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1 - MICROSCOPIO OTTICO
Cellule e tessuti possono essere studiate dal punto di vista morfologico o biochimico e funzionale. L’ANALISI MORFOLOGICA utilizza strumenti quali microscopi ottici , elettronici o citofluorimetri , in grado di ingrandire le immagini delle strutture in esame. In questo caso la preparazione dell’oggetto in esame deve risultare il più possibile conservativa. L’ANALISI BIOCHIMICA E FUNZIONALE ha lo scopo di studiare la natura chimica e le modalità di funzionamento delle cellule utilizzando strumenti come i cromatografi , elettroforesi e spettrometri. L’approccio strumentale, in questo caso, si basa sul frazionamento dell’oggetto in esame. L’analisi morfologica ha dunque lo scopo di aumentare artificialmente l’immagine di un oggetto in modo da portarlo nel campo del visibile. I microscopi, infatti, servono per aumentare il POTERE DI RISOLUZIONE, ovvero la capacità di distinguere come separati due punti molto vicini tra di loro: ad esempio la capacità massima dell’occhio umano è di circa 0,2 mm, mentre un microscopio ottico può arrivare a 0,2 μm (o anche 0,1 μm tramite tecniche particolari) e uno elettronico a 0,2 nm. MICROSCOPIO OTTICO Struttura:
- Oculare
- Tubo porta ottica
- Revolver
- Obiettivo
- Tavolino
- Levetta per apertura/chiusura diaframma del condensatore
- Condensatore
- Supporto per filtri
- Supporto per lenti ausiliarie
- Diaframma di campo
- Basamento
- Braccio
- Levetta per allontanamento della lente frontale dal condensatore
- Manopola per centratura del condensatore
- Vite macrometrica
- Vite micrometrica
- Illuminatore Il TUBO PORTAOTTICA sorregge una coppia di OCULARI dal lato dell’osservatore e gli OBIETTIVI dal lato del tavolino su cui viene posto l’oggetto da osservare. Gli obiettivi sono montati su una torretta girevole detta REVOLVER. Tubo e tavolino sono montati su un braccio ricurvo e il tutto su un basamento. Braccio e basamento vengono genericamente chiamati STATIVO (poiché sono infatti parti statiche). Per la messa a fuoco vengono utilizzati dispositivi meccanici di spostamento: la VITE MACROMETRICA per grandi spostamenti e la VITE MICROMETRICA per messa a fuoco fine. Il tavolino presenta un foro al centro per il passaggio della luce e sotto di esso è disposto il dispositivo di illuminazione costituito da: sorgente di illuminazione (generalmente lampade a incandescenza o alogene) e il CONDENSATORE DI ABBE (una lente convergente che concentra la luce su una zona limitata del preparato, da cui poi fuoriesce un cono luminoso il cui diametro coincide con quello della lente frontale dell’obiettivo). Il condensatore può essere alzato o abbassato in modo da regolare la quantità di luce che raggiunge la lente frontale; questa luminosità può anche essere regolata aprendo o chiudendo il DIAFRAMMA posto sotto il condensatore. Percorso ottico: Nei microscopi ottici l’obiettivo è a corta distanza focale e l’oggetto viene posto al di là del fuoco. Viene così a formarsi, tra i due gruppi diottrici, un’immagine dell’oggetto reale, ingrandita e capovolta detta IMMAGINE INTERMEDIA. L’oculare viene posto in modo che l’immagine intermedia cada all’interno della sua distanza focale ottenendo così un’IMMAGINE SECONDARIA (VIRTUALE) maggiormente ingrandita e
diritta che può essere vista dall’occhio dell’osservatore. L’INGRANDIMENTO DELL’IMMAGINE FINALE è dato dal prodotto dell'ingrandimento dell’obiettivo per l’ingrandimento dell’oculare. Risoluzione: Il POTERE DI RISOLUZIONE di un qualsiasi microscopio ottico è di 0,2 μm; si dice dunque che l’INGRANDIMENTO UTILE fornito da un microscopio ottico è di circa mille volte (1000x). Il LIMITE DI RISOLUZIONE (R) viene espresso dalla FORMULA DI ABBE:
in cui λ è la lunghezza d’onda della luce , n l’ indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente (solitamente aria), e α è il semi angolo di apertura dell’obiettivo. Il prodotto tra n e sen α è detto APERTURA NUMERICA. Dato che l’indice di rifrazione dell’aria è di circa 1 e il sen α viene considerato pari a 1, R risulta proporzionale a ½ λ , cioè alla metà della lunghezza d’onda della luce. Se consideriamo la luce con lunghezza d’onda di 400 nm (cioè la luce visibile), il potere di risoluzione è dunque pari a 200 nm (0,2 μm). Tuttavia è possibile migliorare il limite di soluzione di un microscopio ottico aumentando, ad esempio, il valore di n. Si può infatti interporre, tra lente frontale dell’obiettivo e oggetto, un mezzo con indice di rifrazione maggiore rispetto a quello dell’aria, come ad esempio una goccia d’olio (n pari a circa 1,5): in questo caso si parla di OSSERVAZIONE MICROSCOPICA A IMMERSIONE che permette di ottenere un potere di risoluzione di circa 0,1 μm, il limite estremo della microscopia ottica. In alternativa è possibile utilizzare luce di lunghezza d’onda minore , come ad esempio la radiazione ultravioletta (λ pari a 250-350 nm) con la quale si raggiunge un potere di risoluzione di circa 0,1 μm. In questo caso però, essendo la luce ultravioletta invisibile all’occhio umano, è necessario utilizzare pellicole fotografiche sensibili all’ultravioletto per visualizzare le immagini. Obiettivi e oculari: Negli obiettivi e negli oculari sono riportate sigle e numeri. Alcuni valori corrispondono all’ingrandimento dello specifico obiettivo/oculare (ad esempio 10x o 40x ecc.). Negli obiettivi sono riportati altri valori che ne indicano l’apertura numerica (n ⋅ sen α), la quale indica la massima quantità di luce che l’obiettivo è in grado di ricevere per la formazione delle immagini (sono numeri decimali; es. 0,63 o 0,95 ecc.). Altre indicazioni sugli obiettivi possono essere: 170/0, PI apo oel 100/1, ● la lunghezza del tubo portalenti espressa in mm (nell’esempio 170) ● lo spessore in mm del vetrino copri oggetto per il quale è stato costruito l’obiettivo (es. 0,17) ● PI: obiettivo planatico , in grado di mettere a fuoco tutta la superficie del campo visivo ● apo: ottica con correzione automatica completa (rosso, verde, blu, violetto) ● oel: è necessaria una goccia d’olio da immersione per avere un’immagine nitida dell’oggetto ● fattore di ingrandimento (es. 100x) ● apertura numerica (es. 1,32) Altre indicazioni sugli oculari possono essere: H 10x Periplan GF 10x M Periplan GF 10x MF Periplan GW 10x MF ● H: Huygens , è il modello più semplice di oculare ● Periplan: oculare adatto ad essere associato ad obiettivi planatici ● GF: oculare con campo di osservazione allargato (cioè di 18 mm) ● GW: oculare con campo di osservazione molto largo (di 30 mm)
Si tratta del procedimento ideale, in grado di mostrare un’ immagine reale e dinamica della cellula. Lo studio di cellule viventi, però, è limitato da molti fattori, e il problema principale è che dei frammenti molto piccoli di organi o cellule isolate dall’organismo possono restare in vita solo per breve tempo. Le cellule viventi possono devono essere colorate attraverso determinati coloranti non tossici , detti COLORANTI VITALI. Vi sono due metodi per colorare il campione: COLORAZIONE VITALE: quando il colorante viene iniettato nell’organismo intero; COLORAZIONE SOPRAVITALE: un pezzo di organo viene immerso nel colorante e, dopo breve lavaggio del pezzo, vengono osservate alcune cellule che rimangono colorate. Esempi di coloranti vitali : blu trypan, tionina, litiocarminio, blu pirrolo, inchiostro di china (per fagocitosi), alizarina (ossificazione), verde Janus (mitocondri). STUDIO DI CELLULE E TESSUTI UCCISI Per la preparazione di campioni uccisi è importante fissare le cellule e i tessuti in modo da impedire le alterazioni post mortem ed è inoltre necessario renderli trasparenti alla radiazione utilizzata. Il processo si divide in diverse fasi: FISSAZIONE, INCLUSIONE e SEZIONAMENTO, COLORAZIONE. Fissazione : Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura della cellula dalle alterazioni conseguenti alla sua morte. A questo scopo viene fatto un trattamento chimico che uccide rapidamente la cellula agendo sui componenti proteici cellulari (vengono dunque inattivati gli enzimi lisosomiali in modo da impedire fenomeni di autolisi). La fissazione può essere eseguita con agenti sia chimici che fisici. I FISSATIVI CHIMICI possono essere divisi in due gruppi: un gruppo sono i fissativi che coagulano le proteine (alcuni esempi: alcol etilico, bicloruro di mercurio, acido acetico, acido tricloroacetico, acido picrico); il secondo gruppo comprende i fissativi non coagulanti le proteine (formalina e acido osmico). La FISSAZIONE FISICA, invece, avviene per congelamento o per rapido riscaldamento. Inclusione e sezionamento : Il materiale biologico da osservare, dopo essere stato fissato, deve risultare trasparente in modo da essere attraversato dalla luce. Deve quindi essere tagliato in sezioni di spessore non superiore ai 10 μm, preferibilmente di 2-5 μm, in modo da ottenere una buona risoluzione. Per fare ciò viene utilizzato un particolare strumento detto MICROTOMO, dotato di una lama affilata che taglia fettine di campione del giusto spessore. Per tagliare delle sezioni così sottili di materiale, è necessario prima di tutto inspessire il campione includendolo in sostanze diverse, come la paraffina. In alternativa, è possibile effettuare sezioni di tessuto appena prelevato senza fissarlo (ad esempio per mantenere integre le sue attività enzimatiche) congelando il campione prima di sezionarlo. Ciò può essere fatto grazie ad un particolare microtomo detto MICROTOMO CONGELATORE, il quale congela il pezzo con anidride carbonica prima di tagliarlo, oppure con un CRIOSTATO, cioè un microtomo contenuto all’interno di una cella frigorifera (a - 20 o - 30°C). Colorazione : La colorazione si distingue in: COLORAZIONE DIRETTA (o SOSTANTIVA) quando le sezioni prendono il colorante direttamente dalla soluzione; oppure COLORAZIONE INDIRETTA (o AGGIUNTIVA) quando vengono utilizzate delle sostanze preparatorie alla colorazione, i MORDENTI (sali d’alluminio, di ferro o di cromo). Le colorazioni possono inoltre essere SEMPLICI, quando si usa un solo colorante, o COMBINATE, quando se ne usano due o più. I coloranti possono essere NATURALI (estratti da animali o piante) o ARTIFICIALI. La combinazione più utilizzata è l’EMATOSSILINA-EOSINA, con la quale i nuclei vengono colorati di blu dall'ematossilina e il resto della cellula di rosa dall’eosina. Altri coloranti : arancio G (per il citoplasma); blu di anilina o verde luce (per le fibre di collagene).
3 – MICROSCOPIO A FLUORESCENZA E CONFOCALE
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
Funzionamento : Con questo microscopio il preparato viene illuminato con luce ultravioletta a una determinata lunghezza d’onda (invisibile) e l’immagine risultante è dovuta dalla luce emessa dai componenti esaminati: in sostanza, i preparati si auto illuminano. Questa luce è detta FLUORESCENZA ed è il fenomeno per cui determinate sostanze colpite da radiazioni ultraviolette sono in grado di emettere luce di lunghezza d’onda maggiore e quindi visibile. La radiazione ultravioletta fa sì che gli elettroni di una molecola della sostanza fluorescente vengano eccitati , in questo modo passano da un orbitale a uno superiore assorbendo energia. Gli elettroni eccitati sono però instabili , dunque tendono a ritornare all’orbitale precedente rilasciando energia sotto forma di calore e luce. La luce emessa è appunto la fluorescenza che, avendo un’energia minore della luce eccitante, ha una lunghezza d’onda maggiore che rientra quindi nel campo del visibile. La fluorescenza può essere di due tipi: ● NATURALE o PRIMARIA o AUTOFLUORESCENZA, è prodotta da sostanze presenti nei tessuti (es. vitamina A, riboflavina, porfirine, clorofille); ● SECONDARIA, è indotta da una colorazione (FLUOROCROMIZZAZIONE) con coloranti fluorescenti detti FLUOROCROMI. Questi sono in grado di legarsi in modo selettivo a diversi componenti cellulari e/o tissutali e ne consentono la visione al microscopio (es. arancio di acridina: per nucleoporine e acidi nucleici (nucleo); ioduro di propidio: colora di rosso il DNA; DAPI: colora di blu il DNA; fluoresceina isotiocianato (FITC): marca anticorpi che a loro volta localizzano antigeni tissutali ➝ immunocitochimica ). Struttura : Nel microscopio a fluorescenza il preparato viene eccitato dall’alto da una sorgente luminosa ad alta energia (es. LAMPADA A VAPORI DI MERCURIO). La luce ultravioletta emanata dalla lampada viene deviata da uno specchio dicroico verso il preparato colpendolo dall’alto. Questa luce passa per prima cosa attraverso un FILTRO DI ECCITAZIONE che lascia passare la luce della giusta lunghezza d’onda per eccitare gli elettroni del preparato. Prima dell’oculare è posizionato un FILTRO DI SBARRAMENTO che blocca i raggi ultravioletti riflessi e lascia passare solo la luce emessa dal fluorocromo. Gli obiettivi adatti a questi tipi di microscopi sono detti OBIETTIVI A FLUORITE e sono indicati con la sigla FLUOR o FL. MICROSCOPIO CONFOCALE Si tratta di un microscopio che unisce fluorescenza e software per ricreare un’immagine ingrandita e tridimensionale del preparato. Funzionamento e struttura : Il microscopio confocale è in grado di focalizzarsi su un determinato piano per volta di un preparato di relativo spessore, eliminando le informazioni luminose che provengono da zone sovra- e sotto-fuoco. Riesce cioè a registrare ogni volta una SEZIONE OTTICA SOTTILE e, unendo le immagini grazie ad un computer, fornire un’immagine tridimensionale della struttura in esame. Per fare ciò utilizza un RAGGIO LASER che viene concentrato in un foro (detto FORO CONFOCALE) e la cui immagine riflessa da uno SPECCHIO DICROICO colpisce un determinato punto dell’oggetto sotto osservazione. La luce emessa per fluorescenza viene concentrata in un SECONDO FORO CONFOCALE e registrata da un RILEVATORE che registra il segnale su un computer. La fluorescenza emessa dai punti contigui a quello di focalizzazione non viene invece focalizzata nel secondo foro confocale e dunque non viene registrata dal rilevatore. Il processo viene poi ripetuto su altri punti dell’oggetto facendo scorrere il laser attraverso un dispositivo di scansione. Infine, tutte le immagini vengono elaborate dal computer e visualizzate grazie ad uno specifico software.
presenza di antigeni). Questo apparecchio lavora ad un’elevata velocità e permette infatti di realizzare indagini statistiche in brevi tempi mantenendo le cellule allo stato vitale. Può inoltre essere utilizzato un secondo strumento per la separazione di cellule e organuli: il SEPARATORE CELLULARE. In esso il fluido è costituito da microgocce che contengono una singola particella. Quando le microgocce passano davanti ad un raggio laser, in base al fatto che emettano fluorescenza o meno, vengono caricate negativamente o positivamente (oppure possono essere anche non caricate se contengono aggregati di cellule o sono vuote). Le gocce vengono poi fatte passare in un campo elettrico e, se non caricate, proseguono indisturbate, altrimenti vengono deflesse e raccolte in contenitori diversi.
5 – MICROSCOPI ELETTRONICI (TEM E SEM)
I microscopi elettronici utilizzano un fascio di elettroni per esaminare il campione in esame. Poiché le radiazioni elettromagnetiche hanno una lunghezza d’onda molto più corta rispetto a quella della luce (quella utilizzata nei microscopi ottici), permettono di raggiungere una risoluzione di circa 0,2 nm. Infatti, secondo la formula di Abbe : 𝑅 = 0 , 05 2 𝑛 ⋅ 𝑠𝑒𝑛 𝛼 =^0 ,^2 𝑛𝑚^ dove 0,05 è ricavato da un’altra formula che calcola la lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica: 𝜆 = √ 150 𝑉 , V indica la differenza di potenziale impiegata per accelerare gli elettroni ed è pari a 50.000 V. MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM) Funzionamento : La sorgente luminosa di un TEM è un FASCIO DI ELETTRONI, i quali sono sottoposti ad una forte differenza di potenziale e vengono così accelerati ad una forte velocità. Le lenti del TEM sono costituite da ELETTROMAGNETI (caratterizzate da un angolo di apertura molto piccolo) che riescono ad ingrandire l’immagine dell’oggetto, analogamente alle lenti di vetro di un microscopio ottico. Per far sì che gli elettroni dalla sorgente raggiungano lo schermo, è necessario eliminare tutti gli ostacoli che potrebbero deviare il loro percorso, quindi l’ambiente interno di un microscopio elettronico deve essere sottoposto a valori di VUOTO molto alti (deve essere eliminata tutta l’aria). Gli elettroni del fascio attraversano così l’oggetto e in parte vengono assorbiti , in parte deviati , oppure trasmessi continuando il loro percorso. Quest’ultimi creano una variazione d’intensità e contribuiscono a formare un’immagine (in bianco e nero) su uno SCHERMO FLUORESCENTE, cioè uno schermo in grado di convertire la radiazione elettronica in radiazione fotonica di luce verde visibile. L’immagine può essere osservata da un’apposita finestra , oppure impressa su una lastra fotografica , oppure ancora trasformata in digitale. Struttura : Il TEM è costituito da una COLONNA ELETTRONOTTICA collegata ad un sistema di comando dei circuiti elettrici ed elettronottici e ad un sistema di produzione e controllo del vuoto. All’interno della colonna elettronottica si trovano: SORGENTE ELETTRONICA: composta da un FILAMENTO DI TUNGSTENO che portato all’incandescenza emette elettroni. Il filamento è inserito in un cilindro metallico (CATODO) che genera un forte differenza di potenziale a contatto con un ANODO, cioè un disco metallico caricato positivamente, forato al centro e disposto direttamente sotto il catodo. CONDENSATORE: la lente elettromagnetica che fa convergere il fascio sul preparato. SISTEMA DI INGRANDIMENTO IMMAGINE: le lenti che ingrandiscono l’immagine dell’oggetto (obiettivo circa 100x). SISTEMA REGISTRAZIONE E VISUALIZZAZIONE IMMAGINE: lo schermo a fluorite e una lastra fotografica. HV-TEM:
Esiste anche un altro tipo di TEM in grado di creare differenze di potenziale molto più alte (500.000 - 2.500.000 V) e viene chiamato microscopio elettronico ad ALTO VOLTAGGIO (HV). Con questa strumentazione è possibile osservare preparati costituiti da cellule complete. MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM) Funzionamento e struttura : In un SEM, a differenza di un TEM, la superficie del campione è rivestita da un sottile strato di metalli pesanti (oro o oro-palladio) per consentirne l’osservazione. Il campione viene poi colpito da un sottile fascio di elettroni (di circa 7 nm di diametro) detti PRIMARI, che deflessi formano una specie di “pennello” che esplora la superficie dell’oggetto. Gli elettroni primari vanno così ad eccitare la superficie del campione che emette raggi X ed ELETTRONI SECONDARI. Quest’ultimi vengono raccolti da un RILEVATORE, composto da uno SCINTILLATORE che, emettendo fotoni , scansiona su un monitor in sincrono con il fascio di elettroni primari. L’immagine rilevata sullo schermo è tridimensionale e ha solitamente una risoluzione di 20 nm, anche se con particolari sorgenti è possibile raggiungere anche una risoluzione di 3 nm. Il SEM consente inoltre la microanalisi dei metalli contenuti nel campione: ciò avviene grazie ad una microsonda che raccoglie i raggi X emessi e ne analizza lo spettro, consentendo l’identificazione dell’elemento. In generale, i segnali emessi da un SEM sono: ELETTRONI SECONDARI: sono quelli provenienti dalla superficie del campione e hanno un’energia più bassa a causa degli urti anelastici. Permettono di analizzare la morfologia della superficie del campione. ELETTRONI BACKSCATTERED: sono elettroni emessi dal campione ma con cambiamento di direzione. Forniscono informazioni sulla composizione chimico-fisica dell’oggetto. CATODOLUMINESCENZA RAGGI X: consentono l’identificazione dei metalli contenuti nel campione.
6 – ALLESTIMENTO CAMPIONI PER MICROSCOPIO ELETTRONICO
Il materiale da esaminare al microscopio elettronico deve essere fissato, disidratato e ridotto in fettine estremamente sottili, di circa 50-80 nm di spessore. FASI DI ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI PER TEM Fissazione : si utilizzano dei fissativi in soluzioni tampone. I più adoperati sono il tetrossido di osmio e la glutaraldeide. Disidratazione : il tessuto viene sottoposto a disidratazione in concentrazioni crescenti di alcol etilico o acetone. Inclusione e sezionamento : per l’inclusione vengono utilizzati monomeri acrilici o resine epossidiche che impregnano il tessuto (essendo liquide a temperatura ambiente) e poi vengono fatti polimerizzare mediante un catalizzatore (a 60°C). Per il taglio si utilizza l’ULTRAMICROTOMO, dotato di lame di vetro o di diamante. Possiede un braccio, il cui avanzamento permette il taglio del campione in sezioni ultrafini che si raccolgono sul pelo dell’acqua contenuta in una vaschetta montata su una lama di vetro. Il nastro delle sezioni prodotto viene poi raccolto con un retino che funge anche da portaoggetto. Colorazione : si utilizzano dei COLORANTI ELETTRONICI che aumentano il contrasto del preparato. Sono sali di atomi pesanti, come ad esempio l’acetato di uranile e il citrato di piombo. FASI DI ALLESTIMENTO PER SEM Fissazione e disidratazione (uguali a quelle del TEM) Disidratazione al punto critico (CPD): serve per passare dalla fase liquida a quella gassosa senza danni (avviene con anidride carbonica). Inclusione e taglio (uguali a TEM) Metallizzazione per sputtering : il campione viene ricoperto da un sottile film di metalli che sono stati vaporizzati e poi spruzzati sul campione. Serve per migliorare l’interazione tra fascio di elettroni e campione.
