variazione perché le aree birifrangenti appariranno brillanti o colorate su uno sfondo scuro.
Microscopio invertito a contrasto di fase
È una variante del microscopio ottico progettata per osservare campioni biologici vivi o non colorati, in particolare cellule e tessuti in coltura. Si chiama “invertito” perché ha la struttura rovesciata rispetto a un microscopio tradizionale in quanto la sorgente luminosa si trova sopra il campione, mentre l’obiettivo si trova sotto. Questa configurazione consente di osservare campioni contenuti in contenitori chiusi, come piastre da coltura o provette, senza doverli spostare o trattare. Le cellule in vitro sono quasi completamente trasparenti alla luce visibile, per cui, con un microscopio ottico tradizionale, risulta difficile distinguere le loro strutture interne. La fase è una proprietà della luce che può cambiare quando essa attraversa materiali diversi, come una cellula immersa in un liquido. Quando la luce attraversa sia la cellula che il mezzo liquido circostante, poiché questi due ambienti hanno indici di rifrazione diversi, la luce si propaga al loro interno a velocità leggermente diverse. Questa variazione provoca un ritardo di fase (cioè uno “sfasamento”) tra le onde luminose che passano attraverso le diverse parti del campione. Il microscopio a contrasto di fase è progettato per trasformare queste differenze di fase in variazioni di intensità luminosa (zone più chiare o più scure), rendendo visibili le strutture cellulari senza bisogno di colorazione.
Microscopio confocale laser
A differenza dei microscopi ottici tradizionali che illuminano tutto il campione, il confocale illumina un solo punto alla volta usando un raggio laser molto preciso. Il campione viene trattato con fluorocromi che, quando il laser colpisce un punto, assorbono energia e emettono luce che torna verso il rilevatore passando attraverso un piccolo foro chiamato “pinhole”.
Solo la luce proveniente dal piano perfettamente a fuoco riesce a passare. La luce che proviene da sopra o sotto il piano di messa a fuoco viene bloccata () eliminando pertanto le sfocature tipiche dei microscopi tradizionali. Il laser viene poi spostato su altri punti (scansione riga per riga) finché non viene coperta tutta l’area. Un computer raccoglie tutti i dati punto per punto e ricostruisce l’immagine finale ad alta risoluzione. Ripetendo la scansione a diversi livelli di profondità, si ottengono più “fette” del campione. Il computer può poi unirle in un’unica immagine tridimensionale, permettendo di esplorare l’interno delle cellule o dei tessuti. Per esempio per vedere dove si trova il nucleo, l'apparato di Golgi e i mitocondri in una cellula si possono usare tre fluorocromi diversi. L’immagine ottenuta con il microscopio confocale sarà caratterizzata dal fatto che ogni struttura brillerà con un colore diverso e si potrà vedere dove si trovano con precisione e anche in quale strato della cellula sono. () Immagina che stai guardando un libro chiuso con molte pagine trasparenti una sopra l’altra, e vuoi leggere una sola pagina nel mezzo, senza che le scritte delle pagine sopra e sotto ti confondano. Un microscopio tradizionale illumina tutte le pagine insieme: quindi vedi anche ciò che sta sopra e sotto la pagina che ti interessa = immagine sfocata. Il microscopio confocale invece illumina una sola “pagina” (cioè un piano sottile del campione) con un laser, lascia passare solo la luce emessa da quella pagina precisa attraverso un piccolissimo foro (pinhole), tutta la luce che arriva da altre pagine (sopra o sotto) non riesce a passare attraverso il foro e viene bloccata.
ovvero avvolgimenti elettrici che generano campi magnetici in grado di deviare il fascio di elettroni in tutte le direzioni. In questo modo, il fascio percorre la superficie punto per punto secondo uno schema a scansione raster (riga per riga) permettendo la ricostruzione dell’immagine della superficie. Il campione, posizionato in una camera a vuoto, colpito dal fascio emette diversi segnali, tra cui:
- elettroni secondari → usati per ottenere immagini dettagliate della topografia superficiale.
- elettroni retrodiffusi → utili per evidenziare differenze di composizione chimica (elementi più pesanti appaiono più brillanti).
- raggi X caratteristici → utilizzati per l’analisi chimica degli elementi presenti. L’ingrandimento è compreso tra 10X e 100.000X, mentre il potere risolutivo varia da 1 a 10 nm
Microscopio elettronico a trasmissione-scansione (STEM)
È una combinazione tra TEM e SEM e viene utilizzato per ottenere immagini ad altissima risoluzione e per analizzare la composizione chimica a livello atomico. Unisce la scansione punto per punto del fascio elettronico tipica del SEM e la trasmissione degli elettroni attraverso un campione sottile tipica del TEM.
TECNICHE DI MICROSCOPIA: la criotomografia elettronica
È una combinazione tra la criocongenlazione e il microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La criocongelazione consiste nel rapido congelamento del campione (cellule, virus, complessi proteici…) in azoto liquido o etano liquido a - 196 °C , evitando la formazione di cristalli di ghiaccio (vetrificazione) e ottenendo così che il campione conservi la sua struttura senza colorazioni o fissazioni. Il campione congelato viene inserito in un microscopio elettronico a trasmissione (TEM), mantenendolo sempre a basse temperature. Viene inclinato per esempio da - 60° a +60° e per ogni angolazione si scatta una foto. Tutte queste immagini bidimensionali vengono elaborate dal computer ottenendo come risultato una ricostruzione 3D dettagliata della struttura interna del campione (tomografia).
Microscopio ad effetto tunnel (STM)
È un tipo speciale di microscopio che non usa luce o elettroni ma sfrutta il fenomeno quantistico dell’effetto tunnel per ottenere immagini della superficie di un materiale atomo per atomo. Effetto tunnel: è un fenomeno quantistico in cui una particella (come un elettrone) riesce a passare attraverso una barriera che, secondo la fisica classica, non dovrebbe poter attraversare. Un elettrone si trova davanti a un muro di energia (barriera). Secondo la fisica classica, se la particella non ha abbastanza energia per superarlo, rimbalza. Ma nella meccanica quantistica c’è una probabilità che la particella compaia direttamente dall’altra parte del muro , senza scavalcarlo. Il cuore dello STM è una punta metallica molto affilata (grande quanto un atomo) che viene posta molto vicino alla superficie del campione senza toccarlo.
Quando la punta è a distanza di pochi angstrom (10⁻¹⁰ m) dalla superficie del campione, gli elettroni "saltano" dalla punta al campione o viceversa provocando effetto tunnel. La punta scansiona la superficie del campione riga per riga e questo genera una corrente elettrica debolissima (corrente di tunneling). Poiché l’intensità della corrente dipende dalla distanza tra punta e campione, la punta si alza o si abbassa seguendo le variazioni di altezza degli atomi. Il movimento della punta viene registrato e trasformato in un’immagine 3D della superficie, con risoluzione atomica.
Microscopio a forza atomica (AFM)
È uno strumento che permette di ottenere immagini tridimensionali della superficie di un campione con risoluzione nanometrica o addirittura atomica. Funziona misurando le forze di interazione tra una punta molto affilata e la superficie del campione. La punta di scansione è montata su un braccio elastico, detto cantilever. Quando la punta si muove sopra la superficie interagisce con essa tramite forze intermolecolari e di repulsione, dovute principalmente alla sovrapposizione tra le nubi elettroniche degli atomi della punta e quelli del campione. Queste interazioni provocano una flessione del cantilever che viene rilevata tramite laser. Un sofisticato sistema regola costantemente la distanza tra la punta e la superficie, in modo da mantenere la forza di interazione costante. In questo modo è possibile ricostruire una mappa topografica della superficie del campione. Risulta utile nello studio della morfologia della membrana cellulare o per osservare microstrutture come microvilli, pieghe della membrana, o reticolo di proteine.
La luce di sincrotrone
Un sincrotrone è un anello di grandi dimensioni (con raggio variabile da alcune centinaia di metri fino a qualche chilometro) all’interno del quale particelle subatomiche, come gli elettroni, vengono accelerate fino a velocità prossime a quella della luce. Ciò avviene grazie a una serie di magneti che deviano la traiettoria delle particelle, facendole seguire percorsi ondulati o curvi. Durante questo movimento, gli elettroni emettono una radiazione molto intensa chiamata luce di sincrotrone che copre un ampio spettro di frequenze, dagli infrarossi fino ai raggi X. Questa luce risulta particolarmente brillante e per questo trova applicazione in numerosi campi scientifici. In istologia, è utilizzata per studiare le cellule e i tessuti anche in vivo, cioè senza la necessità di prelevare campioni o sezionarli, attraverso tecniche di imaging non invasive. È usata per studiare tumori, malattie neurodegenerative, alterazioni vascolari, ecc. Ad esempio, nella ricerca sull’Alzheimer, si usano i raggi X del sincrotrone per osservare placche di beta- amiloide in cervelli umani non sezionati. In Italia, il sincrotrone ELETTRA di Trieste è uno dei centri principali. Vi si effettuano studi su tessuti cerebrali umani, cellule tumorali, organi in modelli animali, reperti biomedici antichi.
